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1 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): (2016) ISSN / eissn 연구논문 새로이분리된 Klebsiella pneumoniae 균주들의글리세롤기반 3-hydroxypropionic acid 및 1,3-propanediol 동시생산성평가 고연주, 설은희, 순달아세칼바라지, 권성진, 이재현, 박성훈 * Evaluation of Newly Isolated Klebsiella pneumoniae Strains for the Co- Production of 3-hydroxypropionic acid and 1,3-propanediol from Glycerol Yeounjoo Ko, Eunhee Seol, Balaji Sundara Sekar, Seongjin Kwon, Jaehyeon Lee, and Sunghoon Park* Received: 3 October 2016 / Revised: 21 November 2016 / Accepted: 25 November The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: Co-production of 3-hydroxypropionic acid (3-HP) and 1,3-propanediol (1,3-PDO) was suggested as an innovative strategy to overcome several limitations occurring in the single production of 3-HP from glycerol. In this study, two new isolates of Klebsiella pneumoniae, which produce less lipopolysaccharide (LPS) thus considered less pathogenic than K. pneumoniae DSM 2026, were compared and evaluated for their potential for the co-production of 3-HP and 1,3- PDO. The newly isolated strains showed significantly faster sedimentation rate than DSM, which should be beneficial for downstream processing. Analysis of genome sequences of the isolates confirmed the presence of all genes necessary for glycerol assimilation, 1,3-PDO production and biosynthesis of coenzyme B 12. Co-production yield was highest under anaerobic condition while cell growth was highest under aerobic condition. Both strains showed similarly good performance for the co-production although J2B gave the slightly higher co-production yield of 0.80 mol/mol than GSC021 (0.75 mol/mol). The evaluation of the newly developed strains presented here should be useful in designing similar evaluation experiments for other microorganisms. 부산대학교화공생명공학과 Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Pusan National University, Busan 46241, Korea. Tel: , Fax: parksh@pusan.ac.kr Keywords: Klebsiella pneumoniae, 3-hydroxypropionic acid, 1,3-propanediol, Co-production, Glycerol 1. INTRODUCTION 3-Hydroxypropionic acid (3-HP) 는재생가능한원료기반중간체로써 US department of energy (DOE) 에서선정한 12개의중요한 platform chemicals 중 3번째로중요한 platform chemical로알려져있다. 3-HP는 acrylic acid, 1,3-propanediol (PDO), methyl acrylate, acrylamide, ethyl 3-HP, malonic acid, propiolactone, acrylonitrile 등다양한화합물들의유기합성을위한전구체로사용할수있다. 또한고분자코팅, 금속윤활유를위한가교제및정전기방지제로사용될수있다. 3-HP의시장규모는계속적으로확대되고있는추세이며, 그가치는 3- HP로부터유래되는화합물의시장을통해추정할수있다. 3- HP를이용해전환할수있는대표적플랫폼물질인아크릴산은 2015년기준으로전세계시장규모가 11조원이상이며, 한국시장규모는약 2000억원이상이다 [1]. 앞으로글로벌아크릴산시장가치는 2014~2020년 190억달러에도달할것으로예상하고있다 [2]. 이러한가치를가지는 3-HP의생물학적생산은재조합 Escherichia coli와 Klebsiella pneumoniae 등의다양한미생물을이용하여많은연구가되어왔다 [3-10]. 그러나여전히상업적으로 3-HP를생산하기위한높은농도, 높은생산성, 높은수율등의요구조건을충족시키지못하고있다. 따라서 3-

2 새로이분리된 Klebsiella pneumoniae 균주들의글리세롤기반 3-hydroxypropionic acid 및 1,3-propanediol 동시생산성평가 247 HP 생산을향상시키기위해서는 3-HP 생산시발생되는문제점들을효과적으로해결할수있는연구가필요하다. 3-HP 생산에서가장큰문제점은생성물또는중간생성물이미생물에독성물질로작용하는것이다. 생성물인 3-HP의농도가 200~300 mm를초과하게되면세포성장및글리세롤소모속도가급격히감소되면서결국 3-HP 생산속도에영향을미친다. 또한 3-HP의중간생성물인 3-hydroxypropionaldehyde (3-HPA) 가세포내에 15~30 mm 정도로축적되면세포성장이멈추면서 3-HP 생산이중단되는것으로알려져있다. 또다른주요문제점은 3-HP 생산시필요한 NAD +, coenzyme B 12 등과같은조효소의공급이원활하지못한것이다. coenzyme B 12 는글리세롤을이용한 3-HP 생산에서필요한첫번째효소인 glycerol dehydratase (GDHt) 의필수조효소로, coenzyme B 12 가부족할경우관련된효소활성이저하되기때문에계속적으로공급해주어야한다. 또한두번째효소인 aldehyde dehydrogenase (AldH) 는조효소로 NAD + 를요구하며, NAD + 의계속적인공급을위해서는 NADH의산화와이를위한지속적인산소공급이필요하다. 따라서글리세롤이용능력이우수하고 coenzyme B 12 생산이가능한많은미생물들을이용하여 3-HP 생산연구가이루어졌다. 그러나많은미생물들이 NAD + 가계속적으로재생되는 aerobic 조건에서 coenzyme B 12 를효과적으로생산하는데어려움이있었다. 또한 anaerobic 조건에서 NAD + 의재생을위해 nitrate를이용하여 3-HP 생산을시도하였으나, nitrate가환원되면서발생되는 nitrite의축적이세포에독성을가지는것으로확인되었다 [2,8]. 글리세롤로부터두단계로이루어지는 3-HP와 1,3-propanediol (1,3-PDO) 생산은서로밀접한관계를가지고있을뿐만아니라두물질모두다양한화학물질과원료제조에사용되는고부가가치의폴리머로활용가치가높은것으로평가되고있다 [11-13]. 따라서 3-HP와 1,3-PDO의동시생산은 3- HP의단독생산에서오는여러가지한계점을극복할수있는효과적인전략이될수있다. 먼저 GDHt로부터생산되는중간생성물인 3-HPA 를공통적으로사용하고있어 3-HPA 축적으로인한세포성장저해문제를해결할수있다. 또한 3- HP 및 1,3-PDO 생산과정에서발생하는조효소를교차사용함에따라효과적으로 NAD(H) 재생을충족시킬수있다. 즉, 3-HP 생산에의해생성되는 NADH를 1,3-PDO 생산에필요한 1,3-propanediol oxidoreductase (DhaT) 의조효소로사용하고, 1,3-PDO 생산에의해생성되는 NAD + 를 3-HP 생산에필요한 AldH의조효소로사용하게되면조효소재생에따른문제가근본적으로해결되며따라서효과적인목적생산물의수율향상을기대할수있다. 또한동시생산을위해 aeration 이아닌 microaerobic나 anaerobic 조건을선택함으로써 coenzyme B 12 생산문제를해결할수있다. 여러그룹에서이와같은전략에기반하여재조합 K. pneumoniae를이용하여성공적인결과를발표하였다 [14-18]. Ashok et al. 이 K. pneumoniae DSM2026에 K. pneumoniae 유래의 AldH인 PuuC를과발현하고 DhaT를제거하여 3-HP와 1,3-PDO 를 24 시간동안각각 16.0 g/l 와 16.8 g/l 씩비슷한수준으로생산할수있음을보여주었다 [14]. Huang et al. 은 3-HP 와 1,3-PDO 동시생산에있어다양한 AldH 의효과를조사하였다 [17]. 그결과 E. coli 의 γ-glutamyl-γaminobutyraldehyde dehydrogenase 를 K. pneumoniae 에과발현하였을때 3-HP 및 1,3-PDO 생산능력이가장우수한것으로확인되었다. 즉, 24 시간동안 anaerobic condition 에서 24.4 g/l 의 3-HP 와 49.3 g/l 의 1,3-PDO 를생산하는것을보여주었다. 또한같은균주를이용하여 aeration 을 1.5 vvm 으로증가시켰을때 48.9 g/l 의 3-HP 와 25.3 g/l 의 1,3-PDO 를생산하는것을보여주었다 [18]. Kumar et al. 는부산물생산을피하기위해 resting cell 을사용하였으며, 그결과 11.3 g/l 의 3-HP 와 15.2 g/l 의 1,3-PDO 를생산할수있었다. 또한 lactate dehydrogenase (ldha) 를제거한균주를이용하였을때 3-HP 22.7 g/l, 1,3- PDO 23.5 g/l 의생산량과함께 yield 가 0.71 에서 0.77 로향상된결과를얻었다 [15,16]. 이와같이선행연구에서다양한 AldH 의효과및 aeration 조건에의한 3-HP 와 1,3-PDO 의생산성변화에대한조사가이루어졌다. 또한 resting cell 을이용하여부산물생산감소를통한 3-HP 및 1,3-PDO 동시생산성향상가능성을알아보았다. 비록다양한조건에서 3-HP 및 1,3-PDO 생산성가능성을알아보고이를향상시키기위한연구가이루어졌지만, 상업적으로의미있는수준에도달하지는못하였다. 뿐만아니라대부분실험에서사용된 K. pneumoniae 는상업적적용에제약이따르는병원성균주라는단점이있었다. 따라서 3-HP 및 1,3-PDO 의효과적인동시생산을위해서는병원성문제가적은 K. pneumoniae 균주를선택하여 3-HP 및 1,3-PDO 동시생산의가능성과한계를조사할필요성이있다. 본연구의목적은병원성이없다고알려진 K. pneumoniae 를이용해 3-HP 와 1,3-PDO 의동시생산가능성및한계를조사하는것이다. Lipopolysaccharide (LPS) 생산성이거의없고, 글리세롤이용능력이우수한 K. pneumoniae J2B (J2B) 와 K. pneumoniae GSC021 (GSC021) 를분리하였으며 [19], 분리된균주들의침강양상과동시생산관련유전자조사를통해산업균주로써의가능성및동시생산가능성등을알아보았다. 또한새로이분리한두균주에 3-HP 및 1,3-PDO 동시생산을위해 KGSADH 유전자를과발현한재조합 K. pneumoniae 균주들을개발하였으며, 개발된재조합균주들의동시생산배양조건영향을알아보았다. 배양조건의영향은배양배지, 온도, Aeration 등에대해조사하였으며, 최종적으로가장최적화된조건에서배양된세포들의효소활성측정을통해두균주사이의동시생산생산능력차이와한계를살펴보았다. 2. MATERIALS AND METHODS 2.1. 균주및재료본연구에사용된 Klebsiella pneumoniae J2B 는혐기성소화조로부터분리되었으며 [18], Klebsiella pneumoniae GSC021

3 248 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): (2016) 은 GS Caltex research group에서분리하였다. Miniprep과 DNA gel extraction kits는 Qiagen (Mannheim, Germany) 로부터구입하였다. Primer는 Cosmotech Co. Ltd. (Seoul, Korea) 로부터합성하였다. 3-HP는 Tokyo Kasei Kogyo Co. Ltd, Tokyo, Japan (TCI America) 로부터구입하였다. LB broth (Cat ), yeast extract (Cat ), Bacto TM tryptone (Cat ) 는 Difco (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ, USA) 로부터구입하였다. 글리세롤을비롯한모든화학물질과효소는따로표기하지않는한 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 로부터구입하였다 AldH 를과발현한재조합 K. pneumoniae 균주의제작 Table 1 은본연구에사용된균주, 플라스미드를나타내고있다. AldH 를과발현하기위해 Azospirillum brasilense 로부터유래된 aldehyde dehydrogenase (KGSADH) 유전자를 puc19 벡터에클로닝한 puc19/kgsadh 재조합플라스미드가사용되었다 [7]. E. coli puc19/kgsadh 로부터 miniprep 방법으로재조합 puc19/kgadh 플라스미드를추출하였으며, 분리된재조합플라스미드 puc19/kgsadh 는전기천공법을사용하여 K. pneumoniae J2B 와 K. pneumoniae GSC021 에각각도입하였다. puc19/kgsadh 플라스미드가도입된재조합 K. pneumoniae 두균주는각각 J2B KGSADH, GSC021 KGSADH 로명명하였다 배양조건균주의개발및관리를위해서는 Luria-Bertani (LB) medium 이사용되었으며, 배양조건은진탕배양기에서온도 37 C, 교반속도 200 rpm이되도록유지하였다. 3-HP 및 1,3-PDO 동시생산을위한배지는 M9 최소배지에미량원소를첨가한배지와첨가하지않는배지가사용되었다. M9 최소배지의조성은증류수 1 L에 100 mm potassium phosphate buffer (ph 7.0), 220 mm glycerol, 1.0 g/l yeast extract, 1.0 g/l NaCl, 1.0 g/l NH 4 Cl, 0.25 g/l MgSO 4 7H 2 O로구성된다. 또한미량원소로는 70 mg/l ZnCl 2, 100 mg/l MnCl 2 4H 2 O, 60 mg/l H 3 BO 3, 200 mg/l CoCl 2 4H 2 O, 20 mg/l CuCl 2 2H 2 O, 25 mg/l NiCl 2 6H 2 O, 35 mg/l Na 2 MoO 4 2H 2 O, 5.0 g/l FeSO 4 7H 2 O가사용되었다 [16]. 세포내재조합플라스미드유지를위해배지에 50 μg/ml의 kanamycin이포함되도록하였으며, 플라스미드의과발현을유도하기위해 isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) 가 0.2 mm 농도로첨가되었다. 배양조건에서 aeration 을조절하기위해 250 ml 플라스크에배양액의부피를 50 ml, 100 ml 로달리하였으며, 이조건을각각 aerobic, microaerobic 으로간주하였다. anaerobic 조건은 serum bottle 을부틸고무마개와알루미늄캡으로밀봉하고아르곤가스를주입하여형성하였다 효소활성측정 DhaB 효소활성은 AldH 의효소활성과의커플링반응에의해분석되었으며, NAD + 의환원속도를 UV-spectrophotometer 340 nm 에서관찰하였다. 산소에의한 DhaB 효소의불활성화를피하기위해서효소활성은모두혐기성조건에서수행하였다. 간단하게 DhaB 효소활성측정방법을설명하면다음과같다. 먼저 potassium phosphate buffer (20 mm, ph 8.0) 에 3 mm MgCl 2 와 40 mm 1,2-propanediol 을넣은반응혼합물을 anaerobic cuvette 에넣고질소가스를주입하여혐기성상태를만든다. 상기반응혼합물에 crude cell extract 와 12 U 의 alcohol dehydrogenase (A3263, Sigma) 를주사기로넣은뒤, 37 C 로설정된항온수조에서 3 분동안전배양시킨다. 효소반응은최종부피가 2 ml 이되도록하여 0.2 mm NAD +, 1.5 mm ATP, 15 µm coenzyme B 12 의첨가로개시한다 (Unpublished data). AldH 의활성은 340 nm 에서 NAD + 가 NADH 로환원되는속도를측정하여결정하였다 [6]. DhaT 의활성은효소의역반응 (1,3-PDO 에서 3-HPA) 을통해측정하였으며, 구체적인효소활성측정은 Suman et al. 에의해기술된방법을사용하였다 [20] 분석방법배양된세포의농도는 UV spectrophotometer (Lambda 20, Perkin Elmer, USA) 를이용하여 600 nm에서 optical density (OD 600 ) 로측정하였다. 글리세롤, 3-HP, 1,3-PDO 및여러대사물질들의생산량은 2.5 mm H 2 SO 4 를이동상으로사용하여 high-performance liquid chromatography (Agilent Technologies, HP, 1200 series) 로분석하였다. 분석샘플은배양액을채취하여 13,000 rpm에서 10분간원심분리한후상등액을회수하여 0.2 μm nylon 필터로여과하여준비하였으며, 컬럼은 mm Aminex HPX-87H (Bio-Rad, USA) 를이용하였다. 효소활성분석에사용된단백질농도는 Bradford assay를사용하여정량하였다 [21]. Table 1. List of strains and plasmids used in this study Strains and plasmids Description Source/reference Strains E. coli DH5 alpha Cloning host KCCM, Korea J2B Expression host: Klebsiella pneumoniae J2B [19] J2B KGSASDH Klebsiella pneumoniae J2B harboring KGSADH on the puc19 plasmid This study GSC021 Expression host: Klebsiella pneumoniae GSC021 GS caltex GSC021 KGSADH Klebsiella pneumoniae GSC021 harboring KGSADH on the puc19 plasmid This study Plasmid puc19/kgsadh puc19-lac promoter; KGSADH; Km r [7]

4 새로이분리된 Klebsiella pneumoniae 균주들의글리세롤기반 3-hydroxypropionic acid 및 1,3-propanediol 동시생산성평가 RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 새로이분리된 K. pneumoniae 균주들의침강양상비교균주들의침강특성은분리정제공정에있어필수적인고려사항인데이는생물공정의상업화에중요한역할을하기때문이다 [22]. LPS 생산량이많을수록세포침전이어려우며, 원심분리후에도세포가쉽게배지에분산되는침강특성을가진다 [19]. 따라서 LPS 생산량이많고침강능력이떨어지는 K. pneumoniae DSM2026 (DSM2026) 을대조군으로사용하여새로이분리된 J2B 와 GSC021 의침강양상을비교하였다 (Fig. 1). 침강양상을조사하기위해균주를 M9 배지에서 24 시간동안 37 C, 200 rpm 으로배양하였으며, 세포성장정도를측정하여 ~3 OD 600 정도의세포양을가지도록 2 ml tube 에수집하였다. 침강양상은원심분리시간을달리하여비교하였으며, 원심분리를시킨뒤한차례뒤집었을때의변화도관찰하였다. 그결과원심분리를 5000 rpm 에서 2 분간하였을경우, DSM2026 은거의침강이되지않았으며 GSC 021 는 DSM2026 보다는침강정도가높았으나, J2B 보다는낮았다. 또한 5000 rpm 에서 10 분간원심분리를하였을경우, DSM2026 은여전히 buffer 에분산되어있었으나 GSC021 과 J2B 는모두안정적인세포침전이얻어졌다 rpm 에서 10 분간원심분리후한차례뒤집었을경우에확실하게 DSM 2026 < GSC021 < J2B 순서로침강정도가높은것을알수있었다. 침강특성면에서 DSM2026 에비해 J2B 와 GSC021 이우수한균주임을알수있다. 또한이와같은침강특성은새로분리된균주들의 LPS 생산량이 DSM2026 에비해적다는것을의미한다 J2B 와 GSC021 에서글리세롤 assimilation 및 coenzyme B 12 합성관련유전자들의조사 J2B 와 GSC021 에서글리세롤 assimilation 및 coenzyme B 12 에관련된주요오페론들의차이를알아보기위해 dha, glp, cob 오페론등의 protein sequence 를분석하였다 (Fig. 2(a)). J2B 의 genome 정보는 whole genome sequencing 으로, GSC021 정보는 contigs 형태로획득하였다. K. pneumoniae 는글리세롤 assimilation 을위한대사경로가잘발달되어있다. 특히 dha 오페론은 reductive assimilation pathway 에관련되어있으며, glp 오페론은 oxidative assimilation pathway 에관련되어있는것으로알려져있다. J2B 와 GSC021 모두 dhak, dhak2 (dhal), dhak3 (dham) 등 reductive pathway 에관련된유전자들이함께 cluster 되어있는것으로확인되었으며, dha 오페론의 transcription regulator 인 dhar 또한두균주모두에서확인되었다. 이오페론들의 protein sequence alignment 를수행한결과, J2B 와 GSC021 이 99% 상동성을가지는것으로나타났다. oxidative assimilation pathway 에서주요유전자로알려진 glpk, glpd, glpabc 또한 J2B genome 에서확인된유전자배열이 GSC021 에서도동일한것으로확인되었다. glp 오페론들의 protein sequence alignment 역시 J2B 와 GSC021 이 99% 상동성을가지고있는것으로분석되었다. J2B 와 GSC021 에서 1, 3-PDO 생산경로에속하는유전자들은다른 K. pneumoniae 와마찬가지로두개의오페론에나눠져존재하는것으로확인되었다. 1,3-PDO 생산에서첫번째단계를촉매화하는 glycerol dehydratase (DhaB) 는 dhab1, dhab2, dhab3 유전자에의해암호화되며, 이유전자들은 glycerol dehydratase reactivation factor 의 subunit 으로알려진 gdra 와함께하나의오페론 Fig. 1. Comparison of the sedimentation property of DSM, GSC021 and J2B strains. The cultures of three strains were examined without centrifugation (a), centrifuged at 5000 rpm for 2 min (b), centrifuged at 5000 rpm for 10 min (c) and inverted once after centrifuging at 5000 rpm for 10min (d).

5 250 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): (2016) Fig. 2. Genes of K. pneumoniae involved in assimilation of glycerol (through oxidative and reductive pathways) and biosynthesis of coenzyme B 12. dha/glp operons (a) pdu/cob operons (b), predicted transcription factors and promoters of dhab and dhat operons (c) are presented. The genes coding for proteins involved in the reductive pathway of glycerol are shown in white arrows. 에배열되어있다. 반면 DhaT 를암호화하는유전자인 dhat 는 dhab 와반대편오페론에서전사되는것으로확인되었다. 또한 glycerol dehydratase reactivation factor 의두번째 subunit 인 gdrb 는 dhat 유전자와같은오페론에있으며, dhat 유전자앞에 gdrb 가있는것으로확인되었다. J2B 와 GSC021 에서 1,3-PDO 생산관련된유전자들의배열뿐만아니라 protein sequence alignment 에서도 dhab1, dhab2, dhab3, gdra, gdrb, dhat 유전자모두 99% 이상의상동성을가지고있는것으로분석되었다. 추가적으로 DhaB 와 DhaT 사이에존재하는 intergenic region 에결합하는다양한전사제어인자종류및자리를예측해보았다 (Fig. 2(c)). 그결과비록 prediction score 는낮지만, ArcA, CRP, ArgR, PurR 등과같은다양한전사제어인자들이결합할수있는것으로나타났다. DhaB 의조효소로알려진 coenzyme B 12 또한 3-HP 와 1,3- PDO 생산성을결정하는중요한요소이다. 따라서 J2B 와 GSC 021 에서 coenzyme B 12 의합성에필요한효소들을암호화하는 cob 오페론들에대해서도 protein sequence alignment 분석이이루어졌다 (Fig. 2(b)). J2B 와 GSC021 에존재하는 coenzyme B 12 생산관련유전자들은산소비의존성 coenzyme B 12 합성경로를가지고있으며, 이는 Pseudomonas denitrificans 에존재하는산소의존성경로와확연히차이가있었다. coenzyme B 12 합성관련된 20 개의유전자들이하나의오페론에서 cluster 되어있으며, J2B 와 GSC021 사이에 coenzyme B 12 관련유전자의구성및배열은모두동일한것으로확인되었다. coenzyme B 12 합성에서전사또는번역에관여하는것으로알려진 riboswitch 도 J2B 와 GSC021 에서 99% 의상동성을가지고있는것으로분석되었다 Aeration 에따른세포성장및동시생산성능조사본연구에서는 aeration 조건을달리하였을때 J2B 와 GSC021 의세포성장및동시생산효율을확인하고자하였다. 세포는 aerobic, microaerobic, anaerobic 조건에서배양되었으며, 여러가지 aeration 조건에서배양된두균주의세포성장과 3- HP 및 1,3-PDO 생산에대한비교분석이이루어졌다. 유전자재조합균주인 J2B KGSADH 의 specific growth rate 는 anaerobic, microaerobic, aerobic 에서각각 0.40, 0.53, 0.60 h -1 로 aeration 이증가함에따라 specific growth rate 도동일하게증가하였다. Fig. 3(a) 에서보는바와같이, final cell density 역시 aerobic 조건에서 OD 600 가 5.12 로가장높았으며, 다음으로높은조건은 microaerobic 로 OD 600 가 2.48 이었다. GSC021 KGSADH 또한 anaerobic, microaerobic, aerobic 에서 0.62, 0.67, 0.72 h -1 순으로 specific growth rate 가계산되었다. final cell density 도 aeration 이증가할수록 (2.15, 2.75, 4.84) 증가하는경향을보였다 (Fig. 3(b)). J2B 와 GSC021 을비교하였을때, 모든 aeration 조건에서 GSC021 의 specific growth rate 가높았으며, final cell density 은 aerobic 조건에서는 J2B 가 GSC021 보다약간높았으나, microaerobic 및 anaerobic 조건에서 GSC 021 이 J2B 보다높은것으로확인되었다. Fig. 3(c) 와 3(d) 에서는세가지다른 aeration 조건에서 J2B 와 GSC021 의 3-HP 및 1,3-PDO 동시생산결과를보여주고있다. J2B KGSADH 의경우, microaerobic 과 anaerobic 조건에서 3-HP 생산수율이모두 ~0.25 mol/mol 이었다. 반면, aerobic 조건에서는 3-HP 수율이 0.18 mol/mol 로감소하였다. 그러나 1,3-PDO 생산수율은 aerobic, microaerobic, anaerobic 에서각각 0.10, 0.22, 0.60 mol/mol 로 aeration 이감소함에따라큰폭으로증가하였다. 따라서전체동시생산수율은 aeration 이줄어듦에따라서점점증가하는경향을보였다. GSC021 KGSADH 균주의경우 J2B KGSADH 보다모든조건에서 3-HP 생산수율이비슷하거나낮았으며, 그값은대략 0.20 mol/mol 로나타났다. 반면 1,3-PDO 생산수율은 J2B 균주와동일하게 aeration 이감소함에따라점차적으로증가하는경향을보여주었다. GSC021 KGSADH 에서가장높은 1,3-PDO 생산수율은 0.52 mol/mol 로 anaerobic 에서관찰되었으며, microaerobic 에서는 0.28 mol/ mol, aerobic 에서는 0.16 mol/mol 이었다. 1,3-PDO 수율변화와마찬가지로동시생산수율은 aeration 이낮을수록높았다. 이와같이두균주모두 aeration 조건에따라서세포성장및

6 새로이분리된 Klebsiella pneumoniae 균주들의글리세롤기반 3-hydroxypropionic acid 및 1,3-propanediol 동시생산성평가 251 Fig. 3. Effect of aeration on cell growth (a, b) and co-production (c, d) of 3-HP and 1,3-PDO by J2B KGSADH (a, c) and GSC021 KGSADH (b, d). Symbols: (a, b) closed circle: aerobic, semi-closed circle: microaerobic, open circle: anaerobic; (c, d) grey bar: 3-HP yield, white bar: 1,3-PDO yield, closed circle: total co-production yield of 3-HP and 1,3-PDO. 동시생산수율이서로연관되어변화하는것을알수있었다. 글리세롤이세포성장쪽으로많이사용되면동시생산수율이낮아지고, 글리세롤이세포성장쪽으로적게사용되면동시생산수율이높아지는경향을보였다. 따라서두균주모두 anaerobic 조건에서 3-HP 및 1,3-PDO 동시생산수율이높은것으로확인되었다. J2B KGSADH 의경우동시생산수율이최대 0.80 mol/mol 이었으며, GSC021 의경우동시생산수율이최대 0.72 mol/mol 이었다. J2B KGSADH 의동시생산수율이 GSC021 보다약간높은이유는 J2B KGSADH 의세포성장이 GSC021 KGSADH 보다상대적으로낮은것과관련이있다. 또한동시생산비 (3-HP/1,3-PDO) 를 aerobic, microaerobic, anaerobic 순으로비교해본결과 J2B KGSADH 의경우 1.68, 1.02, 0.39 였으며, GSC021 의경우 0.83, 0.44, 0.31 로나왔다. aeration 이증가함에따라 3-HP 생산비율이점차적으로증가되었다. 이는 Table 2 의 redox balance 결과에서볼수있듯이, aeration 조건에서 NADH 에서 NAD + 로의전환이 electron transport chain (ETC) 에의해효과적으로일어남으로써 NAD + /NADH 비율이향상되고결국 3-HP 생산에사용될수있는 NAD + 가증가했기때문으로추정된다. Aeration 조건에따른대사산물분석에서또한동시생산에대한 aeration 효과를확인할수있다. Table 2 에서보는바와같이 glycolysis 를통해소비된글리세롤이 pyruvate 나 phosphoenolpyruvic acid (PEP) 로부터생성되는부산물의생성에 사용된것을알수있다. 두균주모두높은 aeration 조건에서는최대 50% 정도의글리세롤을 acetate, 2,3-butanediol (2,3- BDO) 등의생산에소비하였으며, anaerobic 에서는약 30% 정도의글리세롤을 acetate, ethanol 생산에소비하였다. 다른 aeration 조건과는달리 microaerobic 에서두균주가다른경향을보였다. J2B KGSADH 의경우약 40% 의글리세롤을 acetate, 2,3-BDO, Ethanol 생산에소비한반면, GSC021 의경우약 50% 의글리세롤을 acetate, lactate, 2,3-BDO, ethanol 등에사용하였다. 이또한동시생산수율이 aeration 의증가에따라감소하는원인이다. aeration 조건에따라생산되는부산물에차이가나는이유는 aeration 에따라활발하게활동하는효소의종류가다르기때문이다. Aeration 에따른두균주의세포성장및동시생산결과로부터 3-HP 및 1,3-PDO 동시생산수율이 glycolysis 로사용되는글리세롤의양에의해결정되는것을확인하였다. 또한동시생산수율이 3-HP 에의해결정됨은 glycolysis pathway 에서필요한조효소 NAD + 가 3- HP 생산에서필요한 AldH 의조효소와동일하여조효소경쟁이일어남을보여주는결과이다 온도변화에따른세포성장및동시생산성능조사본연구에서는배양온도에따른두 K. pneumoniae 의세포성장및동시생산성능을비교하였다. 세포는동시생산수율이가장우수한조건인 anaerobic 에서온도를 37 도, 30 도로달리

7 252 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): (2016) Table 2. Metabolites profile of J2B KGSADH and GSC021 KGSADH grown under different aeration condition Strains and conditions Substrates and metabolites J2B KGSADH GSC021 KGSADH Aerobic Microaerobic Anaerobic Aerobic Microaerobic Anaerobic Substrate (mm) Glycerol Biomass Metabolites (mm) 3-HP ,3-PDO HP and 1,3-PDO Acetate Lactate Succinate ,3-BDO Ethanol Total by-products a Carbon recovery (%) Redox balance (mm) NADH formed NADH consumed a Acetate, Lactate, Succinate, 2,3-BDO and Ethanol. 하여배양되었다. Fig. 4(a) 에서보는바와같이 J2B KGSADH 는 30 도에서 final cell density 가 2.0 으로 37 도에서의 final cell density 보다 0.5 정도높은것으로나타났다. 반면 GSC021 KGSADH 의경우두온도에서 final cell density 는비슷하였으나, 30 도 (0.52 h -1 ) 보다 37 도 (0.62 h -1 ) 에서 specific growth rate 가약간빠른것을알수있었다 (Fig. 4(b)). 온도에따른세포성장결과에서예상할수있듯이, J2B KGSADH 는 37 도에서배양하였을때동시생산수율이 0.80 mol/mol 로 30 도에서배양하였을때의동시생산수율보다 0.05 정도높은결과를보였다 (Fig. 4(c)). 37 도에서활발한세포성장을보였던 GSC 021 KGSADH 는 30 도에서배양하였을때동시생산수율이 0.75 mol/mol 로 37 도에서배양하였을때보다수율이대략 0.10 mol/mol 만큼높은것으로나타났다 (Fig. 4(c)). 흥미롭게 도두균주모두 1,3-PDO 수율은온도에따라큰차이가없었으나, 3-HP 수율이온도에따라변하면서전체동시생산수율을결정짓는것으로확인되었다. 이와같이온도변화에따른세포성장조절을통해동시생산수율을변화시킬수있음은세포성장과동시생산에서글리세롤이용및조효소이용이서로경쟁관계에있음을다시한번의미하는결과이다 배양배지에따른 J2B 와 GSC021 의세포성장및동시생산성능조사 3-HP 및 1,3-PDO 생산에관련된효소들이특정금속이온의첨가에의해효소활성이향상된다는보고가있다 [23]. 이에미량원소를배지에첨가하여동시생산에관련된효소들의활성을최대화시켰을때 J2B KGSADH 와 GSC021 KGSADH Fig. 4. Effect of culture temperature on cell growth and co-production of 3-HP and 1,3-PDO by J2B KGSADH and GSC021 KGSADH. Cell growth of J2B KGSADH (a) and GSC021 KGSADH (b) and co-production yield of 3-HP and 1,3-PDO of J2B KGSADH and GSC021 KGSADH (c) are shown. Symbols: (a, b) solid line: 30 C, dotted line: 37 C; (c) grey bar: 3-HP yield, white bar: 1,3-PDO yield and closed circle, total co-production yield of 3-HP and 1,3-PDO.

8 새로이분리된 Klebsiella pneumoniae 균주들의글리세롤기반 3-hydroxypropionic acid 및 1,3-propanediol 동시생산성평가 253 의세포성장및동시생산변화를조사하였다. 세포는 M9 배지또는 M9 배지에미량원소를추가적으로넣은 Germ 배지에서배양되었다. 또한 M9 배지를사용하였을때동시생산수율이최대로나왔던조건에서실험이진행되었다. J2B KGSADH 의경우 anaerobic, 37 도에서 GSC021 KGSADH 의경우 anaerobic, 30 도에서배양되었다. Fig. 5(a) 에서보는바와같이 J2B KGSADH 와 GSC021 KGSADH 의세포성장이 M9 배지와 Germ 배지사이에큰차이가없는것을알수있다. 배지종류에상관없이 GSC021 KGSADH 의 specific growth rate 가 0.52 h -1 로 J2B KGSADH 보다빨랐고, final cell density 도 GSC021 KGSADH 가 2.5 OD 600 으로 J2B KGSADH 보다 0.5 OD 600 정도높은것을알수있었다. 동시생산수율에서또한 Germ 배지에서 J2B KGSADH 는 0.80 mol/mol, GSC021 은 0.75 mol/mol 로 M9 배지에서의결과와비교하였을때차이가없는것으로확인되었다 (Fig. 5(b)). 뿐만아니라두배지사이에서 3-HP 및 1,3-PDO 생산비에도변화가없었다. 부산물또한 M9 배지에서배양되었을때와마찬가지로두균주모두 acetate 와 ethanol 이주요부산물로생산되었으며, 그양또한차이가없었다. 따라서플라스크배양에서는 M9 배지에사용되는배지조성만으로도미량원소가충분히공급될수있음을알수있었다 HP 와 1,3-PDO 동시생산에관련된주요효소활성평가 J2B 와 GSC021 이비슷한 genome sequence 를가졌음에도불구하고서로다른동시생산수율및동시생산비를보인이유를알아보기위해, 동시생산에관련된세가지주요효소들에대한효소활성을조사하였다. 효소활성측정을위해 J2B 와 GSC021 은각각가장높은동시생산수율을보인조건에서배양되었다. J2B 의경우 37 도 200 rpm anaerobic 조건에서배양되었으며, GSC021 의경우 30 도 200 rpm anaerobic 조건에서배양되었다. 8 h, 16 h, 24 h 에서 DhaB, KGSADH, DhaT 에대한효소활성을측정하였다. DhaB 효소활성은 J2B 의경우모든시간에서 ~1.7±0.1 U/mg 로비슷하였으며, GSC021 의경 우모든시간에서 ~0.6±0.1 U/mg 로비슷한값을가졌다 (Fig. 6(a)). J2B 균주의 DhaB 활성이 GSC021 의 DhaB 활성보다 3 배정도높은것으로나타났다. 이러한 DhaB 의활성차이가같은조건에서 J2B 가 GSC021 에비해좀더높은수율을보여주는데도움을준것으로판단되었다. 흥미롭게도 KGSADH 효소활성측정결과에서는 J2B 균주가 GSC021 균주에비하여모든시간에서약간높은활성을보였다 (Fig. 6(b)). 또한 DhaT 활성측정결과에서는 GSC021 균주가 J2B 균주보다모든시간에서 2 배가량높은효소활성 (~1.3±0.05 U/mg) 을보였다 (Fig. 6(c)). KGSADH 효소활성을통해 J2B 균주가모든조건에서 GSC021 에비해높은 3-HP 생산비율을보인이유를알수있으며, 반대로 DhaT 활성을통해 GSC021 이 J2B 에비해높은 1,3-PDO 생산비율을보인이유를설명할수있다. 이와같이두균주가 DhaB 및 1,3-PDOR 활성에차이를보이는것은다양한전사조절인자로인해단백질발현수준이다를수있기때문이다. 또한 KGSADH 의경우 3-HP 및 1,3-PDO 의농도가증가함에따라효소활성이크게저해되는것으로알려져있다 [15]. 따라서두균주의 KGSADH 효소활성이시간에따라큰폭으로감소되는원인으로간주된다. 4. CONCLUSION 본연구에서는 LPS 생산이적은두 K. pneumoniae 균주들을이용하여 3-HP 및 1,3-PDO 의동시생산및산업균주로써의개발가능성을조사하였다. 균주들의동시생산성능평가를위해침강양상, genome sequence, 동시생산생산성및효소활성등이조사되었다. 두균주모두 DSM 균주보다월등히높은침강양상을보였다. 또한두균주가 genome level 에서도큰차이를보이지않았으며, 배양조건에따른동시생산성에도괄목할만한차이가없는것으로확인되었다. 다시말해두균주모두최소배지에서높은수율로 3-HP 및 1,3-PDO 의동시생산이가능하며, 산업적으로유용한균주가될수있음 Fig. 5. Effect of culture media (M9 minimal medium, M9 or germ medium, Germ) on cell growth (a) and co-production of 3-HP and 1,3- PDO (b). Symbols: (a) closed circle: J2B KGSADH, opened circle: GSC021 KGSADH, solid line: M9, dotted line: Germ; (b) grey bar: 3- HP, white bar: 1,3-PDO, closed circle: total co-production yield of 3-HP and 1,3-PDO.

9 254 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): (2016) Fig. 6. Enzyme activities of DhaB (a), KGSADH (b) and DhaT (c) in the crude cell extracts of J2B KGSADH and GSC021 KGSADH. Symbols: closed circle - J2B KGSADH, opened circle - GSC021 KGSADH. 을의미한다. 그러나동시생산수율및효소활성측면에서는비록그차이가크지는않지만 J2B 가조금더우수한것으로확인되었다. 이러한차이는균주성장과목적대사산물생산에분배되는탄소원의비율, 대사산물생성과균주성장에이용되는효소활성등의차이로설명이가능하였다. 본연구는새롭게분리되는균주에대해가능성과우수성을어떻게조사하는지보여주는예로써다른연구에도도움이될것으로기대된다. 향후 J2B 균주를대상으로세포성장으로의글리세롤흐름조절및불필요한대사경로의제거와같은 metabolic engineering 을통해동시생산수율을향상시킬수있을것으로기대된다. Acknowledgements 본연구는부산대학교기본연구지원사업 (2 년 ) 과부산대학교 BK 21 플러스사업단 ( 동남권화학신기술창의인재양성사업단 ) 의지원으로이루어졌으며, 이에감사드립니다. REFERENCES 1. Future chemical industry, Cover story (Catalyst). _rep&docnum=cr_99/cr99cover.asp (2016). 2. Bozell, J. J. and G. R. Petersen (2010) Technology development for the production of biobased products from biorefinery carbohydrates - the US Department of Energy s top 10 revisited. Green Chem. 12: Kumar, V., S. Ashok, and S. Park (2013) Recent advances in biological production of 3-hydroxypropionic acid. Biotechnol. Adv. 31: Raj, S. M., C. Rathnasingh, J. E. Jo, and S. Park (2008) Production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol by a novel recombinant Escherichia coli BL21 strain. Process Biochem. 43: Rathnasingh, C., S. M. Raj, J. E. Jo, and S. Park (2009) Development and evaluation of efficient recombinant Escherichia coli strains for the production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol. Biotechnol. Bioeng. 104: Raj, S. M., C. Rathnasingh, W. C. Jung, and S. Park (2009) Effect of process parameters on 3-hydroxypropionic acid production from glycerol using a recombinant Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 84: Ko, Y., S. Ashok, S. Zhou, V. Kumar, and S. Park (2012) Aldehyde dehydrogenase activity is important to the production of 3- hydroxypropionic acid from glycerol by recombinant Klebsiella pneumoniae. Process Biochem. 47: Ashok, S., S.M. Raj, Y. Ko, M. Sankaranarayanan, S. Zhou, V. Kumar, and S. Park (2013) Effect of puuc overexpression and nitrate addition on glycerol metabolism and anaerobic 3-hydroxypropionic acid production in recombinant Klebsiella pneumoniae Δglp- KΔdhaT. Metab. Eng. 15: Ashok, S., M. Sankaranarayanan, Y. Ko, K. E. Jae, S. K. Ainala, V. Kumar, and S. Park (2013) Production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol by recombinant Klebsiella pneumoniae ΔdhaTΔyqhD which can produce vitamin B12 naturally. Biotechnol. Bioeng. 110: Zhou, S., C. Catherine, C. Rathnasingh, A. Somasundar, and S. Park (2013) Production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol by recombinant Pseudomonas denitrificans. Biotechnol. Bioeng. 110: Maervoet, V. E., M. De Mey, J. Beauprez, S. De Maeseneire, and W. K. Soetaert (2010) Enhancing the microbial conversion of glycerol to 1,3-propanediol using metabolic engineering. Org. Process Res. Dev. 15: Kumar, V., M. Durgapal, M. Sankaranarayanan, A. Somasundar, C. Rathnasingh, H. Song, D. Seung, and S. Park (2016) Effects of mutation of 2, 3-butanediol formation pathway on glycerol metabolism and 1, 3-propanediol production by Klebsiella pneumoniae J2B. Bioresour. Technol. 214: Durgapal, M., V. Kumar, T. H. Yang, H. J. Lee, D. Seung, and S. Park. (2014) Production of 1, 3-propanediol from glycerol using the newly isolated Klebsiella pneumoniae J2B. Bioresour. Technol. 159:

10 새로이분리된 Klebsiella pneumoniae 균주들의글리세롤기반 3-hydroxypropionic acid 및 1,3-propanediol 동시생산성평가 Ashok, S., S. M. Raj, C. Rathnasingh, and S. Park (2011) Development of recombinant Klebsiella pneumoniae dhat strain for the co-production of 3-hydroxypropionic acid and 1,3-propanediol from glycerol. Appl. Microbiol. Biotechnol. 90: Kumar, V., M. Sankaranarayanan, K. E. Jae, M. Durgapal, S. Ashok, Y. Ko, R. Sarkar, and S. Park (2012) Co-production of 3-hydroxypropionic acid and 1, 3-propanediol from glycerol using resting cells of recombinant Klebsiella pneumoniae J2B strain overexpressing aldehyde dehydrogenase. Appl. Microbiol. Biotechnol. 96: Kumar, V., M. Sankaranarayanan, M. Durgapal, S. Zhou, Y. Ko, S. Ashok, R. Sarkar and S. Park (2013) Simultaneous production of 3-hydroxypropionic acid and 1, 3-propanediol from glycerol using resting cells of the lactate dehydrogenase-deficient recombinant Klebsiella pneumoniae overexpressing an aldehyde dehydrogenase. Bioresour. Technol. 135: Huang, Y., Z. Li, K. Shimizu, and Q. Ye (2012) Simultaneous production of 3-hydroxypropionic acid and 1,3-propanediol from glycerol by a recombinant strain of Klebsiella pneumoniae. Bioresour. Technol. 103: Huang, Y., Z. Li, K. Shimizu, and Q. Ye (2013) Co-production of 3-hydroxypropionic acid and 1,3-propanediol by Klebseilla pneumoniae expressing aldh under microaerobic conditions. Bioresour. Technol. 128: Arasu, M. V., V. Kumar, S. Ashok, H. Song, C. Rathnasingh, H. J. Lee, D. Seung, and S. Park (2011) Isolation and characterization of the new Klebsiella pneumoniae J2B strain showing improved growth characteristics with reduced lipopolysaccharide formation. Biotechnol. Bioprocess Eng. 16: Lama, S., S. M. Ro, E. Seol, B. S. Sekar, S. K. Ainala, J. Thangappan, H. Song, and S. Park (2015) Characterization of 1,3-propanediol oxidoreductase (DhaT) from Klebsiella pneumoniae J2B. Biotechnol. Bioprocess Eng. 20: Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: Chmielowski, R. A., H. S. Wu, and S. S. Wang (2007) Scale-up of upstream and downstream operations for the production of glucosamine using microbial fermentation. Biotechnol. J. 2: Jiang, W., S. Wang, Y. Wang, and B. Fang (2016) Key enzymes catalyzing glycerol to 1, 3-propanediol. Biotechnol. Biofuels. 9: 1.