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1 J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 44(3), 314~323(215) 흑삼의열수및에탄올추출물의항비만효과 박혜진 1 김애정 2 전용필 3 이명숙 1,4 1 성신여자대학교비만과학연구소, 2 경기대학교대체의학대학원 3 성신여자대학교생명과학화학부, 4 성신여자대학교식품영양학과 nti-obesity Effects of Water and Ethanol Extracts of lack Ginseng Hye-Jin Park 1, e-jung Kim 2, Yong-Pil Cheon 3, and Myoungsook Lee 1,4 1 Research Institute of Obesity Sciences, 3 Division of Developmental iology and Physiology, School of iosciences and Chemistry, and 4 Department of Food and Nutrition, Sungshin Women's University 2 The Graduate School of lternative Medicine, Kyonggi University STRCT lack ginseng was made by steaming raw white ginseng nine times at 1 C for 2 h and drying. We then performed pilot experiments using the nine black ginseng extracts for different steaming and drying times to determine their anti-obesity effects. Two ginseng extracts, steaming and drying five times (FSFD) and steaming and drying nine times (NSND), prepared in water or ethanol solution decreased lipid accumulation of 3T3-L1 cells. FSFD in water and ethanol extracts showed higher levels of ginsenosides, in particular, Rh1, Rg2, and Rb1 than NSND, and levels of the three ginsenosides were higher in ethanol extracts than in water extracts. Treatment with FSFD and/or NSND in ethanol extracts significantly regulated PPRγ, C/EPα and MPK phosphorylation in 3T3-L1 cells. We verified doubling time of stem cells from both abdominal fat and subcutaneous fat after FSFD and NSND in ethanol and water extracts were added. lthough addition of FSFD and NSFD in water extracts had no effects on proliferation, ethanol extracts with FSFD and NSND increased doubling time of stem cells in subcutaneous fat. FSFD and NSND in ethanol extracts more effectively reduced adipogenesis compared to those in water extracts. FSFD in ethanol extracts promoted secretion of anti-inflammatory cytokine such as IL-1 and depressed MCP-1 infiltration in 3T3-L1 preadipocytes co-cultured with RW264.7 cells. We concluded that FSFD and NSND ethanol extracts may be developed as a functional food for its anti-obesity effect, but anti-inflammatory effect was shown in ethanol extracted FSFD rather than in NSND. Key words: black ginseng, obesity, inflammation, macrophages M1 & M2 phenotypes 서 비만은체지방조직의증가및지방세포의비대증상에의한질병으로에너지섭취와소비의불균형, 호르몬이상, 유전체이상, 불규칙한생활습관등여러가지원인이제시되고있다. 따라서체지방증가는당뇨병을포함한대사증후군및동맥경화, 간경화, 암, 뇌졸중및암발병의중요한위험인자이다 (1,2). 우리나라의경우 1998년에비하여 213년의비만율은 26.2% 에서 31.8% 로, 대사증후군의증가율은 24.9% 에서 31.9% 로빠르게동반상승하고있다. 여러가지원인중빠른경제성장, 패스트푸드소비증가및운동결핍등환경인자외에도가족력, 인종간유전체등도제안되고있어서비만및대사증후군과관련된기전은매우다양하다 (3-6). 게다가지방조직은에너지대사및호르몬대사의 Received 5 November 214; ccepted 2 December 214 Corresponding author: Myoungsook Lee, Department of Food and Nutrition, Sungshin Women's University, Seoul , Korea mlee@sungshin.ac.kr, Phone: 론 조절이외에도면역체계조절에도영향을받는다 (7-9). 면역체계와지방조직의관련성연구를토대로대식세포와지방조직간 cytokines을매개로한상호작용이염증발생과지방조직분화를주도하므로비만을지속성염증상태로간주하기도한다. 이러한염증상태는지방조직내에 pro-inflammatory cytokines의주된공급원인면역세포역할에의해대사성질환을유발하게된다고알려져있다 (1-13). 따라서비만과염증, 지방조직과면역체계, 지방세포와면역세포와의관련기전연구를위하여새로운비만기전연구모델이필요한시점이라생각된다. 현재로는심도있는면역기능과지방세포분화관련기전연구가필요하지만염증유도성비만을확인하는데매우중요한지표로사용되는대식세포의표현형은 M1(classically activated macrophage, pro-inflmatory macrophage) 과 M2(alternatively activated macrophage, anti-inflammatory macrophage) 두가지가있다. 인삼은 2년전부터중국뿐만아니라아시아전역에널리사용된한약재중의하나이다. 인삼의생리활성은항

2 흑삼의열수및에탄올추출물의항비만효과 315 암, 면역, 신경, 항당뇨등의작용으로알려져있는데 (14-17), 현재우리나라에서는인삼을가공하여홍삼의형태로많이이용되고있다. 인삼의경우홍삼시장이장악하고있으나연간 35억의세계인삼시장을확대하기위하여항암및면역력증강등다양한기능성인삼제품을위한신기술이개발중이다. 한약재가공방법중에서홍삼및흑삼의제조기술인구증구포 ( 九蒸九曝 ) 법은인삼을아홉번의증숙과건조과정으로열, 숙성, 분해과정에서인체에유용한생리활성성분이다량생성되는고난도기술이다. 이러한가공인삼은수치법을달리함으로써주요약효성분인인삼사포닌 (ginsenoside) 의종류와함량이달라진다. 지금까지홍삼과백삼으로부터분리한 ginsenosides는각각 32종및 24종이밝혀져있고, 최근에는인삼가공법이발전함에따라백삼이나홍삼중일반 ginsenosides를특정기능을갖는 ginsenoside로구조를전환시킬수있는물리적, 화학적, 생물학적처리방법등이개발되고있다 (18-2). 인삼가공의수치법에따른주요유효성분의변화를조사한연구에서그함량및조성이다양하게변화한다는것을밝혔다 (21,22). 고려인삼 6년근을구증구포한연구결과에서는조사포닌함량의차이는없었으나 PPD 계열인 Rb1, Rb2, Rc, Rd와 PPT 계열인 Re, Rg1 등은가공후급격히감소한반면 Rh1, Rg3, Rk1 등은가공후증가하였다고보고되고있다 (23). 중국에서는암세포성장에필수적인신생혈관유도인자인 VEGF를억제하는 Rg3을임상허가받아항암제보조제로써암환자들에게사용하고있다 (24). 또한 Rg3의항비만효과는지방세포분화과정에서지방축적을억제하고, ap2 와 GPDH를감소시킴으로써 adipogenesis를억제시킨다는기전으로알려져있다 (25). 또한고지방식이로비만을유도한쥐에게 Rh1을처리하면지방세포분화와염증을감소시킴으로써비만을개선시킬수있다는연구결과가보고되었다 (26). 그러나국내에서는 체지방감소 기능성식품은다양하지만개별인정형원료로는단지 13건에불과하며게다가이러한소재는외국에서이미검증된소재이므로국내기술로개발된신규기능성소재가시급한시점에서향후백삼또는홍삼과차별화되는새로운약리효능성물질의연구대상으로부가가치가높은소재로흑삼의가능성을전망해보고자한다. 따라서본연구에서는 6년생과 ginsenosides 함량차이가크지않는 4년생고려인삼을이용하여한약재가공방법중고난도기술인구증구포법에의하여생성된흑삼 1포부터 9포를각각열수및에탄올추출물로제조하여지방전구세포 (3T3-L1), 대식세포 (RW246.7) 및지방유래줄기세포 (stem cell) 를이용하여다양한항비만효과를검증하고자한다. (1~9포) 을각각열수및 7% 에탄올로추출하여 ginsenoside별함량을 HPLC(lliance 2695, Waters Corporation, Milford, M, US) 로측정하였으며제조한추출물 1 mg을 1 ml로표준원액을만들어각표준원액 1 μl씩취하여분석한다. 칼럼은 XtorraRMS C mm 15 mm(waters Corporation) 를사용하였다. 이동상으로사용한 용매는 18% 아세토니트린 (in.1% 초산 ), 용매는 8% 아세토니트린 (in.1% 초산 ) 이었다. 용매는 gradient elution system으로 분 (%-), ~32분 (%-), 32~65분 (2%- ), 65~8분 (2%-), 8~98분 (1%-), 98~13분 (1%-), 13~15분 (1%-), 15~115분 (1%-) 으로조절하였다. 칼럼온도는 4 C였고, 유속은.25 ml/ min, UV 검출기 (Waters 2996 Photodiode rray Detector, Waters Corporation) 로 ginsenosides의성분을분석하였다. Fig. 1은 ginsenosides 표준품의 HPLC 결과이다. 3T3L-1 세포배양지방전구세포인 3T3-L1 세포는 merican Type Culture Collection(TCC, Manassas, V, US) 에서구입하여 37 C, 5% CO 2 incubator에서 Dulbecco's modified 재료및방법 흑삼의 ginsenosides 함량분석 4년생고려인삼을이용하여구증구포법으로발효한흑삼 Fig. 1. HPLC standard of ginsenosides of black ginseng.

3 316 박혜진 김애정 전용필 이명숙 Eagle's medium(dmem)(welgene, Daegu, Korea) 에 1 % CS(Welgene), 1% penicillin-streptomycin(welgene) 을공급하여 37 C, 5% CO 2 배양조건하에서배양하였다. 3T3-L1의 adipocytes로유도하는방법은분화유도물질인 1 μm dexamethasone(dex, Sigma-ldrich Co., St. Louis, MO, US),.5 mm methylisobutylxanthine(imx, Sigma-ldrich Co.), 1 μg/ml insulin(ins, Sigma- ldrich Co.) 과 1% FS(Welgene) 가포함된 DMEM에서 8일동안배양하였다. 분화유도 2일째 1% FCS와 1 μg/ ml insulin 배양액으로추가배양을실시하였으며, 배지는이틀에한번씩교체하면서세포를배양하였다. 3T3L-1과 RW246.7 세포의공동배양법지방전구세포인 3T3-L1 세포는 cells/well로 seeding 하여 1% CS, 1% penicillin-streptomycin을공급하고 37 C, 5% CO 2 배양조건하에서배양하였다. 48 시간후분화를유도하기위해 1 μm DEX(Sigma-ldrich Co.),.5 mm IMX(Sigma-ldrich Co.), 1 μg/ml INS (Sigma-ldrich Co.) 와 1% FS(Welgene) 가포함된 DMEM(Welgene) 을사용하여배양하였다. 4일후대식세포인 RW264.7 세포를직접주입하여분화된 3T3-L1과함께배양하기시작하였다. 함께배양한지 48시간이지난후에탄올추출물인흑삼 5포와 9포를각각처리하여배지를수합하여서염증성사이토카인을측정하였다. 세포독성검사 (cell viability assay) Cell viability는 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide(mtt)(duchefa, Haarlem, Netherlands) reagent를사용하여측정하였다. 지방세포는 96-well plate에 plating 하였다 (4 1 4 cells/ml). 24시간후에추출물을처리하였고, 5 mg/ml MTT solution 1 μl 를각 well(.1 mg/ml) 에더하였고 3시간동안배양하였다. 상층액은제거하고각 well에서 formazan crystals은 2분동안 1 μl dimethyl sulfoxide(dmso, Sigma-ldrich Co.) 에녹이고, microplate reader(io-rad, Hercules, C, US) 를이용하여 57 nm에서흡광도를측정하였다. 지방축적검사 (Oil Red O staining) 분화완료된 6-well plate의배지를제거한후 1 PS로 2회씻어주었다. 1% formalin 2 ml를넣고실온, 암실에서 1시간이상고정시켰다. Formalin을제거한후후드안에서완전히건조시켰다. Oil Red O Working Solution 1 ml 를넣고실온에서 1분동안염색하였고물로 2회씻어주었다. 사진을찍고후드안에서완전히말린다음 1% isopropanol 1 ml를넣고 Oil Red O solution을녹여 52 nm에서흡광도를측정하였다. 지방유래줄기세포의증식 (doubling time) 변화실험에사용한생쥐는 14시간명과 1시간암을유지하는표준사육조건에서사육되었고성신여자대학교연구윤리및실험동물사용규정에따라유지및처리되었다 ( 승인번호 : SSWU EC 211-1). 비만유도는고지방식이를 1주동안먹여유도하였다. 에탄올및열수추출물인흑삼 5포와 9포는비만유도후 2주간처리하였다. 이후대조군, 고지방식이, 고지방식이와 5포흑삼또는 9포흑삼추출물을함께먹인생쥐의피하지방조직, 복부지방조직을절취하였다. 이로부터기존방법을이용하여지방유래줄기세포인지방간충직세포 (mesenchymal cell) 를수획하였다. 수획된줄기세포는 1% FS(Welgene), 1 U/mL penicillin,.1 mg/ml streptomycin, 3.7 mg/ml sodium bicarbonate를첨가한 DMEM(Gibco, Grand Island, NY, US) 배양액을이용하여공기중 5% CO 2, 37 C 조건의배양기에서배양하면서 3~4세대까지계대를유지하였다. 계대시세포수를계수하여배수가되는시간을계산하여이를 doubling time으로하였다. RN extraction 분화가완료된 6-well plates에 well당 5 μl의 trizol (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, US) 을넣고 scraper로 cell을모은다. Lysis 된 sample을 e- tube에옮겨담고실온에서 5분동안배양한다. Trizol 1 μl당 2 μl의비율로 chloroform을넣고 15초동안잘섞는다. 실온에서 5분동안 incubation 후 4 C에서 13, rpm으로 15분동안원심분리한다. 상층액을새로운 e- tube로옮긴다. 동량의 isopropanol을넣고섞어준다. 실온에서 1분동안배양한후 4 C에서 13, rpm으로 15분동안원심분리한다. Pellet이생긴것을확인하고상층액을제거하여 1 ml의 75% cold ethanol로세척하고, 4 C에서 7,5 rpm으로 5분동안원심분리한다. 상층액을빼낸후 ethanol을없애기위해건조시킨다. DEPC water(rnasefree water) 3 μl를넣어 pellet을잘녹인다. RN sample을정량한다. DiaStar TM RT Kit(SolGent) 을사용하여 cdn를합성한다. PCR-tube에 total RN를 2~3 μg의농도가되게넣고 1 pmole Oilgo dt를 1 μl 넣고 DEPC water로 total volume을 1 μl로맞춘다. 65 C에서 5분동안 heating 시킨후즉시 ice로옮긴다. Pre-heating 한 product 1 μl에 5X RT Reaction uffer(included 1 mm dntp mix) 4 μl, 8 mm DTT 1 μl, DiaStar TM RTase 1 μl, DEPC water 4 μl를넣고 total volume을 2 μl로맞춘다. 부드럽게섞어준다음 5 C에서 1시간동안배양하고 95 C에서 5분동안불활성화시킨다. RT-PCR RT product(2 μl) 를 Taq DN polymerase를사용하여 PCR(25~3 cycle) 증폭시킨다 (denaturing at 94 C for 5

4 흑삼의열수및에탄올추출물의항비만효과 317 min, annealing at 55 C for 3~5 sec, extension at 72 C for 3~5 sec, 72 C 1 min, 4 C ). PCR이완료된 product를 Etr을포함하는 2% agarose gel에 5 μl씩 loading 하여전기영동하여결과를확인한다. dipocytokines 과염증인자분석세포의증식과지방축적이종료된배양 9일째수거된배지에서단핵구 / 대식세포에서분비되어지방세포의염증반응에서기여하는 M2(anti-inflammatory effects) 마커로 IL-1을, M1(pro-inflammatory effect) 마커로 IL-6을분석하여분화된지방세포의증식에지질축적현상이기여하는지확인하였다. 또한 3T3L-1에 insulin 처치 2일후 RW injection에의한 contact co-culture 후 9일째염증인자 M1형 (MCP-1) 과 M2형 (IL-1) 분비를살펴보았다. Western blot analysis 분화가완료된 DSCs는 5 mm Tris-Cl(pH 7.5), 15 mm NaCl, 1 mm dithiothreitol,.5% nonyl phenoxypolyethoxylethanol, 1% Triton X-1, 1% deoxycholate,.1% sodium dodecyl sulfate(sds), 1 mm ethylenediaminetetra acetic acid, 1 μm leupeptin, 1 μm pepstatin, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride,.1 μm aprotininprotein을포함하는 protein extraction solution(pro-preptm, intron iotechnology Inc., Seongnam, Korea) 에균질화하였다. 균질화된 samples은 3분동안 ice에방치하였고, 간헐적으로 vortex 기기로섞어주었다. 4 C에서 2분동안 13, rpm(16,69 g Micro 17 TR, Hanil, Incheon, Korea) 에원심분리하였다. 상층액은 8% SDS-polyacrylamide gel에분리되었고, wet transfer(io-rad) 법에의하여 28 m에서 2시간동안 NC membrane에단백질이이동할수있도록계획한후, membranes은 3% fat-free dry milk에서블라킹처리를하였고, oxidant sensing protein, polyclonal(1:1,) (iovision, Mountain View, C, US) 인 HO-1과 α-tubulin monoclonal 항체 (1:1,) 를이용하였다. Primary antibody는 secondary peroxidase conjugated anti-rabbit 또는 anti-mouse 항체 (1:1,) 를이용하였다. Immuno-positive bands는 enhanced chemiluminescence(elpis, Daejeon, Korea) 에의해감지되었다. 통계분석본연구에서나온실험결과는 National Institute of Health Image Software(NIH, ethesda, MD, US) 를이용하여분석하였다. 분석수치는평균과표준편차로나타내었고 t-test와 NOV을한후 onferroni post hoc test 에의하여 P<.5 수준에서유의성을검증하였다. Table 1. Composition of ginsenosides of black ginseng concentrates from water and ethanol extracts Ginsenoside H 2O extract 7% EtOH extract (mg/g) FSFD 1) NSND 2) FSFD NSND Rg1 Re Rf Rg2 Rh1 Rb1 Rc Rd Rg3 Rh 결과및고찰 흑삼 5포 /9포의열수및에탄올추출물의 ginsenosides 함량분석일반적으로홍삼과흑삼의 ginsenosides 비교결과로 Rg3, Rg2의증가를보고하였으나본연구실의경우처럼흑삼의찌고말리는반복과정에서의열수및에탄올추출물의비교는처음으로시도되었다. 즉구증구포흑삼 (1~9포) 을각각열수및 7% 에탄올로추출하여 ginsenoside별함량을 HPLC로측정한결과 5포와 9포의흑삼추출수율및 ginsenosides 유효성분의함량이높았기때문에흑삼제조시 5포와 9포를제조하여열수및 7% 에탄올추출물을본실험에사용하였다. 본실험에서사용된 HPLC 조건은 Table 1과같으며, 열수및에탄올추출모두에서 Rf, Rg2, Rb1, Rc, Rg3가흑삼 5포추출물에서가장높은것을알수있었다. 또한열수추출에비해 7% 에탄올추출에서대부분의 ginsenoside의추출수율이증가하였고, 특히 7% 에탄올추출에서 5포흑삼의추출수율및 ginsenosides(rf, Rg2, Rh1, Rb1, Rc, Rd, Rg3) 의유효성분의함량이높게나타났다. 그러나흑삼은제조과정이구증구포라는기본원칙만있을뿐찌거나말리는온도및시간등공정과정의표준화가미비한상태에서파우치혹은농축가공되어홍삼가공식품류로유통되고있어서안전성문제가대두되고있다 (27). 지방세포분화의지질축적및관련분화인자측정 Pre-adipocyte에서 adipocyte로분화하는과정에서 MDI와 insulin 등분화를유도시키는인자들을공급한후지방전구세포인 3T3-L1을 8일까지세포배양하여관찰하였다. dipocyte로분화하는동안지질축적 (Oil Red O staining) 및관련분화인자인 PPRγ(peroxisome proliferator-activated receptorγ) 와 C/EP(CCT/enhancer binding protein) 및지질분해효소인 HSL(hormone sensitive lipase) 을확인하였다. 즉 pre-adipocyte ) Ginseng extracts which were steamed and dried five times. 2) Ginseng extracts which were steamed and dried nine times.

5 318 박혜진 김애정 전용필 이명숙 Lipid accumulation (%) Preadipocyte dipocyte D Normalized intensity Preadipocyte dipocyte PPRγ C/EPα HSL Fig. 2. Change of mrn PPRγ, C/EPα, HSL, and lipid accumulation after differentiation. (,) fter adipocyte 3T3-L1 cells were differentiated by 8 days, lipid accumulation was determined using Oil Red O staining. (C, D) Expression of mrn PPRγ, C/EPα, HSL was measured by PCR method. Values are mean±sd. P<.5. 와비교하여보면 adipocyte에서 PPRγ 및 C/EPα 발현증가, HSL 발현감소등지질축적의증거를확인하였다 (Fig. 2). 흑삼의열수및에탄올추출물의세포독성측정본연구는구중구포법으로생성된흑삼 1~9포에서추출한열수및에탄올추출물을 ginsenosides 물질분석을하여생리활성이높은 5포와 9포추출물을 3T3-L1에처치하여지질축적 (adipogenesis) 의변화와세포독성을관찰하기로하였다. 이를위하여지방전구세포를성숙한지방세포로분화시키는과정에서흑삼추출물을처리하여비만예방효과의검증을시도하였다. 먼저세포생존율을조사하기위해각각의추출물에따라세포독성을확인한결과 1, μg/ ml까지고농도에서도세포독성이나타나지않았다. 지방세포가분화하는동안흑삼 5포와 9포의열수및에탄올추출물을다양한농도 (, 75, 15, 3 μg/ml) 로처리하여 3T3- L1 세포를배양하였으며, 지방세포분화가끝난후 Oil Red O 염색법을통해지질축적의변화를시험한결과, 농도의존적으로유의적인지질축적의감소를보였다 (Fig. 3). 이중 3 μg/ml의농도에서가장효과적으로지질축적감소의효과가나타나 3 μg/ml의농도로흑삼 5포와 9포의열수및에탄올추출물을처리하여 control군과비교하였을때열수및에탄올추출물인흑삼 5포와 9포모두각각 88.4%, 83.1%, 83.5%, 77.6% 로지질축적의감소를보였다 (Fig. 4). Oil Red O 염색을통해세포내 lipid droplet을염색한후흡광도를측정하여정량한결과에서는흑삼 5포와 9포의열수및에탄올추출물모두에서유의적으로감소하였다 (Fig. 4). 특히그중에서흑삼 9포에탄올추출물이가장효과적이었으며, 흑삼 5포와 9포의열수및에탄올추출물 3 μg/ml 처리시세포생존율을세포독성도조사 (MTT assay) 를통하여확인하였다. 세포생존율의변화는 control군과 비교한흑삼 5포와 9포의열수및에탄올추출물의처리군의 cell viability를백분율로표시하였다. 3T3-L1 세포의생존율은 control군과비교하였을때흑삼 5포와 9포의열수및에탄올추출물모두유의적인변화를관찰할수가없었다 (Fig. 4C). 따라서흑삼 5포와 9포의열수및에탄올추출처리는세포생존율을감소시키는독성효과는없으며, 미성숙한지방세포에서성숙한지방세포로분화되는과정에서지질축적을현저히억제하여비만의예방효과를기대할수있었다. 흑삼의열수및에탄올추출물에의한지질합성및지질분해관련인자들의발현흑삼 5포와 9포의열수및에탄올추출물고농도 (3 μg/ ml) 처리시 adipogenesis 관련인자들 (PPRγ, C/EPα) 과 MPK(MP-activated protein kinase) 인산화의발현에미치는영향을확인한결과 PPRγ의단백질발현감소는흑삼 9포에탄올추출물에서, C/EPα의 mrn 발현감소는흑삼 5포와 9포에탄올추출물에서효과적이었다 (Fig. 5, 5). 지방산산화를조절하는 MPK의인산화를관찰한결과 control군에비해열수추출물 5포와 9포, 에탄올추출물 5포와 9포는각각 2.19배, 3.9배, 3.98배, 6.35배증가하였다 (Fig. 5C, 5D). 미성숙한지방세포에서성숙한지방세포로분화하는과정에서세포내에서는다양한유전자발현의변화가일어난다. 여러가지지방세포의특이전사인자들중핵심적인전사조절인자인 C/EP와 PPRγ는지방세포가분화하는과정에서활성화된다 (28,29). 이전사인자들은이미 3T3-L1 지방세포에서 Rg3가 PPRγ 유전자발현을감소시키고 MPK를활성화시켜항비만효과를보여준결과가보고된바있다 (3). 반대로 ginsenoside R1의처리에의해 PPR γ2와 C/EPα를조절함으로써 adipogenesis를촉진시킨다

6 흑삼의 열수 및 에탄올 추출물의 항비만 효과 FSFD in water Lipid accumulation (%). Lipid accumulation (%) (μg/ml) Control 12 NSND in water 1 Lipid accumulation (%). Lipid accumulation (%). 8 Control 12 FSFD in EtOH (μg/ml) NSND in EtOH extracts which were steamed and dried five times; NSND, ginseng extracts which were steamed and dried nine times. Values are 4 2 mean±sd. P<.5. Control (μg/ml) Fig. 3. Lipid accumulation of black ginseng from water and ethanol extracts in dose-dependent manner. Inhibitory effect of black ginseng from water and ethanol extracts in 3T3-L1 adipocytes was measured using Oil Red O staining at 8 days. 3T3-L1 adipocytes were treated with, 75, 15, or 3 μg/ml of black ginseng extracts. FSFD, ginseng Control (μg/ml) 는 연구 결과도 발표되기도 하였다(31). 이처럼 지방세포에 비만에 중요한 역할을 한다(34). 지질대사에서 지방산 합성 서 ginsenosides를 처리하여 지질대사와 관련된 연구가 활 유도를 저해하는 MPK는 HepG2 cell에서 ginsenoside 발히 진행 중이다. 최근 홍삼에 대한 보급률이 점점 급증함 Re에 의해 활성화되어 지질과 포도당 대사를 향상시킬 수 에 따라 삼에 함유된 ginsenosides의 화합물을 추출하여 있다는 연구 결과가 보고된 바 있다(35). 또한 정상식이로 항비만 효과를 알아본 연구들도 늘어나고 있는 추세이다. 사육하는 흰쥐에게 흑삼 추출물을 투여하여 체중과 혈중 지 3T3-L1 지방세포에 ginsenosides 중 Rg3를 처리하여 질 농도를 측정한 결과 흑삼 추출물 투여군에서 체중 증가 지질축적을 감소시키고 HepG2 cells에서 Rg3가 MPK를 억제효과를 나타내었으며, 체지방 감소 및 혈액 내 중성지방 활성화시켜 지질축적을 억제한다는 연구 결과들이 보고되 함량이 감소되었다고 보고하였다(36). 본 연구에서는 3T3- 었다(32,33). 세포 내 에너지 항상성을 유지하기 위한 핵심 L1 지방세포가 분화하는 동안 흑삼 5포와 9포의 열수 및 적인 조절자로서 이미 널리 알려져 있는 MPK는 당뇨와 에탄올 추출물 모두 지질축적 억제효과가 나타났다. 그러나

7 32 박혜진 김애정 전용필 이명숙 Lipid accumulation (%). % of control. C Control FSFD NSND FSFD NSND water EtOH 3 μg/ml PPRγ Control FSFD NSND FSFD NSND water EtOH 3 μg/ml C Cell Viability (%). % of control. D % of control Control FSFD NSND FSFD NSND water EtOH 3 μg/ml C/EPα Control FSFD NSND FSFD NSND water EtOH 3 μg/ml p-mpk/mpk Control FSFD NSND FSFD NSND water EtOH 3 μg/ml Fig. 4. Lipid accumulation and cell viability of black ginseng from water and ethanol extracts. () Inhibitory effect of lipid accumulation was determined with treatment of black ginseng from water and ethanol extracts using Oil Red O staining. () Spectrophotometric quantification of Oil Red O stained 3T3-L1 with black ginseng extracts was measured at 8 days. (C) Cell viability was determined using MTT assay. FSFD, ginseng extracts which were steamed and dried five times; NSND, ginseng extracts which were steamed and dried nine times. Values are mean±sd. P<.5. Fig. 5. Expression of PPRγ, C/EPα, MPK phosphorylation by black ginseng from water and ethanol extracts. () Level of PPRγ in 3T3-L1 cells with treatment of 3 μg/ml of black ginseng from water and ethanol extracts was measured using western blotting. () mrn level of C/EPα was determined using PCR. (C) Expression of MPK phosphorylation was observed using western blotting. (D) Level of p-mpk/mpk was analyzed by western blotting (graph of Fig. 5C). FSFD, ginseng extracts which were steamed and dried five times; NSND. ginseng extracts which were steamed and dried nine times. Values are mean±sd. P<.5. 그중에서도흑삼 9포에탄올추출물이 p-mpk 활성을증가시켰고 C/EPα와 PPRγ 발현감소효과가가장좋았다. 흑삼 5포열수및에탄올추출물중에서는에탄올추출물에서만 C/EPα 감소및 p-mpk 증가를보여주었는데 Rg3 외에도지방세포분화와염증을감소시키는 Rh1의증가또한항비만효과를보충한것으로보인다. 따라서흑삼의항비만효과는열수추출물보다에탄올추출물이, 5포보다 9 포흑삼이지질축적억제및지질분해증가와관여한인자들에영향을주는것을알수있다. 이는 5포보다 9포에서증가한특이한 ginsenosides를발견하지못하였기때문에에탄올추출물에서증가한 Rh1, Rg2, Rf 등의혼합적인효과를기대해볼수있겠다. 에탄올추출물인흑삼에의한염증인자의변화 3T3-L1 지방세포와 RW264.7 대식세포의 co-culture 실험으로흑삼 5포및 9포에탄올추출물을처리한결과, 에탄올추출물인흑삼 5포의경우농도가증가할수록 proinflammation 인자인 M1(MCP-1) 은변화가거의없었으나 anti-inflammation 인자인 M2(IL-1) 는 M1보다더높은증가를보여주었다 (Fig. 6). 그리고에탄올추출물인흑삼 9포의경우는큰차이가없었다. 이는단일세포인 3T3-L1 지방세포에에탄올추출물인흑삼 5포를처리한경우 M1과 M2 각각의경향에대한해석이모호하였다. 그러나 coculture 후 RW264.7 대식세포와 3T3-L1 지방세포의상호작용을확인한결과 M2형이더우세하다는결과로에탄

8 흑삼의열수및에탄올추출물의항비만효과 321 역학적변화로염증성사이토카인인 IL-4, IL-6, IL-8, IL-13, MCP-1 등의분비를촉진하였다 (41). 본연구에서는지질축적및지질대사에효과적인에탄올추출물인흑삼 5포와 9포를이용하여지방세포와대식세포를 co-culture 한결과흑삼 5포에탄올추출물의경우에는 M1(MCP-1) 보다 M2(IL-1) 가증가되어비만에의해유발된염증을감소시킬수있는가능성을발견되었다. 즉에탄올추출물인흑삼 5포가염증성사이토카인분비를억제하였고이는항염증효과로이어질수있을것이라생각된다. Fig. 6. Change of anti- and pro-inflammation with treatment of black ginseng from ethanol extracts in co-cultured cells. 3T3-L1 adipocytes and RW264.7 macrophage cells were treated with black ginseng from ethanol extracts. Expression of IL-1 (M2) and MCP-1 (M1) were observed in co-cultured cells. 올추출물인흑삼이항염증의역할에더크게영향을미치는것으로나타났고, 또한이실험으로인해지방세포증식에대식세포 M1과 M2가미치는상호영향을관찰하기에적절하였다. 한편비만은만성염증과의밀접한관계를가지는것으로보고되면서이런염증상태는지방조직내에서 cytokines을분비함으로써면역세포들과의상호작용에의해심각한대사성질환 ( 제2형당뇨병및심혈관계질환 ) 및합병증을유발하는것으로알려져있다 (37,38). 따라서비만과염증, 지방조직과면역체계, 지방세포와면역세포와의관련된연구들이활발히진행중이다 (39). 대장암및대식세포 (colon 26-M3.1) 를이용하여흑삼이항암효과뿐만아니라항염작용도우수하다는것을증명하였다 (4). 특히아토피질병을유발하는진드기 (Dermatophagoides pteronyssinus) 추출물을사람의단핵구와호산구에처리한다음흑삼추출물을처치하면아토피관련사이토카인분비를억제하는작용이알려졌다. 아토피는 Th 1 세포 /Th 2 세포의불균형에의한면 지방줄기세포의 doubling time 변화대조군, 고지방식이만을준그룹, 지방식이에에탄올흑삼 5포를함께준그룹의피하지방에서유래한줄기세포의경우시작단계의 doubling time은모든군에서유사하였으나계대가진행되면서고지방식이와 5포흑삼에탄올추출물을섭취한군의피하지방줄기세포의 doubling time이연장되었다 (Fig. 7). 복부지방의경우 P에서대조군의 doubling time에비하여고지방식이를섭취한두군모두에서짧았으며, in vitro에서계대를유지하는동안에그정도를계속유지하였다 (Fig. 7). 열수및에탄올추출물인흑삼 5포나 9포추출물이지방줄기세포의증식에미치는영향에대한연구는본연구를통하여최초로시도되었다. 에탄올추출물인흑삼 5포는복부지방줄기세포, 에탄올추출물인흑삼 9포는피하와복부지방줄기세포의증식속도에유의한경향을보였다. 에탄올추출물 5포에노출된줄기세포는계대가길어질수록 doubling time 이증가하여줄기세포의증식정도의감소가관찰되었다. 한편에탄올추출물 9포에노출시키는동안피하지방줄기세포의증식정도가억제되어 doubling time이길어졌으며, 계대를유지하는동안대조군의증식속도와같아져원상태로의회귀를예측할수있었다. 복부지방줄기세포의경우에있어서는에탄올추출물인 9포의노출과이후계대 C D Fig. 7. Effect of black ginseng in ethanol extracts in stem cells from subcutaneous and abdominal fat in mice. Stem cells from subcutaneous (,C) and abdominal fat (, D) in mice were treated with black ginseng from ethanol. Doubling time was observed by black ginseng extracts in stem cells.,# P<.5.

9 322 박혜진 김애정 전용필 이명숙 과정에서고지방식이만을한것에비하여줄기세포증식정도가낮았다. 이는에탄올추출물흑삼 5포와 9포가부위에따른지질축적억제에효과가있음을의미한다. 요 본연구는구중구포법과정의흑삼 1~9포를대상으로열수및 7% 에탄올추출물의 ginsenosides을분석한결과생리활성이높다고판단한흑삼 5포와 9포열수및에탄올추출물을각각 3T3-L1 지방세포, RW264.7 대식세포, 지방유래줄기세포에처치하여세포독성, 지질축적 (adipogenesis) 및염증인자변화를관찰하였다. 본연구에서는열수추출물보다에탄올추출물흑삼에서효율적으로 ginsenosides가추출되었다. 또한흑삼에탄올추출물이 PPRγ 및 C/EPα 감소, MPK의인산화증가등 adipogenesis 관련인자를억제하였으며, 아울러염증성사이토카인의분비를억제하였다. 따라서비만및대사성질환의예방에도잠정적으로이용될수있을것으로기대되지만 ginsenosides와비만과의조절기전연구및항염증성기전등에대한정확한기전규명이필요하다. 현재인삼에함유된 ginsenosides를이용하여체지방감소등의기능성식품으로많이개발되고있는현실을감안해볼때홍삼및흑삼의제조기술인구증구포법의효율적인표준화공정기술, 유효생리활성성분의대량생산및안전성기술등이개발된다면항비만에대한고부가가치상품개발이가능할것으로기대된다. 약 감사의글 본연구는성신여자대학교교내연구비에의하여수행되었습니다. REFERENCES 1. Faust IM, Johnson PR, Stern JS, Hirsch J Diet-induced adipocyte number increase in adult rats-new model of obesity. m J Physiol 235: E279-E Klyde J, Hirsch J Increased cellular proliferation in adipose tissue of adult rats fed a high-fat diet. J Lipid Res 2: Choi SH, Kim TH, Lim S, Park KS, Jang HC, Cho NH Hemoglobin 1c as a diagnostic tool for diabetes screening and new-onset diabetes prediction: a 6-year community-based prospective study. Diabetes Care 34: Kim DM, hn CW, Nam SY. 25. Prevalence of obesity in Korea. Obes Rev 6: Kim S, Moon S, Popkin M. 2. The nutrition transition in South Korea. m J Clin Nutr 71: Ministry of Health & Welfare, Korea Centers for Disease Control and Prevention Korea Health Statistics 213: Korea National Health and Nutrition Examination Survey (KNHNES Ⅵ-1) Oh NR, Hwang R, Jeong JI, Park SH, Yang JS, Lee YH Effects of long-term high-fat diet feeding on gene expression of inflammatory cytokines in mouse adipose tissue. J Exp iomed Sci 18: Lee YH, Pratley RE. 25. The evolving role of inflammation in obesity and the metabolic syndrome. Curr Diabetes Rep 5: Lee YH, Pratley RE. 27. bdominal obesity and cardiovascular disease risk: the emerging role of the adipocyte. J Cardiopulm Rehabil Prev 27: Cinti S, Mitchell G, arbatelli G, Murano I, Ceresi E, Faloia E, Wang S, Fortier M, Greenberg S, Obin MS. 25. dipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. J Lipid Res 46: Surmi K, Hasty H. 28. Macrophage infiltration into adipose tissue: initiation, propagation and remodeling. Future Lipidol 3: Weisberg SP, McCann D, Desai M, Rosenbaum M, Leibel RL, Ferrante W Jr. 23. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. J Clin Invest 112: Xu H, arnes GT, Yang Q, Tan G, Yang D, Chou CJ, Sole J, Nichols, Ross JS, Tartaglia L, Chen H. 23. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. J Clin Invest 112: Jie YH, Cammisuli S, aggiolini M Immunomodulatory effects of Panax ginseng C.. Meyer in the mouse. gents ctions 15: Kim YC, Kim SR, Markelonis GJ, Oh TH Ginsenosides Rb1 and Rg3 protect cultured rat cortical cells from glutamate-induced neurodegeneration. J Neurosci Res 53: Tahara M, Kono H, Mune S, Odashima S ction of ginsenosides on tumor cells growth inhibition and redifferentiation of neoplasia. Wakan Iyaku Gakkaishi 2: Yokozawa T, Kobayashi T, Oura H, Kawashima Y Studies on the mechanism of the hypoglycemic activity of ginsenoside-rb2 in streptozotocin-diabetic rats. Chem Pharm ull (Tokyo) 33: Kwon SW, Han S, Park IH, Park JM, Park MK. 21. Liquid chromatographic determination of less polar ginsenosides in processed ginseng. J Chromatogr 921: Ko SK, Lee KH, Hong JK, Kang S, Sohn UD, Im O, Han ST, Yang W, Chung SH, Lee Y. 25. Change of ginsenoside composition in ginseng extract by vinegar process. Food Sci iotechnol 14: Nam KY, Choi JE, Park JD Transformation techniques for the large scale production of ginsenoside Rg3. Korean J Medicinal Crop Sci 21: Kitagawa I Chemical investigation of naturally occurring drug materials: elucidation of scientific basis for traditional medicines and exploitation of new naturally occurring drugs. Yakugaku Zasshi 112: Shoji J Studies on the constituents of ginseng. Nat Med 53: Nam KY, Lee NR, Moon D, Song GY, Shin HS, Choi JE Changes of ginsenosides and color from black ginsengs prepared by steaming-drying cycles. Korean J Medicinal Crop Sci 2: Xu TM, Cui MH, Xin Y, Gu LP, Jiang X, Su MM, Wang DD, Wang WJ. 28. Inhibitory effect of ginsenoside Rg3 on ovarian cancer metastasis. Chin Med J 121: Lee MS, Kim IH, Kim CT, Kim YH Effects of ginsenoside Rg3 on adipocyte fatty acid binding protein mrn expression and glycerol-3-phosphate dehydrogenase activity

10 흑삼의열수및에탄올추출물의항비만효과 323 during adipocytes differentiation. Korean J Lipidol 21: Gu W, Kim K, Kim DH Ginsenoside Rh1 ameliorates high fat diet-induced obesity in mice by inhibiting adipocyte differentiation. Chem Pharm ull 36: Kim SN. 28. Study on ginsenoside patterns on the steam processing of Korean ginseng and hypoglycemic action on streptozotocin induced diabetic rats of 9 time-steamings ginsengs. PhD Dissertation. Joongbu University, Chungnam, Korea. p Rosen ED, Sarraf P, Troy E, radwin G, Moore K, Milstone DS, Piegelman M, Mortensen RM PPR gamma is required for the differentiation of adipose tissue in vivo and in vitro. Mol Cell 4: Wu Z, Rosen ED, Erun R, Hauser S, delmant G, Troy E, McKeon C, Darlington GJ, Spiegelman M Crossregulation of C/EP alpha and PPR gamma controls the transcriptional pathway of adipogenesis and insulin sensitivity. Mol Cell 3: Hwang JT, Lee MS, Kim HJ, Sung MJ, Kim HY, Kim MS, Kwon DY. 29. ntiobesity effect of ginsenoside Rg3 involves the MPK and PPR-gamma signal pathways. Phytother Res 23: Shang W, Yang Y, Jiang, Jin H, Zhou L, Liu S, Chen M. 27. Ginsenoside Rb1 promotes adipogenesis in 3T3- L1 cells by enhancing PPRγ2 and C/EPα gene expression. Life Sci 8: Kim SN, Lee JH, Shin HS, Son SH, Kim YS. 29. Effects of in vitro-digested ginsenosides on lipid accumulation in 3T3-L1 adipocytes. Planta Med 75: Lee S, Lee MS, Kim CT, Kim IH, Kim Y Ginsenoside Rg3 reduces lipid accumulation with MP-activated protein kinase (MPK) activation in HepG2 cells. Int J Mol Sci 13: Choi HC MP-activated protein kinase activating agent and its implication. Endocrinol Metab 27: Quan HY, Yuan HD, Jung MS, Ko SK, Park YG, Chung SH Ginsenoside Re lowers blood glucose and lipid levels via activation of MP-activated protein kinase in HepG2 cells and high-fat diet fed mice. Int J Mol Med 29: Song GY, Oh HJ, Seong SR, Seo Y, Park YJ, Myung CS. 26. Effect of black ginseng on body weight and lipid profiles in male rats and fed normal diets. Yakhak Hoeji 5: Wisse E. 24. The inflammatory syndrome: the role of adipose tissue cytokines in metabolic disorders linked to obesity. J m Soc Nephrol 15: Chawla, Nguyen KD, Goh YPS Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nat Rev Immunol 11: Lumeng CN, Saltiel R Inflammatory links between obesity and metabolic disease. J Clin Invest 121: Kim J, Kang SJ, Lee KH, Lee M, Ha SD, Cha YS, Kim SY. 21. The chemopreventive potential and anti-inflammatory activities of Korean black ginseng in colon26-m3.1 carcinoma cells and marcrophages. J Korean Soc ppl iol Chem 53: Shin YJ, Jang HH, Song GY Study on anti-atopic effects of black ginseng. Kor J esthet Cosmetol 1: