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보나 경
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1 J Koren Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 42(11), 1872~1877(2013) 젖산생성능이우수한김치유래젖산균의분리및두유발효특성 이란숙 1 정경희 1 최웅규 2 조장원 1 김경임 3 김영찬 1 1 한국식품연구원 2 한국교통대학교식품공학과 3 혜전대학교호텔조리외식계열 Isoltion nd Identifiction of Lctic cid Producing Bcteri from Kimchi nd Their Fermenttion Properties of Soymilk LnSook Lee 1, Kyung Hee Jung 1, UngKyu Choi 2, ChngWon Cho 1, KyungIm Kim 3, nd YoungChn Kim 1 1 Kore Food Reserch Institute, Gyeonggi , Kore 2 Dept. of Food Science & Technology, Kore Ntionl University of Trnsporttion, Chunguk , Kore 3 Division of Hotel Culinry Arts & Foodservice, Hyejeon College, Chungnm , Kore ABSTRACT Lctic cid cteri ere selected on the sis of lctic cid producing ility from kimchi, trditionl Koren fermented food. Among the initil screening of over 150 strins selected from the smple, 27 strins ere selected s lctic cid producing cteri, nd 4 strins ere finlly selected sed on their ility to produce reltively high levels of lctic cid. The four strins ere identified s Lctocillus (L.) plntrum Gk04, Pediococcus pentosceus Gk07, L. revis Gk35 nd L. curvtus Gk36 y the conventionl morphologicl, culturl, physiologicl nd iochemicl chrcteristics, s ell s y 16S rrna sequence nlysis. Among the identified lctic cid cteri, L. curvtus Gk36 s used for soymilk fermenttion. The vile cell counts nd cidity vlues mesured for the L. curvtus Gk36 ere comprle to the commmercil L. cidopillus. Thus, the L. curvtus Gk36 is potentil proiotic strin to prepre fermented soy products, such s kephir, yogurt, tempeh nd soy suce. Key ords: lctic cid, kimchi, lctic cid cteri, soymilk, Lctocillus curvtus 서 두유의주원료인콩 (Soyen, Glycine mx. L) 은 isoflvone, sponin, oligoscchrides 등의기능성성분이많이함유되어있고양질의단백질과지방질을함유하고있는영양학적으로우수한식품이다. 두유는유당을포함하고있지않아우유에의한유당불내증과알레르기를일으키는유아를위한고단백우유대체식품으로서의가치를인정받고있으며성인병예방에좋은식물성영양음료로서인식이더욱확대되고있다 (1). 최근에는두유를젖산균등 GRAS (generlly regrded s sfe) 미생물로발효시켜 isoflvone, 유리아미노산, 펩타이드등의체내흡수율증가, 콩비린내저감및항산화효과증진등기능성을높일수있는발효두유에대한관심이증대되고있다 (25). 젖산균은오랫동안산업적으로이용되어온중요한균주중하나로자연계에널리분포하고있으며인간의장내에서 론 Received 12 July 2013; Accepted 9 August 2013 Corresponding uthor. Emil: yckim@kfri.re.kr, Phone: 정상균총을형성하는그람양성의구균또는간균으로 ctlse 음성을나타낸다. 이러한젖산균은유가공품과발효식품인김치, 된장, 간장등에서풍미를향상시키고, cteriocin과같은미생물생육억제물질과다량의젖산을생성하여식품내의부패균성장을억제하는등식품의보존성과안전성향상에기여하고있다 (68). 특히김치는배추나무를주원료로마늘, 생강, 고춧가루등다양한향신료를첨가하여발효시킨한국전통의발효식품으로 (9,10), 김치발효에관여하는주발효균인젖산균은발효초기에는 Leuconostoc 속이우세하게증식하며발효후기에는 Lctocillus 속이왕성하게증식하는것으로알려져있다 (11). 시중에판매중인발효두유는 Lctocillus(L.), L. ulgricus 등젖산균을이용하여제조한예는있으나, 우리나라전통식품인김치유래젖산균을이용하여유음료에적용시킨사례는거의없다. 따라서본연구에서는두유의영양학적가치를높이기위한기초연구로서한국의전통발효식품인김치로부터젖산발효도와성장력이우수한균주를분리및동정하였으며, 분리균주및시판균주를이용하여두유의발효특성에대한연구를수행하였다.

균주의생육과정에서산을생성하여노란색을띠는균주를선별하였으며 MRS 평판배지에 3회에걸쳐순수배양하여형성된 colony 중에서투명환 (cler zone) 이가장큰 4개의균주를선발하였고 70 C에보존하면서실험에사용하였다. AACC method 0231(13) 에따라적정산도를측정하였다. 즉배양액 10 ml를동량의증류수를넣고균질화한후 1.

2 젖산생성능이우수한김치유래젖산균의분리및두유발효특성 1873 재료및방법김치로부터젖산균의분리및배양경기도일대의각가정에서수집한배추김치전체를마쇄한후멸균거즈로여과한액을유효균주분리를위한시료로사용하였다. 시료를희석한후 0.1 ml를취하여 0.01% romocresol green이첨가된 MRS(Difco Lortories, Detroit, MI, USA) 한천배지에도말하여 30 C에 48시간배양하였다. 균주의생육과정에서산을생성하여노란색을띠는균주를선별하였으며 MRS 평판배지에 3회에걸쳐순수배양하여형성된 colony 중에서투명환 (cler zone) 이가장큰 4개의균주를선발하였고 70 C에보존하면서실험에사용하였다. AACC method 0231(13) 에따라적정산도를측정하였다. 즉배양액 10 ml를동량의증류수를넣고균질화한후 1.0% phenolphthlein 지시약을가하여 0.1 N NOH 용액으로적정하여소비된 NOH 용액의부피를산도로환산하여계산하였다. 분리균주를이용한두유발효특성콩은 5 C에서 24시간불려껍질을제거하고물기를제거한대두의 15배 (v/) 가되도록증류수를가한후분쇄하였으며여과한두유를 80 C에서 30분간저온살균하여사용하였다. 두유의발효는살균한두유를냉각시킨후전배양한젖산균을 1% 접종하여 30 C에서 24시간동안정치배양하면서 3시간간격으로시료를채취하여분석하였다. 분리균주의형태및생화학적특성분리세균의특성조사는그람염색후광학현미경 (BX60, Olympus, Tokyo, Jpn) 을통한형태학적관찰, ctlse 활성여부및 API 50 CHL kit(biomérieux s, Mrcy I'Etoile, Lyon, Frnce) 에의한 50여종의탄수화물이용성을확인하였다. API 50 CHL 실험에의한 strip의판독은각 tue의색변화로 negtive(), positive() 등으로판정하였으며 API 50 CHL dtse를이용하여동정하였다. 통계처리모든분석결과는 SPSS progrm(spss, version 17.0, SPSS Inc., Chicgo, IL, USA) 을사용하여통계처리하였으며 5% 수준에서분산분석 (ANOVA) 을이용한 Duncn의다중범위검정또는 Student's ttest를실시하여유의적차이를검정하였다. 결과및고찰 분리균주의 16S rrna 유전자염기서열분석선발균주의동정은 16S rrna의염기서열결정및상동성검색을통하여실시하였다. 선발균주는 MRS 액체배지에서 24시간배양하여 genomic DNA를추출 (SolGent TM Cenomic DNA Prep kit, Solgent Co., Ltd., Dejeon, Kore) 후 riosoml RNA gene 증폭을위하여 universl primer 27F(5'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG3') 와 1492R(5'GGT TAC CTT GTT ACG ACT T3') 을사용하였으며염기서열은 ABI PrismTM BigdyeTM Termintor Cycle Sequencing Redy Rection kit v3.1(applied Biosystems, Foster, CA, USA) 와 ABI 3730XL cpillry DNA Sequencer(Applied Biosystems) 를사용하여 ( 주 ) Solgent에서염기서열을분석하였다. 염기서열결정은 NCBI( 와 EzTxon server 2.1( 에등록된염기서열정보를대상으로가장높은상동성을나타내는분류군을해당염기서열에해당하는 cteri로결정하였으며, PHYLIP pckge(12) 의 Dndist와 Neighor progrm에기초해서계통도를나타내었다. 젖산균의분리김치시료로부터약 150여종의균주를 1차선별한후 0.01% romocresol green이첨가된 MRS 한천배지에천자배양하여젖산생성균이생성한산에의해노란색의 cler zone을형성하는총 36 colony의젖산생성균을분리하여이들을각각 Gk01에서 Gk36으로명명하고, 각 colony에대하여젖산생성선별배지에 toothpick 기법으로접종하여 24시간및 48시간배양 (Fig. 1) 후의활성도를 cler zone의크기로측정한결과 Tle 1에나타낸바와같이 (A) (B) 분리균주의생육특성분리균주를 37 C에서정치배양하면서 3시간간격으로시료를채취하여 600 nm에서흡광도를측정 (UV1601 UVVis Spectrophotometer, Shimdzu Co. Ltd., Tokyo, Jpn) 하여생육곡선을작성하였으며, 생육에따른산도는 Fig. 1. Imge for cler zone formtion y lctic cid cteri isolted from kimchi on MRS gr plte ith 0.01% romocresol green. (A) fermenttion for 24 h, (B) fermenttion for 48 h.

3 1874 이란숙 정경희 최웅규 조장원 김경임 김영찬 Tle 1. Cler zone size s ctivity of lctic cid producing lctic cid cteri Strins Gk01 Gk03 Gk04 Gk06 Gk07 Gk09 Gk10 Gk11 Gk12 Gk13 Gk14 Gk15 Gk16 Gk17 Gk18 Gk19 Gk20 Gk21 Gk22 Gk23 Gk24 Gk25 Gk29 Gk30 Gk33 Gk35 Gk36 Cler zone size (mm) 24 h fermenttion 48 h fermenttion 4.2± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.10 총 27종의젖산생성균주를얻었다. 이중상대적으로성장속도가빠르고 cler zone의크기가 9 mm 이상인 Gk04, Gk07, Gk35 및 Gk36을젖산생성능력이우수한균주로선발하였다. 젖산균의동정김치시료로부터분리한균주의동정을위해그람염색에의한형태, ctlse 생성여부및 49개의탄소원에대한이용성차이로동정하는생화학적인방법인 API test결과는 Tle 2에나타내었으며동정용프로그램을이용하여해석한결과, Gk04는 L. plntrum과 93.8%, Gk07은 Pediococcus(Ped.) pentosceus와 99.8%, Gk35는 L. revis와 98.5%, Gk36은 L. curvtus와 98.5% 유사한것으로판정되었다. 종수준까지의정확한동정을위하여분자생물학적기술을이용한각균주의 16S rrna 염기서열분석을통하여상동성을비교하였다. 일반분류학상으로 이상의염기서열상동성을나타내는균주들의경우하나의종으로정의할수있는데분석결과 Tle 3에나타낸바와같이 97~ 99% 의상동성을나타내었으며각각 L. plntrum Gk04, Ped. pentosceus Gk07, L. revis Gk35 및 L. curvtus Gk36으로명명하였다. Lctocillus 및 Pediococcus 속 Tle 2. Morhologicl nd iochemicl chrcteristics of the strins isolted from kimchi Chrcteristics Morphology shpe Grm stin Ctlse Glycerol Erythritol DArinose LArinose Riose DXylose LXylose Adonitol MethylβDxylopyrnoside DGlctose DGlucose DFructose DMnnose LSorose Rhmnose Dulcitol Inositol Mnnitol Soritol αmethyldmnnoside αmethyldglucoside NAcetylglucosmine Amygdlin Arutin Esculin Slicin Celloiose Mltose Lctose Meliiose Sucrose Trehlose Inulin Melezitose Rffinose Strch Glycogen Xylitol Gentioiose DTurnose DLyxose DTgtose DFucose LFucose DAritol LAritol Gluconte 2ketogluconte 5ketogluconte Rection Gk04 Gk07 Gk35 Gk36 rod coccus rod rod : positive rection, : negtive rection, : ek positive. 은김치와같은발효된야채나과일에존재하는젖산균으로일반적으로 Lctocillus 속의젖산균은발효유제품에서

4 젖산생성능이우수한김치유래젖산균의분리및두유발효특성 1875 Tle 3. Identifiction nd identity percentge of isolted strins y API 50 CHL nd 16S rrna nlysis Strin No. Identifiction API 50 CHL Gk04 Gk07 Gk35 Gk36 Lctocillus plntrum Pediococcus pentosceus Lctocillus revis Lctocillus curvtus 93.8% 99.8% 98.5% 98.5% 27F 99% 16S rrna 1492R 98% 99% Fig. 2. Phylogenetic reltionship eteen L. curvtus Gk36 nd other relted cteri sed on 16S rrna sequence. 도확인되는반면, Pediococcus 속젖산균은유제품에는잘이용되지않으며된장이나간장양조에중요한젖산균으로알려져있다. 본연구에서는유제품제조에주로이용되는 Lctocillus 속중젖산생성능이상대적으로우수한 L. curvtus Gk36을두유발효를위한최종균주로사용하였으며이균주의유전학적계통수 (phylogenetic tree) 는 Fig. 2에나타내었다. 까지감소하였음을보고한바있다. 배양온도에따른균체의생육, ph 및산생성정도를관찰한결과는 Fig. 4와같다. 각온도에서 24시간배양후균체의생육정도를측정한결과 25 C 및 30 C에서유의적으로가장높게나타났으며배양액의 ph를측정한결과는 45 C 에서유의적으로가장높게나타났으며 25, 30 및 37 C에서는유의적으로차이를보이지않았다. 산도측정결과는 ph L. curvtus Gk36 의생육특성 L. curvtus의배양시간에따른생육, ph 및산생성정도를경시적으로관찰한결과는 Fig. 3과같다. 균체의생육은배양 6~15시간에증가폭이가장크게나타났으나배양 15 시간이후부터는증가폭이둔화되었고, 24시간이후에는균의생장에변화가거의없음을알수있었다 (Fig. 3A). 배양액의 ph는초기 6.34에서배양 15시간후 3.84 수준까지도달했으나그이후는거의변함이없음을보여주었다 (Fig. 3A). 배양액의산도는초기 0.27에서배양 6시간에 0.32, 18시간에 1.57로배양 6~18시간에증가율이높았다. 이는균의생장을나타내는흡광도값의변화와일치하는경향을보였다 (Fig. 3B). L. curvtus는다양한박테리오신을생산하는대표적인젖산균으로서특히식품단백질로부터내인성항균펩타이드를생산하여식품의안전성과안정성을높이는것으로알려져있다 (1416). Ahmdov 등 (17) 의보고에의하면 Azerijni cheese에서분리한 L. curvtus 는배양 2시간부터급격히성장하여 8시간이후부터는정지기에들어갔으며발효시간에따른배양액의 ph는초기 7.2 에서배양 12시간까지급격히감소하여 25시간배양후 3.8 Acidity (%) (B) Time (h) Fig. 3. Kinetics of groth, ph (A) nd cidity (B) during the cultivtion of L. curvtus Gk36 in MRS medi t 30 C.

5 1876 이란숙 정경희 최웅규 조장원 김경임 김영찬 c Asornce (OD 660nm) ph Acidity (%) Fig. 4. Effect of temperture on groth, ph nd cidity during the cultivtion of L. curvtus Gk36 in MRS medi for 24 h. Brs ith different letters for ech tretment represent significnt different mong the smple (Duncn's multiple rnge test, P<0.05). 값과반대경향을보였으며 45 C에서가장낮게나타나균생장및산생성정도를고려한다면 L. curvtus 의최적배양온도는 25~30 C임을알수있었다. 이러한결과는 Ksk 등 (18) 과 Mtrgs 등 (19) 이각각 Estonin semihrd cheese 및 Greek dry fermented slmi에서분리한 L. curvtus의최적배양온도는각각 30~37 C 및 30 C에서균체의생장률이가장높았다는보고와유사하였다. L. curvtus Gk36 의두유에서발효특성두유발효를위해본연구에서분리한김치유래 L. curvtus Gk36과젖산균발효음료, 정장제등식품및의약품제조에주로사용되며두유에서산생성능이우수하다고알려진 (20) 시판균주 L. cidophillus KCTC 3168을이용하여발효시간에따른생균수, ph 및산도를경시적으로관찰한결과는 Tle 4와같다. L. curvtus Gk36 균주의생균수는접종초기 6.29 log CFU/mL에서발효 24시간후 8.41 log CFU/mL까지증가하였으며, L. cidophillus KCTC 3168의생균수는접종초기 6.46 log CFU/mL에서발효 24시간후 8.15 log CFU/mL로나타났으나두균주간에유의적차이는없었다. ph는 L. curvtus Gk36의경우초 기 6.37에서발효 24시간후 5.21로감소하였고, L. cidophillus KCTC 3168은초기 6.25에서발효 24시간후 4.42까지감소하여 L. curvtus Gk36보다유의적으로더낮게나타났다. 산도는 L. curvtus Gk36의경우초기 0.08 에서발효 24시간후 0.21로증가하였고, L. cidophillus KCTC 3168은초기 0.08에서발효 24시간후 0.21까지증가하는것으로나타났으나두균주간에유의적차이는없었다. 두균주모두커드를형성하였으며이액없이부드러운상태를유지하였다. 일반적으로젖산균을이용한발효음료제조시젖산균이생성한산에의해커드가생성되는데산생성능은두유에서의미생물의생장정도및 crohydrtes 발효정도에의해결정된다. 젖산균은일반적으로두유에서도잘자라지만우유에비해산생성능은낮은것으로알려져있으며젖산균이생성한산에의해우유에서는 ph 5.2~5.3에서커드가생성되기시작하여 ph 4.6~4.7에서커드형성이완료되는것으로알려져있다 (2123). 요약본연구는경기도일대의배추김치로부터젖산생성능이우수한젖산균주분리및두유발효특성에대해조사하였다. 먼저 0.01% romocresol green이첨가된 MRS 한천배지에서 cler zone의 size 측정을통하여우수한젖산생성능을갖는균주를선발후탄수화물이용성조사및 16S rrna 염기서열분석으로 L. plntrum Gk04, Ped. pentosceus Gk07, L. revis Gk35 및 L. curvtus Gk36이동정되었으며특히 99% 의상동성을갖는 L. curvtus Gk36을두유발효를위한최종균주로사용하였다. L. curvtus Gk36과시판균주 L. ctocillus에의한두유발효결과 ph는 L. ctocillus에서유의적으로더낮은것으로나타났으나생균수및산도측정결과두균주간에유의적차이가없는것으로나타나 L. curvtus Gk36 균주는두유발효등발효제품제조를위한젖산균균주로이용이가능할것으로판단되었다. Tle 4. Chnges in ph, cidity nd vile cell counts of soymilk fermented ith L. curvtus Gk36 nd L. cidophillus KCTC 3168 t 30 C for 24 h Fermenttion time (h) 0 24 Vile cell counts (log CFU/mL) L. curvtus Gk36 L. cidophillus KCTC 3168 ph L. curvtus Gk36 L. cidophillus KCTC 3168 Acidity (%) L. curvtus Gk36 L. cidophillus KCTC ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.05 * 4.42± ± ±0.01 * Significnt differences eteen L. curvtus Gk36 nd L. cidophillus KCTC 3168 mesured y Student's ttest (P<0.05). 감사의글 본연구는농림축산식품부수출전략기술개발사업에의해이루어진것으로연구비지원에감사드립니다. REFERENCES 1. Chou CC, Hou JW Groth of ifidocteri in soymilk nd their survivl in the fermented soymilk drink during storge. Int J Food Microiol 56: Kno M, Tkyngi T, Hrd K, Sd S, Ishik F Biovilility of isoflvones fter ingestion of soy everges in helthy dults. J Nutr 136: Jng JK, Yoon SH Preprtion of soy yogurt using isolted soyen protein nd hey poder. J Koren Soc

6 젖산생성능이우수한김치유래젖산균의분리및두유발효특성 1877 Food Sci Nutr 26: Wng YC, Yu RC, Chou CC Groth nd survivl of ifidocteri nd lctic cid cteri during the fermenttion nd storge of cultured soymilk drinks. Food Microiol 19: Wng YC, Yu RC, Chou CC Antioxidtive ctivities of soymilk fermented ith lctic cid cteri nd ifidocteri. Food Microiol 23: Kim MJ, Kim GR In vitro evlution of cholesterol reduction y lctic cid cteri extrcted from Kimchi. Kore J Culinry Res 12: Klenhmmer TR Bcteriocins of lctic cid cteri. Biochimie 70: Mtsumur H, Tkeuchi A, Kno Y Construction of Escherichi colibifidocterium logum shuttle vector trnsforming B. longim 105A nd 108A. Biosci Biotech Biochem 61: Cheigh HS, Hng JH Antioxidtive chrcteristic of Kimchi. Food Industry nd Nutrition 5(3): Prk KY, Cheigh HS Antimutgenic nd nticncer effects of lctic cid cteri isolted from Kimchi. Bioindustry Nes 13: Stmer JR, Stoyl BO, Dunckel BA Groth rtes nd fermenttion ptterns of lctic cid cteri ssocited ith suerkrut fermenttion. Milk Food Technol 34: Felsenstein J PHYLIP (phylogeny inference pckge). version 3.6. Deprtment of Genetics, University of Wshington, Settle, WA, USA. 13. AACC Approved methods of the AACC. 10th ed. Americn Assocition of Cerel Chemists, St. Pul, MN, USA. Method Sudirmn I, Mthieu F, Michel M, Lefevre G Detection nd properties of curvticin 13, cteriocinlike sustnce produced y Lctocillus curvtus SB13. Curr Microiol 27: Grver KI, Murin PM Purifiction nd prtil mino cid sequence of curvticin FS47, hetstle cteriocin produced y Lctocillus curvtus FS47. Appl Environ Micro 60: Tichczek PS, Meyer JN, Nes IF, Vogel RF, Hmmes WP Chrcteriztion of the cteriocins curvcin A from Lctocillus curvtus LTH 1174 nd skcin P from Lctocillus ske LTH673. Syst Appl Microiol 15: Ahmdov A, Todorov SD, HdjiSfxi I, Choiset Y, Reson H, Messoudi S, Kuliyev A, de Melo Frncoc BDG, Choert JM, Hertlé T Antimicroil nd ntifungl ctivities of Lctocillus curvtus strin isolted from homemde Azerijni cheese. Aneroe 20: Ksk S, Admerg K, Orloski A, Vogensen FK, Møller PL, Ardö Y, Plme T Physiologicl properties of Lctocillus prcsei, L. dnicus nd L. curvtus strins isolted from Estonin semihrd cheese. Food Res Int 36: Mtrgs M, Metxopoulos J, Gliotou M, Drosinos EH Influence of ph nd temperture on groth nd cteriocin production y Leuconostoc mesenteroides L124 nd Lctocillus curvtus L442. Met Sci 64: Mitl BK, Steinkrus KH, Nylor HB Groth of lctic cid cteri in soymilks. J Food Sci 39: Liu K Soyens: chemistry technology nd utiliztion. Chpmn nd Hll, Ne York, NY, USA. p Donkor ON, Henriksson A, Vsiljevic T, Shh NP Proiotic strins s strter cultures improve ngiotensinconverting enzyme inhiitory ctivity in soy yogurt. J Food Sci 70: M375M Wlstr P, Jenness R Diry chemistry nd physics. John Wiley nd Sons, Ne York, NY, USA. p 264.

한수지 51(4), , 2018 Original Article Korean J Fish Aquat Sci 51(4), ,2018 해조류첨가가쌀코지제조와효소활성에미치는영향 전준영 이미향 1 정인학 1 정민정 김병목 * 한국식품연구원, 1 강릉원주대

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