224 현봉길 신경순 정한식 최서열 장민철 이우진 최근형 results suggest that NR assay is more effective for determining the survival of marine plankton and can be applied to

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승현 종
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1 The Sea Journal of the Korean Society of Oceanography Vol. 19, No. 4, pp , November Free Access 선박평형수처리시스템효율검증을위한해양플랑크톤생사판별시 Neutral red 염색법적용가능성연구 현봉길 1,2 신경순 1 정한식 1 최서열 1 장민철 1 이우진 1 최근형 1, * 1 한국해양과학기술원선박평형수센터 2 부경대학교해양학과 Application of Neutral Red Staining Method to Distinguishing Live and Dead Marine Plankton for the Investigation of Efficacy of Ship s Ballast Water Treatment System BONGGIL HYUN 1,2, KYOUNGSOON SHIN 1, HANSIK CHUNG 1, SEO-YEOL CHOI 1, MIN-CHUL JANG 1, WOO-JIN LEE 1 AND KEUN-HYUNG CHOI 1, * 1 Ballast Water Center, Korea Institute of Ocean Science & Technology, Geoje, , Republic of Korea 2 Department of Oceanography, Pukyong National University, Busan , Republic of Korea 선박평형수를통한외래종확산을방지하기위해국제해사기구 (IMO) 에서는 2004 년선박평형수관리협약을채택하였다. 이협약에따르면앞으로대부분의선박들은선박평형수처리시스템을통해서해양생물을사멸또는제거시킨후배출해야하며, 이는플랑크톤의생사판별방법을통하여이루어진다. 본연구에서는국제적으로선박평형수처리후생사판별법으로널리사용되고있는 fluorescein diacetate assay (FDA) 염색방법의제한성과이의대안으로 Neutral red (NR) 염색방법사용가능성을살펴보고자하였다. FDA 염색법은대부분의플랑크톤염색에되어서현재가장널리사용되는방법임에도불구하고본연구에서는 Ditylum brightwellii 을제외한모든식물플랑크톤대해서낮은염색효율 ( 전체평균염색효율 <50%) 을보였으며, 식물플랑크톤이갖는고유한형광 ( 적색 ) 에간섭을많이받는것으로나타났다. 또한 FDA 는형광파장에노출된후빠르게색이바래지는경향도관찰되었다. 반면에 NR 은조사된모든동 식물플랑크톤개체수에대해서 90% 이상의높은염색효율을보였다. 두염색법모두포르말린을이용해서사멸시킨동 식물플랑크톤에대해서는염색이되지않았다. 본연구결과를통해서 NR 염색법을이용한동 식물플랑크톤생사판별은매우효율적이라고판단된다. In order to prevent the spread of non-indigenous aquatic species through the ballast water in commercial ships, International Maritime Organization (IMO) adopted in 2004 the International Convention for Control and Management of Ship s Ballast Water and Sediments. The Convention mandates treatment of ballast water for most transoceanic voyages and its confirmation of treatment is made with plankton live/dead assay. Fluorescein diacetate assay (FDA), which produces bright green light for live phytoplankton, has been a de facto standard method to determine the survival of marine plankton, but its staining efficacy has been in dispute. In the present study, we examined the limitation of FDA, and compared its efficacy with Neutral red (NR) staining, another promising assay and widely used especially for zooplankton mortality. For all phytoplankton species studied in the present study, except Ditylum brightwellii, the staining efficiency was <50% with FDA. The green FDA fluorescence interfered with phytoplankton autofluorescence in most samples. In contrast, NR assay stained over 90% of both phytoplankton and zooplankton species tested in this study. FDA assay also showed that green FDA fluorescence rapidly faded when phytoplankton cells were exposed to microscope light. Both FDA and NR assay were negative on formalin-killed individuals of both phytoplankton and zooplankton species. Our Received March 6, 2014; Revised May 13, 2014; Accepted September 3, 2014 *Corresponding author: Keunhchoi@kiost.ac 223

2 224 현봉길 신경순 정한식 최서열 장민철 이우진 최근형 results suggest that NR assay is more effective for determining the survival of marine plankton and can be applied to test the efficacy of ballast water treatment. Key words: ballast water, International Maritime Organization (IMO), marine plankton, Neutral red (NR), fluorescein diacetate (FDA) 서 선박평형수는해양생물을다른지역으로장거리이동시키는여러가지인자중가장중요한운송수단으로, 전세계적으로연간약 ~50-100억톤이선박평형수가이동되고있다 (Endresen et al., 2004). 선박평형수안에는동 식물플랑크톤뿐만아니라이들의발아전단계인동물플랑크톤의알 (eggs) 과식물플랑크톤휴면포자도포함되어있으며, 이들중대부분은운송과정 (ballasting and de-ballasting operation and long voyage time) 및배출된후새로운환경에잘적응하지못하고사멸하게된다 ( 백과신, 2009). 그러나현재까지의많은연구결과들은선박평형수운송과정에서살아남은몇몇생물들이해당지역의수서생태계를교란시켜심각한환경적및경제적문제를일으키고있다고보고하고있다 (Bax et al., 2003; Pimentel et al., 2005; Zetsche et al., 2012). 그래서 2004년국제해사기구 (IMO: International Maritime Organization) 에서는선박평형수에포함되어있는외래종의확산을방지하기위 해여러가지형태의처리장치를통하여사멸또는제거시킨후배출해야하는국제선박평형수관리협약을채택하였고, 협약에따르면오는 2016년에는모든선박에설치가의무화된다 (IMO, 2001). IMO에서정한선박평형수처리수에대한배출기준조항을보면, 짧은쪽한변의길이가 50 μm 이상인생물은 1 ton 당 10 개체미만, 10 and <50 μm 크기의생물은 ml당 10개체미만으로생물이살아있을경우에만배출이허용된다. 하지만 IMO에서는선박평형수처리장치생사판별시험 (D2 regulation) 수행을위한특정방법을제시하고있지않고있다 (Zetsche and Meysman, 2012). IMO의 D2 규정에부합한선박평형수처리관점에서동 식물플랑크톤생사판별은매우중요하다 (Wait et al., 2003). 현재까지보고된방법으로는 10 and <50 μm 크기의생물 ( 주로식물플랑크톤 ) 을대상으로자가형광관찰방법 (Tang et al., 2007), 입자계수자동화장비인 Flow cytometry와 FlowCAM (flow-based imaging cytometry) 을이용한방법 (Veldhuis and Fuhr, 2008; 백과신, 2009) 과 Calcein-AM (calcein acetoxymethyl ester) ( 백과신, 2009; PeperzaK and Brussaard, 2011), FDA (fluorescein diacetate assay) (Garvey et al., 2007), CMFDA (5-chloromethyfluorescein diacetate) (Steinberg et al., 2011), SYTOX Green nucleic acid stain (Steinberg et al., 2011) 등여러가지의세포염색법이있다. 50 μm 생물을대상으로는부속지 (appendage) 의운동성여부와뾰족한침으로자극하여그들의반응성을평가하는자극법 ( 백과신, 2009) 및 NR (Neutral red) (Dressel et al., 1972; Elliott and Tang, 2009), Evans blue (Crippen and Perrier, 1974), Aniline blue (Bickel et al., 2009) 를이용한염색법등이있다. 그리고한변의길이가 50μm 이상인식물플랑크톤을염색하기위해서위에서언급한식물플랑크톤염색법들이혼용되어사용되고있다. 하지만현재까지보고된연구결과들은특정단일종 (e.g. Tetraselmis suecica) 을이용해서염색유무를판 론 별한결과가대다수이며, 자연상태의동물플랑크톤을대상으로한결과들또한대상생물의종특이성에의해서분석양상이서로다르게나타남으로써, IMO D2규정에근거한선박평형수내벌크샘플분석에직접적으로적용하기어려운실정이다. 또한최근에개정된미국형식승인 (USCG Phase II) 기준은기존 IMO D2 규정에비해 100배강화된시험결과를제시하도록하고있다. 따라서동 식물플랑크톤을대상으로미국형식승인을위한적용가능한새로운시험방법이필요한실정이다. NR 염색법은세포내리소좀 (lysosomes) 과산성화된세포기관 (acidic organelles) 에염색을시키는생체염색방법이다 (Horobin and Kiernan, 2002). 현재까지이염색방법은 50 μm가넘는대상생물중요각류 (copepod) 와굴과홍합유생염색에주로사용되었으며 (Jacobson et al., 1993), 식물플랑크톤인경우염색시작은크기의세포는뚜렷하게염색이되지않으며, 염색후수분이내로세포가수축및이완이되는단점이있어서생사판별을위한도구로적합하지않다고보고되었다 (Reynolds et al., 1978). 하지만최근 Zetsche and Meysman (2012) 의연구에서는동 식물플랑크톤의크기에관계없이시험에사용된모든종 ( 배양종 + 자연종 ) 들이염색이되었으며, 특히크기가큰규조류인경우매우염색이잘되는것으로보고되었다. 현재까지배양종이아닌자연상태의군집을이용한식물플랑크톤 NR 염색법에관한연구가많이진행되지않았으며, 동물플랑크톤을대상으로도특정분류군의염색유무에서로다른의견을보이고있다 (Elliott and Tang, 2009). 따라서본연구에서는자연상태의동 식물플랑크톤군집을대상으로 NR 염색효능을파악해보고자하였다. 또한식물플랑크톤군집을대상으로생사판별시보편적으로사용되고있는 FDA 결과를 NR 염색결과와비교해서 NR이선박평형수처리시스템생사판별을하는데있어서동 식물플랑크톤생사판별기법으로이용될수있는지를알아보았다. 재료및방법 조사지역및방법동 식물플랑크톤생사판별을위한자연시료는거제시장목면에위치한한국해양과학기술원남해연구소부두에서 2014년 2월에채집하였다. 동 식물플랑크톤은 mesh size가 20 μm( 식물플랑크톤채집용 ) 와 200 μm( 동물플랑크톤채집용 ) 네트를이용해서저층에서표층까지수직인양하여채집하였으며, 채집후 500mL 채수병 (PC bottle) 에살아있는생물을고농도로농축을한후인접한실험실로옮겼다. 환경변화에따른동 식물플랑크톤이스트레스를줄이기위해실험실온도를해수온도 ( 표층수온 : 7.76 o C) 와유사한상태로조정한후빠른시간내에염색하여분석하였다. 현장에서채집된동 식물플랑크톤은형광 (Axioplan2; Carl Zeiss, Germany) 및실체현미경 (Stemisv II; Carl Zeiss, Germany) 하에서동 식물플랑크

3 선박평형수처리시스템효율검증을위한해양플랑크톤생사판별시 Neutral red 염색법적용가능성연구 225 Table 1. List of phytoplankton species and their response to vital stain fluorescein diacetate assay (FDA) in live, dead (0h) and dead (24h) samples FDA Live Samples Dead Samples (0h) Dead Samples (24h) + +,- - SE (%) + - SE (%) + - SE (%) BACILLARIOPHYCEAE Asterionella glacialis Chaetoceros affinis Chaetoceros compressus Chaetoceros curvisetus Chaetoceros debilis Chaetoceros diadema Chaetoceros didymus Cylindrotheca closterium Ditylum brightwellii Eucampia zodicus Leptocylindrus danicus Pseudo-nitzschia sp Skeletonema costatum Thalassionema frauenfeldii Thalassionema nitzschioides DINOPHYCEAE 0 0 Ceratium furca Ceratium fusus : stained, +,-: autofluorescence interfere with green FDA fluorescence, -: not stained, SE (%): Staining Efficiency (%). 톤도감 (Cupp, 1943; Chihara and Murano, 1997; Tomas, 1997) 을참고해서분류하였다 (Table 1, 2). Fluorescein diacetate (FDA) 염색방법 FDA 염색은백과신 (2009) 의보고한내용을근거로수행하였다. 먼저염색시약인 FDA (10209CE, Sigma-Aldrich) 시약 100 mg을 25 ml 갈색암병에 20mL 의 dimethysulfoxide (DMSO) 와혼합해서 working solution 을조제하였다. 조제된 working solution 원액은여과해수를이용하여 400배희석한다음 1.5 ml e-tube에식물플랑크톤이포함된시료 1mL를넣은후 400배희석된용액 25 μl를넣어서염색을하였다. 약 15분간암상태에서시료와염색약을반응을시킨후형광현미경 blue excitation filter (excitation: nm, emission: 520 nm) 하에서염색유무를관찰하였다. Working solution원액은조제후냉암조건에서장기간보존이가능하지만여과해수를이용해서 400배희석한 working solution은조제후 1시간이내에사용을해야한다 ( 백과신, 2009). Neutral red (NR) 염색방법 NR 염색은 Elliott and Tang (2009) 의방법을따랐다. NR 표준용액은 100 ml 순수 (deionized water) 에 NR (BCBG8681, Sigma- Aldrich) 분말 1g을넣은후교반기를이용해 12시간이상 mixing 을해서조제하였다. 조제된 NR 표준용액은 250 ml 갈색암병에넣고보관하였으며, NR 표준용액이유효기간을 1달이내로설정하여관리하였다. 식물플랑크톤염색유무를관찰하기위해시료 50 ml 에 75 μl NR 표준용액을넣은후약 5분간암상태에서시료와염색약을반응시킨후형광현미경을이용해서 light field 조건에서계수하였다. 동물플랑크톤은시료 10 ml에서 15μL NR 표준용액을 넣은후약 15분간암상태에서시료와염색약을반응시킨후실체현미경을이용해서 dark field 조건에서계수하였다. 식물플랑크톤의염색시간은 5분으로동물플랑크톤의염색시간인 15분에비해 3배이상짧은데, 이는 NR을이용해서식물플랑크톤을염색하였을경우염색시간이길어지면식물플랑크톤의생사판별에영향을줄수있다는선행연구결과를고려하여조정하였다 (Reynolds et al., 1978). 생사판별방법 FDA 염색법을이용하여현장에서채집한살아있는플랑크톤을염색할경우녹색형광을발하지만몇몇종들은식물플랑크톤이갖는고유형광이겹쳐서보인다고보고되었다 ( 백과신, 2009). 따라서본연구에서는 FDA염색방법을이용한식물플랑크톤생사판별시살아있는세포에대해서강한녹색형광을띄는개체를 (+) 로판별하고, 녹색형광과다른색상특히빨간색형광이부분적으로발하는개체를 (+, -), 녹색형광이아닌다른색상을띄거나형광을발하지않는개체를 (-) 로분류해서계수하였다. NR 염색방법을이용해서현장에서채집한동 식물플랑크톤을염색하였으며, 살아있는개체는적색을띄게된다. 본연구에서적색을띈개체를 (+) 로판별하였고, 염색이되지않은개체를 (-) 로분류해서계수하였다. 또한사멸한플랑크톤들이염색유무를판별하기위해 4% 중성포르말린용액을이용하여동 식물플랑크톤을고정한후바로 (0h) 그리고 24시간뒤에염색유무를확인하였다. 모든분석은하나의종에대해서 100개체이상염색유무를확인하였으며, 샘플링당시개체수가많지않았던 Cylindrotheca closterium( 규조류 ) 및와편모조류는 50개체이상을계수해서결과값의통계적유의성을확보하고자하였다.

4 226 현봉길 신경순 정한식 최서열 장민철 이우진 최근형 Table 2. List of phytoplankton and zooplankton species and their response to membrane stain Neutral red (NR) in live, dead (0h) and dead (24h) samples NR Live Samples Dead Samples (0h) Dead Samples (24h) + - SE (%) + - SE (%) + - SE (%) PHYTOPLANKTON BACILLARIOPHYCEAE Asterionella glacialis Chaetoceros affinis Chaetoceros compressus Chaetoceros curvisetus Chaetoceros debilis Chaetoceros diadema Chaetoceros didymus Cylindrotheca closterium Ditylum brightwellii Eucampia zodicus Leptocylindrus danicus Pseudo-nitzschia sp Skeletonema costatum Thalassionema frauenfeldii Thalassionema nitzschioides DINOPHYCEAE Ceratium furca Ceratium fusus ZOOPLANKTON Podon leuckarti Unidentified ostracods Acartia omorii Acartia steueri Acartia copepodites Centropages abdominalis Centropages copepodites Eurytemora pacifica Eurytemora copepodites Paracalanus parvus s. l Corycaeus affinis Oithona spp Unidentified harpacticoids Cirriped larvae Polychaeta larvae : stained, -: not stained, SE (%): Staining Efficiency (%) 결과및고찰 선박평형수내외래생물종의장거리이동에의한해양생태계교란은매우심각한실정이며, 이에 IMO에서는 D-2라는선박평형수처리규정을제정하였다 (IMO, 2001). 그래서 2012 년부터새롭게만들어지는일정규모 (5000 ton) 이상의선박은선박평형수처리장치를의무적으로설치해야한다 (IMO, 2001). 현재해양플랑크톤생사판별기법은식물플랑크톤을대상으로는 FDA와 CMFDA 염색법, 동물플랑크톤을대상으로는 NR 염색법이보편적으로사용되고있다 (Garvey et al., 2007; Elliott and Tang, 2009; Steinberg et al., 2011). 하지만이러한염색법의염색효율에대해서아직까지도논의중에있으며, IMO 에서는식물플랑크톤과동물플랑크톤으로구별하지않고크기에따라 3개의분류로나누어서살아있는생물의개체수분석을요구하고있다. 따라서선박평형수처리시스템의운영효율을검증하기위한동 식물플랑크톤생사판별에복합적으로적용할수있는효과적이면서간단한생사판별기술이필요한실정이며, 이러한요구에대한대안으로본연구에서는 NR 염색법의적용가능성여부를확인해보았다. 현장에서채집한총 17종 ( 규조류 15종, 와편모조류 2종 ) 이식물플랑크톤을대상으로 FDA와 NR 염색방법의염색효율을알아

선박평형수처리시스템효율검증을위한해양플랑크톤생사판별시 Neutral red 염색법적용가능성연구 227 Fig. 1. Various phytoplankton species from Jangmok Bay stained Fluorescein diacetate (FDA).

5 선박평형수처리시스템효율검증을위한해양플랑크톤생사판별시 Neutral red 염색법적용가능성연구 227 Fig. 1. Various phytoplankton species from Jangmok Bay stained Fluorescein diacetate (FDA). (A) Eucampia zodiacus; (B) Thalassionema frauenfeldii; (C) Ditylum brightwellii; (D-E) Skeletonema costatum; (F) Chaetoceros affinis; (G) Chaetoceros curvisetus 보았다 (Table 1, 2). FDA 염색법으로염색을한식물플랑크톤중 Ditylum brightwellii, Thalassionema frauendfeldii 종을제외한나머지규조류는 FDA 염색시약에대해서염색효율이 90% 미만이며, 특히 Chaetoceros affinis를제외한 Chaetoceros spp., C. closterium, Pseudo-nitzschia sp. 등은 40% 이하의염색효율을보여서염색이거의되지않는것으로나타났다 (Table 1; Fig. 1B, C). 또한강한적색형광으로인해 FDA 녹색형광이간섭되는현상이와편모조류를제외한모든규조류에서관찰되었으며, 특히세포하나의크기가작고체인을형성하는 Chaetoceros spp., Leptocylindrus danicus, Skeletonema costatum 에서뚜렷하게나타났다 (Fig. 1E, G). 백과신 (2009) 의연구결과에따르면 Leptocylindrus danicus, Skeletonema costatum과같은규조류는염색이잘되지않으며, 또한 Pleurosigma normanii 에서녹색형광이무시될정도의강한적색형광이관찰됐다고보고하였다. Garvey et al.(2007) 도 FDA를염색한 Coscinodiscus granii에서적색형광간섭이일어났다고보고하였다. 이러한 FDA 염색에따른형광간섭에대한이유는현재까지명확하게규명되지않았으며, 단지세포의형태학적특성에따라서 FDA 염색시약이부분적으로침투되어반응한결과일것으로추축되고있다. NR 염색법으로염색을한식물플랑크톤염색효율결과를보면, 조사된모든식물플랑크톤을대상으로 90% 이상의매우좋은염색효율을보였고, 17 종중 11종은 100% 염색이되는것으로나타났다 (Table 2; Fig. 2). 또한 NR은크기가작은 Chaetoceros spp. 및 S. costatum, Pseudo-nitzschia sp. 부터크기가큰 Cerataulina sp., Eucampia zodiacus, D. brightwellii, Thalassionema frauenfeldii, 그리고와편모조류인 Akashiwo sanguinea와 Protoperidinium sp. 까지모두염색이잘되는것으로나타났다 (Fig. 2A-J). 또한 Reynolds et al.(1978) 의연구결과에따르면 S. costatum은 NR 염색후 30분뒤에관찰하였을때 NR 시약이세포밖으로삼출 (exudation) 되는

228 현봉길 신경순 정한식 최서열 장민철 이우진 최근형 Fig. 2. Various phytoplankton species from Jangmok Bay stained with Neutral red (NR). (A) Ditylum brightwellii; (B) Chaetoceros sp.; (C) Cerataulina sp.

6 228 현봉길 신경순 정한식 최서열 장민철 이우진 최근형 Fig. 2. Various phytoplankton species from Jangmok Bay stained with Neutral red (NR). (A) Ditylum brightwellii; (B) Chaetoceros sp.; (C) Cerataulina sp.; (D) Eucampia zoduacus; (E) Skeletonema costatum; (F) Stephanopyxis sp.; (G) Thalassionema frauenfeldii; (H) Akashiwo sanguinea; (I) Protoperidinium sp.; (J) Pseudo-nitzschia sp. 현상이 관찰 되었다고 하였는데, 본 연구에서도 염색 후 약 20분 후 S. costatum, D. brightwellii, E. zodiacus 와 같은 종에서 NR 염색 시약의 세포 밖으로 삼출되는 현상이 관찰 되었다(Fig. 3AC). 하지만 NR 염색 후 빠른 시간 내에 관찰을 한다면 살아있는 세포 계수 시 NR 시약의 세포 삼출에 따른 영향을 받지 않을 것 으로 판단된다. NR 염색법이 동물플랑크톤 대한 염색 효율을 알아 보기 위해 현장에 채집한 동물플랑크톤을 대상으로 실험을 실시 하였다. 현 장에서 채집된 동물플랑크톤은 요각류가 11종으로 가장 많은 수를 차지하였고, 지각류 1종(Podon leuckarti), 패충류 1종(unidentified ostracods), 유생류 2종[따개비 유생(cirriped larvae), 다모류 유생 (polychaeta larvae)] 등 총 15개의 분류군으로 동정되었다(Table 2). 채집된 모든 동물플랑크톤을 각각 100개체를 관찰한 결과 저 서성 요각류인 harpacticoids 에서 2개체가 염색이 되지 않은 것을 제외하면 관찰된 모든 개체에서 100% 염색이 되는 것으로 나타 났다(Table 2; Fig. 4). Crippen and Perrier (1974)도 NR 염색법을 이 용해서 현장에 채집한 살아 있는 동물플랑크톤의 주요 분류군인 요각류(calanoid copepods), 다모류의 알과 유생(polychaete eggs and larvae), 복족류 알(gastropod eggs), 히드로충 유생(hydrozoans larvae), 윤충류(rotifers)와 모악류(chaetognaths)의 생사 판별에 적

7 선박평형수 처리 시스템 효율 검증을 위한 해양 플랑크톤 생사판별시 Neutral red 염색법 적용 가능성 연구 229 Fig. 3. Photographs showing that Neutral red (NR) stain leach in some phytoplankton species (B, D, F) after its initial successful incorporation (A, C, E). (A-B) Ditylum brightwellii; (C-D) Skeletonema costatum; (E-F) Eucampia zodiacus. 용해서 성공하였다고 보고하였다. 저서성 요각류인 harpacticoids 중 2개체가 살아있음에도 불구하고 염색이 되지 않았는데 본 연구에 서는 명확한 이유를 찾을 수가 없었다. 따개비 유생과 지각류, 그 리고 패충류도 요각류와 마찬가지로 NR 염색시약에 대해서 100% 염색이 되는 것으로 나타났다(Table 2). 하지만 따개비 유생과 패 충류는 부속지 기관의 가장 자리에만 빨간색으로 염색이 되어서 염색 유무를 결정하는데 어려움이 있었으나, Elliott and Tang (2009)의 선행 연구에서 NR 염색시 살아 있는 따개비 유생은 부 속지 기관 가장자리에만 옅은 핑크색을 띈다는 결과를 고려해서 본 연구에서는 모두 염색이 된 것으로 판단하였다. 전반적으로 염색은 요각류 성체 및 후기 유생(copepodites)과 다모류 유생(polychaeta larvae)이 빠르게 염색이 잘되었고, 지각류인 Podon leuckarti, 패 충류, 따개비 유생은 요각류나 다모류 유생보다는 다소 느리게 염 색이 되는 것으로 나타났다. Elliott and Tang (2009)은 또한 크기 가 작은 동물플랑크톤 후기 유생 및 따개비 유생에서 일정 시간 (0.5h)이 경과함에 따라 NR 염색 시약이 빠르게 색이 바래진다고 보고하였으나 본 연구에서는 20분간 염색 후 관찰 시 관찰된 모 든 종에 대해서 이러한 현상이 관찰되지 되지 않아서 해당 분류 군에 대한 생사판별시 30분 이내에 수행을 하면 색이 바래지는 영 향에 대한 오차를 줄일 수 있을 것으로 판단된다. 사멸된 동 식물플랑크톤을 대상으로 살아 있는 세포 염색방법을 이용한 염색 여부 확인은 현미경을 이용한 생사판별시 매우 중요 하기 때문에 본 연구에서도 포르말린을 넣어서 사멸시킨 동 식물 플랑크톤을 대상으로 FDA와 NR 염색 여부를 확인하였다(Table

copepodites; (F) Eurytemora spp. copepodites; (G) Unidentified harpacticoids. 1, 2; Fig. 5A, B).

8 230 현봉길 신경순 정한식 최서열 장민철 이우진 최근형 Fig. 4. Various zooplankton species from Jangmok Bay stained with Neutral red (NR). (A) Eurytmora pacifica adults; (B) Acartia Steueri adults; (C) Unidentified harpacticoids (top) and Polychaete larvae (bottom); (D) Centropages spp. copepodites (E) Acartia spp. copepodites; (F) Eurytemora spp. copepodites; (G) Unidentified harpacticoids. 1, 2; Fig. 5A, B). 먼저포르말린을넣어서사멸시킨식물플랑크톤을대상으로 FDA 염색유무를확인한결과, 조사되어진모든식물플랑크톤을대상으로경과시간에관계없이염색이되지않아서사멸된세포의상각 (epivalve), 하각 (hypovalve) 혹은환각면 (girdle) 에염색약이침착되지않는것을확인할수있었다 (Table 1; Fig. 5A). 포르말린을넣어서사멸시킨동 식물플랑크톤을 NR 로염색한결과에서도모두경과시간에관계없이염색이되지않았다 (Table 2; Fig. 5). 하지만본연구에서는포르말린을이용해서플랑크톤을사멸시켰지만, 추가적인플랑크톤생사판별을위한염색방법연구는실제로선박평형수설비에적용되는방법을이용해서플랑크톤을사멸시킨후반응을지켜봐야할것으로판단된다. IMO D-2 규정에따르면선박평형수처리장치를통과한처리수를네트를이용해서농축을하며, 농축된샘플 ( 10 and <50 μm기준 10L, 50 μm기준 1ton 농축된샘플 12개각각3반복분석 ) 에포함된생물은각각의크기에따라서 6시간이내에분석을해야한다. 또한 USCG Phase II 기준을준수하기위해서는보다많은양의처리수를농축해야함으로동 식물플랑크톤생사판별을하는데있어서매우어려움이따른다. 이러한문제를해결하기위해서현재가장널리사용되고있는생사판별기법은염색법이다. 따라서본연구에서는선박평형수처리시스템형식승인및설치된장비의효율을조사하는데있어FDA와 NR염색법의적용가능성을알아보았다. 일반적으로염색법은다음과같은사항을충족해만선박평형수처리장치를통과한생물의생사판별에적용될수있다 ; 1) 염색방법이간단 명료해야한다. 주변환경여건에따라다르겠지만상황이좋지않을경우샘플을분석하는데주어지는시간이 6시간보다훨씬짧을수도있기때문에염색방법은쉽고빠르게염색을할수있어야한다. FDA 와 NR 모두방법이간단하고염색에소요되는시간도약 15분정도로적게소요되기때문에이부분에대해서는둘다충족을한다고판단된다. 2) 일정시간이상염색이지속되어야한다. 현미경을통한생사판별시염색지속시간이짧아서염색된색상이바래지면결과값에오차가발생할수있다. FDA염색법인경우형광현미경하에서생사판별을하는데, nm 파장에노출이되면녹색형광이강도가약해지는경향을보이는반면 (Garvey et al., 2007), NR 은광학현미경하에서관찰을수행하기때문에광원에노출에따른색바램이 FDA 염색법보다적다고판단된다. 본연구에서도광의세기를측정하지는못했지만일정시간 nm 파란색파장에노출된 FDA로염색된샘플의형광의강도가약해지는경향을보였다. 3) 대상생물에대한염색효율이좋아야한다. 가장중요한항목으로약하게염색이되거나같은종임에도불구하고염색유무가 Fig. 5. Photographs of neutral red-treated plankton species from the field were formalin-killed. Shown are all dead phytoplankton (A) and zooplankton (B) species.

9 선박평형수처리시스템효율검증을위한해양플랑크톤생사판별시 Neutral red 염색법적용가능성연구 231 불확실하다면생사판별시매우큰어려움이따른다. 본연구에서도 NR 인경우는동 식물플랑크톤모두에게염색이잘되는것으로나타난반면, 식물플랑크톤을대상으로한 FDA 염색인경우염색이되지않거나적색형광에의해서간섭을받는상황이발생했다. 위의결과를요약정리하면, NR 염색법은현재널리사용되고있는 FDA 염색법보다식물플랑크톤염색에있어서보다높은효율을보였으며, 동물플랑크톤도종에따라서다소차이는있으나조사된거의모든종이다염색되는것으로나타났다. 따라서 NR 염색법을이용한비교분석및실험에적용한결과마다장 단점이있지만, 본연구결과에서는 NR 염색법을이용한동 식물플랑크톤생사판별이매우효율적이라고판단된다. 또한, 상대적으로염색강도가약해서생사판별결정에어려움이따르는동물플랑크톤종에대해서는침을이용한자극법과같이사용한다면매우유용할것으로판단된다. 사 이연구는해양수산부과제 (PM57480) 에의해수행되었습니다. 사 참고문헌 (References) Agusti, S., M.C. Sánchez, Cell viability in natural phytoplankton communities quantified by a membrane permeability probe. Limnol. Oceanogr., 47: Baek, S.H. and K. Shin, Applicability of fluorescein Diacetate (FDA) and Calcein-AM to determine the viability of marine plankton. Ocean Polar Res., 31(4): Bax. N., A. Williamson, M. Aguero, E. Gonzalez, W. Geeves, Marine invasive alien species: a threat to global biodiversity. Mar. Policy, 27(4): Bentley-Mowat, J., Application of fluorescence microscopy to pollution studies on marine phytoplankton. Bot. Mar., 25: Bickel, S.L., K.W. Tang and H.-P. Grossart, Use of aniline blue to distinguish live and dead crustacean zooplankton composition in freshwaters. Freshwater Biol., 54: Crippen, R.W. and J.L. Perrier, The use of neutral red and Evans blue for live-dead determinations of marine plankton (with comments on the use of rotenone for inhibition of grazing). Biotech. Histochem., 49: Chihara, M. and M. Murano, An illustrated guide to marine plankton in Japan, University of Tokai Press, Tokyo. Cupp, E.E., Marine plankton diatoms of the west coast of North America, University of California Press, Berkeley and Los Angeles. Dressel, D.M., D.R. Heinle and M.C. Grote, Vital Staining to Sort Dead and Live Copepods. Ches. sci., 13: Elliott, D.T. and K.W. Tang, Simple staining method for differentiating live and dead marine zooplankton in field samples. Limnol. Oceanogr. Methods, 7: Endresen, Ø., H. Lee Behrens, S. Brynestad, A. Bjørn Andersen, R. Skjong, Challenges in global ballast water management. Mar. Pollut. Bull., 48: Franklin, D., C. Cegres, O. Hoegh-Guldberg, Increased mortality and photoinhibition in the symbiotic dinoflagellates of the Indo-Pacific coral Stylophora pistillata (Esper) after summer bleaching. Mar. Biol., 149: Fuhr, F., J. Finke, P.P. Stehouwer, S. Oosterhuis, M. Veldhuis, Factors influencing organism counts in ballast water samples and their implications. In Bellefontaine, N., Haag, F., Linden, O. et al. (eds), IMO-WMU Research and Development Forum. WMU Publications, Malmö, Sweden, pp Garvey, M., B. Moriceau and U. Passow, Applicability of the FDA assay to determine the viability of marine phytoplankton under different environmental conditions. Mar. Ecol. Prog. Ser., 352: Horobin, R.W., J.A. Kiernan, Conn s biological stains: A handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. (10 th Ed) BIOS Scientific Publishers, Oxford. IMO, Report on the ballast water treatment standards workshop. In 1 st International ballast water treatment standards workshop, IMO London, pp March workshopreport.htm. Onji, M., T. Sawabe, T. Ezura, An evaluation of viable staining dyes suitable for marine phytoplankton. Bull. Fac. Fish. Hokkaido Univ., 51(3): Peperzak, L., C.P.D. Brussaard, Phytoplankton viability assay for oil compounds in water. In Timmis, K.N. (ed.) Handbook of hydrocarbon and lipid microbiology. Springer, Berlin Heidelberg, pp Pimented, D., R. Zuniga, D. Morrison, Update on the environmental and economic costs associated with alien-invasive species in the United States. Ecol. Econ., 52(3): Reynolds, A., G. Mackiernan, S. Van Valkenburg, Vital and mortal staining of algae in the presence of chlorine-produced oxidants. Estuaries, 1(3): Steinberg, M., E. Lemieux, L. Drake, Determining the viability of marine protists using a combination of vital, fluorescent stains. Mar. Biol., 158: Tang, Y.Z., F.C., Dobbs, Green autofluorescence in dinoflagellates, diatoms, and other microalgae and its implications for vital staining and morphological studies. Appl. Environ. Microbiol., 73: Tomas, C.R., Identifying marine phytoplankton, Academic Press, California. USCG, Generic Protocol for the Verification of Ballast Water Treatment Technology. NSF International. 157pp. USEPA, Vessel general permit for discharges incidental to the normal operation of vessels. 193pp. Wait, T.D., J. Kazumi, P.V.Z. Lane, L.L. Farmer, S.G. Smith, S.L. Smith, G. Hitchcock, T.R. Capo, Removal of natural populations of marine plankton by a large-scale ballast water treatment system. Mar. Ecol. Prog. Ser., 258: Zetsche, E.-M. and F.J.R. Meysman, Dead or alive? Viability assessment of micro- and mesoplankton. J. Plankton Res., 34: 년 3 월 6 일원고접수 2014 년 5 월 13 일수정본접수 2014 년 9 월 3 일수정본채택담당편집위원 : 이준백

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10(3)-01(032).fm ˆg Journal of the Korean Society for Marine Environmental Engineering Vol. 10, No. 3. pp. 127-137, August 2007 z f pp 1 Út r 1 Ú e 1 Ú 1 Ú 2 Ú 1 1 mn p n 2 mn p mff lsn The Electrochemical Chlorination