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1 J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 44(7), 1084~1089(2015) 연구노트 감귤유산균발효물의항균활성과 ACE 저해능 최소연 1 김시경 1 윤은영 1 강대욱 2 최낙식 2 문미선 3 이승철 1 1 경남대학교식품생명학과 2 창원대학교생명보건학부 3 제주담아 Antimicrobial and ACE Inhibitory Activities of Citrus unshiu Fermented with Lactic Acid Bacteria SoYeon Choi 1, SiKyung Kim 1, UnYoung Youn 1, DaeOok Kang 2, NackShick Choi 2, MiSun Mun 3, and SeungCheol Lee 1 1 Department of Food Science and Biotechnology, Kyungnam University 2 Department of Bio Health Science, Changwon National University 3 Jeju Dama Co., Ltd. ABSTRACT To develop high quality citrus products, seven lactic acid bacteria were innoculated onto ground citrus (Citrus unshiu) and cultured for 10 days. On culture days 0, 3, 5, 7, and 10, citrus ferments were withdrawn, and their antimicrobial and angiotensinⅠ converting enzyme (ACE) inhibitory activities were evaluated. Citrus ferments innoculated with and, which were isolated from kimchi, showed relatively higher antimicrobial activities against food poisoning bacteria. Citrus ferments innoculated with and also showed stronger ACE inhibitory activities than other ferments. and showed more than 99% homogeny with Pediococcus acidilactici and Lactobacillus sakei, respectively, by 16S rrna gene analysis. These results indicate that fermentation with P. acidilactici and L. sakei might contribute to the increased antimicrobial and antihypertensive activities of citrus. Key words: citrus, ferment, lactic acid bacteria, antimicrobial, ACE inhibitory activity 서 감귤은운향과 (Rutaceae) 에속하는과실을총칭한명칭이며, 식용으로이용되는종류는감귤속 (Citrus) 에많고오렌지류, 레몬류, 유자류등의많은종류가있지만우리나라에서는온주밀감 (Citrus unshiu) 에주로한정하여부르고있다. 온주밀감은주요감귤중가장낮은온도에견디는품종으로제주도에서널리재배되고있다 (1). 감귤에는 carotenoid, flavonoid, cellulose, pectin, limonoid, 비타민류등의다양한생리활성물질들이다량함유되어있어항산화, 항염, 항암등다양한생리적작용을나타낸다고보고되어있다 (2). 감귤은생과형태로주로소비가되고일부는착즙하여주스가공으로이용되어왔다. 국가통계포털에의하면우리나라의감귤은 2011년 21,424 ha에서경작되어약 68 만톤이생산되었으며, 그중약 10만톤이가공되었다 (3). 감귤은우리나라에서가장많이생산되는과실이지만 1인당 Received 10 March 2015; Accepted 26 May 2015 Corresponding author: SeungCheol Lee, Department of Food Science and Biotechnology, Kyungnam University, Changwon, Gyeongnam , Korea sclee@kyungnam.ac.kr, Phone: 론 연간소비량은계속감소할것으로예상되고있다 (4). 이에초콜릿, 크런치, 말랭이등의다양한감귤가공제품이개발되어판매되고있으며, 머핀 (5), 식초 (6), 양갱 (7), 식빵 (8) 등의다양한제품개발이연구되고있다. 한편유산균 (lactic acid bacteria) 은당류를발효하여젖산및다양한대사산물을생산하는미생물로최근에는건강증진과질병을예방하고자하는 probiotics로서의연구가폭넓게진행되고있으며, 각종발효식품, 사료첨가제등의제조에널리이용되고있다 (9). 또한발효식품을통하여인체내로섭취한유산균은장내로유입되어유익균주의생육을부양하고유해세균을억제하여장내유용미생물의균형을유지시킨다. 그리고항산화작용, 항암작용, 면역활성화작용, 혈중콜레스테롤저하등의작용이있어질병을예방하는데도움이된다고보고되어있다 (10). 유산균의이러한기능성을바탕으로근래오미자유산균발효물 (11), 유산균발효마늘추출물 (12), 유산균발효밤송이추출물 (13) 등이연구되었다. 본연구의목적은고품질감귤가공제품개발에활용한목적으로감귤을유산균으로발효시켜생리활성을향상시키고자하였다. 이를위해미생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures(KCTC), Daejeon, Korea) 로부터

2 감귤유산균발효물의항균활성과 ACE 저해능 1085 분양한유산균 5종과김치에서분리한 2종의유산균을이용하여감귤을발효시켰고, 발효과정중의항균활성과 angiotensin converting enzyme(ace) 저해능을분석하였다. 재료및방법재료및시약본실험에사용된감귤은 2014년 7월에제주도에서시판되는온주밀감 (Citrus unshiu) 을구입하여사용하였다. 항균활성을위한미생물배지는모두 Becton, Dickinson and Company(Sparks, MD, USA) 의제품을사용하였다. ACE 저해능분석을위한시약인 captopril, hippuryl histidine leucine(hhl), rabbit lung acetone powder는 Sigma Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA) 에서구입하였다. 그외의시약은모두 1급이상을사용하였다. 사용균주및배양조건감귤발효를위해미생물자원센터에서 5종의균주 [Enterococcus faecalis KCTC 2011(), Enterococcus lactis KCTC 21015(), Lactobacillus acidophilus KCTC 3140(), Lactobacillus plantarum KCTC 3104(), Leuconostoc mesenteroides KCTC 3505()] 를분양받아이용하였다. 또한김치에서유산균분리를위하여시료에 0.85% 생리식염수를이용하여적정농도로희석하고선택배지에도말하여 1차선별을하였다. 분리원으로부터항균활성을갖는미생물균주를 1차선별하기위하여 MRS 혹은 LB 평판배지에각각 10 4 ~10 3 으로희석한시료를도말하고 30 C 항온배양기에서 20시간이상배양하여 CL 1과 를분리하여이용하였다. 감귤발효를위한실험에서모든균주의전배양은 MRS 액체배지 (Difco, Detroit, MI, USA) 에서 30 C, 100 rpm, 2일간진탕배양하여활성화시키고감귤마쇄물에접종하였다. 감귤발효물제조감귤을수돗물로깨끗이세척한후증류수로다시세척하였다. 발효과정중오염을방지하기위하여세척한감귤표면에자외선 (G30T8 germicidal lamps, Sankyo Denki Co., Ltd., Kanagawa, Japan) 을 15분간조사하였다. 그리고마쇄기 (HBL3500S, 삼양전자, 김포, 한국 ) 를이용하여감귤을고르게분쇄한후미리멸균한 1,000 ml 플라스크에 270 g의감귤마쇄물을준비하였다. MRS 액체배지에서전배양된 7종의유산균을각각 30 ml씩감귤마쇄물에접종한후, 30 C, 100 rpm의진탕배양기 (DS250SW, 대원과학, 부천, 한국 ) 에서 3, 5, 7, 10일간발효시킨후발효물을회수하였다. 각발효물을원심분리 (4 C, 10분, 5,000 g) 하여상징액을 Whatman No.1 여과지 (Advantec, Tokyo, Japan) 로통과시킨여과액을각분석의시료로사용하였다. 대조구로는유산균대신멸균증류수를첨가하여이용하였다. 항균활성 0.5% yeast extract agar plate 위에항균시험균주배양액 1% 와 0.1 M phosphate buffer(ph 7.0) 를포함한 0.8% NB soft agar 10 ml를중층하여 test plate를제조하였다. 감귤발효물시료 50 μl를 test plate에 spotting 하고건조한후, 37 C 항온배양기에서 12시간이상배양하여항균시험균주에대한투명환형성유무를조사하고항균활성을측정하였다. 항균활성에이용한균주는다음과같다. Bacillus cereus KCTC 1013, Enterococcus faecium KCTC 3095, Escherichia coli AB 1041, Micrococcus luteus IAM 1056, Salmonella Typhimurium KCTC 1926, 그리고 Staphylococcus aureus subsp. aureus KCTC ACE 저해능 ACE 저해능은 Cushman과 Cheung(14) 의방법에따라측정하였다. 50 mm sodium borate buffer(ph 8.3) 20 ml 에 1 g의 rabbit lung acetone powder를 4 C에서 24시간동안교반한후, 10분간원심분리 (4 C, 5,000 g) 하여 ACE 조효소액을얻었다. 증류수를가하여 20배로희석한시료 50 μl에 ACE 조효소액 50 μl를가하여 37 C에서 10분간방치한후, 25 mm HHL 100 μl를첨가하여 37 C에서 60분간반응시켰다. 1 M HCI 250 μl를가하여 30초간교반하고원심분리 (4 C, 10분, 5,000 g) 하여상징액 200 μl를얻었다. 이상징액을 80 C에서 30분간완전히건조시켜증류수 1 ml를넣은후에 228 nm에서흡광도를측정하였다. 대조군은추출물대신증류수를가해실험하였으며, 양성대조군으로 captopril을사용하였다. ACE 저해능은다음계산식을이용하여구하였다. ACE 저해능 (%)=1 시료첨가구의흡광도무처리구의흡광도 균주동정김치에서분리하여본연구에사용된유산균 과 CL 2를 16S rrna 유전자분석으로동정하였다. Colony 형태로균주를솔젠트사 ( 대전, 한국 ) 에송부하여유전자분석을의뢰하였다. 16S rrna sequencing에사용되는 universal primer인 27F primer(5'agagtttgatcctggctcag 3') 와 1492R primer(5'ggttaccttgttacgactt 3') 를이용하여 polymerase chain reaction(pcr) 을실시하였다. Capillary DNA Sequencer(3730XL, Applied Biosystems, Grand Island, NY, USA) 를이용하여염기서열을분석하였고, 분석된염기서열을이용하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information, nlm.nih.gov/) 의 blast search를통해상동성을조사하여동정하였다. 통계처리모든실험은 3회반복으로이루어졌으며, 그결과 SPSS

3 1086 최소연 김시경 윤은영 강대욱 최낙식 문미선 이승철 software(ver. 12.0K, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 를사용하여처리하였다. 각측정군의평균과표준편차를산출하고 Duncan의다중범위검정 (Duncan's multiple range test) 으로유의성을검정하였다. 모든처리값의차이는신뢰수준 95%(P<0.05) 로비교분석하였다. 결과및고찰항균활성 7종의유산균을접종하여배양한감귤발효물시료의항균활성을 6종의병원성미생물 (B. cereus, Ent. faecium, E. coli, M. luteus, Sal. Typhimurium, S. aureus) 을대상으로조사하여그결과를 Table 1에나타내었다. 유산균을별도로첨가하지않고감귤만을배양한발효물 () 의경우실험에사용된모든균주에대해항균활성을나타나지않았으며, (Ent. lactis), (Ent. faecalis), (Lac. acidophilus) 균주로발효시킨감귤발효물들도항균활성을보이지않았다. (Leu. mesenteroides) 균감귤발효물은 B. cereus, E. coli, Sal. Typhimurium에대해약한항균 활성을보였다. (Lac. plantarum) 균감귤발효물은모든대상균주에대하여약한항균활성을보였다. 김치에서분리한유산균 과 균감귤발효물은비교적항균활성이강하였다. 특히 균감귤발효물은발효기간이증가할수록항균활성이가장증가하여발효 10일째에는 Ent. faecium 균주를제외하고모든대상균주에대해강한항균활성을나타내었다. 이는감귤에서유산균이발효하는과정에서생성된대사산물에기인하는것으로생각된다. Cho 등 (15) 은자연발효한오미자발효액에서원래항균활성이없었으나발효에의해오미자액이 E. coli 균주에대해항균활성을나타낸바있다. 한편본연구에서항균활성의대상으로이용한 B. cereus는식품부패의원인균으로대부분비병원성균이지만일부는식중독의원인으로독소형과설사형으로분류되며, Ent. faecium은병원성으로수막염을유발하며, E. coli는대부분비병원성균이지만일부는장염성의병원성이있고, M. luteus는일상환경에널리존재하는미생물이며호염성이있고환자에게감염되기도하며, Sal. Typhimurium과 S. aureus는대표적인식중독균이다. Table 1. Antibacterial effect of extracts from fermented Citrus unshiu Microorganism Sample 1) Fermentation day Microorganism Sample 1) Fermentation day Bacillus cereus Escherichia coli Salmonella Typhimurium Enterococcu faecium Micrococcus luteus Staphylococcus aureus 1), unfermented citrus;, fermented citrus without starter. Fermented citrus with, Enterococcus lactis;, Enterococcus faecalis;, Leuconostoc mesenteroides;, Lactobacillus acidophilus;, Lactobacillus plantarum;, a lactic acid bacteria isolated from kimchi; and, another lactic acid bacteria isolated from kimchi. 2) Antibacterial activity:, nondetected;, <1.0 mm;, mm; and, >1.5 mm of hallow size.

4 감귤유산균발효물의항균활성과 ACE 저해능 1087 ACE 저해능인체내에존재하는 renin은 angiotensinogen을 angiotensin Ⅰ로분해하고, 비활성의 angiotensin Ⅰ은 ACE에의해혈관수축작용이있는 angiotensin Ⅱ가된다. 이 angiotensin Ⅱ는동맥혈관을수축하여혈압을상승시키고, 부신에서 aldosterone의분비를촉진하여신장의나트륨및수분의재흡수를증가시킴으로써고혈압발병에관여한다 (16). 감귤발효물시료를 20배희석하여 ACE 저해활성을측정한결과를 Fig. 1에나타내었다. ACE 저해능은 4.62± 2.71~86.22±1.57% 의범위를보이는데, 20배희석한추출물임에도 7일과 10일발효한, 감귤발효물시료는 80% 가넘는높은 ACE 저해능을보였다. 한편양성대조군인 captopril은 2 μg/ml 농도에서 91% 의 ACE 저해능을유발하였다. 그러나 발효추출물은오히려발효기간이길어질수록 38.17% 에서 14.19% 로감소하였다. 부추당침액의유산균발효에따른 ACE 저해능경우에는유산균종류에따라 50.4~67% 의 ACE 저해능을보이며 (17), 이것은사용된유산균의종류는다르지만본연구가더높은저해능을보이는것을확인할수있었다. 또한 ACE 저해능은주로단백질이나펩티드에의해유발되는데 (18) 유산균을이용하여발효한감귤추출물에서생성된산물이단백질, 펩티드로이루어졌을가능성이커보이며이로인해 ACE 저해능이우수하게나타난것으로사료된다. 균주동정김치에서분리되어감귤의발효과정에서높은항균활성을보인유산균균주 과 를동정하기위해서 PCR 로 16S rrna 유전자를증폭시킨후염기서열을결정하고, 이를 NCBI의 GenBank에등록된유전자들과상동성을비교한결과 은 Pediococcus acidilactici와, 는 Lactobacillus sakei와 99% 이상의상동성을보였다 (Fig. 2). P. acidilactici는김치 (19) 와막걸리 (20) 에서분리되어보고된바있으며, Pediococcus 속에서생성된박테리오신은총칭하여 pediocin이라명명되고있다 (21,22). P. acidilactici의 pediocin은특히 Listeria monocytogenes에강한항균력을보였다 (23). Lac. sakei는당으로부터알코올 또는유산균을생성하는젖산균으로 sakacin이라는박테리오신을생성한다 (24). 박테리오신은펩타이드, 단백질로구성된항균성물질로같은환경에서자라는다른미생물에대한경쟁적인저해제로다양한미생물에서분리된다 (25). 특히유산균은김치발효에중요한역할을하고다양한항균물질을생산하는것으로알려졌으며, 박테리오신의항균범위는매우광범위하여부패균, 식중독균, 전염병균이나포자형성균등의증식을억제하거나사멸시키는데효과적이다 (26). 박테리오신은항생제와달리단백질로구성되어인체에들어오면소화기관내에서단백질가수분해효소에의해쉽게분해되어인체에무독성이고잔류성이없다. 항생제는 2차대사산물인데비해박테리오신은자신의유전자로부터직접생합성된다 (27). Lac. sakei가생산하는 sakacin은 A, G, K, P, Q형이보고되어있는데, 그중에서 A형과 P형이잘알려져있다 (28). 본연구에서확인된 Lac. sakei가생산하는 sakacin은저해범위가좁은박테리오신이아니라 Streptococcus lactis가생성하는박테리오신인 nisin(29) 과같이저해범위가매우넓은것을알수있었다. 한편 P. acidilactici로생선풀 (surimi) 을발효시켰을때생성된아미노화합물에의해 ACE 저해능을보인다고보고되었다 (30). 또한육류유래 Lac. sakei로돼지골격근을분해하였을때생성되는펩티드가 ACE 저해능을보이는것도확인되었다 (31). 이상으로볼때본연구에서이용된 P. acidilactici와 Lac. sakei 균주도감귤의발효과정에서생성한대사물질이 ACE 저해능을유발한것으로유추할수있었다. 요약고품질감귤가공품개발을위하여감귤에 7종의유산균을각각접종하여 10일간배양하면서 0, 3, 5, 7, 10일째의발효물의생리활성을분석하였다. 병원성미생물에대한감귤발효물의항균활성을측정한결과김치에서분리한유산균인 과 의발효물이발효기간이길어질수록강한항균활성이나타났다. 또한각감귤발효물의항고혈압활성을 ACE 저해능으로분석하였을때 과 의발효 ACE inhibitory activity (%) aw bx cx cx dy cw d ew dz eey bcz cz ay efy fy by dx y dz dyx exw e fx gw cy by cx d dw ev bz ex ew cy d dw ew Day bx cz fv Fig. 1. Angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activity of fermented Citrus unshiu ( 20 dilution). Values are means±sd of triplicate experiments. Different letters (ag and vz) above the bars are significantly different (P<0.05) within same days and same lactic acid bacteria fermentation, respectively. Groups are the same as in Table 1.

5 1088 최소연 김시경 윤은영 강대욱 최낙식 문미선 이승철 A B Fig. 2. Phylogenetic trees of related to Pediococcus acidilactici (A) and related Lactobacillus sakei (B).

6 감귤유산균발효물의항균활성과 ACE 저해능 1089 물이발효기간이길수록높은활성을나타내었다. 과 균주를 16S rrna gene의구조로분자계통학적유연관계를파악한결과각각 Pediococcus acidilactici 및 Lactobacillus sakei와 99% 이상의상동성을가지는것을확인할수있었다. 이상의결과는감귤을 P. acidilactici와 Lac. sakei로발효하여항균력과항고혈압능이증진된가공품의제조에활용이가능함을시사한다. 감사의글 본논문은중소기업청에서지원하는 2013년도산학연공동기술개발 (No. C ) 의연구수행으로인한결과물임을밝힙니다. RERENCES 1. The Korean Society of Food and Nutrition Food nutrition dictionary. Korea Dictionary Research Publishing, Seoul, Korea. p Silalahi J Anticancer and health protective properties of citrus fruit components. Asia Pac J Clin Nutr 11: Korean Statistical Information Service. Html/statHtml.do?orgId=101&tblId=DT_1ET0292&vw_cd =MT_ZTITLE&list_id=F1H&seqNo=&lang_mode=ko&lan guage=kor&obj_var_id=&itm_id=&conn_path=e1 (accessed Feb 2015). 4. Jejuilbo. idxno= (accessed Feb 2015). 5. Oh SW, Chung KH Physicochemical and sensory properties of muffins with added powdered tangerine peel. 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untitled 3. 농업환경연구과 과제구분 기본연구 수행시기 전반기 연구과제 및 세부과제 수행 기간 소 속 책임자 농가에 적합한 부식성곤충 대량 사육기술 개발 12~ 13 농업환경연구과 곤충팀 이영혜 1) 부식성 곤충 먹이 제조 기술 개발 12~ 13 농업환경연구과 곤충팀 이영혜 색인용어 부식성곤충, 장수풍뎅이, 계통, 먹이제조 ABSTRACT In first check,