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1 J Korean Med Obes es 2014;14(1): pissn , eissn JKOMO Original Article AW 세포에서 Metformin 과병행투여시상승효과를나타내는한약재의선별연구 김형구ㆍ왕경화ㆍ채희성 1 ㆍ진영원 1 ㆍ최한석 2 ㆍ김호준 동국대학교한의과대학한방재활의학과교실, 1 동국대학교약학대학약학교실, 2 동국대학교의과대학내분비내과교실 Screening of Herbal Medicines for Synergistic Effects of Metformin and Herbal Extracts Combination in AW Cells Hyung-Gu Kim, Jing-Hua Wang, Hee-Sung Chae 1, Young-Won Chin 1, Han-Seok Choi 2, Hojun Kim Department of Oriental ehabilitation Medicine, College of Oriental Medicine, Dongguk University, 1 Department of Pharmacy, College of Pharmacy, Dongguk University, 2 Department of Endocrinology Medicine, College of Medicine, Dongguk University eceived: May 20, 2014 evised: May 31, 2014 Accepted: June 2, 2014 Correspondence to: Hojun Kim Department of Oriental ehabilitation Medicine, Dongguk University Ilsan Oriental Hospital, 27 Donggung-ro, Ilsandong-gu, Goyang , Korea Tel: ax: kimklar@dongguk.ac.kr Copyright 2014 by The Society of Korean Medicine for Obesity esearch Objectives: This study was performed to evaluate the effects of Metformin and Lonicerae los, Agrobacterium hizogenes, Coptidis hizoma, Atractylodis hizoma Alba, Houttuyniae Herba extracs combinations on hypoglycemia in AW cells. Methods: Expressions of Sirt1, p-adenosine monophosphate-activated kinase (p-ampk), AMPKalpha, peroxisome proliferator activated receptor (PPA)-alpha, PPA-gamma, X-box binding protein 1 (XBP-1), tumor necrosis factor (TN)-alpha and interleukin (IL)-6 were analyzed by real time polymerase chain reaction and Western blotting analysis. esults: The level of gene expression of Sirt1, p-ampk, AMPK-alpha, PPA-alpha and XBP-1 in relation to that of beta-actin were increased or decreased significantly with the Metformin and Lonicerae los, Agrobacterium hizogenes extracts combination groups. The level of gene expression of TN-alpha and IL-6 were increased significantly with the Metformin and Houttuyniae Herba, Coptidis hizoma extracts combination groups. Conclusions: Metformin and Lonicerae los, Agrobacterium hizogenes extracts combination groups showed synergistic hypoglycemic effects by increasing AMPK and PPA gene expression in AW cells. Key Words: Metformin, Herbal medicines, Synergistic effects, Combination, Hypoglycemia 서론 당뇨병은인슐린의절대적또는상대적결핍및조직에서의인슐린작용성저하에기인하는고혈당과이에수반되는대사장애를특징으로하는질환이다. 인류문명의발달에따른식이형태와생활양식의변화로인해비만인구와함께증가추세에있는제2형당뇨병 (type 2 diabetes mellitus) 은인슐린의분비가절대적으로부족한제1형당뇨병 (type 1 diabetes mellitus) 과는달리인슐린저항성이주요한병태생리학적특징이다. 인슐린저항성은유전적인요인과함께 말초조직에서인슐린감수성을감소시키는식이형태나비만, 운동부족, 스트레스등의생활습관과밀접한관련이있다 1). 인슐린민감성의감소는비만과매우높은연관성을가지며, 비만상태에서의염증반응이인슐린민감성을감소시킨다는연구들이많이보고되고있다 2). 현재제2형당뇨병치료제를살펴보면인슐린분비능을증가시키는 sulfonlurea 계통의약물이있고, 인슐린작용력을향상시키는 peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPA gamma) agonist인 pioglitazone과 rosiglitazone의약물이있으며간에서당신생합성을감소시키는 13

2 Metformin 계통의물질도있고탄수화물의소화흡수를방해하여식후혈당의상승을방지하는 acarbose 계통의약물도있다 3-5). Metformin은 biguanide계약물로현재제2형당뇨병환자의 1차약물요법으로사용되고있으며특히다른경구용혈당강하제에비해저혈당및체중증가등의부작용이적다는장점이있다. 하지만드물게젖산증 (lactic acidosis) 을유발하는것으로보고되었고, 이로인해신질환, 간질환, 저산소증, 심각한감염, 알코올중독증등이동반된경우에는주의해야한다 6). Metformin은 rench lilac의주요성분으로 1957년부터유럽에서사용되어왔고, 미국에서는 1994년부터사용이허가되었으나, 작용점및작용기전에근거하여개발된약물이아니며, 작용기전은비교적최근에밝혀졌다. 이제까지알려진대표적인작용기전은세포의에너지조절에관여하는 adenosine monophosphate-activated kinase (AMPK) 의활성화를유도하여간에서당신생작용을억제하고근육및간에서지방산산화를촉진시키는것으로보고되었다 6). 최근연구결과에의하면 Metformin 의혈당저하작용에는 AMPK의인산화상위 kinase인 LKB1이필요한것으로밝혀졌으며, LKB1에의해 transcriptional co-activator 인 TOC2의인산화를통한당신생억제작용을나타내는것으로밝혀졌다. 제2형당뇨병발생의중요한인자인비만과인슐린저항성에염증반응이밀접하게연관되어있음이밝혀짐에따라향후염증관련연구가제2형당뇨병을비롯한대사증후군의병인규명에중요한기여를할것으로생각된다. 현재까지 Metformin 의염증관련연구는소수의논문이발표되어있으며, 대부분심순환계작용과연관하여혈관내피세포 (endothelial cell) 를중심으로염증반응을억제한다는결과가보고되었다. 예를들면 Metformin은 endothelial cell에서 AMPK 활성화를통해 nuclear factor kappa B 활성을억제하며, endometriotic stromal cell에서 interleukin (IL)-8 및 aromatase 활성을억제하는것으로보고되었다 7). 따라서 Metformin의 macrophage에서의항염증기전을규명하면염증반응의제어가어떻게인슐린저항성개선및혈당강하작용에연계되는지를좀더직접적으로규명할수있을것으로기대된다. 최근양약과한약의병용을통하여약효상승과부작용감소를얻으려는시도가늘어나고있으나아직까지많이이뤄지지않았다. 그중에는쥐에게 Metformin과대황을병용투여했을때항산화효과가증가한연구 8), 쥐에게 Metformin과황금을병용투여했을때췌장의인슐린분비능력이개선되고혈중중성지방, 콜레스테롤이유의하게감소한연구등이있다 9). 하지만양약과한약의병용이 AMPK 활성화에영향을주는지에대한연구는찾아보기힘들었다. AMPK 활성화에대한상승작용이밝혀진다면, 복용중인 Metformin의양을감량하여 Metformin의부작용을최소화할수있을것이다. 본연구에서는백출, 어성초, 금은화, 황금, 황련추출물을 Metformin과함께 AW 세포에처리하여, quantitative real time-polymerase chain reaction (qt-pc) 을통해 AMPK, PPA-alpha, PPA-gamma, IL-6, tumor necrosis factor (TN)-alpha, X-box binding protein 1 (XBP-1) 을관찰하였다. 또한 Western blot을통하여 Sirt1 and p-ampk protein level 등을관찰하였다. 상기실험을통해각각의군에서 Metformin 과한약재의상호연관성에대하여알아보고자하였으며, 나아가 Metformin과병용투약하여부작용감소및약효상승을시켜주는한약물개발가능성을보고자하였다. 재료및방법 1. 실험재료 Macrophage cell line인 AW 세포는한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea) 에서분주받아사용하였고, 세포배양은 Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM) 에 10% fetal bovine serum (BS) 과 2 mml-glutamine, 100 U/ml penicillin, and 100 lg/ml streptomycin이함유된배지를사용하였다. CO 2 incubator 37 o C, 5% CO 2-95% O 2 조건하에서배양하였다. 실험에사용된백출, 어성초, 금은화, 황금, 황련추출물 (water 100%, ethanol 30%) 은동국대학교약학대학에서제공받아사용하였다. 각각의세포를정상군 ( 이하 N), Metformin 처리군 ( 이하 M), 백출추출물 (ethanol 30%) 처리군 ( 이하 BCE), 백출추출물 (water 100%) 처리군 ( 이하 BCW), 어성초추출물 14

3 김형구외 : Metformin 과병행투여시상승효과를나타내는한약재 (ethanol 30%) 처리군 ( 이하 USE), 어성초추출물 (water 100%) 처리군 ( 이하 USW), 금은화추출물 (ethanol 30%) 처리군 ( 이하 GUE), 금은화추출물 (water 100%) 처리군 ( 이하 GUW), 황금추출물 (ethanol 30%) 처리군 ( 이하 HGE), 황금추출물 (water 100%) 처리군 ( 이하 HGW), 황련추출물 (ethanol 30%) 처리군 ( 이하 HLE), 황련추출물 (water 100%) 처리군 ( 이하 HLW), Metformin+ 백출추출물 (ethanol 30%) 처리군 ( 이하 M+BCE), Metformin+ 백출추출물 (water 100%) 처리군 ( 이하 M+BCW), Metformin+ 어성초추출물 (ethanol 30%) 처리군 ( 이하 M+USE), Metformin+ 어성초추출물 (water 100%) 처리군 ( 이하 M+USW), Metformin+ 금은화추출물 (ethanol 30%) 처리군 ( 이하 M+GUE), Metformin+ 금은화추출물 (water 100%) 처리군 ( 이하 M+ GUW), Metformin+ 황금추출물 (ethanol 30%) 처리군 ( 이하 M+HGE), Metformin+ 황금추출물 (water 100%) 처리군 ( 이하 M+HGW), Metformin+ 황련추출물 (ethanol 30%) 처리군 ( 이하 M+HLE), Metformin+ 황련추출물 (water 100%) 처리군 ( 이하 M+HLW) 의 22군으로만들었다. 이후각각의세포군에 24시간동안 100 μg/ml 약물처리를하고, 1 mm Metfornmin 을처리했다. 2. 세포배양 AW cell은 DMEM에 10% BS와 2 mmlglutamine, 100 U/ml penicillin, and 100 lg/ml streptomycin이함유된배양액을사용하여 37 o C, 5% CO 2, 90% humidity의조건하에서배양되었다. 배양된세포는 2~3일에한번씩배양액을바꾸어주면서배양하여세포분화가최대에도달하였을때 phosphate buffered saline (PBS) 으로세포를세척한후 trypsin-edta 용액으로부착된세포를분리한뒤원심분리하여세포를모은다음세포와배지를잘혼합하여계대배양하여사용하였다. 3. Determination of tissue gene expression of AW cell by qt-pc Total NA는 Trisure (Bioline, USA) 를사용하여 protocol에따라분리정제하였다. 1 μg의 total NA를 cdna synthesis kit (Sprint TM T Complete Oligo- (dt) 18; Clontech, MountainView, CA, USA) 를이용하여 protocol에따라역전사반응을수행하여 first strand cdna를얻었다. T-PC 샘플은 Light Cycler-ast Start DNA Master SYB Green (oche Applied Science, Indianapolis, ID, USA) 을이용하여최종반응용량을 20 μl로하여 LightCycler instrument (oche Applied Science) 에서진행하였다. Primer 종류및서열은 Table 1에표시한바와같다. PC amplification은 C/EBPα에서 95 o C에서 10분동안 prior incubation 후, 45 cycle의 amplification (95 o C 에서 10초간 denaturation, 52 o C에서 10초간 annealing, 72 o C에서 15초간 extension) 하였고 beta-actin 에서는 95 o C에서 10분동안 prior incubation 후, 35 cycle의 amplification (95 o C에서 10초간 denaturation, 52 o C에서 10 Table 1. The Primer Sequence Used for eal-time Polymerase Chain eaction Genus specific primers Direction Sequence Annealing temperature ( o C) Beta-actin XBP-1 AMPK alpha1 PPA-alpha PPA-gamma TN-alpha IL-6 5 -GCAAGTGCTTCTAGGCGGAC-3 5 -AAGAAAGGGTGTAAAACGCAGC-3 5 -TGGCCGGGTCTGCTGAGTCCG-3 5 -GTCCATGGGAAGATGTTCTGG-3 5 -AAGCCGACCCAATGACATCA-3 5 -CTTCCTTCGTACACGCAAAT GCCTGTCTGTCGGGATGT-3 5-GGCTTCGTGGATTCTCTTG-3 5 -GCCCTTTGGTGACTTTATGGA-3 5 -GCAGCAGGTTGTCTTGGATG-3 5 -GAACTGGCAGAAGAGGCACT-3 5 -AGGGTCTGGGCCATAGAACT-3 5 -AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3 5 -CAGAATTGCCATTGCACAAC XBP-1: X-box binding protein, AMPK: adenosine monophosphate activated kinase, PPA: peroxisome proliferator activated receptor, TN: tumor necrosis factor, IL: interleukin. 15

4 초간 annealing, 72 o C에서 15초간 extension) 하였다. 데이터는 LightCycler Software (oche Diagnostics, Penzberg, Germany) 로분석하였다. 각각의분석에서 cdna 대신물을음성대조군으로사용하여발생가능한 primer-dimer 형성을체크하였다. 유전자의전사레벨은 beta-actin을기준으로삼아 2-ΔCt ( 목표한유전자의 threshold 값 beta-actin의 threshold 값 ) 를구하는방식으로계산되었고, 유전자의발현량은 differentiation media만처리한대조군을 1.0으로간주하여상대적인값을측정하였다. 4. Western blot analysis Cell lysate preparation을위해처리된세포를 150 mm NaCl (PBS) 이포함된 10 mm phosphate buffer (ph 7.4) 용액으로세척한후, 0.1% sodium dodesyl sulfate (SDS) and 10 mm β-mercaptoethanol이포함된 PBS 용액에넣고용해시켰다. 세포를수거하여 8% SDS-polyacrylamide gels에넣은후, protein band를 semi-dry blotter (MilliBlot-SDE system; Millipore, Bedford, MA, USA) 를사용하여 nitrocellulose membranes (Schleicher and Schull, Dassel, Germany) 위에떨어뜨렸다. 그리고 membrane을 0.1% tween-20 (Tris-buffered saline [TBS]-T) 이포함된 10 mm TBS (ph 7.2) 으로 1회세척한후, 3% 무지분유가첨가된 TBS (ph 7.2) 에넣고상온에서 1시간동안 blocking 시켰다. Anti-Sirt1 antibody, anti-p-ampk antibody, anti-ampk antibody (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 혹은 anti-beta actin antibody와반응하였다. 2시간동안 incubation한후, horseradish peroxidase-conjugated goat anti-abbit immunoglobulin G (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) (diluted 1:1,000) 을 2차항체로하여배양하였다. 그후 chemiluminescence solution (Amersham Corp., Newark, NJ, USA) 으로처리하여 image reader (LAS-3000; uji Photo ilm, Tokyo, Japan) 로분석하였다. esultant protein band의강도는 densitometry로측정하였고, 단백질의정량은 beta-actin 을참고로하여분석하였다. 5. 통계처리각각의군별로 4번의결과측정을하였으며, 실험결과는평균값 ± 표준오차 (mean±standard error) 로표시하였고 SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 를이용한 oneway ANOVA로각실험군간의통계적분석을시행하였다. 실험의통계적유의성은 P값이 0.05 이하인경우에유의한것으로보았다. 결과 1. Effect of the Metformin induced expression in AW cells of Sirt1 and p-ampk by extracts Metformin 과백출, 금은화, 어성초, 황금, 황련추출물들의병용이 Sirt1과 p-ampk 의발현에영향을주는지확인하기위하여백출, 금은화, 어성초, 황금, 황련추출물 (ethanol 30%) 을처리한 AW 세포들과 Metformin+ 백출, 금은화, 어성초, 황금, 황련추출물 (ethanol 30%) 을처리한 AW 세포들을 western blot 방법으로관찰하였다. Metformin 과백출, 금은화, 어성초, 황금, 황련추출물 (ethanol 30%) 을함께처리한 AW 세포들에서 ig. 1. Differential effects of extract on Metformin-induced SirT1 and p-adenosine monophosphate activated kinase (p-ampk) expression in AW cells. lysates were analyzed using western blotting. N: normal, M: Metformin, A: Atractylodis hizoma Alba 30% EtOH extract, B: Lonicerae los 30% EtOH extract, C: Houttuyniae Herba 30% EtOH Extract, D: Agrobacterium hizogenes 30% EtOH Extract, E: Coptidis hizoma 30% EtOH Extract. 16

5 김형구외 : Metformin 과병행투여시상승효과를나타내는한약재 Metformin을함께처리하지않은 AW 세포들에비해 Sirt1과 p-ampk의발현이증가하였다. 특히 Metformin 과금은화추출물 (ethanol 30%) 을함께처리한 AW 세포에서 Sirt1과 p-ampk의발현이증가한것을확인할수있었다 (ig. 1). 2. The level of gene expression of AMPK-alpha in relation to that of beta-actin N군은 0.80, M군은 0.76으로측정되었다 (ig. 2). M+ USE군은 0.84, M+GUE군은 2.70, M+HGW군은 4.50으로측정되었다. M+USE, M+GUE, M+HGW 3개군은 M 군과비교시통계적으로유의하게 AMPK-alpha 유전자의발현정도가증가하였다 (M+USE; P<0.05) (M+GUE, M+ HGW; P<0.001). 특히 M+HGW군이가장많이증가한것을확인할수있다. 3. The level of gene expression of PPA-alpha in relation to that of beta-actin N군은 1.01, M군은 0.68로측정되었다 (ig. 3). M+USE 군은 2.29, M+USW군은 1.59, M+HGW군은 3.38, M+ HLE군은 1.57로측정되었다. M+USE, M+USW, M+HGW 3개군은 M군과비교시통계적으로유의하게 PPA-alpha 유전자의발현정도가증가하였다 (M+USW, M+HLE; P<0.05) (M+USE, M+HGW; P<0.001). 특히 M+HGW 군이가장많이증가하였다. 4. The level of gene expression of PPA-gamma in relation to that of beta-actin N군은 1.03, M군은 0.83으로측정되었다 (ig. 4). M+ USE군은 0.94, M+GUW군은 0.90, M+HLE군은 1.05로측정되었다. M+USE, M+GUW, M+HLE 3개군은 M군과 ig. 2. The level of gene expression of adenosine monophosphateactivated kinase (AMPK)-alpha in elation to that of beta-actin in AW cells. N: normal, M, Metformin: E, ethanol 30%. W: water 100%, BC: Atractylodis hizoma Alba, US: Houttuyniae Herba, GU: Lonicerae los, HG: Agrobacterium hizogenes, HL: Coptidis hizoma. *Significantly different from M (P< 0.05). Significantly different from M (P<0.001). ig. 3. The level of gene expression of peroxisome proliferator activated receptor (PPA)-alpha in relation to that of beta-actin in AW cells. N: normal, M: Metformin, E: ethanol 30%, W: water 100%, BC: Atractylodis hizoma Alba, US: Houttuyniae Herba, GU: Lonicerae los, HG: Agrobacterium hizogenes, HL: Coptidis hizoma. *Significantly different from M (P<0.05). Significantly different from M (P<0.001). 17

6 ig. 4. The level of gene expression of peroxisome proliferator activated receptor (PPA)-gamma in relation to that of beta-actin in AW cells. N: normal, M: Metformin, E: ethanol 30%, W: water 100%, BC: Atractylodis hizoma Alba, US: Houttuyniae Herba, GU: Lonicerae los, HG: Agrobacterium hizogenes, HL: Coptidis hizoma. ig. 5. The level of gene expression of X-box binding protein (XBP-1) in relation to that of beta- actin in AW cells. N: normal, M: Metformin, E: ethanol 30%, W: water 100%, BC: Atractylodis hizoma Alba, US: Houttuyniae Herba, GU: Lonicerae los, HG: Agrobacterium hizogenes, HL: Coptidis hizoma. *Significantly different from M (P< 0.05). Significantly different from M (P<0.001). 비교시통계적인유의성은없었으나, PPA-gamma 유전자의발현정도가증가하였다. 5. The level of gene expression of XBP-1 in relation to that of beta-actin N군은 1.00, M군은 1.01로측정되었다 (ig. 5). M+BCE 군은 0.42, M+BCW 군은 0.42, M+USE 군은 0.32, M+USW 군은 0.40, M+GUE 군은 0.41, M+GUW 군은 0.53, M+HGE 군은 0.38, M+HGW 군은 0.05, M+HLE 군은 0.18, M+HLW 군은 0.39로측정되었다. Metformin 과함께추출물을처리한모든군에서 M군과비교시통계적으로유의하게 XBP-1 유전자의발현정도가감소하였다 (M+GUW; P<0.05) (M+ BCE, M+BCW, M+USE, M+USW, M+GUE, M+HGE, M+HGW, M+HLE, M+HLW; P<0.001). 특히 M+ HGW군이가장많이감소하였다. 6. The level of gene expression of TN-alpha in relation to that of beta-actin N군은 1.01, M군은 1.34로측정되었다 (ig. 6). M+BCW 군은 1.40, M+HGE군은 1.30으로측정되어 M군과비슷한수치를유지하였다. M+GUE군은 0.66, M+GUW군은 0.97, M+HGW군은 0.13으로측정되어통계적으로유의성은나타나지않았지만, M군과비교시감소하는경향을보였다. 하지만 M+USE군은 4.55, M+USW군은 6.39, M+HLW군은 7.73으로측정되었다. M+USE, M+USW, M+HLW 3개군은 M군과비교시통계적으로유의하게 TN-alpha 유전자의발현정도가증가하였다 (M+USE; P <0.01) (M+USW, M+HLW; P<0.001). M+BCE군은 3.28, M+HLE군은 4.16으로측정되어통계적으로유의성은나타나지않았지만, M군과비교시증가하는경향을보였다. 18

7 김형구외 : Metformin 과병행투여시상승효과를나타내는한약재 ig. 6. The level of gene expression of tumor necrosis factor (TN)-alpha in relation to that of beta-actin in AW cells. N: normal, M: Metformin, E: ethanol 30%, W: water 100%, BC: Atractylodis hizoma Alba, US: Houttuyniae Herba, GU: Lonicerae los, HG: Agrobacterium hizogenes, HL: Coptidis hizoma. Significantly different from M (P <0.01). Significantly different from M (P<0.001). ig. 7. The level of gene expression of interleukin (IL)-6 in relation to that of beta-actin in AW cells. N: normal, M: Metformin, E: ethanol 30%, W: water 100%, BC: Atractylodis hizoma Alba, US: Houttuyniae Herba, GU: Lonicerae los, HG: Agrobacterium hizogenes, HL: Coptidis hizoma. Significantly different from M (P<0.01). Significantly different from M (P<0.001). 7. The level of gene expression of IL-6 in relation to that of beta-actin N군은 1.11, M군은 1.91로측정되었다 (ig. 7). M+BCE 군은 0.41, M+BCW 군은 0.22, M+GUE 군은 0.59, M+GUW 군은 0.35, M+HGE군은 0.12, M+HGW군은 0.74로측정되었다. M군과비교시통계적으로유의성이나타나진않았으나모두 IL-6 유전자의발현정도가감소하였다. 하지만 M+USE 군은 2.90, M+USW 군은 6.46, M+HLE 군은 10.65, M+HLW군은 22.96으로측정되었다. M+USW, M+HLE, M+HLW 3개군은 M군과비교시통계적으로유의하게 IL-6 유전자의발현정도가증가하였다 (M+USW; P<0.01) (M+HLE, M+HLW; P<0.001). M+USE군은 M군과비교시통계적으로유의성이나타나지않았으나 IL-6 유전자의발현정도가증가하였다. 고찰 백출의성분은 atractylol 을주성분으로하는정유성분과 atractylone, vitamin A 등을함유한다 10). 백출에관한약리적인연구로는보비위하는작용으로공복감지연효과에대한보고가있고 11), 백출을함유하는처방인五苓散, 茵蔯五苓散등에서이뇨작용과신부전보호작용을보고한바가있다 12). 또한백출의추출물이 streptozotocin 에의한췌장과신장조직의손상을줄이고이상지질대사를억제함으로써당뇨병개선효과가있다는보고가있다 13). 어성초에관한연구로는인체의 T, B세포에미치는영향 14), 항균활성작용 15) 및면역기능에미치는영향 16), 고지혈증 17) 등에관한실험적연구가보고되었다. 또한비만세포에어성초추출물을처리하였을때염증성매개물질에대한억제효과를기대할수있다는보고가있다 18). 19

8 금은화의성분중 tannin이급성장염및해독효과를나타내는유효성분으로밝혀져있고 19), 해열탕의항염증작용에대한연구에서 lipopolysaccharide (LPS) 로유도된 NO의생성, inos, COX-2 및 cytokine에미치는영향에서항염작용의유의성을보고한바있다 20). 황금에는활성성분으로 baicalein, biacalin, chrysin, oroxylin-a, wogonin 및 wogonoside 등과같은 30여종이상의 flavonoid가함유되어있으며, 항염증, 항당뇨, 항균, 항알레르기, 항바이러스, 항고혈압및항산화등과같은많은약리학및생물학적활성을가지는것으로알려져있다 21-24). 황련의임상작용을살펴보면장이나위에쌓여서일어나는설사나위열로인한구토에유효하며해열과해독작용이뛰어난것으로알려져있다. 강한항균작용을하는것으로알려진성분은 berberine 인데이는위장내의세균과진균및대장내의감염에대하여항균력이강하여위염과위장및대장내발효를개선하고소화관에정체된내용물에대장균이작용하여 gas를생성하는것을방지하는것으로알려져있다. 또한 berberine 유도체를이용하여콜레스테롤대사조절기능이행해져온것으로알려져있다 25). 본연구에서는항지질및항염증등의효과가있는상기의백출, 어성초, 금은화, 황금, 황련추출물을 Metformin 과병용하였을때, 혈당조절및염증조절에어떠한효과를나타낼것인지에대한여부를 in vivo 실험을통해알아보고자하였다. Metformin은신체의다양한기관에작용하여항당뇨효능을나타내며, 생체내의에너지항상성을조절하는주요한효소인 AMPK를주요목표로하여나타난다 26). AMPK는 serine/threonine kinase의일원으로세포내에너지상태를감지하는 에너지센서 로알려져있는효소이다. AMPK는세포내에너지가부족한상황 (adenosine triphosphate [ATP] 에비해 AMP가증가하는상황 ) 에서활성화되어정상에너지균형을회복시키기위해 ATP를소비하는과정 ( 지방산, 콜레스테롤등의합성을억제하고반대로 ATP를생산하는과정 ), 즉지방산산화, 해당과정을활성화시킨다 27). AMPK는지방세포로부터분비되는렙틴 (leptin) 과아디포넥틴 (adiponectin) 의세포내신호전달물질로서도잘알려져있다 28). Acetyl-CoA carboxylase (ACC) 는지방대사가증가할경우에생성되는효소물질가운데하나이다. AMPK는지방산합성에서 ACC 등핵심효소를억제함으로써 ATP의추가적사용을억제한다 29). Metformin 과한약재추출물들을병용하였을때의혈당조절효과를조사하기위해 Western blot 방법을사용하여관찰하였다. Metformin 과한약재추출물들을함께처리한군에서, 처리하지않은군들에비해 Sirt1과 p-ampk의발현이증가하였다. 특히 M+GUE군에서 Sirt1과 p-ampk 의발현이증가한것을확인할수있었다. T-PC을통해 AMPK-alpha 유전자의발현정도를측정하였을때, M+USE군, M+GUE군, M+HGW군은통계적인유의성을나타내었다 (P<0.05) (P<0.001). 위의 3 개군중에서, M+HGW군이가장발현정도가높게나타났다. 이는 Metformin과어성초추출물 (ethanol 30%), 금은화추출물 (ethanol 30%), 황금추출물 (water 100%) 의병용이인슐린저항성을감소시키고고혈당을개선하는데 Metformin을단독사용한것보다나은효과를나타낸다고볼수있다. PPA-alpha 는간조직에서주로발현되며 liver와 muscle 에서 peroxisomal & mitochondrial β-oxidation과 fatty acid uptake 등을통해중성지방의분해에관여하는당 지질대사를조절한다. 최근에는식욕을억제하여포만감을일으켜체중감소를유도한다는보고가있어비만치료제로서가능성이제기되고있다. PPA-alpha 의활성은 lipoprotein lipase를통해 triglyceride의 level을낮춘다 30,31). 본실험에서 PPA-alpha 유전자의발현정도를측정하였을때, M+USE군, M+USW군, M+HGW군, M+HLE군은통계적인유의성을나타내었다 (P<0.05) (P<0.001). 위의 4개군중에서, M+HGW 군이가장발현정도가높게나타났다. 이는 Metformin 과어성초추출물 (ethanol 30%, water 100%), 황금추출물 (water 100%), 황련추출물 (ethanol 30%) 의병용이 PPA-alpha 유전자발현정도증가에어느정도의미가있다고생각된다. PPA-gamma 는지방세포의전사조절분자중의하나이다. 이는지방세포의분화및지방합성과저장에관여하는효소들의발현을조절하는역할을하는데지방대사뿐만아니라대사증후군, 염증반응그리고동맥경화증에있어서여러가지유전자의발현을조절하는역할을한다고알려져 20

9 김형구외 : Metformin 과병행투여시상승효과를나타내는한약재 있다 32). 또한말초조직에서인슐린민감도를항진시키는데있어서중요한기능을담당하는것으로예상되는데 PPAgamma 작용제주입시에단백뇨의감소, 혈압강하효과및혈중지질대사에영향을준다는점과당뇨병치료제중 thiazolidinedione 계열에속하는 pioglitazone이 PPAgamma 작용제로서인슐린저항성을개선시켜혈당을조절한다는보고가이를뒷받침해주고있다 33). 본실험에서 PPA-gamma 유전자의발현정도를측정하였을때, M+ USE군, M+GUW군, M+HLE군에서증가하였으나통계적인유의성은볼수없었다. 소포체스트레스가제2형당뇨병의발병에중요한역할을한다는보고들이있으며이는췌장의베타세포의사멸뿐아니라인슐린저항성에도영향을준다고알려져있다. 소포체스트레스발생시이를없애는데관여하는것이 XBP-1으로보고되었다 34). 본실험에서 XBP-1 유전자의발현정도를측정하였을때, Metformin 과약물추출물을병용한모든군에서통계적으로유의하게감소하였다 (P<0.05) (P<0.001). 특히 M+HGW군에서 XBP-1 유전자의발현정도가가장많이감소하였다. 이는소포체스트레스가발생시제거를위해 XBP-1이작용을함으로, XBP-1 유전자의발현정도감소는소포체스트레스의감소를의미한다고볼수있다. Metformin 과약물추출물들의병용이소포체스트레스감소및예방에의의가있는것으로해석할수있다. 사이토카인이란다양한자극에의한반응으로면역세포나다른다양한세포로부터분비되는낮은분자량의조절단백또는당단백이다. 그중에는 M1 대식세포가분비하는염증성사이토카인 (IL-1 β, IL-6, TN-alpha) 과 M2 대식세포와관련된항염증성사이토카인 (IL-4, IL-10) 이있는데, 염증성사이토카인은다른면역세포들을활성화시켜염증반응을증가시키는반면, 항염증성사이토카인은과도한염증반응을억제하고항상성을유지하는역할을한다. M1 대식세포와 M2 대식세포는각각염증성사이토카인과항염증성사이토카인의길항작용을통해면역균형을유지한다 35). TN-alpha 는활성화된 M1 대식세포에의해생성되어미생물의감염으로부터숙주를보호하며, 염증반응을활성화시키는역할을한다. 그러나 TN-alpha 가장기적으로분비될경우만성적인감염에대해패혈증으로인한쇼크 반응을나타내며, 류마티스관절염등의만성염증질환등을발생시킨다 36). TN-alpha 는염증에서뿐만아니라, 대사질환에도영향을미치는중요한사이토카인이다. TN-alpha 는비만상태인설치류의지방조직에서그발현이매우증가된상태로존재한다는것이보고되었으며 37), 증가한 TN-alpha 는비만상태에서의염증반응에아주중요한매개체로작용하며, 인슐린민감성을감소시킨다 38). 또한혈중중성지질농도를증가시키며유리지방산생성을증가시키는등지질대사에도영향을미치는것으로알려져있으며, IL-6 생성을유도하여 IL-6와함께스캐빈저수용체 (S-A, Lox-1) 의발현을증가시켰다는보고도있다 39). 본실험에서 TN-alpha 유전자의발현정도를측정하였을때, M+GUE군, M+GUW군, M+HGW군은통계적인유의성은나타나지않았지만감소하는경향을보였다. 하지만 M+BCE 군, M+USE 군, M+USW 군, M+HLW 군, M+HLE 군은증가하는경향을나타내었다. 특히 M+USE군, M+USW 군, M+HLW군은통계적으로유의하게 TN-alpha 유전자의발현정도가증가하였다 (P<0.01) (P<0.001). 이는 Metformin과어성초추출물, 황련추출물의병용시염증작용에유의해야한다는것을시사한다. 본실험에서 IL-6 유전자의발현정도를측정하였을때, M+BCE 군, M+BCW 군, M+GUE 군, M+GUW 군, M+HGE 군, M+HGW군은통계적인유의성은나타나지않았지만감소하는경향을보였다. 하지만 M+USE군, M+USW군, M+HLE군, M+HLW군은증가하는경향을나타내었다. 특히 M+USW군, M+HLE군, M+HLW군은통계적으로유의하게 IL-6 유전자의발현정도가증가하였다 (P<0.01) (P<0.001). 이는 Metformin 과어성초추출물, 황련추출물의병용시염증작용에유의해야한다는것으로볼수있다. 이번실험을종합하면, Metformin 과금은화, 황금추출물의병용이 Sirt1, p-ampk, AMPK-alpha, PPA-alpha, PPA-gamma, XBP-1 유전자의발현정도를유의성있게각각증가, 감소시키는것을관찰할수있었다. 그리고금은화는 ethanol 30% 로, 황금은 water 100% 로추출하였을경우에좋은결과를나타내었다. 하지만 Metformin 과어성초, 황련추출물의병용시 TN-alpha, IL-6 유전자의발현정도가유의성있게증가하였다. 따라서이번연구에서는 in vivo 모델을통해 Metformin과금은화, 황금추출물의 21

10 병용이 Metformin 단독사용시보다좀더혈당조절및염증억제효과가있다는것을알수있었다. 또한 Metformin 과어성초, 황금추출물의병용시염증작용에대한주의가필요할것으로사료된다. 약동학적인추가적인연구가필요하겠지만, 만성적인염증상태의지속은인슐린저항성을유도하여좋지않은영향을미칠수있다 40). 추후 Metformin 과한약추출물들의병용사용시의약리학적인기전뿐만아니라인슐린, 염증조절작용에관여하는다양한반응경로에대한추가적인연구가필요할것으로생각된다. 지속적인연구시에 Metformin 과병용사용하여약효를증가시키고부작용을감소시키는치료약물의개발가능성이있을것으로생각된다. 결론 Metformin과백출, 어성초, 금은화, 황금, 황련추출물 (ethanol 30%, water 100%) 을함께처리하여 Sirt1, p-ampk, AMPK-alpha, PPA-alpha, PPA-gamma, XBP-1, TN-alpha, IL-6 유전자의발현정도에미치는영향에대해다음과같은결론을얻었다. 1. Metformin 과금은화, 황금추출물의병용은 Western blot, T-PC 분석시, Sirt1, p-ampk, AMPK-alpha, PPA-alpha 유전자의발현정도가유의성있는증가를나타냈다. 2. Metformin 과금은화, 황금추출물의병용은 Western blot, T-PC 분석시, XBP-1 유전자의발현정도가유의성있는감소를나타냈다. 3. Metformin 과어성초, 황련추출물의병용은 T-PC 분석시, TN-alpha, IL-6 유전자의발현정도가유의성있게증가하여, 주의가필요할것으로생각된다. 4. 금은화는 ethanol 30% 추출물이, 황금은 water 100% 추출물이 Metformin 과함께사용하였을때효과가좋은것으로관찰되었다. 5. Metformin 과금은화, 황금추출물의병용은 Metformin 단독사용시보다혈당조절및염증조절작용효과가유의하게나타났으며, 추후지속적인연구를하여 Metformin 과병용시약효를증가시키고부작용을감소시키는치료약물로개발가능성이있을것으로생각된다. 감사의글 본연구는한국보건산업진흥원을통해보건복지부 ( 양한방융합기반기술개발사업 ) 의재정지원을받아수행된연구임 (HI14C0558). eferences 1. Korean Diabetes Association. Textbook of diabetes. Seoul : EPUBLIC : Shoelson SE, Herrero L, Naaz A. Obesity, inflammation, and insulin resistance. Gastroenterology ; 132 : ineman MS, Bicsak TA, Shen LZ, Taylor K, Gaines E, Varns A, et al. Effect on glycemic control of exenatide (synthetic exendin-4) additive to existing metformin and/or sulfonylurea treatment in patients with type 2 diabetes. Diabetes Care ; 26 : Tosi, Muggeo M, Brun E, Spiazzi G, Perobelli L, Zanolin E, et al. Combination treatment with metformin and glibenclamide versus single-drug therapies in type 2 diabetes mellitus: a randomized, double-blind, comparative study. Metabolism ; 52 : Oudjeriouat N, Moreau Y, Santimone M, Svensson B, Marchis Mouren G, Desseaux V. On the mechanism of alpha-amylase. Eur J Biochem ; 270 : Zhou G, Myers, Li Y, Chen Y, Shen X, enyk-melody J, et al. ole of AMP-activated protein kinase in mechanism of metformin action. J Clin Invest ; 108 : Huang NL, Chiang SH, Hsueh CH, Liang YJ, Chen YJ, Lai LP. Metformin inhibits TN-alpha-induced IkappaB kinase phosphorylation, IkappaB-alpha degradation and IL-6 production in endothelial cells through PI3K-dependent AMPK phosphorylation. Int J Cardiol ; 134 : Waisundara VY, Huang M, Hsu A, Huang D, Tan BK. Characterization of the anti-diabetic and antioxidant effects of rehmannia glutinosa in streptozotocin-induced diabetic Wistar rats. Am J Chin Med ; 36(6) : Waisundara VY, Hsu A, Huang D, Tan BK. Scutellaria baicalensis enhances the anti-diabetic activity of metformin in streptozotocin-induced diabetic Wistar rats. Am J Chin Med ; 36(3) : Professors of herbology in colleges of oriental medicine. Herbology. Seoul:Younglimsa. 2004: Han HK, Je HS, Kim GH. Effects of cirsium japonicum powder on plasma glucose and lipid level in streptozotocin induced daibetic rats. Korean J ood Sci Technol. 2010;42: Son DW, Kim DG, Lee SJ. Effect of natural functional mixture 22

11 김형구외 : Metformin 과병행투여시상승효과를나타내는한약재 on the descent of blood glucose level in streptozotocin-induced diabetic (typei) rats(ii). Korean J Culin es. 2011;17: Han YK, Park YK. Effect of Atractylodis hizoma Alba water extract on streptozotocin-induced diabetes in rats. Korean J Herbol ; 26(4) : Jun YE. Partial purification of houttuynia cordata thunb extract and characterization of its immunological activities in human system. MS Thesis. Seoul: Seoul University : Kang JM. Identification of volatile essential oil, and flavor characterization and antibacterial effect of fractions from Houttuynia cordata Thunb -II. lavor characterization and antibacterial effect of fraction from Houttuynia cordata Thunb by Prep-HPLC-. MS Thesis. Busan: Pukyong Natioal University : Gil YS. An experimental study on the effects of Houttuynia cordata Thunb and sanggukeum on immune function. MS Thesis. Seoul: Kyung Hee University : Lee JW. Experimental study on the preventive effects of Houttuyniae herba on hyperlipidemia. MS Thesis. Seoul: Kyung Hee University : Lee HJ, Kim KJ. The effects of Houttuyniae Herba on the mast cell-mediated inflammatory responses. J Korean Orient Med Ophthalmol Otolaryngol Dermatol ; 22(2) : World Health Organization. Lead Environmental health criteria 3. Geneva : WHO : Gok JK, Kim JJ, No YL, Lee SH, Jung SY, Jung HJ, Jung SK. Experimental esearch on the Effect of Haeyeol-tang. J Korean Orient Intern Med ; 28(4) : Huang Y, Tsang SY, Yao X, Chen ZY. Biological properties of baicalein in cardiovascular system. Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord ; 5 : Jung HS, Kim MH, Gwak NG, Im YS, Lee KY, Sohn Y, et al. M. Antiallergic effects of Scutellaria baicalensis on inflammation in vivo and in vitro. J Ethnopharmacol ; 141 : Lu Y, Joerger, Wu C. Study of the chemical composition and antimicrobial activities of ethanolic extracts from roots of Scutellaria baicalensis Georgi. J Agric ood Chem ; 59 : Waisundara VY, Hsu A, Huang D, Tan BK. Scutellaria baicalensis enhances the anti-diabetic activity of metformin in streptozotocin-induced diabetic Wistar rats. Am J Chin Med 2008 ; 36 : Lee JS, Park HG, Woo E, Lee EJ, An DG, Yoon WS, et al. A study on the extraction efficiency of berberine in coptodis rhizoma. J Analytical Sci Technol ; 10(2) : Musi N, Hirshman M, Nygren J, Svanfeldt M, Bavenholm P, ooyackers O, et al. Metformin increases AMP-activated protein kinase activity in skeletal muscle of subjects with type 2 diabetes. Diabetes ; 51(7) : Kola B, Grossman AB, Korbonits M. The role of AMP-activated protein kinase in obesity. ront Horm es ; 36 : Janovska A, Hatzinikolas G, Staikopoulos V, McInerney J, Mano M, Wittert GA. AMPK and ACC phosphorylation: effect of leptin, muscle fibre type and obesity. Mol Cell Endocrinol ; 1 : Landree LE, Hanlon AL, Strong DW, umbaugh G, Miller IM, Thupari JN, et al. C75, a fatty acid synthase inhibitor, modulates AMP-activated protein kinase to alter neuronal energy metabolism. J Biol Chem ; 3817 : Guo W, Huang N, Cai J, Xie W, Hamilton JA. atty acid transport and metabolism in HepG2 cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol ; 290(3) : Dreyer C, Krey G, Keller H, Givel, Helftenbein G, Wahli W. Control of the peroxisomal beta-oxidation pathway by a novel family of nuclear hormone receptors. Cell ; 68(5) : ossen ED, Sarraf P, Troy AE, Bradwin G, Moore K, Milstone DS, et al. PPA gamma is required for the differentiatio of adipose tissue in vivo and in vitro. Mol Cell ; 4 : ossen ED, Sarraf P, Troy AE, Bradwin G, Moore K, Milstone DS, et al. PPA gamma is required for the differentiatio of adipose tissue in vivo and in vitro. Mol Cell ; 4 : Park SW, Zhou YJ, Lee J, Lu A, Sun C, Chung J, et al. The regulatory subunits of pi3k, p85α and p85β, interact with XBP-1 and increase its nuclear translocation. Nat Med Apir ; 16(4) : eldmann M, Saklatvala J. Proinflammatory cytokines. In: Oppenheim JJ, eldman M, editors. Cytokine reference. New York : Academic Press : Vila-del Sol V, resno M. Involvement of TN and N-kB in the transcriptional control of cyclooxygenase-2 expression by IN-γ in macrophages. J Immunol ; 174 : Olefsky JM, Glass CK. Macrophages, inflammation, and insulin resistance. Ann ev Phisiol ; 72 : JI ZZ, Dai Z, XU YC. Anew tumor necrosis factor (TN)-α regulator, lipopolysaccharides-induced TN-α factor, is associated with obesity and insulin resistance. Chin Med J ; 124(2) : Hashizume M, Mihara M. Atherogenic effects of TN-α and IL-6 via upregulation of scavenger receptors. Cytokine ; 58 : Jung IJ. The role of plasminogen activator inhibitor-1 in the regulation of adipocyte function. MS Thesis. Seoul: Ewha Womans University :