대한내분비학회지 : 제 20 권제 4 호 2005 지상강좌 Wnt 신호전달 - 최근의연구동향및질병과의연관성? 서울시립대학교생명과학과 조익훈 Wnt Signal Transduction and Its Involvement in Human Diseases Eek-Hoon Jho Department of Life Science, The University of Seoul, Korea 서론 Wnts는세포로부터분비되는 cystein이많은당단백질로서, 주변세포의 receptor에결합하여활성화된 receptor를통해여러가지단계를거쳐많은유전자의발현을조절함으로써, 다양한생명현상을조절한다고알려져있다 [1~3]. Wnt gene은처음에 mouse mammary tumor virus (MM- TV) 의 insertion에의해서유도되는많은종류의 tumor에서공통적으로발견되는 genomic sequence로서, 최초의 cellular oncogene으로밝혀졌으며 int라고명명되었다 [4]. 이결과는정상세포가암의원인유전자 (proto-oncogene) 를갖고있다는사실을의미하고, 이발견으로 1989년에 Michael Bishop 박사와 Harold Varmus 박사가 Nobel상을공동수상하게되었다. 그후에 Dr. Nusse group에의해서 Drosophila의 morphogenesis 과정에서 segment polarity gene이라고알려진 wingless가 int-1의 homolog라는사실이밝혀진후로 int가암의형성뿐만아니라, 세포사이의 communication을조절하는 signal로서발생과정에서중요한역할을한다고제안되었고 [5], Wingless (wg) 와 int-1이 homolog gene임이밝혀진후, wg와 int를합쳐서 Wnt라고부르게되었다 [6]. Wnt signaling의연구동향 Wnt signaling의연구분야에는현재노벨상을받은 4 명의연구자 (Dr. Harold Varmus (1989 수상 ), Dr. Eric Wieschaus (1995), Dr. Paul Greengard (2000), Dr. David Baltimore (1975) 와 Stanford 대학의 Dr. Roel Nusse를비롯한 13명의 Howard Hughes Medical Institute (HHMI) investigators 들을포함한많은연구자들이주연구또는부 연구주제로서연구하고있을정도로치열한경쟁하에최첨단의연구를수행하고있다 (HHMI investigators의총수는약 300명, www.hhmi.org). 이들은 Wnt signaling연구의초기단계부터거의 20여년동안연구비의제약없이세계최고수준의연구를수행하고있다. 이들연구자들의공통적인경향은초기에는 Xenopus나 Drosophila를대상으로 Wnt signaling의발생단계에서의기능연구를해오다가, 최근에는 Wnt signaling을조절하는 small molecule의 High Throughput Screening (HTS) 을수행하거나다양한병인기전으로서의 Wnt signaling의역할을밝히고치료방법을개발하고자하는연구를수행하고있다는점이다. 또한 Stanford 대학의 Dr. Roel Nusse는 Wnt gene homepage를개설하여 Wnt signaling에관련된많은자료를정리하고수시로 update하여 Wnt signaling 연구의진입장벽을낮추는역할도수행하고있다 (http://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.htm). 지난 20여년간의 Wnt 신호전달의연구방향을간단히요약하면크게 4가지방향으로요약된다. 1. Wnt signaling 의신호전달에관여하는새로운 components 의발굴및기능연구 Wnts가 ligands로작용함으로써암의형성및발생과정에서중요한역할을하고있다는사실이밝혀진후, Wnts의 receptor 및세포내의 Wnt 신호전달에관련된 components 의발굴과 Wnt signaling에의해서조절되는 target gene의발굴에관련된많은연구가이루어졌다. 90년대초반에는 Drosophila를이용한유전과발생의연구를통하여 Wnt signaling pathway를확립하기위한많은연구가수행되었다. Wnt signaling에관한연구는암의원인유전자로서시작되었지만, 90년대초반에국내의연구자들에게는비교적생소한발생유전학분야에서엄청나게많은연구가이루어 - 306 -
- 조익훈 : Wnt 신호전달 - 최근의연구동향및질병과의연관성? - 졌기때문에국내에서의연구가활성화되지않은이유라고생각된다. 하지만, 90년대후반에는기본 pathway가확립된바탕위에서그 signaling을조절하는 component의발굴및생화학적연구가시작됨으로써, 발생유전학분야의경험이그렇게많지않은신호전달을연구하는연구자들이참여하게되어서 Wnt signaling의연구분야가더욱확대되게되었다. 또한, Wnt signaling이꼬마선충 (C. elegance), 초파리 (Drosophila), 개구리 (Xenopus), zebra fish, mouse 및 human에이르기까지공통적인 pathway를통해전달된다는사실이밝혀지고, cancer를비롯한다양한질병과의연관성이보고되면서국내에서도많은연구자들이관심을갖게되었다. 2. Wnt signaling 의발생및세포분화에있어서의역할연구 위에서언급한바와같이 Wnt signaling의연구는 Drosophila를비롯한다양한종류의 model system에서발생과정에서의역할을구명하는연구가주로수행되어왔다. 현재 mouse의경우는 19가지의 Wnt genes가알려져있고, 그 receptor로알려진 Frizzleds는 10가지가밝혀져있다 (http:// www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.htm). 대부분의 Wnt gene들이 knock-out된 mice가제작되었고, 특정 Wnt가 knock-out되었을때다양한표현형을나타내었다. 가령 Wnt1이 Knock-out되었을때는 midbrain과 cerebellum의형성이일어나지않았고 [7, 8], Wnt4가 knock-out된 mice 는 kidney defects를나타내고 [9], Wnt5a의경우는 truncated limbs의 phenotype을나타내어서 [10], Wnt signaling 이발생과정에서다양한역할을수행하고있다는사실을시사하였다. 세포가특정 fate로분화하는과정에서 Wnt signaling이 positive 또는 negative하게작용한다는사실을보이는실험도상당히많이수행되었으며, 특히최근에는 stem cell의분화조절에대한관심이증대되면서 hematopoietic stem cell의 proliferation이나 embryonic stem cell의 neuronal fate로의분화에서 Wnt signaling의역할이발표되고있다 [11~13]. 하지만, stem cell의분화에관련된연구결과는연구자마다상반된결과가보고되고있어서, 실제 in vivo에서의역할은분명치않다고생각된다. 3. 모델동물을이용하여 Wnt signaling 의이상에의해서유도되는질병들의연구 Wnt signaling에이상이생기면 cancer 및기형발생이유도된다는사실이많이알려져있었기때문에다양한질병의병인기전이나치료제의독성을검증하기위해서많은동물모델이제작되었고, 현재도많이사용되고있다. 가령 Wnt signaling의 key effector인 β-catenin의 mutation이나 tumor suppressor로알려진 Adenomatous polyps coli (APC) 의 truncation은사람의다양한종류의 cancer에서발견되는데, 이들과유사한 mutation을갖는동물모델들은 cancer의유발기전이나항암제의유효성및독성검사를검증하는데이용되고있다 [14,15]. 최근에들어서는 cancer나발생과정에서의문제뿐만아니라 adipogenesis[16,17], osteoporosis[18,19], schizophrenia[20,21] 및 Alzheimer's disease[22~24] 등과같은다양한성인질환에도 Wnt signaling의이상과연관성이있다는보고가많이나와서, 기존의 cancer나발생에서의 Wnt signaling의역할규명이라는주제에서다양한성인질환의병인요인으로서의 Wnt signaling의역할규명이라는새로운방향으로연구가진행되고있다. 4. Wnt signaling 을조절할수있는 small molecule 의발굴및 target identification Chemical genomics 방법을통하여Wnt signaling을조절하는 small molecule을발굴하려는시도는전세계의유명제약회사들에서모두수행되고있다고보아도무리가없을것이다. Rockefeller 대학의 Dr. Paul Greengard (2000년 Nobel 상수상 ) 는 HTS를사용하여 Wnt signaling을 regulation하는 small molecule들을발굴하여최근에 Nature medicine에보고한바있다 [25]. 특히 Dr. Paul Greengard 의경우는 HTS를수행하여 Wnt signaling을조절하는 small molecule들을발굴하였고, embryonic stem cell에서의 Wnt signaling의역할을규명하는연구를수행하고있다. Wnt 신호전달의전반적인개요 본 review 에서는 Wnts가발생과정에서 morphogen으로작용하여 cell과 cell 간의 interaction을조절함에따라적절한형태의발생을조절하는현상의설명보다는, 외부에서 Wnt signaling이왔을때세포표면으로부터핵내부로의신호전달의과정을중심으로설명하고자한다 (See reviews in[26,27] for morphogenic role of Wnt signaling). 세포내에서의 Wnt 신호전달은 key effector molecule인 β-catenin을통하여전달되는 canonical signaling pathway 와세포내 calcium의농도를조절하여서 PKC의활성을변화시키거나 Rac이나 Rho와같은 small G protein의활성화를통해 JNK activity를조절하는 non-canonical signaling pathway 로나눌수있다 (Fig. 1). 유전학적, 생화학적인방법을통하여많은연구가 canonical pathway의규명에집중이되어왔지만, 최근에는 non-canonical pathway 의생물학적중요성이인식되면서이분야의연구가점차활성화되는추세이다. - 307 -
- 대한내분비학회지 : 제 20 권제 4 호 2005 - Cer, BMP4 Kremen b-trcp1/2, Cullins, Skp1 DKK1 LRP5/6 Wnts APC GSK Axin, Axin2 Fz Dvl RhoA CDC42, Rock α β γ G-protein GTP GDP PLC, PKC α Adenyl Cyclase camp ATP Canonical pathway MEKK1, SEK1 JNK 1 Ca 2+ Calmodulin PKA Smad2/3 ICAT Tcf Target Genes NF-AT p p CREB Non-canonical pathway Fig. 1. Schematic diagram for Wnt signaling. 1. Canonical Wnt signaling pathway 세포가외부로부터 Wnt에의해자극이되지않을때, cytoplasmic β-catenin은 Axin과 APC protein complex 내에서 casein kinase I과 GSK3β라는 kinase에의해서 phosphorylation 된다 (Fig. 2). 인산화된 β-catenin은 β-trcp E3 ubiquitin ligase에의해인식되고 ubiquitination/proteasome pathway를통해서분해되어 cytoplasm내의 β-catenin level 이낮게유지된다. 하지만, 외부로부터 Wnt의자극이오게되면 β-catenin의 degradation complex에서 scaffolding protein으로작용하는 Axin이 degradation complex로부터빠져나가고, GSK3β의 activity가 inhibition 되어서, β-catenin의 phosphorylation이억제된다. 이 unphosphorylated β-catenin 은분해가되지않아서 cytoplasmic β-catenin level이증가되는데, 이안정화된 β-catenin은핵내로이동하여 transcription factor인 Tcf ( 또는 LEF) 와결합하여다양한유전자의발현을조절하게된다 (Fig. 2). Wnt signaling의조절에이상이생기면 cancer가유발되거나발생에이상이생기는이유는 β-catenin/tcf signaling에의해 cell cycle 조절에관여하는 c-myc 또는 cyclin D1이나, 발생에서중요한 transcription factor로작용하는 simois나 brachury 등과같은유전자의발현이조절되기때문이라고설명된다. 본 review에서는 canonical Wnt signaling의전달과정을세포외부, cytoplasm 내부와핵내에서일어나는과정들로나누어서, 그과정에관여하는 molecule들을중심으로설명 하고자한다. 1) 세포외부에서일어나는 canonical Wnt 신호전달현재 mouse의경우는 19가지의 Wnt genes가알려져있는데, cytoplasmic β-catenin의 level을증가시킬수있는 Wnt1, Wnt3a 등은 canonical Wnts로분류되고, Wnt 5a와같이 β-catenin의 level을높이지않고 PKC나 CamKII 등을활성화시키는것들을 non-canonical Wnts로분류한다 [28, 29]. 많은세포들에서 Wnts나 Wnts의 receptor로알려진 Fz 의발현양상을조사해보면, 몇가지의 Wnts나 Fz만이발현되고, 그발현패턴은세포마다차이가있는데, 어떻게각세포마다특이적으로 Wnts나 Fz의발현이조절되는지는앞으로더많은연구가필요한분야이다. 많은연구자들이의문을갖는분야는어떻게특정 Wnts가 specificity를가지면서다양한 biological 현상을조절하는지에관한문제이다. 이러한 specificity는다양한 Wnts의발현 pattern이다르고특정 Wnts와 Fz간의 affinity 차이에의해서조절된다는부분적인설명이있긴하지만 [30,31], 실제로 in vivo에서 Wnt signaling이엄격한 specificity를갖고전달되는지에대한여부도확실치않아서, 아직특정 Wnt와 Fz specificity를설명하기에는부족함이많은실정이다. 이문제는 Wnt/Fz interaction을 target으로 Wnt signaling을조절하는 small molecule을이용하고자하는시도의성패와직결된다고할수있다. 가령 chondrogenesis 과정에관련된특이적인 Wnt 와 Fz가있다면, 그 Wnt와 Fz의 interaction을조절하는 - 308 -
- 조익훈 : Wnt 신호전달 - 최근의연구동향및질병과의연관성? - Fz Cytoplasm APC APC : Adenomatous polyposis coli protein Ubiquitination dependent b-catenin degradation Axin GSK3b P P PP2A P b-trcp Ub Ub Ub Nucleus Tcf C-Myc, Cyc D1, Siamois, Brachyury etc. Proliferation Development Fig. 2. Simplified version of canonical Wnt signaling. small molecule은다른조직에서 Wnt signaling을 activation 시키는부작용을최소로하면서골다공증의약으로사용할수있는가능성이있다고할수있다. Wnts의 co-receptor로비교적최근에밝혀진 Low-density lipoprotein receptor-related protein-5 (LRP-5) 의 mutation은 canonical Wnt signaling의전달에이상을유발하여, bone의형성에문제를일으킨다고알려졌다 [18]. Lrp 5/6의 cytoplasmic domain은 Wnt signaling이존재할때 Axin의 docking site로작용하여, β-catenin degradation complex로부터 Axin을제거함으로써, β-catenin의 degradation을억제한다고밝혀졌다 [32,33]. Wnt signaling은 Cerberus, FrzB 및 Dickkopf1 등에의해서세포외부에서 inhibition될수있다 (Fig. 1, reviews in[34]). Cerberus와 FrzB는 Wnt와 Fz이 binding하는것을 blocking하고 Dickkopf1은 Lrp에결합함으로써 Wnt signaling을 inhibition한다. 특히 Dickkopf1은 Wnt/β-catenin signaling의 downstream target gene으로서 negative feedback 작용으로서 Wnt signaling을조절한다고밝혀졌다 [35,36]. 2) Cytoplasm 에서일어나는 canonical Wnt 신호전달아직기전이나신호전달에관련된 molecule들이모두밝혀진것은아니지만, Wnt 신호전달의연구분야중생화학적으로가장많이연구가이루어진부분이다. 위에서언급한바와같이 ligand인 Wnt의존재여부에따른 key effector molecule인 cytoplasmic β-catenin의 level을조절하는것이핵심이라고할수있다 (Fig. 2). Cytoplasmic β-catenin은 scaffold protein인 Axin, tumor suppressor라고알려진 APC protein의 complex 내에서 casein kinase I 과 GSK3β에의해 phosphorylation 된다. 이 phosphorylated β -catenin은 ubiquitin-proteasome pathway에서 degradation target을인식하는역할을하는 E3 ligase의일종인 β-trcp 에의해인식되어 degradation이진행된다. Axin은약 100 KDa 되는 protein으로 Axin complex에있는거의모든 protein들 (APC, GSK3β, β-catenin, protein phosphatase 2A (PP2A), Dvl 등 ) 과 direct하게 interaction 하는 domain을갖고있어서, β-catenin의 phosphorylation/ dephosphorylation에관여하는 molecule들을서로근접한거리에있게하는역할을한다 [37,38]. Axin이없거나 mutation이일어나서 β-catenin binding domain이 truncation 될경우, GSK3β에의한 β-catenin의 phosphorylation 일어나지않아서 β-trcp가인식할수없게되어 cytoplasmic β-catenin level의증가가유도된다. 이 complex 내에서 APC의생화학적인기전은명확하지않지만, APC를 coding하는유전자에 mutation이일어나서 β-catenin 또는 Axin binding sites가 truncation 되면 β-catenin을 degradation 할수없게된다. 따라서, Axin이나 APC의 mutation은 β-catenin의 signaling을활성화시키는결과를낳게되어 tumor의형성을유도하게되고, 다양한 human cancer에있어서 Axin과 APC의 mutation이발견되기때문에이들은 tumor supp- - 309 -
- 대한내분비학회지 : 제 20 권제 4 호 2005 - ressor로간주된다 [39~41]. Wnt가 receptor인 Fz에 binding하게되면 cytoplasm에존재하는 Dishevelled (Dvl or Dsh) 가 casein kinase II에의해 phosphorylation되면서 membrane에있는 Frizzled로이동하게된다. 어떻게 Wnt와 Fz의결합이 CKII에의한 Dvl 의 phosphorylation을유발하고 membrane으로이동하게하는지는밝혀지지않았지만, 이결과로 Dvl가직접또는간접적으로 GSK3β의활성을억제하게된다 [42~43]. 따라서 GSK3β는더이상 β-catenin을 phosphorylation시킬수없어서 cytoplasmic β-catenin의 level이증가하게된다. Wnt/Fz의결합에의한 cytoplasmic β-catenin의 level을증가시키는또다른기전은 β-catenin의 down-regulation에필수적인 Axin이 Wnt의 co-receptor인 LRP5/6로이동되어 degradation되는것으로설명된다 [32~33]. 이때 Axin complex 전체가이동하는지아니면 Axin만이 complex로부터분리되어이동하는지분명치않다. 또한어떤기전에의해서 Wnt/Fz signaling이 Axin complex로전달되며, Axin이이동되고분해되는지도상당히중요한문제라고여겨진다. 아마도 PP2A에의한 dephosphorylation이 Axin의이동및 degradation에서중요한역할을하리라고생각되며, 또한 Axin complex 내에있는새로운단백질의발굴이예상된다고할수있다. 3) 핵내에서일어나는 canonical Wnt 신호전달 Wnt/β-catenin signaling에의해서발현이조절되는대부분의유전자는 promoter 부위에 Groucho라는단백질과 Tcf/LEF라는단백질이결합하여 transcription을억제한다. Wnt signaling이존재하는상태에서증가된 cytoplasmic β -catenin이핵내로이동하게되면, Groucho를밀어내고 Tcf/LEF와결합하여 transcription을활성화시킴으로써많은유전자의발현을조절하게된다. 하지만, 실제로는이과정을 negative 또는 positive 하게조절하는많은단백질이존재하여 in vivo에서는 Wnt signaling의전달을정교하게조절하는것이가능하다고여겨진다. 가령 ICAT라는단백질은 β-catenin과 Tcf/LEF와의결합을방해함으로써 Wnt signaling의전달을억제하고 [45], p300/cbp의 histone acetyl transferase activity는 Tcf/LEF가결합한부위의 chromosomal remodeling을유발함으로써 Tcf/β-catenin에의한 transcription에 positive하게작용한다고알려져있다 [46~47]. 현재까지약 80여가지의유전자의발현이조절된다고알려져있으며, 그중많은유전자가 cancer의형성및진행과관련이있거나, 발생및분화의조절과연관이되어있다 (http://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.htm). 발현이증가되는대표적인유전자인 c-myc과 cyclin D1 등은 cell proliferation에관여하고, transcription factor로알려진 siamois나 brachuyry 등은배아발생이나세포분화에서중요 한역할을하고있다. 핵내로들어간 β-catenin은 transcription을활성화시킨후, Wnt signaling 존재하에 level이증가되고핵내로같이들어오는 APC에의해서 cytoplasm으로 export된다고제안되었다 [48,49]. 아직도정확한기전에관해서는논란의여부가있지만, APC의 tumor suppressor로서의역할은직접적인 β-catenin의 degradation이아니라, 핵내의 β-catenin 을 degradation이일어나는 cytoplasm의 Axin complex로이동시키는 shuttle vector로여겨진다. 따라서 Wnt signaling이존재할때핵내로들어온 β-catenin은 APC가 truncate된경우계속해서핵내에존재하게되어비정상적인 target 유전자의발현을유도하여 tumor를형성한다고이해되고있다. 2. Non-canonical Wnt signaling pathway 위에서설명한 canonical Wnt 신호전달방법외에전달되는 Wnt 신호전달을총칭하는것으로지금까지는이신호전달과정에관여하는 components들이밝혀지지않았거나기능이잘밝혀지지않아서알려진것이많지않다. 하지만, 최근들어서는새로운 components가발굴되고 canonical Wnt signaling의상호조절에의한다양한생물학적현상에서중요한역할을한다는사실이밝혀져서향후몇년이내에많은연구결과가기대되는분야이다. 간단히 non-canonical Wnt signaling을요약하면, 1) 특정 Wnt/Fz의결합에의한 intracellular Ca +2 level 증가의결과로 protein kinase C 및 Ca +2 /calmodulin dependent kinase (CamKII) 및 Ca +2 dependent phosphatase인 calcineurin과같은 Ca +2 -sensitive enzyme이활성화되어신호가전달되는것과 2) small GTPase의일종인 rho나 cdc42를통해서 JNK의활성이이루어지거나, 3) focal adhesion kinase (FAK) 를통해서 cell motility를조절하는경우로나눌수있다 (Fig. 3, [50~51]). Wnt signaling에의해서다양한 Ca +2 -sensitive enzyme이활성화될수있기때문에지금까지밝혀졌던 PKC나 CamKII 외에활성이조절되는 enzyme의발굴이예상되고, 다양한 enzyme 활성의결과가어떤방법에의해서특정생물학적현상조절로이어질수있는지에관한해답은상당히많은연구가필요하다고할수있다. 한예를들면 JNK도 in vitro에서 Ca +2 signaling에의해서조절될수있고 Ca +2 dependent phosphatase인 calcineurin도동일한 signaling 에의해조절될수있는데 [52], cell의입장에서본다면발생과정에서일어나는 JNK에의한 morphogenetic movement와 calcineurin의활성화에의한등축과배축으로의분화의결정 (determination of dorsal-ventral axis differentiation, [53]) 을구별하는것이상당히중요하다고할수있다. 이구별은 calcium signal의 frequency와 amplitude에의해서 - 310 -
- 조익훈 : Wnt 신호전달 - 최근의연구동향및질병과의연관성? - Wnt Fz Dvl Cytoplasm APC OH Axin OH GSK3b b-trcp PP2A b-catenin stabilization and accumulation OH OH OH Nucleus β-catenin Tcf C-Myc, Cyc D1, Siamois, Brachyury etc. Proliferation Development Fig. 3. Simplified version of non-canonical Wnt signaling. 결정된다고해석되는데, Cacineurin의경우는낮은 level의 calcium signaling이지속적으로존재할때활성화되고, JNK는단기간에높은 level의 calcium spike를필요로한다 [54~55]. 다른경우도동일한방법에의해서조절되는지는명확하지않으므로각각의경우에따른조절기전은앞으로더많은연구가필요하다고여겨지며, 어떤방법에의해서 Calcium signaling의 frequency와 amplitude가조절되는지도밝혀져야할부분이라고생각된다. Rho/JNK에의한 Wnt signaling은 Drosophila의 wing에붙어있는가는털이나홑눈의내부에있는 photoreceptor의방향성을결정짓는 planar cell polarity (PCP) 에서중요한역할을한다고알려져있다 [56]. Vertebrate의경우는 Drosophila와동일한 PCP 현상은볼수없지만, 그와유사한현상인 convergent extension ( 배아발생단계의 gastrulation 시기에일어나는세포들이방향성을갖고길어지면서서로가 intercalation이일어나는현상 ) 과정에서중요하다고밝혀져있다 [57]. Drosophila Wnt-4에 mutation이일어나면발생과정동안 cell의 migration이억제가되는데이때세포내의 cytoskeleton과 extracellular matrix 사이에서 anchor 역할을하는 focal adhesion의형성에이상이있고, 조절에관여하는 focal adhesion kinase (FAK) 의 activity가낮다는사실이밝혀짐으로써 non-canonical Wnt signaling이 cell adhesion 을조절하는역할을한다고알려졌다 [58]. Non-canonical Wnt signaling은다양한경로로신호가전달되지만, 어떤유전자의발현이조절되는지밝혀진바는 그리많지않고, 어떤 transcription factor가그과정에서중요한역할은하는지에대한연구도미진하다. 그이유는 canonical Wnt signaling의경우는 Wnt conditioned media ( 최근에는 purified Wnt도사용 ) 또는 Wnt 유전자의 transfection에하면 β-catenin의증가여부가 Wnt signaling 전달의 marker로사용되어연구를수행할수있지만, non-canonical Wnt signaling의경우는 Wnt signaling이실제로전달되고있는지를쉽게확인할수있는공통적인 marker가존재하지않아서라고여겨진다. 또한 non-canonical Wnt signaling에서는 canonical signaling 과같이 Tcf/LEF라는공통적인 transcription factor가존재하지않고각각의다른 pathway마다특이적인 transcription factor들이사용되기때문이아닌가생각된다. 앞으로더많은 non-canonical Wnt signaling의 target gene들이밝혀지면, 그 target gene들로부터 non-canonical Wnt signaling의역할을구명하는연구가예상된다. Wnt 신호전달과인간질병과의연관성 Wnt signaling의이상에의한 cancer가유발되는사실은 Wnt가밝혀진때부터알려져왔고 Wnt signaling을조절함에의해서암을치료하고자하는시도는많은제약회사들에의해서경쟁적으로진행되고있다. 하지만, 최근들어서 Wnt signaling이 adipogenesis, polycystic kidney disease, schizophrenia, osteoporosis 및 Alzheimer's disease를비롯한많은질병과의연관성이밝혀지거나예상되어서각각의 - 311 -
- 대한내분비학회지 : 제 20 권제 4 호 2005 - Wnts Fz Dvl α γ β G-protein Ca 2+ PLC RhoA MEKK1, SEK1 CDC42, Rock FAK PKC CaCN CamKⅡ JNK 1 NF-AT Planar Cell Polarity Convergent Extension Cell motility Differentiation 질병의연구에전문성을가진의학자들과 Wnt signaling을연구하는과학자들간의긴밀한협동연구의필요성이증대되고있다. 또한 stem cell의분화에도 cellular context에따라 Wnt signaling이 positive 또는 negative하게작용한다는사실이밝혀지고있어서, stem cell을이용하여질병을치료하고자하는많은연구자들의관심이고조되고있다. 본강좌에서는다양한질병중내분비학을연구하시는분들이관심이있을 adipogenesis, osteoporosis 및 stem cell 의분화조절에서 Wnt signaling의연관성을중심으로설명하고자한다. 1. Wnt와 adipogenesis 지방조직 (adipose tissue) 을이루는지방세포 (adipocyte) 는지방 (fat) 을포함하고있는세포로써체내지방대사를조절하는것뿐아니라당대사에도관여하여전반적인에너지항상성유지를담당하고또한지방을태움으로써열을발생 (thermogenesis) 시켜체온을유지하는등의중요한기능을담당하고있다. 하지만과다한지방세포의형성 (adipogenesis) 과불균형적인에너지의공급과잉에의해비만 (obesity) 이라는새로운문제가현대의사회적이슈로부각되고있다. 2000년 Science에처음으로 adipogenesis가 Wnt signaling에의해서억제된다고보고된후부터지방세포형성의조절 target으로서 Wnt signaling에대한연구가주목받게되었다 [16]. Adopogenesis는 myocytes, osteoblasts 또는 adipocytes를형성할수있는 mesenchymal stem cells에서시작하는 multistage process이다. Pluripotent mesenchymal stem cell의운명을결정짓는요인으로 BMP가관여한다고알려져있으며, 이는어떠한수용체와결합을하느냐에따라지방세포로분화하기도하고골세포로분화하기도한다 [59]. 지방전구세포 (preadipocyte) 가지방세포 (adipocyte) 로분화하는데에는여러가지전사인자들이작용을하는것으로알려져있으며이에대한연구는많이진행되어왔다. 간단히요약하면, 지방전구세포가분비하는 IGF-I, Glucocorticoid 와같은 adipogenic inducers들에의해분화가유도되면분화초기전사인자로 C/EBPβ와 C/EBPδ가발현되고이는 cascade 반응으로 C/EBPα와 PPARγ를발현시킨다. 이두전사인자는지방세포분화를이끄는주된전사인자로서서로가서로의발현을증가시키게되고이렇게과량발현된 C/EBPα와 PPARγ는 ap2나 adiponectin과같은 adipocyte specific genes을발현시켜형태학적으로나세포의기능적으로변화된 adipocyte를형성한다 [60]. 지방전구세포에서발현되는 Wnt10b는세포내조절인자로서지방세포분화에중요전사인자인 C/EBPα와 PPARγ 의발현을억제함으로써지방세포특이유전자가발현되지못해지방세포형성을막는다 [16,61]. 또한 Wnt10b가증가시키는세포내 β-catenin양과 PPARγ간의균형조절이지방세포분화에중요하다고알려져있으며이두단백질간의균형은 GSK3β에의한 β-catenin의인산화를통한단백질분해에의존적으로조절되고있음이확인되었다 [16, 61, 62]. In vitro에서뿐아니라 transgenic mice를통한 in vivo 결과에서도 Wnt10b가지방세포형성에억제역할을담당하고있음이최근확인되었다 [63]. Ormond A. MacDougald 팀에의해제작된 FABP4/Wnt10b transgenic mice는 adipose tissue에서만발현되는 FABP4 promoter를이용하여 Wnt10b를 adipose tissue에과량발현시켰을때고지방식이법에도불구하고 body fat의양과 fat cell의수가정상쥐보다 50% 미만임을보여줬다. 이는또한비만과함께주의를요하게되는당뇨병의원인인 insulin sensitivity와 glu- - 312 -
- 조익훈 : Wnt 신호전달 - 최근의연구동향및질병과의연관성? - cose tolerance에있어서도저지방식이법을한정상쥐에비해더좋은결과를보여줬다 [63]. 아직은형질전환쥐에서보여지는특징들이어떠한 mechanism 에의한조절인지더연구가필요하지만이번결과는 Wnt10b가 fat cell development에서중요한역할을하고있다는사실을보여준다. 2. Wnt와 osteoporosis Bone은 osteoblastic bone formation과 osteoclastic bone resorption 사이의균형에의해유지되는 dynamic tissue이다. 사람이태어나서성장하는동안 bone mass는꾸준히증가하여 skeletal maturation을형성하게되지만, 나이가들어감에따라점차적으로 bone mass를손실하여결국 osteoporosis와같은 bone disease가나타나게된다. 또한, autosomal-recessive OPPG (osteoporosis-pseudoglioma syndrome) 의경우에는어린환자들의경우도 bone mass가매우낮아서골절유발빈도가매우높다. Osteoporosispseudoglioma syndrome collaborative group에서는 OPPG 질병에걸린가계리스트를확보한후그원인유전자로서 LRP5를찾아내어 Wnt singling이 bone formation에중요하다는것을처음으로확인시켰다 [18,64]. LRP5는 osteoblast에서특이적으로발현되는유전자와 multiple abnormality bone phenotype에관련된 chromosome 11q13를 mapping하는과정에서처음 cloning이되었다 [65]. 이러한 LRP5는거의모든조직에서낮은레벨로발현이되며세포분화과정동안발현정도가크게변하지않으며또한그것의 ligand가밝혀지지않아관심을받지못한유전자였다. 하지만, 발생과암을비롯한다양한질병의형성에관여하는 Wnts에대한 co-receptor임이확인이됨에따라 LRP5를통한 Wnt signaling의 bone formation의역할에대한연구가본격적으로시작되었다 [66,67]. LRP5는 Wnts subfamily (Wnt1, Wnt3a등 ) 와결합하여 Frizzled receptor와함께 ternary complex를형성한다. 이것은 canonical Wnt signaling pathway를활성화시켜 osteoblast의분화를촉진하게되어 bone formation을증가시키게된다 [66]. 정상적인상황에서이러한 signaling activation은 Dickkoff에의해억제가되어균형적으로조절이되지만, OPPG환자들의대다수는 LRP5 extracellular domain 에서의다양한 mutation으로인해 LRP5의기능이상실되어 bone formation 과정이제대로이루어지지않고, 그결과균형적인조절이깨지게된다 [18,68]. Bone formation과 bone mass에서의 LRP5의역할은 mouse에서유전적으로검증되었다. Osteoblast differentiation의주요조절자인 Cbfa1 유전자의발현이정상적임에도불구하고, LRP5가 null mutation된 mouse는 obsteoblast proliferation과기능이감소하여 postnatal bone loss를일으켰다 [69]. 이와는반대로, osteoblast에서 constitutive active form인 LRP5 (G171V) 를발현하는 transgenic mouse는 bone formation과 bone mass가증가하였다 [70]. 그리고, bone 밀도가높은개인에게서 G171 근처의아미노말단에여섯개의추가적인 mutation이최근에확인이되었다 [68]. 또하나의흥미로운사실은하나의 LRP5 유전자만 mutation이일어나하나의정상적인유전자를가지고있는사람의경우에도정상인에비해 bone mass가낮다는점이다. 이는 LRP5 단백질이 bone mass를조절하는조절장치임을의미한다. 따라서, LRP5 경로의활성을조절함으로써 bone 밀도를증가시키는것이가능하게될것으로생각된다. 3. Wnt와 stem cell differentiation Stem cell 분화의조절에관한연구는그기초연구뿐만아니라당뇨병, 심장병, 관절염, 퇴행성뇌질환, 뇌신경손상등과같은여러난치병에대한배아줄기세포를이용한세포치료방법으로서많은연구가이루어지고있다. 여러가지해결해야할문제가많지만, 가까운장래에 stem cell을이용한질병의치료방법이보편화된다고여겨짐으로전세계적으로치열한경쟁속에연구가진행되고있다. 특히, 1) stem cell의 maintenance/self-renewal capacity 유지에대한 mechanism과 2) 원하는특정조직으로의 differentiation을유도할수있는방법의개발등이주요연구분야이다. 본강좌에서는최근에밝혀진결과를중심으로배아줄기세포와성체줄기세포에서의 Wnt signaling의역할을나누어서설명하고자한다. 1) 배아줄기세포 (Embryonic Stem Cell, ESC) Embryonic stem cell은어떤세포로도분화할수있는능력을 (totipotency) 갖고있어서특정조직으로분화하는능력만을 (pluripotency) 갖고있는 adult stem cell과구분될수있다. 2000년에 Nobel상을수상한 Rockefeller 대학의 Paul Greengard박사그룹은 `6-bromoindirubin-3'-oxime (BIO)' 라는 GSK3β inhibitor를이용해서 activation된 Wnt/ β-catenin signaling이 human과 mouse ESC의 pluripotency 와 self-renewal capacity를유지시킨다고보고하였다 [25]. 또한, β-catenin의 level을조절하는 APC의다양한 mutant form들을이용하여, 증가된 β-catenin에의해 mouse ESC의 differentiation이억제된다고보고된바있다 [71]. 위결과들에서보이는 Wnt signaling의영향은 ESC에서 differentiation을억제하여 pluripotency를유지하고, self-renewal 즉 proliferation을촉진시키는데관여하는것으로보인다. 하지만, 본인의연구결과에의하면, mouse ESC이다양한경로로분화하는동안여러가지종류의 Wnt 및 Fz의발현이변화하는것을볼수있어서한두가지 components의과발현과 inhibitor의처리에의한실험은원하는방향으로 ESC의분화를유도할수있을지는모르지만, 그결과로부 - 313 -
- 대한내분비학회지 : 제 20 권제 4 호 2005 - 터 in vivo에서 ESC의분화의조절에있어서 Wnt signaling 의역할을일반화시키는것은문제가있다고여겨진다. inflammatory bowel disease같은질환의치료에이용될수있을것이다 [79]. 2) 성체줄기세포 (Adult Stem Cell) 앞에서언급한것과같이 Wnt signaling은 embryonic stem cell에서뿐만아니라, 각종 tissue-specific adult stem cell에서도 proliferation에관여한다. 그러나 cell lineage determination과같은 differentiation과정에도관여한다는보고들이있다. 이와같이동일한 Wnt signaling이상이한역할을한다는결과는 mouse embryonic, neural, hematopoietic stem cells의 gene information을비교한결과로미루어특정 cellular context에따라유전자발현패턴의상이성에기인한다고추측된다 [72]. In vitro에서 purification한 Wnt3a protein을처리함에의해서 hematopoietic stem cell의 self-renewal에 Wnt/β -catenin signaling이관여한다는것이밝혀졌다 [73]. 또한, 지속적인 activated β-catenin 의발현과 inhibitor인 Axin과 mutant Fz9 (CRD domain) 의발현을통하여 hematopoietic stem cell에서 Wnt/β-catenin signaling이 self-renewal capacity를유지시킨다는 in vivo/in vitro 결과들을보고하였다 [12]. 현재 β-catenin을통하지않는 non-canonical Wnt signaling의 stem cell에대한연구는활발히진행중인것으로보인다. Murdoch et al. 에의하면, Wnt5a-conditioned media를 human hematopoietic progenitor cell을 engraft한 mice에 injection한결과, reconstitution이증가한것을관찰하였고, 이는 Wnt-5a signaling이 hematopoietic stem cell expansion, engraftment 또는 survival을촉진한다는것을시사한다 [74]. Secreted Wnt inhibitor인 DKK-1을 skin specific K-14 promoter를이용하여 epidermis basal cell에서발현시킨 in vivo 실험결과, skin appendage에속하는 hair follicle, teeth, mammary gland의형성이억제된결과를얻었다 [75]. 또한 Eaine Fuchs박사그룹의연구결과는 β-catenin 의증가가 skin stem cell의 population의증가및 multipotency 를유지시키고, TCf-3과 Lef-1와의 complex를통하여 skin stem cell의 lineage differentiation에도관여한다는결과등도최근에밝혀졌다 [76]. TCF-4-deficient mice에서 fetal development 동안에 intestinal progenitor cell이관찰되지않는결과들이밝혀졌다 [77]. 더욱이, adult에서 Wnt signaling이 gut progenitor cell 에서 activation된상태이고, Wnt signaling inhibitor로알려진 Dickkopf-1(Dkk1) 를처리했을때, small intestine과 colon의 proliferation이억제되는결과들로보아, Wnt signaling은 intestinal stem cell의 self-renewal에관여한다고보여진다 [78]. 이러한결과들은 Wnt signaling activator를이용하여 gut epithelium의재생, 즉 homeostasis를유지하고, Wnt 신호전달의연구방향및결론전체적으로볼때 Wnt signaling에관련된생화학적또는유전학적인연구는많은부분이밝혀졌지만, 아직도더많은연구가필요하다. 다른생물학의연구분야에서와마찬가지로 Wnt signaling 분야에서가장어려운점은동일한 molecule이 cellular context에따라서다른역할을하는것이다. 따라서, 단순히특정유전자의 overexpression 이나 inhibitor의사용에의한결론은실제로 in vivo에서일어나는사실과다를가능성이있다. 최근들어여러가지인간질환에 Wnt signaling의이상이관련되었다는사실이밝혀지고있으며, 그러한질병의치료방법으로 Wnt signaling을조절하려는시도가많아지고있다. 따라서정확한질환치료의작용점을설정하기위해서는 Wnt signaling의조절에관련되는더많은 molecule 들의발굴과기전의이해가필수적이다. Wnt signaling의조절을이용하여질병을치료하고자할때, Wnt signaling 에관련된 molecule들이다른발생단계나 cell type에서상반되는기능을수행하는경우는단순한 drug의투여에의한질병의치료방법으로는부적절하다고여겨진다. 또한많은 cell signaling의경우에서볼수있는바와같이 Wnt 신호전달의경우도 TGF-β signaling을비롯한다른 signaling과의 cross regulation을하고있다고밝혀지고있어서, Wnt signaling을 target으로하는 drug의사용은많은주위와문헌의참고가필요하다. Wnt signaling의조절에의한질병의치료방법의개발은그상업적인가치때문에그중요성이더해질것이라고예상한다. Wnt가밝혀진이후약 20여년동안세계적으로도최고의연구자들이극심한경쟁하에연구가진행되어왔고현재도그상황은계속되고있다. 하지만, 새로발견되는질병과 Wnt signaling과의연관성의연구는시작점이동일하기때문에국내의임상연구자들과기초연구자들간의긴밀한공동연구가이루어지면충분히국제적인경쟁력이있다고여겨진다. 따라서, Harvard대학의 Dr. Xi He가말한대로 Wnt signaling의기초연구자와다양한질병의전문성을가진임상전문가들이서로를돕는 Wnt-Wnt (win- win 으로발음됨 ) 전략이사용되면, Wnt 신호전달을조절하는신약의개발을통한바이오산업의진흥에도크게기여를하리라고예상된다. 감사의글본저자는 2004년도서울시립대학교학술연구조성 - 314 -
- 조익훈 : Wnt 신호전달 - 최근의연구동향및질병과의연관성? - 사업으로부터연구비를지원받아연구를수행하였습니다. 참고문헌 1. Reya T, Clevers H: Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature 434:843-850, 2005 2. Moon RT, Kohn AD, De Ferrari GV, Kaykas A: WNT and beta-catenin signalling: diseases and therapies. Nat Rev Genet 5:691-701, 2004 3. Logan CY, Nusse R: The Wnt signaling pathway in development and disease. Annu Rev Cell Dev Biol 20:781-810, 2004 4. Nusse R, Varmus HE: Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell 31:99-109, 1982 5. Rijsewijk F, Schuermann M, Wagenaar E, Parren P, Weigel D, Nusse R: The Drosophila homolog of the mouse mammary oncogene int-1 is identical to the segment polarity gene wingless. Cell 50:649-657, 1987 6. Nusse R, Brown A, Papkoff J, Scambler P, Shackleford G, McMahon A, Moon R, Varmus H: A new nomenclature for int-1 and related genes: the Wnt gene family. Cell 64:231, 1991 7. McMahon AP, Bradley A: The Wnt-1 (int-1) protooncogene is required for development of a large region of the mouse brain. Cell 62:1073-1085, 1990 8. Thomas KR, Capecchi MR: Targeted disruption of the murine int-1 proto-oncogene resulting in severe abnormalities in midbrain and cerebellar development. Nature 346:847-850, 1990 9. Stark K, Vainio S, Vassileva G, McMahon AP: Epithelial transformation of metanephric mesenchyme in the developing kidney regulated by Wnt-4. Nature 372:679-683, 1994 10. Yamaguchi TP, Bradley A, McMahon AP, Jones S: A Wnt5a pathway underlies outgrowth of multiple structures in the vertebrate embryo. Development 126:1211-1223, 1999 11. Staal FJ, Clevers HC: WNT signalling and haematopoiesis: a WNT-WNT situation. Nat Rev Immunol 5:21-30, 2005 12. Reya T, Duncan AW, Ailles L, Domen J, Scherer DC, Willert K, Hintz L, Nusse R, Weissman IL: A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature 423:409-414, 2003 13. Otero JJ, Fu W, Kan L, Cuadra AE, Kessler JA: Beta-catenin signaling is required for neural differentiation of embryonic stem cells. Development 131: 3545-3557, 2004 14. Gregorieff A, Clevers H: Wnt signaling in the intestinal epithelium: from endoderm to cancer. Genes Dev 19:877-890, 2005 15. Meniel V, Hay T, Douglas-Jones A, Sansom OJ, Clarke AR: Mutations in Apc and p53 synergize to promote mammary neoplasia. Cancer Res 65:410-416, 2005 16. Ross SE, Hemati N, Longo KA, Bennett CN, Lucas PC, Erickson RL, MacDougald OA: Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science 289:950-953, 2000 17. Bennett CN, Ross SE, Longo KA, Bajnok L, Hemati N, Johnson KW, Harrison SD, MacDougald OA: Regulation of Wnt signaling during adipogenesis. J Biol Chem 277:30998-31004, 2002 18. Gong Y, Slee RB, Fukai N, Rawadi G, Roman- Roman S, Reginato AM, Wang H, Cundy T, Glorieux FH, Lev D, Zacharin M, Oexle K, Marcelino J, Suwairi W, Heeger S, Sabatakos G, Apte S, Adkins WN, Allgrove J, Arslan-Kirchner M, Batch JA, Beighton P, Black GC, Boles RG, Boon LM, Borrone C, Brunner HG, Carle GF, Dallapiccola B, De Paepe A, Floege B, Halfhide ML, Hall B, Hennekam RC, Hirose T, Jans A, Juppner H, Kim CA, Keppler- Noreuil K, Kohlschuetter A, LaCombe D, Lambert M, Lemyre E, Letteboer T, Peltonen L, Ramesar RS, Romanengo M, Somer H, Steichen- Gersdorf E, Steinmann B, Sullivan B, Superti-Furga A, Swoboda W, van den Boogaard MJ, Van Hul W, Vikkula M, Votruba M, Zabel B, Garcia T, Baron R, Olsen BR, Warman ML: LDL receptor-related protein 5 (LRP5) affects bone accrual and eye development. Cell 107:513-523, 2001 19. Patel MS, Karsenty G: Regulation of bone formation and vision by LRP5. N Engl J Med 346:1572-1574, 2002 20. Miyaoka T, Seno H, Ishino H: Increased expression of Wnt-1 in schizophrenic brains. Schizophr Res 38:1-6, 1999 21. Svenningsson P, Tzavara ET, Carruthers R, Rachleff I, Wattler S, Nehls M, McKinzie DL, Fienberg AA, Nomikos GG, Greengard P: Diverse psychotomimetics - 315 -
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