Microsoft Word doc

Transcription

1

2 이학석사학위논문 고농도포도당과 Palmitate 에의한 INS-1 베타세포의세포사기작연구 아주대학교대학원 의학과 이연정

3 고농도포도당과 Palmitate 에의한 INS-1 베타세포의세포사기작연구 지도교수강엽 이논문을이학석사학위논문으로제출함 년 8 월 아주대학교대학원 의학과 이연정

4 이연정의이학석사학위논문을인준함. 심사위원장강엽인 심사위원이관우인 심사위원정윤석인 아주대학교대학원 2008 년 6 월 23 일

5 - 국문요약 - 고농도포도당과 Palmitate 에의한 INS-1 베타세포의 세포사기작연구 당뇨병은인슐린이부족하거나인슐린이제대로작용하지못하여혈액내의포도당농도가높아져서발생하는만성대사질환이다. 인슐린저항성이외에도포도당자극인슐린분비 (GSIS) 의감소, 인슐린유전자발현의감소, 베타세포의양적감소에의한베타세포의기능이상이제 2형당뇨병을유발시키는중요한병인으로인식되고있다. 이중에서베타세포의양적감소는베타세포의복제및신생이불충분하고세포사가상대적으로많이일어나서나타나게된다고생각된다. 고혈당과함께높은농도의 FFA는베타세포의양적감소를유발한다고생각하고있다. 포도당과지방산에의한베타세포의양적감소의기작은첫번째로베타세포가지속적으로포도당에노출되게되면 ROS가생성되고, 이로인해산화적스트레스가유발되어지방산독성이나타난다고알려져있다. 두번째로베타세포가지속적으로 FFA에노출되면 JNK, NF-κB, p38 과같은여러가지 stress 신호와 ER stress 의유발, 생존신호인 AKT 신호의감소등에의해서베타세포에지방산독성이나타난다고알려져있다. 세번째로포도당과 FFA가동시에지속적으로존재하게될때 ceramide 의합성, PKC 신호의활성에의한포도당 / 지방산독성이나타나게된다. 본연구에서는 INS-1 베타세포에서포도당 / 지방산독성이나타나는지확인하고, 이때어떤기작으로세포사멸이유도되는지를연구하였다. INS-1 베타세포에서 palmitate의농도를 400 μm 로고정하고포도당농도를 25 mm로처리한경우 INS-1 세포의생존율이감소하였다. INS-1 세포의생존율감소는 DNA fragmentation 의증가, Caspase 3와 PARP의활성화, DAPI - i -

6 염색을통하여핵이응축되는현상을확인하여 apoptosis 를통한세포사라고밝혔다. 산화적스트레스와스트레스신호관련저해제에의해서는세포사저해효과가나타나지않았고, ER 스트레스, Ca 2+ 신호관련약제에의해서는세포사저해효과가나타났다. 베타산화를촉진시켜주는 bezafibrate 와 AICAR에의해 INS-1 세포사멸저해효과가가장크게나타난사실을확인하여지방대사에관점을두었다. ACC 저해제인 TOFA에의해세포사멸이더촉진되었고지방합성을저해하는 FAS 저해제인 cerulenin 에의해세포사억제효과가나타났다. 또한지방합성을촉진시키는 T 에의해서는오히려세포사멸억제효과가가장뛰어나게나타났다. 이런사실로지방합성자체가 HG/PA에의해유도되는 INS-1 세포사에결정적인역할을하지않는다고생각된다. HG/PA에의해서 TCA 회로중간산물의감소, palmitate와 pyruvate의산화감소, ATP 수준의감소가일어나는것을확인하여에너지부족에의한세포사로생각되며 TCA 회로에서 anaplerosis 의유입을증가시켜주는 Leu, BCH, KIC+MMS 를처리했을때와 cataplerosis 유출을저해하는약제인 BTA를처리했을때세포사저해효과가나타났고, ATP의감소를회복시켰다. 당뇨병동물모델인 OLETF rat의 islets에서도 HG/PA에의한 INS-1 세포사에저해효과가있었던약제들에의해세포사저해효과가나타났고, ATP 또한감소시키지않았다. 결론적으로지방합성은 HG/PA에의한 INS-1 세포사멸에결정적인역할을하지않고, 지방산의베타산화감소와미토콘드리아의대사이상에의한에너지부족이초래되어 apoptosis 를통한세포사를유발시키는것으로추측된다. 핵심어 : High glucose(hg), Palmitate(PA), anaplerosis, energy depletion - ii -

7 차례 국문요약 ⅰ 차례 ⅲ 그림차례 ⅵ 표차례 ⅷ Ⅰ. 서론 1 A. 당뇨병 (Diabetes Mellitus) 의정의 1 B. 제2형당뇨병에서베타세포의기능이상 2 1. 베타세포에서포도당대사 4 2. 베타세포에서지방산대사 6 3. 포도당독성 (Glucotoxicity) 9 4. 지방산독성 (Lipitoxicity) 포도당 / 지방산독성 (Glucolipotoxicity) 10 C. 연구목적 14 Ⅱ. 재료및방법 15 A. 재료 재료 15 B. 방법 췌장소도세포및세포주배양 췌장소도세포분리 MTT assay Cell death detection assay TG staining ATP assay 19 - iii -

8 7. RT-PCR Western blotting Palmitate oxidation Pyruvate oxidation Metabolite extraction 23 Ⅲ. 결과 24 A. 고농도포도당과 palmitate 에의해 INS-1 세포에서포도당 / 지방산독성 (Glucolipotoxicity) 이나타남 24 B. 여러가지저해제를이용한 INS-1 세포사의작용기전확인 HG/PA에의한 INS-1 세포사에서산화적스트레스와스트레스신호의영향 HG/PA에의한 INS-1 세포의세포사에서 ER stress 와 Calcium 의영향 HG/PA에의한 INS-1 세포사에서지방산대사의영향 28 C. HG/PA에의한 INS-1 세포사와지방합성과의연관관계 HG/PA에의한 INS-1 세포사에서 T 에의한지방합성유전자발현의증가 INS-1 세포에서 HG/PA에의한포도당대사와지방합성관련유전자발현의변화 35 D. 미토콘드리아대사이상에의한에너지부족에의한세포사 TCA 회로의 anaplerosis/cataplerosis 조절에의한세포사억제효과 TCA cycle components 의변화 HG/PA에의한 INS-1 세포사에서 pyruvate 산화와 palmitate 산화의감소 INS-1 세포에서 HG/PA에의한 ATP의감소 48 - iv -

9 5. HG/PA를처리한 INS-1 세포에서여러가지약제들에의한 ATP 수준의변화 50 E. OLETF islets에서 HG/PA에의한세포사 52 Ⅳ. 고찰 54 A. HG/PA에의한 INS-1 세포사증가 54 B. HG/PA에의한 INS-1 세포사에서산화적스트레스, 스트레스신호, ER stress, Calcium, 지방산대사의영향 54 C. HG/PA에의한 INS-1 세포사에서지방합성과의연관관계 56 D. HG/PA 에의한 INS-1 세포사에서미토콘드리아의대사이상 57 Ⅴ. 결론 59 참고문헌 60 - v -

10 그림차례 Fig. 1. Impaired Beta Cells in T2DM 3 Fig. 2. Metabolism of glucose 5 Fig. 3. Fatty acid metabolism in the pancreatic beta-cell 8 Fig. 4. Beta cell glucolipotoxicity 13 Fig. 5. HG/PA-induced INS-1 beta cell death 26 Fig. 6. Role of oxidative stress and stress signals in viability of the HG/PA treated INS-1 cells 30 Fig. 7. Effect of ER stress and calcium signals on HG/PA treated INS-1 cells 31 Fig. 8. Pathway of lipid metabolism 32 Fig. 9. Effect of Lipid Metabolism in viability of HG/PA treated INS-1 cells 33 Fig. 10. T increase TG accumulation in HG/PA treated INS-1 cells 37 Fig. 11. T regulate lipid synthesis related gene expression 38 Fig. 12. Effects of HG/PA on glucose metabolism and lipid metabolism related gene expression in INS-1 cells 39 Fig. 13. Pathway of anaplerosis/cataplerosis in the beta cell 41 Fig. 14. Effects of anaplerosis/cataplerosis in viability of HG/PA treated INS-1 cells 43 Fig. 15. HG/PA induced the reduction of TCA cycle intermediates in INS-1 cell 44 Fig. 16. Pyruvate oxidation is decreased in HG/PA treated INS-1 cells 46 Fig. 17. Palmitate oxidation is decreased in HG/PA treated INS-1 cells 47 - vi -

11 Fig. 18. ATP levels in HG/PA treated INS-1 cells 49 Fig. 19. Effects of beta oxidation, TG accumulation, TCA cycle related molecules on ATP levels in HG/PA treated INS-1 cells 52 Fig. 20. Effects of HG/PA on viability and ATP levels in pancreatic islets in OLETF rat model 54 - vii -

12 표차례 Table 1. A list of the used inhibitors 17 Table 2. Primers used for PCR analysis 21 - viii -

13 I. 서론 A. 당뇨병 (Diabetes M ellitus) 의정의 당뇨병 (Diabetes Mellitus) 은췌장 (pancreas) 에서분비되는인슐린 (insulin) 이부족하거나인슐린이우리몸에서제대로작용하지못하여혈당이에너지로이용되지않고혈액속에쌓여서고혈당증상을나타내는만성대사질환이다. 정상인의경우체내에포도당 (glucose) 이흡수되면혈중당농도가증가하고췌장베타 (β) 세포가높아진포도당농도를인식하여인슐린을분비하고분비된인슐린은간, 근육, 지방세포등과같은표적세포에서포도당의흡수를촉진하여혈당을낮추게된다. 반면포도당농도가낮은상황에서는췌장알파 (α) 세포가글루카곤 (glucagon) 을분비하여간에서저장된글리코겐 (glycogen) 을포도당으로분해시키고포도당신합성 (gluconeogenesis) 을촉진시켜혈액에포도당을공급하여혈당을조절하게된다. 이러한인슐린의분비및작용이저하되거나글루카곤의분비가증가해서혈중포도당농도가기저농도에비해높은상태로지속적으로유지되면신장기능의저하, 혈관내에당이축적되어발생하는동맥경화, 망막의출혈로인한시력저하등여러합병증이함께나타나기도한다. 제2형 (Type 2) 당뇨병은전체당뇨병의 95% 이상을차지하고있고주로중년기이후에서나타나게된다. 인슐린이어느정도분비됨에도불구하고인슐린의작용이적절하게이루어지지못해발병하게되며발병초기에는인슐린분비능력이남아있으므로인슐린비의존형당뇨병 (Non Insulin Dependent Diabetes Mellitus : NIDDM) 으로불리어지고있다. 이러한제2형당뇨병은인슐린의작용이상즉, 간, 근육및지방조직같은말초조직에서의인슐린저항성 (insulin resistance) 뿐만아니라인슐린을분비하는췌장베타세포의기능이상 - 1 -

14 (dysfunction) 및양적 (mass) 감소로인한인슐린부족 (insulin deficiency) 이 동반되어발병하는것으로인식하고있다. B. 제 2 형당뇨병에서베타세포의기능이상 제2형당뇨병환자의췌장베타세포는발병전혹은초기에인슐린저항성을극복하고자기저인슐린의분비 (basal insulin release) 는증가하지만당뇨병이진행될수록포도당자극인슐린분비 (GSIS: glucose-stimulate insulin secretion) 능력의감소와같은인슐린분비의감소와더불어인슐린 mrna, 인슐린단백질양이현저히줄어드는특징을나타낸다. 여기서인슐린을생산하고분비하는베타세포의손실은제1형당뇨병의주된병인으로알려져왔으나최근에는베타세포의손실이제2형당뇨병의발병에도결정적인역할을한다고믿고있다. 췌장소도에서베타세포의양적조절은베타세포의복제 (replication), 신생 (neogenesis), 세포사 (apoptosis) 의균형에의해조절된다 (Rhodes 등, 2005). 제2형당뇨병환자는베타세포의복제및신생이불충분하고세포사가상대적으로많이일어나베타세포가양적으로감소하여발병한다 (Rhodes 등, 2005). 당뇨병으로진행되기전과영양및비만상태가계속되면베타세포주위의환경적조건이베타세포의세포사를유도하기적당한상태로되며이런상태가지속되면베타세포의양적감소가일어난다. 베타세포의양적조절은개인의유전적감수성과환경적요인에의해조절되어진다. 베타세포의사멸을증가시키는환경적요인으로지방산의세포독성, 특히당농도가높은상황에서포도당 / 지방산독성 (glucolipotoxicity) 이중요한역할을한다고생각된다 (Kanto 등, 2005; Prentri 등, 2002). 지방산은그자체로베타세포에독성을보이는데베타세포가지속적으로지방산에노출되면세포내대사과정이지방산산화에서지방합성과정으로변환되며이때만들어지는중간산물이세포사관련신호를활성화시킬수있다고알려져있다 (El-Assaad 등, 2003; Rocuit 등, 2000; Chen 등, 2005)

15 Fig. 1. Impaired Beta Cells in T2DM - 3 -

16 1. 베타세포에서포도당대사포도당은인슐린비의존성포도당수송체 (non-insulin-dependent glucose transpoter) 인 GLUT2 (Glucose Transporter 2) 에의해베타세포내로수송된다. 이때 GK (glucokinase) 에의해포도당이 glucose-6-phosphate 로인산화되어진다. 여기서 glucose-6-phosphate 는 pentose phosphate 경로, glycogen 합성경로를통해대사될수있다. glucose-6-phosphate 가인산화되어 fructose-6-phosphate 로전환되어지는데이때 glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase (GFAT) 에의해 fructose-6-phosphate 는 hexosamine 경로로대사될수있다. fructose-6-phosphate 는일련의과정을거쳐 glycolysis 마지막산물인 pyruvate 로대사된다. 베타세포는여러면에서다른동물세포와는차별성을나타낸다. 첫번째로는생리학적으로적절한범위의 (2~20 mmol/l) 의포도당농도를사용한다. 두번째로는 lactate dehydrogenase 와원형질막 monocarboxylate pyruvete/lactate 수송체의활성이낮다. 반면미토콘드리아의 malate/aspartate shuttle의활성이높게나타나 NADH의미토콘드리아산화를원활하게한다. 세번째로베타세포에서는 PDH (pyruvate dehydrogenase) 와 PC (pyruvate carboxylase) 의활성이높게나타나포도당과 pyruvate 의 anaplerosis 와산화적대사를원활하게한다. Pyruvate 에서형성된 acetyl CoA는 oxaloacetate 와만나미토콘드리아의 TCA 회로에서대사되어 citrate 를만들어낸다. 이런미토콘드리아의대사를통해 NADH와 FADH 2 를생산하게된다 (Brennan 등, 2002). 이모든대사에의해미토콘드리아의 TCA회로, 산화적인산화, ATP 생산을증가시키게된다. 이때 ATP/ADP의비율이증가되면 ATP-sensitive K+ channel 이닫히고, 원형질막의탈분극화가일어나 voltage-activated Ca 2+ channel 이열리게되어세포내로 Ca 2+ 이유입된다 (Matschinsky 등, 1996). 결국 Ca 2+ 은원형질막에서인슐린을가지고있는과립과융합되어진다 (Prentki 등, 1996; Roduit 등, 2004). 이로인해포도당에의한인슐린분비가일어나게된다

17 Fig. 2. Metabolism of glucose - 5 -

18 2. 베타세포에서지방산대사혈액속에순환하고있는 lipoprotein 이 lipoprotein lipase 에의해 glylcerol 과 fatty acid로방출되면 fatty acid는혈액에존재하는단백질인 serum albumin 과결합한다. 수용성인 serum albumin 단백질은지용성인 fatty acid를베타세포내로이동시켜준다. Fatty acid는 albumin과분리되어확산에의해세포질로수송되어지거나세포표면의 receptor 와상호작용에의하여효과를나타낼수도있는데 GPCR (G-protein coupled receptor) 인 GPR40 가 long chain fatty acid의 receptor 로알려져있다 (Itoh 등, 2003; Briscoe 등, 2003; Katsuma 등, 2005). 포도당농도가낮거나 camp에의해 PKA가활성화되면 HSL (hormone sensitive lipase) 을활성화시킨다. HSL은 NEFA (non-esterified fatty acid) 의생산또는다른지방신호분자 (lipid signaling molecule) 를통한인슐린분비, 조절에서지방분해에관여하는효소이다. HSL은 TG store 를분해시켜 fatty acid를방출하게된다. 이과정은 GSIS에중요한역할을하게된다. 실제적으로 HSL-knockout mice의소도에서 GSIS가감소되어있다고보고되어있다 (Roduit 등, 2001). 또한포도당농도가증가하면베타세포에서 HSL 유전자발현을유도하게된다 (Winzell 등, 2001). 포도당의수준이낮을때 fatty acid는 ACS (acyl-coa synthetase) 에의해 long chain acyl CoA로전환되고 long chain acyl CoA는 CPT-1 에의하여미토콘드리아내로들어가서베타산화가일어나에너지를생산하게된다. 미토콘드리아에서의지방산의베타산화는 3단계로일어나게된다. 제 1단계, acetyl-coa 형태로지방산이분해된다. 2단계에서는, acetyl-coa 의아세틸잔기가시트르산회로를거쳐서 CO 2 로산화된다. 이때전자운반체인 NADH와 FADH 2 가생성되는데, 이것들은제 3단계에서미토콘드리아의호흡사슬에전자를전해주고, 이전자는호흡사슬을거쳐서산소로전해진다. 이러한과정을거쳐지방산산화에의해서방출된에너지는 ATP의형태로보존된다. 반면포도당수준이높을때는 malonyl CoA가증가되어 CPT-1 의활성을 - 6 -

19 저해하고세포질내에 long chain acyl CoA가축적된다. 이때베타세포에서는 malonyl CoA가지방산대사를포도당대사로전환시켜주게된다. 포도당대사에의해생산된 glycerol 3-phosphate 는세포질에축적된 long-chain acyl CoA와만나베타세포에서 TG로에스테르화되어진다. AMPK는포도당산화가낮을때 fatty acid를산화시키는대사로전환시킨다. 반면 fatty acid, cholesterol 합성은포도당산화가높을때진행된다. 기저포도당농도가높아진후에포도당수송과포도당산화는증진되고 AMPK의활성은감소하게된다. 이때 ACC, HMG CoA reductase 의탈인산화로인해활성화되고, mtor 또한활성화된다. 이로인해 fatty acid, cholesterol, 단백질합성이증가되고동시에 fatty acid 산화는감소하게된다. 새로합성된 fatty acid는 DAG와같은지방신호분자를만들어낼수있는데이로인해 PKC가활성되고인슐린분비가증진되게된다. 지속적으로베타세포가높은농도의포화지방산에노출되게되면포도당산화가저하되고 ATP/AMP 비율이감소하여 AMPK가활성화된다. 이때 ACC의인산화로인해 ACC의활성이저해되고지방산합성은감소하게되고지방산산화가증진된다. AMPK는 lipogenic, glycolytic 효소를조절하는중요전사인자인 SREBP1c. HNF-4α 등의발현변화에의해지속적으로베타세포의기능을조절하게된다. 베타세포에서 SREBP1c 유전자를과발현시켰을때 TG 축적이증가하고, 인슐린분비가저하된다고알려져있다 (Rutter 등, 2003)

20 Fig. 3. Fatty acid metabolism in the pancreatic beta-cell Fatty acids are ' activated' on the β-cell to become acyl-coa. This acyl CoA may be oxidized in the mitochondrial matrix, or may be esterified in the cytosol to become TG. Glucose metabolism may also to give rise to cytosolic citrate via cataplerosis, which subsequently can be converted into acetyl-coa and oxaloacetate by ATP-citrate lyase, and the conversion of acetyl-coa into malonyl CoA via the action of ACC. NEFAs may also bind to GPR40 receptors and stimulate unknown signal transduction pathway(s). Clin Sci 112(1): 27-42,

21 3. 포도당독성 (Glucotoxicity) 포도당은베타세포의인슐린유전자발현과분비에있어서주요조절자이다. 그러나포도당이베타세포에지속적으로노출되게되면인슐린유전자발현감소에의해인슐린합성및분비가감소하게되어베타세포의기능이상을가져오고비가역적독성을나타내게된다. 이러한현상을포도당독성 (glucotoxicity) 이라한다 (Robertson 등, 2003). 만성적인고혈당이베타세포의기능이상을일으키는데에관계하는생화학적기전으로는최근포도당대사과정중활성산소 (Reactive Oxygen Species, ROS) 의과도한발생으로인해일어나는만성적산화스트레스 (oxidative stress) 의증가가관련될것이라는증거들이제시되고있다 (Robertson 등, 2003; Robertson, 2004). 정상농도의활성산소는세포의항상성을유지하는데도움을주지만, 만성적인고혈당상태에베타세포가노출되면포도당의산화적인산화 (oxidative phosphorylation) 과정중의미토콘드리아에서의전자전달과정, 글리세르알데히드자동산화 (glyceraldehyde autooxidation), hexosamine 형성경로, advanced glycation end product (AGE) 형성, protein kinase C의활성화등여러경로를통해과량의활성산소가축적되고이러한활성산소는잘밝혀져있지않은신호전달체계를통해서, 당에의해조절되는여러베타세포특이적유전자의발현을변화시키고특히 PDX-1, MafA와같은인슐린유전자발현에있어서중요한전사인자의발현및활성을변화시켜인슐린유전자발현을감소시킨다고알려져있다 (Koji 등, 2003; Kaneto 등, 2001; Kaneto, 2002). 또한베타세포에서는 catalase, glutathion peroxidase 와같은항산화효소의발현이비교적낮기때문에산화적스트레스에민감하다고알려져있다 (Lenaen, 1996; Tiedge, 1997). 실제로당뇨병모델쥐인 ZDF rat 또는 db/db mouse 에서고농도포도당에만성적으로노출될때베타세포에 N-acetyl-cystein (NAC) 과같은항산화제를처리하거나항산화효소를과발현시킬때당독성에의해발생한베타세포의기능이상이일부회복된다는보고가있다 (Kaneto 등, 1999; Tanaka 등, 1999; - 9 -

22 Benhamou 등,1998). 현재까지산화적스트레스에의한인슐린유전자발현의저해현상에관련된신호전달체계 (signaling pathway) 에서대표적으로알려진것이 JNK (c-jun N-terminal kinase) 인데, 실제로산화적스트레스에의해활성화된 JNK가, forkhead 전사인자인 Foxo1/FKHR 을매개로핵내에존재하는 PDX-1 을세포질로이동시켜인슐린유전자발현을감소시키는것으로알려져있다 (Kaneto 등, 2002; Kawamori 등,2006). 4. 지방산독성 (Lipitoxicity) 포도당과마찬가지로정상상태에서지방산은베타세포의필수적인연료로써중요하다. 그러나베타세포가과량의지방산에지속적으로노출되면기저인슐린분비는증가하지만포도당자극인슐린분비가저해받고, 인슐린유전자발현의저해와베타세포의세포사가유발되는데이러한현상을지방산독성 (lipotoxicity) 이라한다. 실제로제 2형당뇨병에서지방대사의이상으로혈중유리지방산의과다하게증가하여인슐린저항성과베타세포의기능이상을유발시키는것으로알려져있다 (Unger, 1995). ZDF rat에서과량축적되는 TG의경우, 소도세포에서의 TG 합성효소인 diacylglycerol-acyltransferase-1 의과발현을통한 TG 과량축적실험에서인슐린분비는감소하나인슐린유전자발현에는영향을주지않았다 (Kelpe 등, 2002). 반면에 palmitate 에의한 de novo 합성을통해증가된 ceramide 는인슐린분비에는영향을미치지않고 JNK의활성화에의한 c-jun 의존적혹은비의존적경로를통하거나, PKB 저해에의한 Foxo1 전사인자의핵내이동을유도하여인슐린프로모터활성을억제함으로써인슐린유전자발현을저해하는것으로추정하고있다 (Kelpe 등, 2003) 5. 포도당 / 지방산독성 (Glucolipotoxicity) 과도한포도당과지방산에의해베타세포기능에비가역적독성을나타내

23 는현상을포도당 / 지방산독성 (glucolipotoxicity) 이라한다. 포도당 / 지방산독성은지방산독성에포도당독성이더해져증대된것으로설명되고있다. 포도당이 (2~10 mm) 로존재하거나포도당수준이낮을때지방산이높게존재하게되면베타세포에독성을나타내지않지만지속적으로포도당과지방산이함께베타세포에노출되면지방합성경로가활성화된다. 초기에는베타세포가이상황을극복하기위하여인슐린분비가증가하지만계속적으로세포질에 FA CoA가쌓이게되고중성지방합성이계속적으로증가하게되면인슐린분비도저하된다. 결국에는지방대사주요전사인자들의활성과지방대사중간산물의생성에의해베타세포는과도한연료독성에서벗어날수없게되어베타세포에독성을가져오게되고명백한제 2형당뇨병으로발전하게된다고믿고있다 (Prentki 등, 2002). 만성적인고혈당과증가된지방산에의해베타세포의지방대사가활성화된다. 이때생성되는중간산물들이만들어내는신호에의해베타세포에기능이상을일으키게된다. 여기에관계하는세포내매개인자로써 cholesterol 합성을들수있다. 실제로 ATP-binding cassette transporter subfamily A member 1 (ABCA1) 유전자를제거시킨베타세포에서 cholesterol 의유출을하지못하여세포내에 cholesterol 이증가되고인슐린분비가저하된다고알려져있다 (Brunham 등, 2007). 두번째로 ceramide 의생성은 palmitate 가인슐린유전자저해하도록조절된다고추측된다. Ceramide 에의해조절되는두가지주요신호전달체계는 MAPK와 PI3K 경로를들수있다. 인슐린유전자의전사는전사인자활성의영향에의해조절되어지는데 JNK는대부분의세포에서 ceramide 에의한신호전달경로로써인슐린유전자전사를억제한다 (Mathias 등, 1998). 인슐린에민감한세포에서는 palmitate 에서 ceramide 를형성하는것은 PKB (AKT) 활성을억제시킨다고알려져있다. 이것은아마도 PKCζ 활성에의해나타나는것으로보인다 (Bourbon 등, 2000). 세번째로 TG의세포질내축적이베타세포에독성을가져올수있다고추측되어진다. 실제로 ZDF rat에서지속

24 적으로 glucose 와 palmitate 에노출되었을때 TG의양이증가되어베타세포의기능이상을가져오게되며, islets 에서 TG의합성은 insulin 분비를저하시켰다 (Kelpe 등, 2002). 또한아직정확히밝혀져있지않지만 TG로에스테르화되기전의중간산물들인 lysophosphatidic acid, phosphatidic acid, diacylglycerols 등이베타세포기능을저하시킨다고믿고있다 (Prentk 등, 2006)

25 Fig. 4. Beta cell glucolipotoxicity Possible mechanism of β-cell glucolipotoxicity implication malonyl-coa, PPAR-α, PPAR-γ, SREBP-1c, and altered lipid partitioning. Diabetes 51: S405-S413,

26 C. 연구목적 베타세포의양적감소는제2형당뇨병환자에게나타나는중요한병인이다. 베타세포의세포사원인중하나가포도당 / 지방산독성 (glucolipotoxicity) 인데이기전은명확히밝혀져있지않다. 본연구에서는고농도포도당과 palmitate 에의해 INS-1 세포에서포도당 / 지방산독성이나타나는것을확인하였고그기작이기존에보고되어있는산화적스트레스와관련이있는지, 다른스트레스신호와관련이있는지, Ca 2+ 신호또는 ER stress 와관련이있는지, 지방합성경로의중간대사물질생성과관련이있는지, 또는다른기작에의해세포사를유도하는지규명하고자하였다

27 Ⅱ. 재료및방법 A. 재료 1. 재료세포배양에사용하는 Fetal Bovine Serum 은 Sigma (Sigma-Aldrich Co, St. Lois, USA) 에서구입하였고, 항생제 (penicillin G, streptomycin) 는 GibcoBRL (Invitrogen Co, Califonia, USA) 에서구입하였다. 세포배양에사용하는 RPMI 1640 과포도당이없는 RPMI 1640 은 Sigma (Sigma-Aldrich Co, St. Lois, USA) 에서구입하였다. 췌장소도세포분리에이용한 collagenase P는 Roche (Rochediagnostics GmbH, Mannheim, Germeny) 에서구입하였고, ficoll 은 Sigma에서구입하였다. NMMA, NAC, EGTA/AM, SB203580, SP600125, SN50 등의저해제들은 Calbiochem (EMD Bioscience, Inc, Darmstadt, Germany) 에서구입하였다. etomoxir, bromopalmitate, orlistat, AICAR, lovastatin, fumonisin B1, myriocin, chelerythrine, T , L-leucine, glutamine, pyruvate, methyl pyruvate, BCH, KIC, mono methyl succinate, BTA, PAA는 sigma에서구입하였고, cerulenin 과 TOFA는 Cayman (Cayman Chemical, Michigan, USA) 에서구입하였고, hydroxycitrate 로사용한 CITRIMAX 는 Bestlifevitamin (bestlifevitamin, USA) 에서구입하였다. RT PCR에사용된 TRI Zol은 MRCGENE에서구입하였고 RT-PCR kit는 Takara (Takara, Otus, Japan) 에서구입하였다. Western blot에사용된 AKT, AMPK, mtor, Caspase 3, PARP에대한항체는 Cell Signaling (Cell Signaling Technology Inc, Denver,USA) 에서, actin에대한항체는 Sigma에서 HIF-1β 에대한항체는 BD Bioscience Parmingen 에서구입하였다. ATP assay 를위한 CellTiter-Glo Luminescent cell viability assay kit는 Promega (Promega Co, Madison, WI 53711, USA) 에서구

28 입하였다. Pyruvate oxidation 과 palmitate oxidation 을위한 [1-14 C]Pyruvic acid, sodium salt 와 [1-14 C]Palmitic acid 는 GE Healthcare 에서구입하였고, Perchloric acid 는 Sigma 에서구입하였다

29 Table 1. A list of used inhibitors Name NMMA NAC GSH SN50 SP00125 SB Dantrolin EGTA EGTA/AM Nifedifine Nimodipine Bay K8644 Etomoxir Bromopalmitate Orlistat Bezafibfate AICAR GW9662, Troglitazone HCA Lovastatin TOFA Cerulenin C75 Fumonisin B1 Myriocin Chelerythrine T Pyruvate Methyl pyruvate Leucine aminobicyclo-heptane-2-carboxylic acid(bch) Glutamine a-ketoisocarproic acid (KIC) Mono methyl succinate BTA BM Phenyl acetic acid (PAA) Function NO inhibitor Anti-oxidant Endogenous anti-oxidant NF κb inhibitor JNK inhibitor p38 MAPK inhibitor Ryanodine receptor Ca 2+ channel blocker Extracellular Ca 2+ chelator Intracellular Ca 2+ chelator L-type Ca 2+ channel blocker L-type Ca 2+ channel blocker L-type Ca 2+ channel opener CPT-1 inhibitor Nonmetabolized palmitate analogue, CPT-1 inhibitor HSL inhibitor PPAR αagonist AMPK activator Irreversible PPAR-γantagonist PPAR-γagonist Citrate lyase inhibitior HMG-CoA synthesis inhibitior ACC competitive inhibitor FAS inhibitor FAS inhibitor, CPT-1 stimulate Ceramide inhibitor Ceramide inhibitor PKC inhibitor LXR ligand agonist, general activator of lipogenesis Glutamate dehydrogenase activator Non-metabolized leucine analog, Glutamate dehydrogenase activator supply acetyl CoA supply succinate Tricarboxylate(citrate, isocitrate) Carrier inhibitor Dicarboxylate(malate) carrier inhibitor PC inhibitor

30 B. 방법 1. 췌장소도세포및세포주배양 OLETF 췌장소도세포와 INS-1 세포주는 11 mm 포도당이함유된 RPMI 1640 배지에 10% fetal bovine serum 과 100 IU/ ml penicillin 과 100 μg / ml stretopmycin 의항생제를첨가하여 5% CO 2 와 37 의온도를유지하면서배양기에서배양하였다. 2. 췌장소도세포분리췌장소도세포는 collagenase digestion 방법으로분리하였다. 30~33 주된웅성 OLETF rat의 common bile duct에 0.75 mg / ml의 collagenase 를 10 ml주사기로주입하여췌장을분리해냈다. 37 water bath에서 7분에서 10분간췌장소도세포를 digestion 시키고, 차가운 HBSS를 30 ml넣어효소반응을중지시키고, 세차게흔들어준후 500 x g에서 2회세척한후, 상등액은버리고 HBSS 10 ml을더하여 pippeting 10회정도해준후, 600 μm mesh 에걸러서 digestion 되지않은 exocrine 세포들은제거하였다. 걸러진용액은 500 x g 로원심분 리하여씻어내는과정을 2회반복하였다. 남은침전물은 25% ficoll 용액에섞은후, 그위에 23%, 21.5%, 20.5%, 11% ficoll 층을만들고 3000 rpm에서 10분간원심분리하였다. 11% 와 20.5% 사이층에걸린췌장소도세포를걷어내어 RPMI 1640 으로세척한후, 10% fetal bovine serum 과 1% 항생제가포함된 RPMI 1640 배지를넣어주어배양기에서 24시간배양하였다. 3. MTT assay 96 well plate에 INS-1 세포를 5 x 10 4 개씩분주하여 24시간배양한후배양액에포도당과여러약제를처리하고 30분후에 palmitate 를처리하여배양한후, 18시간에서 24시간이지난후배양액을버리고 0.5 mg / ml MTT를 1시간동안처리한다. 그후에 MTT 용액은버리고 isopropanol (0.1N HCl/isopropanol)

31 을넣어주고 30 분반응시킨후에 spectrophotometer 를이용하여측정하였다 (630 nm, Bio-Rad, Hercules, CA). 4. Cell death detection assay 96 well plate에 INS-1 세포를 5 x 10 4 개씩분주하여 24시간배양한후에여러농도의포도당과 palmitate 를 24시간동안처리하고 lysis buffer (0.1% tritonx-100, 0.1% sodium citrate) 로세포를용해한후에원심분리 (700 x g, 5min) 하여핵을가라앉히고상층에있는 nucleosome DNA를 sandwich ELISA 에넣는다. 여기에는 anti-histone monoclonal antibodies 가코팅되어있다. 여기에 peroxidase-conjugated anti-dna monoclonal antibodies 를넣으면 nucleosome DNA complex 에 peroxidase 가남아있게되고이것을측정하였다. (405 nm, 2,29-azino-di [3-ethylbenzthiazolinsulfonate] (ABTS) as the substrate). 5. TG staining Microscope cover glass에 INS-1 세포를 3 x 10 5 개로분주하여유리에세포를부착시켜 24시간배양한다. 배양후에배양액에포도당 25 mm, T μm 첨가해준후, palmitate 400 μm 을넣고 1일, 3일배양한다. 배양후에배양액을버리고 1X PBS로 2회세척한후, 10% formalin 을넣고 1시간동안세포를고정시킨다. 1X PBS로두번세척한후에 55% isopropanol 에녹여져있는 0.3% Oil Red O 용액에 2시간동안염색시킨다. 1X PBS로 2회세척한후에 glass를말린후슬라이드글라스에고정시킨다. 6. ATP assay 96 well plate 에 INS-1 세포를 5 x 10 4 개씩분주하여 RPMI 1640 배양액 에 24 시간배양한후에, 포도당과 palmitate 그리고여러약제를 18 시간처리한

32 후새로운 RPMI 1640 배양액으로교환하고실온에서 30분동안안정화시킨다. pipett 으로세포를떼어내어 1.5 ml tube로옮기고동량의 CellTiter-Glo 시약을넣는다. standard 는 100 μm ATP를 RPMI 1640 배양액에희석하여최종농도가 1 μm, 100 nm 10 nm이되도록만들어 sample 과같은방법으로배양액과동량의 CellTiter-Glo 시약을넣는다. 2분동안 vortex 하여세포를 lysis 시킨다. 상온에서 10분동안세포를안정화시킨후에 luminometer 로값을측정하였다. 7. RT-PCR INS-1 세포를 12 well plate에 3 x 10 5 개씩분주하여 37, 5% CO 2 배양기에서 24시간배양한후, 배양액에포도당을 25 mm이되게첨가해주고, palmitate 400 μm 을처리한후시간별로세포를수거하였다. 세포를 1X PBS로세척한후, RNA TRI Zol 을이용하여 RNA를추출하여정량하였다. 1 μg의 RNA를 1000U AMV 역전사효소 0.5 μl, 2.5 mm dntp 4 μl, Random 9mer 1 μl, RNase inhibitor 0.5 μl, MgCl 2 4 μl, 10X RT buffer 2 μl와혼합하여 30 10분, 42 30분, 99 5분동안역전사반응을시켜 cdna를합성하였다. 이렇게얻어진 cdna로아래의 primer 들을사용하여 PCR을수행하였다. 1.5% agarose gel에서 PCR 반응물을전기영동하여 ethidium bromide로염색하여관찰하였다

33 Table 2. Primers used for PCR analysis. Name Sequence Cyclophilin (Forward) 5'-CCA AAG ACA GCA GAA AAC TT-3' Cyclophilin (Reverse) 5'-GAA ATT AGA GTT GTC CAC AG-3' Glut2 (Forward) 5'-TGG GTT CCT TCC AGT TCG-3' Glut2 (Reverse) 5'-AGG CGT CTG GTG TCG TAT-3' Glucokinase (Forward) 5'-TGA CAG AGC CAG GAT GGA-3' Glucokinase (Reverse) 5'-TCT TCA CGC TCC ACT GCC-3' Insulin (Forward) 5'-CCA GGC TTT TGT CAA ACA GCA C-3' Insulin (Reverse) 5'-CAG TTG CAG TAG TTC TCC AGT TG-3' PDX1 (Forward) 5'-TGC TAA TCC CCC TGC GTG CCT GTA-3' PDX1 (Reverse) 5'-CTC CTC CGG TTC TGC TGC GTA TGC-3' PPAR α (Forward) 5 -TGT CAC ACA ATG CAA TCC GTT T-3 PPAR α (Reverse) 5 -TTC AGG TAG GCT TCG TGG ATT C-3 CPT1 (Forward) 5'-TAT GTG AGG ATG CTG CTT CC-3' CPT1 (Reverse) 5'-CTC GGA GAG CTA AGC TTG TC-3' UCP2 (Forward) 5'-AAA GAT ACT CTC CTG AAA GC-3' UCP2 (Reverse) 5'-TTA CTA CGT TCC AGG ATC C-3' PC (Forward) 5'-GCCAACAGAGGTGAGATTGCCATCC-3' PC (Reverse) 5'-CATCTTGCGGACCACCTCTG-3' PDK1 (Forward) 5'-ACC ATG CAG ACA AAG GCG TTT-3' PDK1 (Reverse) 5'-TAT ACA CAG GGA GTC TTT CGA TG-3' PDK2 (Forward) 5'-GCC ACG AGT CCA GCC TCA CTC-3' PDK2 (Reverse) 5'-GAC AGG CAG GCG CTC CAC T-3' ACC (Forward) 5'-CGT GTG TGG AAG TGG ACG-3' ACC (Reverse) 5'-TCT CTG CAT AGC ACT GGC C-3' FAS (Forward) 5'-CCC ATC TTC CTG CCT GTG-3' FAS (Reverse) 5'-TGT GCT GTC TCC TCG-3' ADD (Forward) 5'-GTA CTG CAG CCA CAC TTC AT-3' ADD (Reverse) 5'-CAC ATC TGT GCC TCC TCC AC-3' GPAT (Forward) 5'-CAA CAA CCT CAA CAT CCC CAT CTT C-3' GPAT (Reverse) 5'-CAG TCT AGA CTA CAG CAC CAC GAA GCT CAG AAT G-3' PAP (Forward) 5'-CAG GGA TCC ATG GAG CGG AGG TGG GTC TTC G-3' PAP (Reverse) 5'-CAG TCT AGA AGC ATA GCA GTT AGG GTC GGT C-3' DGAT (Forward) 5'-CAG ACG CGT GAC GAG GTG CGG GCC GAA GCC ATG-3' DGAT (Reverse) 5'-CAG TCT AGA GGC TGG CCT TTG GCA GTA GCT C-3' HMG CoA (Forward) 5'-GTG ATT ACC CTG AGC TTA GC-3' HMG CoA (Reverse) 5'-TGG GAT GTG CTT AGC ATT GA-3'

34 8. Western blotting INS-1 세포를 60 x 15 mm culture dish에 2 x 10 6 개씩분주하고 24시간배양한후, 포도당농도가 25 mm이되게배양액에포도당을첨가하고 palmitate 400 μm 처리하여시간별로각각의세포들을수거하여 RIPA buffer (1% triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 50 mm NaCl 2, 50 mm Tris-HCl, 1 mm sodium vanadate, 2 mm PMSF) 를이용하여세포로부터단백질을분리, 정량하여 sample buffer (187 mm Tris-HCl ph 6.8, 10% SDS, 30% glycerol, 100 mm DTT, 0.3% bromophenol blue) 에희석하여 5분간끓인다음 8~12% SDS-pholyacrylamide gel에서전기영동한후, gel 상의단백질을전기적으로 Immobilon membrane (Milipore, Bedford, MA) 으로이동시키고 5% skim milk로한시간동안 blocking 하였다. 각각의항체와 4 에서 12시간동안반응시키고 TBST(25 mm Tris-buffered saline, 0.3% Tween20) buffer 로세번세척하여 horseradish peroxidase 가결합된 2차항체로한시간동안반응시킨후, TBST 로세번세척하여, ECL (enhanced chemiluminescence) system (Amersham Bioscience, Pittsburgh, USA) 으로항체와결합된단백질들을조사하였다. 9. Palmitate oxidation INS-1 세포를 12 well plate 에 3 x 10 5 으로분주하여 24 시간배양하고포 도당 25 mm이포함된 RPMI 1640 배양액으로교환해준후에 palmitate 400 μm 을처리하여시간별로실험을수행하였다. HG/PA를처리한배양액을버린후 KRB buffer 로 2회씻어낸후, 2 mm 포도당, 1 mm carnitine, 0.5 μci/ml [1-14 C]palmitate 와 unlabeled palmitate 200 μm 를 0.05% BSA가포함된 KRB buffer 를넣고 2시간배양하였다. 유리병안에두개의 LS vial tube을넣고, 하나의 LS vial tube에는배양이끝난배양액을옮겨담고, 다른한쪽의 LS vial tube에는 1M KOH 400 μl를넣었다. 배양액이들어간 LS vial tube에차가운 40% perchloric acid를 150 μl더하여반응을정지시키고유리병마개를닫고봉

35 합하여실온에서 16 시간동안방치시켰다. LSC cocktail 4 ml과반응이끝난 KOH 를섞어서 lipuid scintillation counting 하여값을측정하였다. 10. Pyruvate oxidation INS-1 세포를 12 well plate 에 3 x 10 5 으로분주하여 24 시간배양하고포 도당 25 mm이포함된 RPMI 1640 배양액으로교환해준후에 palmitate 400 μm 을처리하여시간별로실험을수행하였다. HG/PA를처리한배양액을버린후 KRB buffer 로 2회세척한후, 2 mm 포도당, 1 mm pyruvate, 0.1 μci/ml [1-14 C]pyruvate 포함된 KRB buffer 를넣고 2시간배양하였다. 유리병안에 LS vial tube를두개를넣고, 하나의 LS vial tube에는배양이끝난배양액을옮겨담고, 다른한쪽의 LS vial tube에는 1M KOH 400 μl를넣었다. 배양액이들어간 LS vial tube에차가운 40% perchloric acid를 150 μl더하여반응을정지시키고유리병을마개로봉합하여실온에서 16시간동안방치시켰다. LSC cocktail 4 ml과반응이끝난 KOH를섞어서 lipuid scintillation counting하여값을측정하였다. 11. Metabolite extraction INS-1 세포를 100 x 20 mm culture dish에 1 x 10 7 개씩분주하여 24시간동안배양한후포도당 25 mm 과 palmitate 400 μm 을처리하여시간별로세포를수거하였다. 세포의배양액을버리고차가운 PBS로 2회씻어준후 -20, 80% methanol 을더하여액체질소위에서세포를수거하여 1.5 ml tube에옮겨담은후, vortex 하여 6000 x g에서원심분리하여상층액을얻었다. 이과정을 2회더반복하여 pooling extraction 시켰다. 모아진 sample 은 45, 진공상태에서건조시켰다. 이것을 50% methanol 로다시용해시키고 debris 를제거하기위하여 x g에서원심분리하여상층액을얻고, 이상층액에 internal standard mix를더하여대사체의변화량을 LC-MS/MS 로분석하였다

36 Ⅲ. 결과 A. 고농도포도당과 palmitate 에의해 INS-1 세포에서포도당 / 지방산독성 (Glucolipotoxicity) 이나타남 INS-1 세포에서포도당 / 지방산독성 (glucolipotoxicity) 이나타나는지확인하기위하여 11 mm 포도당이포함된배지에서 INS-1 세포를하루동안배양한후, palmitate 를농도별로처리하고 MTT assay 방법으로세포의생존율을확인하였다. 그결과 11 mm 포도당만처리한 INS-1 세포의생존율을 100% 로정했을때 11 mm 포도당과 400 μm palmitate 농도에서 INS-1 세포의생존율이 70% 로나타났다 (Fig 5-A). Palmitate의농도를 400 μm 로고정시키고포도당농도를 5 mm, 11 mm, 16.7 mm, 25 mm로처리하였을때 INS-1 세포의생존율은 90%, 60%, 47%, 40% 로나타나포도당농도에의존적으로세포의생존율이감소하는것을확인하였다 (Fig 5-B). 이결과로인하여 INS-1 세포에서포도당 / 지방산독성 (glucolipotoxicity) 이나타나는것을확인하였다. 포도당 / 지방산독성에의해 INS-1 세포사가진행될때어떤경로를통해세포사가진행되는지알아보기위하여 Cell death detection kit를사용하여 DNA fragmentation 을측정하였다. palmitate 농도를 400 μm 로고정시키고, 포도당 5 mm 또는 25 mm 농도를처리하여 18시간후에 DNA fragmentation 을확인한결과 25 mm 포도당과 400 μm palmitate를처리한세포가 5 mm 포도당만처리한세포보다 DNA fragmentation 이 1.8 배증가한것을확인하였다 (Fig 5-C). 또한 apoptosis 의대표적인단백질인 Caspase (cysteinyl aspartate-specific proteases) 를확인하고자위와같은조건에서 18시간배양후, 세포를수거하여 western blot으로 Caspase 3의발현양상을확인하였다 (Fig 5-D). 포도당의농도가높아짐에따라 cleaved Caspase 3의발현이증가하였고, cleaved PARP 역

37 시포도당농도가높아짐에따라발현양이증가하는것을관찰하였다. 또다른세포사의특징으로세포사가일어나면핵이응축되는현상이나타난다. INS-1 세포에 25 mm 포도당과 400 μm palmitate 를 18시간처리한후 DAPI 염색을하여핵의모양을관찰하였다. 대조군은정상적으로핵이존재하는데비해 25 mm 포도당과 400 μm palmitate 처리한세포에서는핵이응축되는것을확인하였다 (Fig 5-E). 또한 HG/PA를처리하고 18시간후에전자현미경으로세포를관찰한결과핵이응축되는것을확인하였고, ER membrane 의격리가일어나는것을확인하였으며, 미토콘드리아의크기가커지는것을확인하였다 (Fig 5-F). 결론적으로 INS-1 세포에서고농도포도당과 palmitate에의해포도당 / 지방산독성 (glucolipotoxicity) 이나타나며이것은 apoptosis 를통한세포사로확인되었다

38 Fig. 5. HG/PA-induced INS-1 beta cell death INS-1 cells were pretreated with different concentration glucose for 30 mins before adding 400 μm palmitate. After incubating for 18 hrs, cell viability were determined by MTT assay (A). INS-1 cells were pretreated with 5 mm or 25 mm glucose for 30 mins before adding 400 μm palmitate. And then DNA fragmentation was determined by cell death detection ELISA kit (B). Activation of cleaved Caspase 3 and PARP were confirmed by immunoblotting with caspase 3 antibodies and PARP antibodies. It was detected by immunoblotting (C). DAPI fluorescent nuclear staining of HG/PA treated INS-1 cells (D). Morphological changes were observed by electron microscopy (F)

39 B. 여러가지저해제를이용한 INS-1 세포사의작용기전확인 1. HG/PA에의한 INS-1 세포사에서산화적스트레스와스트레스신호의영향포도당 / 지방산독성에의한베타세포의세포사를유도하는매개인자로써 Reactive Oxigen Species (ROS) 와 JNK, p38 MAPK와같은스트레스신호분자, 또는 NF-κB 의활성등이알려져있다. 이러한매개인자들이 HG/PA에의한 INS-1 세포사에관계되어있는지확인하였다. INS-1 세포를 96 well plate에분주하여하루동안배양한후에 25 mm 포도당이포함된배지에각각의약제들을첨가해주고여기에 400 μm palmitate를처리하여 18시간후에 MTT assay로세포의생존율을확인하였다. 25 mm 포도당만처리한세포의생존율은 100% 로나타났으며 25 mm 포도당과 400 μm palmitate에의해서세포의생존율은 40% 로나타났다. 이때 anti-oxidant 인 NAC, GSH와 NO 저해제인 NMMA, P38 저해제인 SB203580, JNK 저해제인 SP600125, NF-κB 저해제인 SN50 에의해서 HG/PA에의한 INS-1 세포의생존율에큰영향을주지않았다 (Fig 6). 2. HG/PA에의한 INS-1 세포사에서 ER stress와 calcium의영향포도당 / 지방산독성에의한베타세포의세포사매개인자로알려져있는 ER stress 와 calcium 신호가 HG/PA에의한 INS-1 세포사에관여하는지알아보았다. INS-1 세포를 96 well plate에분주하고하루동안배양한후에 25 mm 포도당이포함된배지에 ER stress 관련약제인 chemical chaperon 4-PBA 와 calcium 관련약제들을처리하고, 여기에 400 μm palmitate 를처리하여 18시간후에 MTT assay로세포의생존율을확인하였다. 그결과 ER stress 관련약제인 4-PBA 에의해 INS-1 세포의생존율은 51% 로나타났다. Ca 2+ 관련약제중 intracellular Ca 2+ chelator 인 EGTA/AM에의해 INS-1 세포의생존율이 54%, L-type Ca 2+ channel blocker 인 nifedipine, nimodipine 에의해세포의생존율이

40 56%, 49% 로나타나세포사멸저해효과를보였고, L-type Ca 2+ channel opener 인 BayK8644 에의해서는세포의생존율이 36% 로나타났고, ryanodine receptor Ca 2+ channel blocker 인 dantroline 에의해세포의생존율이 49% 로나타났다 (Fig 7). 3. HG/PA에의한 INS-1 세포사에서지방산대사의영향베타세포가포도당과 palmitate 에지속적으로노출되면베타세포의대사는지방산산화보다는지방합성경로로활성화되어 TG 에스테르화가촉진된다. 그과정중에생성되는 ceramide, cholesterol, arachidonic acid 와같은중간대사산물이만들어내는신호가베타세포에독성을나타낸다고알려져있다. 이러한지방합성경로의활성과함께생성된중간대사산물들이 HG/PA에의한 INS-1 세포사에관여하는지확인하기위하여지방대사경로에관여하는여러가지저해제또는활성제를 HG/PA와함께 INS-1 세포에처리하여세포의생존율을확인하였다. INS-1 세포를 96 well plate에분주하여 RPMI 1640 배양액에하루동안배양한후, 25 mm 포도당이포함된배양액에여러가지저해제또는활성제를처리하고, 여기에 400 μm palmitate 를처리하여 18시간후에 MTT assay 로세포의생존율을확인하였다. 그결과 CPT-1 을저해하는 etomoxir 또는 bromopalmitate 에의해지방산의베타산화를저해하였을때세포의생존율은 etomoxir 에의해 28%, bromopalmitate 에의해 18% 로나타났다. 반면지방산의베타산화를증가시킨다고알려진 PPARγagonist 인 bezafibrate 와 AMPK 활성제인 AICAR에의해세포의생존율은각각 79%, 63% 로나타났다. 두번째로 LC-CoA 합성을저해하기위해그위의경로를차단하였다. citrate lyase 저해제인 HCA(hydroxycitrate) 에의해세포의생존율은 63% 로나타났고, ACC 저해제인 TOFA에의해세포의생존율은 27%, FAS 저해제인 cerulenin 에의해세포의생존율이 45% 로나타났다. 세번째, 지방대사중간산물이 HG/PA에의한 INS-1 세포사에관여하는지알아보았다. HMG-CoA 합성을저해하는 lovastatin 을처리

41 하여 cholesterol 합성을저해하였을때세포의생존율이 30%, ceramide 저해제인 fumonisin B1, myriocin 에의해세포의생존율은 50%, 47% 로나타났고, PKC 저해제인 GF109203x 에의해세포의생존율이 58%, phospholipase A 저해제인 aristochic acid에의해세포의생존율이 22% 로나타났다. 네번째, TG에서 FFA 로분해되는데작용하는효소인 HSL (hormone sensitive lipase) 저해제인 olristat 에의해세포의생존율은 20% 로나타났다. 마지막으로 LXR agonist 인 T 에의하여세포의생존율이 94% 로나타났다.(Fig 9)

42 Fig. 6. Role of oxidative stress and stress signals in viability of the HG/PA treated INS-1 cells INS-1 cells were pretreated with 25 mm glucose and several inhibitors for 30 mins before adding 400 μm palmitate. After incubating for 18 hrs, cell viability were measured by MTT assay

43 Fig. 7. Effects of ER stress and calcium signals on HG/PA treated INS-1 cells INS-1 cells were pretreated with 25 mm glucose and several Ca 2+ related inhibitors for 30 mins before adding 400 μm palmitate. After incubating for 18 hrs, cell viability were measured by MTT assay. Values are means ± S.E. *, P < 0.05 versus HG+PA

44 Fig. 8. Pathway of lipid metabolism

45 Fig. 9. Effects of Lipid Metabolism in viability of HG/PA treated INS-1 cells INS-1 cells were pretreated with 25 mm glucose and lipid metabolism related inhibitors for 30 mins before adding 400 um palmitate. After incubating for 18 hrs, cell viability were measured by MTT assay. Values are means ± S.E. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < versus HG+PA

46 C. HG/PA 에의한 INS-1 세포사와지방합성과의연관관계 1. HG/PA에의한 INS-1 세포사에서 T 에의한지방합성유전자발현의증가 T 에의한 LXR의활성이계속되면베타세포에지방독성을일으켜서베타세포기능이상을나타낸다고알려져있다 (Choe 등, 2007). 그러나앞에서확인한바와같이 INS-1 세포에 HG/PA를처리하여세포사가유도될때, LXR agonist 인 T 에의해세포사저해효과가가장크게나타났다. 이상황에서과연 T 에의해 INS-1 세포에서지방합성이활성화되고있는지를확인하였다. INS-1 세포를 RPMI 1640 배양액에하루동안배양하고 25 mm 포도당이포함된배양액으로교체해준후 400 μm palmitate 를처리한세포와 T μm 과 25 mm 포도당이포함된배양액으로교체해준후 400 μm palmitate 를처리한세포를 1일, 3일배양하여 Oil Red O 염색을통하여 TG 염색을수행하였다 (Fig 10). 그결과 HG/PA와함께 1 μm T 을처리한세포는 HG/PA만처리한세포보다세포사가일어나지않았고, 세포내에지방 granule 처럼보이는것을현미경으로관찰하였다. 세포내에생성된 granule 은 Oil Red O 염색에의해빨간색으로염색되어 TG가축적된것으로확인하였다 (Fig 10). INS-1 세포에 1 μm T 과 25 mm 포도당과 400 μm palmitate 를처리했을때 1일보다 3일째에서 TG 축적이더활발한것을확인하였다. 결론적으로 T 은 HG/PA에의한 INS-1 세포의세포사를억제하였으며시간이지날수록 TG 합성이활성화되는것을확인하였다. 이와같은상황에서 T 에의하여지방합성관련유전자들이증가하는지확인하였다 (Fig 11). INS-1 세포를 RPMI 1640 배양액에하루동안배양한후에 5 mm 포도당또는 25 mm 포도당만처리하였을때, 5 mm 포도당또는 25 mm 포도당이포함된배양액에 400 μm palmitate를처리하였을때, 5 mm 포도당또는 25 mm 포도당이포함된배양액에 1 μm T 을처리하고 400 μm palmitate 를처리하여

47 1일, 3일배양한후, 세포를수거하여세포에서 RNA를추출하였고 RT-PCR 방법으로지방합성에관여하는여러유전자들의 mrna 변화량을확인하였다. 25 mm 포도당만하루처리했을때 acetyl-coa 에서 malonyl CoA로전환시켜주는효소인 ACC (Acetyl-CoA Carboxylase) 와 malonyl CoA에서 palmitoyl CoA 로전환시켜주는효소인 FAS (Fatty acid Synthase) 유전자의 mrna 발현양이가장뚜렷하게나타났고, 25 mm 포도당과 400 μm palmitate 를처리하였을때 ACC, FAS 유전자의 mrna 발현양이감소하였다. HG/PA에 T 을처리하였을때 HG만처리했을때보다 ACC, FAS 유전자의 mrna 발현양이증가하였고, T 에의하여 ADD (SREBP-1c) 유전자의 mrna 발현양이가장높게증가하였다. 2. INS-1 세포에서 HG/PA에의한포도당대사와지방합성관련유전자발현의변화 INS-1 세포를 RPMI 1640 배양액에하루동안배양한후, 25 mm 포도당을처리또는 25 mm 포도당과 400 μm palmitate를처리하여 INS-1 세포를배양하였다. 6시간간격으로 0시간부터 24시간까지세포를수거하여 RNA를추출하였고, RT-PCR 방법으로베타세포특이유전자들과지방산베타산화에관여하는유전자들, 지방합성에관여하는유전자들의변화를확인하였다. 그결과베타세포특이유전자중포도당대사에관여하는 GK (glucokinase) 유전자의 mrna 양이 25 mm 포도당과 400 μm palmitate를처리하였을때시간이경과함에따라점차감소하는경향을보였다. 또한지방합성에관여하는여러유전자들중지방합성에결정적인전사인자인 ADD, ACC, FAS 유전자의 mrna의양은 25 mm 포도당에의해서시간이경과함에따라점차증가하였고, 25 mm 포도당과 400 μm palmitate에의해서는시간이경과함에따라점차감소하는경향을보였다. 또한지방산의베타산화에관여하는효소인 CPT-1 (Carnitine Palmitoyltransferase 1) 과 UCP2 (Uncoupling protein 2) 유전자의 mrna의발

48 현양에는큰변화가없었다. 포도당대사에의해생성된 pyruvate 는미토콘드리아에서 oxaloacetate 로대사되는데여기에작용하는효소인 PC (pyruvate carboxylase) 는지방산합성과 anaplerosis 에중요한역할을하며포도당에의한인슐린분비에도필수적인효소이다. PC 유전자의 mrna 발현양은 25 mm 포도당과 400 μm palmitate 처리에의해 12시간이후로급격하게감소하였다

49 Fig. 10. T increase TG accumulation in HG/PA treated INS-1 cells INS-1 cells were pretreated with 5 mm glucose or 25 mm glucose and T μm for 30 mins before adding 400 μm palmitate for 1days, 3days analyzed by Oil Red O staining

50 Fig. 11. T regulate lipid synthesis related gene expression. INS-1 cells were pretreated with 5 mm glucose or 25 mm glucose and treated with vehicle or 1 μm T for 30 mins before adding BSA or 400 μm palmitate for 1days, 3days. These gene expression monitored by RT-PCR

51 Fig. 12. Effects of HG/PA on glucose metabolism and lipid metabolism related gene expression in INS-1 cells INS-1 cells were treated with 25 mm glucose. In individual groups palmitate were added after 30 mins. After 0, 6, 12, 18, 24 hrs. RT-PCR were performed to check the mrna levels

52 D. 미토콘드리아대사이상에의한에너지부족에의한세포사 1. TCA 회로의 anaplerosis/cataplerosis 조절에의한세포사억제효과미토콘드리아의 TCA 회로중간산물들의재공급또는증가에 (anaplerosis) 의해미토콘드리아의대사가활성화되고, 미토콘드리아에서대사된산물은미토콘드리아에서세포질로유출되어 (cataplerosis) 어떠한신호를전달하게된다 (MacDonald, 2007). INS-1 세포에서 HG/PA에의하여지방합성경로가활성화되는데, 지방합성경로의활성이세포사를유도하는데중요하게작용하지않는것으로보여지방합성경로의전단계인미토콘드리아대사에이상이생겼을것으로추측하였다. 이때외부에서 TCA 회로의중간산물을증가시켜주면 HG/PA 에의한 INS-1 세포사에저해효과가나타나는지확인하였다. INS-1 세포를 RPMI 1640 배양액에서하루동안배양한후, 25 mm 포도당이포함된배양액에 pyruvate, metyl-pyruvate, leucine, glutamine, leucine 과 glutamine, BCH (aminobicyclo-heptane-2-carboxylic acid), KIC (α-ketoisocarproic acid), MMS (mono methyl succinate), KIC와 MMS 등의아미노산을처리하고, 여기에 400 μm palmitate 를처리하여 18시간후에 MTT assay 를통하여세포의생존율을확인하였다. 그결과 HG/PA에의해 INS-1 세포의생존율이 40% 나타날때 pyruvate 와 methyl pyruvate 에의해서세포의생존율에변화가없었고, leucine 에의해 INS-1 세포의생존율은 58%, leucine 과 glutamine에의해서는세포의생존율이 52%, leucine 의 analogue 인 BCH에의해세포의생존율이 84% 로나타났다. KIC와 MMS에의해서세포의생존율은 62% 를보였다. 또한미토콘드리아대사에의해생성된 citrate 가세포질로빠져나가는통로를저해하는약제인 BTA (1,2,3-benzentricaboxylate) 를 INS-1 세포에 HG/PA와함께처리하였을때 INS-1 세포의생존율이 73% 로나타났다. 반면 PC의저해제인 PAA(phenyl acetic acid) 를처리하여 pyruvate가미토콘드리아내로대사되는것을저해하였을때세포의생존율이 13% 로나타났다

53 Fig. 13. Pathway of anaplerosis/cataplerosis in the beta cell

54 Fig. 14. Effects of anaplerosis/cataplerosis in viability of HG/PA treated INS-1 cells INS-1 cells were pretreated with 25 mm glucose and anaplerotic/cataplerotic fuels or inhibitors for 30 mins before adding 400 μm palmitate. After incubating for 18 hrs, cell viability were measured by MTT assay. Values are means ± S.E. * P < 0.05, ** P < 0.01 versus HG+PA

55 2. TCA cycle components의변화 INS-1 세포에서 HG/PA 처리에의해미토콘드리아의대사이상이나타나는지확인하였다. 우선세포내에너지생산경로인미토콘드리아의 TCA 회로가원활히돌아가고있는지를확인하기위해 INS-1 세포에 HG/PA를처리하여시간에따라 TCA 회로의중간산물들의변화량을확인하였다. INS-1 세포를 RPMI 1640 배양액에하루동안배양한후, 25 mm 포도당과 400 μm palmitate 를처리하여 6시간간격으로 0시간부터 18시간까지세포를수거한후, 대사체를추출하였다. 추출한대사체에서 LS-MS 방법을통하여 TCA 회로중간산물들의변화량을확인하였다 (Fig 14). 그결과 malate, α-ketoglutarate 와 malonyl-coa 는 6시간에약간증가하였고, 그이후로양이감소하였다. 그리고 citrate, acetyl-coa 는시간이경과함에따라서서히지속적으로감소하였고, malate 의 양적인변화가가장뚜렷하게나타났다. 결론적으로 HG/PA 에의해 INS-1 세포 에서 TCA 회로의중간대사산물들은시간이경과함에따라모두감소되었다

56 Fig. 15. HG/PA induced the reduction of TCA cycle intermediates in INS-1 cells INS-1 cells were incubated pretreated with 25 mm glucose for 30 mins before adding 400 μm palmitate. After 0, 6, 12, 18 hrs. Cells were harvested and metabolites extraction performed as described Material and Methods. The level of extracted metabolites determinded via LC-MS/MS

57 3. HG/PA에의한 INS-1 세포사에서 pyruvate 산화와 palmitate 산화의감소미토콘드리아대사이상이초래되면미토콘드리아에서 pyrvate 와 palmitate 의산화가감소될것으로생각하였다. HG/PA 처리에의해 INS-1 세포에서 pyruvate 와 palmitate 의산화가감소되어있는지확인하였다. INS-1 세포를 RPMI 1640 배양액에하루동안배양한후, 25 mm 포도당과 400 μm palmitate 를처리하여 6시간간격으로 pyruvate 산화를측정하였다. 이때 14 C label 되어있는 pyruvate 가세포내로들어가서산화되는비율을측정하였다. 이때음성대조군으로써 PC 저해제인 PAA 농도 10 mm을 2시간처리한세포에서는 pyruvate 산화가 80% 감소한것을확인하였다. HG/PA 처리하고 0시간에서 pyruvate 산화를 1로보았을때시간이경과함에따라 pyruvate 산화가지속적으로감소하는것을확인하였다 (Fig 16). 또한 HG/PA에의해서 INS-1 세포에포도당 / 지방산독성이나타날때 palmitate 의산화가감소되어있는지확인하였다. 14 C label 되어있는 palmitate 를이용하여세포내로 palmitate 가들어가서산화되는정도를측정하였다. 25 mm 포도당과 400 μm palmitate 를처리하고 6시간간격으로 18시간까지처리한세포에서 14 C label 되어있는 palmitate 를 2시간동안반응시킨후에 palmitate 산화를측정하였다. 양성대조군으로써 palmitate 의지방산화를촉진시켜주는 bezafibrate 를 6시간처리하였고, 또한음성대조군으로써지방산화를억제시키는 etomoxir 를 6시간동안처리한후, 14 C label 되어있는 palmitate 를 2시간동안반응시켜 palmitate 산화를측정하였다. HG/PA를 6시간처리한세포와비교하여 bezafibrate 를처리한세포에서 palmitate 의산화가 1.2 배증가하였고, etomoxir 를처리한세포에서는 palmitate 의산화가 0.6 배감소하는것을확인하였다. 또한 HG/PA를시간별로처리한세포에서는 0시간을기준으로하여값을 1로정하였을때 6시간에는 0.8, 12시간에는 0.6, 18시간에는 0.2 의값을나타냈 다. 결론적으로시간이경과함에따라 palmitate 산화되는정도가지속적으로 감소하였다 (Fig 17)

58 Fig. 16. Pyruvate oxidation is decreased in HG/PA treated INS-1 cells INS-1 cells were pretreated with 25 mm glucose for 30 mins before adding 400 μm palmitate. After 0, 6, 12, 18 hrs. Cells were then incubated for 2 h in KRB buffer containing 2 mm glucose, 1 mm pyruvate, 0.1 μ Ci/ml[1-14 C]pyruvate, respectively. CO 2 produced in pyruvate oxidation were measured as described in Material and Methods. Values are means ± S.E. ** P < 0.01 versus 0 time

59 Fig. 17. Palmitate oxidation is decreased in HG/PA treated INS-1 cells INS-1 cells were pretreated with 25 mm glucose for 30 mins before adding 400 μm palmitate. After 0, 6, 12, 18 hrs. Cells were then incubated for 2 h in KRB buffer containing 2 mm glucose, 1 mm carnitine, 0.5 μ Ci/ml[1-14 C]palmitate, 0.2 mm unlabeled palmitate, and 0.05% BSA, respectively. CO 2 produced in palmitate oxidation were measured as described in Material and Methods. Values are means ± S.E. ** P < 0.01 versus 0 time

60 4. INS-1 세포에서 HG/PA에의한 ATP의감소 INS-1 세포를 RPMI 1640 배양액에하루동안배양한후, 25 mm 포도당이포함된배양액으로교체하고여기에 400 μm palmitate 를처리하여 CellTiter-Glo Luminescent cell Viability assay 방법으로시간에따라 ATP 수준의변화를측정하였다. 그결과 25 mm 포도당만처리한세포에서는시간이경과함에따라 ATP 수준이증가하였고, 9시간에서 ATP 수준이최대로나타났다. 25 mm 포도당과 400 μm palmitate 를처리한조건에서도 9시간까지 ATP 수준이증가하였지만 25 mm 포도당만처리한세포에서보다 ATP 수준이낮았다. 9시간이후로는 25 mm 포도당만처리한세포에서 ATP 수준이약간감소하는경향을보였고, 25 mm 포도당과 400 μm palmitate 처리한조건에서는 ATP 수준이점차감소하여 24시간에는 0시간에서의 ATP 수준에비해 60~70% 감소하였다 (Fig 13)

61 Fig. 18. ATP levels in HG/PA treated INS-1 cells INS-1 cells were pretreated with 25 mm glucose for 30 mins before adding 400 μm palmitate for the indicated time. Total ATP levels were measured as described in Material and Methods

62 5. HG/PA를처리한 INS-1 세포에서여러가지약제들에의한 ATP 수준의변화지방산의베타산화를증가시킨다고알려진약제인 bezafibrate 와 AICAR 그리고 LXR agonist 인 T 그리고미토콘드리아의 anaplerosis 를증가시켜주는약제인 BCH, Leu+Gln, KIC+MMS 와 cataplerosis 를막는약제인 BTA에의해서 HG/PA에의한 INS-1 세포사저해효과가뛰어난것을확인하였고, PC 저해제인 PAA에의해서는세포사를더욱악화시킨것을확인하였다. INS-1 세포에 HG/PA 처리에의해점차 ATP 수준이감소하는데이때위의약제들에의해 ATP 수준의감소를저해하는지확인하였다. INS-1 세포를 RPMI 1640 배양액에하루동안배양한후 25 mm 포도당이포함된배양액으로교체해주고여기에위의여러약제들을첨가해주었다. 그후 400 μm palmitate 를처리하여 18시간후에 CellTiter-Glo Luminescent cell viability assay 방법으로세포의 ATP 수준을측정하였다. 그결과 HG/PA에의해 INS-1 세포의 ATP 수준이 40% 로나타났고, 지방산의베타산화를촉진시키는 bezafibrate 와 AICAR에의해서 ATP 수준이 91%, 69% 로나타났고, T 에의하여 ATP 수준이 89% 나타났으며미토콘드리아의 anaplerosis 를증가시켜주는 BCH에의해 ATP 수준이 75%, Leu+Gln 에의해 54%, KIC+MMS 에의해 77% 로나타났다. 미토콘드리아에서생성된 citrate 를세포질로의유출을저해하는 BTA에의해 ATP 수준이 75% 로나타났다. 반면 PC 저해제인 PAA에의하여 INS-1 세포의 ATP 수준은 27% 로나타났다

63 Fig. 19. Effects of beta oxidation, TG accumulation, TCA cycle related molecules on ATP levels in HG/PA treated INS-1 cells INS-1 cells were pretreated with 25 mm glucose and several metabolism inhibitors and anaplerotic/cataplerotic fuels and inhibitors for 30 mins before adding 400 μm palmitate. After incubating for 18 hrs, total ATP levels were determined by ATP assay. Values are means ± S.E. * P < 0.05, ** P < 0.01 versus HG+PA

64 E. OLETF islets 에서 HG/PA 에의한세포사 당뇨병동물모델인 OLETF의 islets 에서도 INS-1 세포에서와같이 HG/PA에의한세포사가나타나는지를확인하였다. OLETF의 islets 을분리하고 trypsin 을처리하여 islets 을단일세포로만들어 96 well plate에분주하여 2일동안 RPMI 1640 배양액에배양하였다. 그후에 5 mm 포도당또는 25 mm 포도당농도에서 400 um palmitate 를처리하여 36시간동안배양하여 islets 에서세포사가일어나는것을현미경으로관찰한후 MTT assay 방법으로세포의생존율을확인하였다. 그결과 400 μm palmitate 을처리하였을때 5 mm 포도당농도에서보다 25 mm 포도당농도에서세포의생존율이감소하는것을관찰하여 OLETF islets 에서도포도당 / 지방산독성이나타나는것을확인하였다. ATP 수준또한세포의생존율과같은양상으로 400 μm palmitate 를처리하였을때 5 mm 포도당농도에서보다 25 mm 포도당농도에서더욱감소하는것을확인하였다. 그리고 INS-1 세포에서세포사멸억제효과가뛰어났던여러가지약제 (bezafibrate, T , BCH, BTA) 를 HG/PA와함께 OLETF islets 에처리하여 MTT assay 로세포의생존율을확인한결과이약제들에의해 OLETF의 islets 에서도 HG/PA에의한세포사를저해하는효과가나타났다 (Fig 22)

65 Fig. 20. Effects of HG/PA on viability and ATP levels in pancreatic islets in OLETF rat model Islets were isolated and dissociated as described Materials and Methods. Dissodiated islet cells were pretreated 5 mm and/or 25 mm glucose in presence of 0.5 mm bezafibrate or 1 μm T or 10 mm BCH or 5 mm BTA for 30mins before adding 0.1% BSA(con) or 400 μm palmitate for 36 hrs. Cell viability was determined by MTT assay (A). Total ATP level was determined by ATP assay (B)

66 Ⅳ. 고찰 제2형당뇨병은말초조직에서의인슐린저항성뿐만아니라인슐린을분비하는췌장베타세포의기능이상및양적감소로인한인슐린부족이동반되어발병하는것으로인식하고있다. 특히베타세포가고혈당과고지질에지속적으로노출되게되면베타세포에독성을나타내게된다. 본실험에서는백서의베타세포주인 INS-1 베타세포에서고농도의포도당과포화지방산인 palmitate 의지속적인노출에의해유발되는세포사의원인과그작용기전을규명하고자하였다. A. HG/PA 에의한 INS-1 세포사증가 백서의베타세포주인 INS-1 세포는 400 μm palmitate 의농도에서포도당농도에의존적으로세포의생존율이감소하였다. 또한이조건에서포도당농도에의존적으로대표적인세포사단백질인 caspase 3 와 PARP 가활성화되었다. 또다른세포사의커다란특징으로세포의핵이응축되는데 HG/PA 를 18 시간처리하였을때핵이응축되는것을 DAPI 염색을통해확인하였으며 DNA fragmentation 이증가하는것을확인하여 HG/PA 에의해 INS-1 세포는 apoptosis 로세포사가일어난다는것을확인하였다. B. HG/PA 에의한 INS-1 세포사에서산화적스트레스, 스트레스신호, ER stress, Calcium, 지방산대사의영향 현재까지포도당 / 지방산독성에의한베타세포기능이상의주요기전으로 ROS 또는 NO 에의한산화적스트레스, JNK 신호와같은스트레스신호와 ER 스트레스

67 의활성이알려져있다. 또한지방대사의활성으로생성되는지방대사중간산물들이베타세포에독성을나타낸다고알려져있다 (Penrki 등, 2006). 본연구에서는지속적인고농도포도당과지방산에의해유도되는 INS-1 세포사의작용기전을확인하기위하여기존에알려져있는베타세포의세포사에관여하는매개인자가 HG/PA에의한 INS-1 세포사에관여하는지여러가지약제들을이용하여확인하였다. 이때산화적스트레스와스트레스관련신호는 HG/PA 에의한 INS-1 세포사에크게관여하지않았다. 최근 ER stress 와 Ca 2+ 신호가지방산에의한베타세포의세포사에작용하는중요한매개인자로알려져있다. Ca 2+ 은세포의생존을조절하는데중요하게작용하고항상성이깨지게되면세포내에지속적으로 Ca 2+ 농도가올라가게되어세포사를유도하게된다. HG/PA 에의한세포사에서 ER stress 관련약제 chemical chaperon 인 4-PBA 와여러가지 Ca 2+ 관련저해제들에의해세포사를일부저해하는것을확인하여 ER stress 와 Ca 2+ 이 HG/PA 에의한 INS-1 세포사에어느정도관여할것으로추정된다. 베타세포가포도당과지방산에노출되면지방합성경로가활성화된다. 지방합성경로에관여하는여러가지저해제또는촉진제를 HG/PA 와함께처리하여세포의생존율을확인한결과지방산의베타산화를촉진시킨다고알려진약제인 bezafibrate, AICAR에의해서는세포사저해효과가나타났고, CPT-1 의작용을저해하여베타산화를억제시키는약제인 etomoxir 와 bromopalmitate 에의해서는세포사를유도하여 HG/PA에의한 INS-1 세포사에지방산의베타산화가중요하게작용할것으로추정된다. 또한 HCA에의해 acetyl-coa 합성을저해하여 LC-CoA 합성경로를차단시켰을때세포사저해효과가나타났지만 ACC 저해제인 TOFA에의해서 malonyl CoA 합성을저해하여 LC-CoA 합성경로를차단하였을때는세포사가더일어났고 FAS 저해제인 cerulenin 에의해서약간의세포사저해효과가나타난사실로보아 LC-CoA 합성이 INS-1 세포에서꼭독성을나타낸다고볼수없었다. 또한지방대사중간산물들의생성에의해만들어지는신호가베타세포에독성을나타내는지확인하기위해, 첫번째로 cholesterol 합

68 성을저해하는 lovastatin 을처리하였을때세포사저해효과가나타나기보다세포사를더촉진시켰다. 이것은기존에 cholesterol 합성이베타세포에독성을가져온다고알려진사실과다르게나타난사실이다. 두번째로 ceramide 합성을저해하는 fumonisin B1에의해세포사저해효과가나타났고, PKC 저해제인 GF109203x 에의해서도세포사저해효과가나타났다. ceramide 합성과 PKC 활성이베타세포에독성을나타낸다는기존의보고에어느정도일치하는결과이다. 또한 TG를 FFA로분해시키는지방분해효소 HSL (hormone sensitive lyase) 저해제인 olristat 에의해서세포사를더욱악화시킨것은 TG store 에서 FFA로분해되고다시 TG로축적되는 cycle 이 HG/PA 에의한 INS-1 세포사에중요하게작용할것이라생각된다. 그리고 LXR agonist 인 T 에의해 LXR이활성되면 ADD1, FAS 등의지방합성유전자의발현을조절하게되고, TG를증가시키게된다. 이러한작용으로 T 에의하여베타세포내지방합성경로가활성화되어질때 T 은 HG/PA에의한 INS-1 세포사를촉진시킬것으로예상하였다. 그렇지만 T 에의해세포사멸저해효과가뛰어나게나타난것은가장흥미로운사실이다. 위의사실들을종합해보면지방합성경로의활성화가베타세포에독성을가져오는데결정적인역할을할것이라고생각되지않는다. 반면지방산의베타산화와 TG/FFA 의순환이베타세포세포사에중요하게작용하는것으로확인하였다. C. HG/PA 에의한 INS-1 세포사에서지방합성과의연관관계 T 에의해지속적으로 LXR이활성화되면지방이축적되어베타세포에지방산독성 (lipotoxicity) 이나타난다고알려져있다 (Choe 등, 2007). 그렇지만위의결과에서보았듯이 HG/PA와함께 T 을처리하여지방합성을유도하였을때 HG/PA에의한 INS-1 세포사를유도하기보다오히려세포사를억제하는효과가뛰어났다. T 에의해지방합성경로가활성화되는지확인하

69 기위해 INS-1 세포에 HG/PA와함께 T 을처리하여 TG 염색을수행한결과 3일후에 TG가축적되는것을확인하였고, 세포내에서지방합성관련유전자의발현의증가는하루만에일어나는것을확인하여 HG/PA와함께 T 에의하여 INS-1 세포에서지방합성이활성화되는것을확인하였다. 또한 HG/PA처리에의해 INS-1 세포에서지방합성이활성화될것으로예상하였지만지방합성관련유전자인 FAS, ACC의 mrna 발현양이시간에따라점차감소하는것을확인하였다. 이결과로 HG/PA에의해지방합성경로가활성화되지않지만세포사가진행되는것을알수있었다. 또한 T 에의해지방합성경로를유도하더라도 INS-1 세포에독성을나타내지않았고, 오히려세포사멸을저해하는효과가나타나는것을확인하였다. 결론적으로지방합성경로의활성화가 INS-1 세포의세포사를유도하는데결정적인역할을하지않는것으로확인하였다. D. HG/PA 에의한 INS-1 세포사에서미토콘드리아의대사이상 지방합성경로의활성이 HG/PA 에의한 INS-1 세포사에크게관여하지않는것을확인하여지방합성경로의전단계에존재하는미토콘드리아대사에이상이있을것으로추측하였다. 포도당과함께 TCA 회로의 anaplerosis 를증가시켜주는여러가지아미노산들은베타세포에서인슐린분비를증진시킨다고알려져있다 (Michael, 2006) 그러나 TCA 회로의 anaplerosis 와베타세포에서포도당 / 지방산독성과의연관관계는아직밝혀진것이없다. HG/PA 에의한 INS-1 세포사에서미토콘드리아대사이상에의한에너지부족이세포사를유도한다면이때외부에서미토콘드리아의대사를원활하게해주는공급원을보충해주었을때세포사멸저해효과가나타나는지확인하였다. 그결과 INS-1 세포에 HG/PA 와함께 leucine 의 analogue 인 BCH, leucine 과 glutamine 그리고 KIC와 MMS를더해주어 anaplerosis input 을증가시켰을때와미토콘드리아에서대사된 citrate 의세포질로의유출을저해하여 cataplerosis

70 output 을감소시켰을때 HG/PA 에의한 INS-1 세포사를저해효과가뛰어난것을확인하였다. 그러나 pyruvate 가 oxaloacetate 로전환되는데작용하는 PC(pyruvate carboxylase) 를저해하는 PAA 에의해서 HG/PA 에의한 INS-1 세포의세포사를더욱악화시키는사실을확인하였다. 이것으로 HG/PA 에의한 INS-1 세포사에미토콘드리아대사에서 anaplerosis 와 cataplerosis 의균형이매우중요하게작용하는것으로추정된다. 또한 HG/PA 에의해 TCA 회로의중간산물들이감소, pyruvate 산화감소와 palmitate 의베타산화의감소되어있는것을확인하여 HG/PA 처리에의해 INS-1 세포에서에너지를생산하는대부분의경로가차단되어있다고생각하였고시간의경과에따라 ATP 수준이감소하는것을확인하였다. 이때외부에서지방산의베타산화를촉진시켜주는약제인 bezafibrate, AICAR 와세포사저해효과가가장컸던 T 과미토콘드리아의 anaplerosis 를증가시켜주는 BCH, KIC+MMS 와 cataplerosis 를저해하는 BTA 에의해 HG/PA 에의한 INS-1 세포에서 ATP 수준이감소하는것을막았다. 결론적으로 INS-1 세포에서지방산의베타산화뿐만아니라 TCA 회로의 anaplerosis/cataplerosis 의균형이세포내에너지를생산하는데매우중요하게작용한다고추정된다

71 Ⅴ. 결론 고농도포도당과지방산의지속적인노출에의하여 INS-1 세포에서포도당 / 지방산독성이나타났고이것은 apoptosis 를통한세포사로확인되었다. 포도당 / 지방산독성에의해베타세포의세포사에관여한다고알려진산화적스트레스, stress 신호는 INS-1 세포에서 HG/PA 에의한세포사에큰영향을미치지않았고, calcium 과 ER Stress 가 INS-1 세포에서 HG/PA 에의한세포사에일부관여하였다. 지방합성은 HG/PA 에의한 INS-1 세포사에서결정적인역할을하지않았고, 지방산의베타산화감소와미토콘드리아의대사이상에의한에너지부족이 apoptosis 를통한세포사를유발하는것으로추정된다

72 참고문헌 1. Bandyopadhyay GK, Yu JG, Ofrecio J, Olefsky JM: Increased malonyl-coa levels in muscle from obese and type 2 diabetic subjects lead to decreased fatty acid oxidation and increased lipogenesis; thiazolidinedione treatment reverses these defects. Diabetes 55: , Borradaile NM, Han X, Harp JD, Gale SE, Ory DS, Schaffer JE: Disruption of endoplasmic reticulum structure and integrity in lipotoxic cell death. J Lipid Res 47: , Broderick TL, Quinney HA, Lopaschuk GD: Carnitine stimulation of glucose oxidation in the fatty acid perfused isolated working rat heart. J Biol Chem 267: , Carobbio S, Ishihara H, Fernandez-Pascual S, Bartley C, Martin-Del-Rio R, Maechler P: Insulin secretion profiles are modified by overexpression of glutamate dehydrogenase in pancreatic islets. Diabetologia 47: , Chen N, Liu L, Zhang Y, Ginsberg HN, Yu YH: Whole-body insulin resistance in the absence of obesity in FVB mice with overexpression of Dgat1 in adipose tissue. Diabetes 54: , Civelek VN, Deeney JT, Shalosky NJ, Tornheim K, Hansford RG, Prentki M, Corkey BE: Regulation of pancreatic beta-cell mitochondrial metabolism: influence of Ca2+, substrate and ADP. Biochem J 318: , Cnop M, Hannaert JC, Hoorens A, Eizirik DL, Pipeleers DG: Inverse relationship between cytotoxicity of free fatty acids in pancreatic islet cells and cellular triglyceride accumulation. Diabetes 50: ,

73 8. Doh KO, Kim YW, Park SY, Lee SK, Park JS, Kim JY: Interrelation between long-chain fatty acid oxidation rate and carnitine palmitoyltransferase 1 activity with different isoforms in rat tissues. Life Sci 77: , Donath MY, Ehses JA, Maedler K, Schumann DM, Ellingsgaard H, Eppler E, Reinecke M: Mechanisms of beta-cell death in type 2 diabetes. Diabetes 54:S108-S113, Eitel K, Staiger H, Rieger J, Mischak H, Brandhorst H, Brendel MD, Bretzel RG, Häring HU, Kellerer M: Protein kinase C delta activation and translocation to the nucleus are required for fatty acid-induced apoptosis of insulin-secreting cells. Diabetes 52: , El-Assaad W, Buteau J, Peyot ML, Nolan C, Roduit R, Hardy S, Joly E, Dbaibo G, Rosenberg L, Prentki M: Saturated fatty acids synergize with elevated glucose to cause pancreatic beta-cell death. Endocrinology 144: , Elghazi L, Balcazar N, Bernal-Mizrachi E: Emerging role of protein kinase B/Akt signaling in pancreatic beta-cell mass and function. Int J Biochem Cell Biol 38: , Farfari S, Schulz V, Corkey B, Prentki M: Glucose-regulated anaplerosis and cataplerosis in pancreatic beta-cells: possible implication of a pyruvate/citrate shuttle in insulin secretion. Diabetes 49: , Fischer Y, Böttcher U, Eblenkamp M, Thomas J, Jüngling E, Rösen P, Kammermeier H: Glucose transport and glucose transporter GLUT4 are regulated by product(s) of intermediary metabolism in cardiomyocytes. Biochem J 321: ,

74 15. Folmes CD, Lopaschuk GD: Role of malonyl-coa in heart disease and the hypothalamic control of obesity. Cardiovasc Res 73: , Fransson U, Rosengren AH, Schuit FC, Renström E, Mulder H: Anaplerosis via pyruvate carboxylase is required for the fuel-induced rise in the ATP:ADP ratio in rat pancreatic islets. Diabetologia 49: , Gleason CE, Lu D, Witters LA, Newgard CB, Birnbaum MJ: The role of AMPK and mtor in nutrient sensing in pancreatic beta-cells. J Biol Chem 282: , Guay C, Madiraju SR, Aumais A, Joly E, Prentki M: A role for ATP-citrate lyase, malic enzyme, and pyruvate/citrate cycling in glucose-induced insulin secretion. J Biol Chem 282: , Gunawardana SC, Liu YJ, Macdonald MJ, Straub SG, Sharp GW: Anaplerotic input is sufficient to induce time-dependent potentiation of insulin release in rat pancreatic islets. Am J Physiol Endocrinol M etab 287: E828-E833, Herrero L, Rubí B, Sebastián D, Serra D, Asins G, Maechler P, Prentki M, Hegardt FG: Alteration of the malonyl-coa/carnitine palmitoyltransferase I interaction in the beta-cell impairs glucose-induced insulin secretion. Diabetes 54: , Hopkins TA, Sugden MC, Holness MJ, Kozak R, Dyck JR, Lopaschuk GD: Control of cardiac pyruvate dehydrogenase activity in peroxisome proliferator-activated receptor-alpha transgenic mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol 285: , Jensen MV, Joseph JW, Ilkayeva O, Burgess S, Lu D, Ronnebaum SM,