J Koren So Food Si Nutr 한국식품영양과학회지 43(), 5~59(4) http://dx.doi.org/.3746/jkfn.4.43..5 위염동물모델과위벽세포에서히스타민경로를통한매스틱검 (Chios Msti Gum) 의위산분비억제효과및기전연구 남다은 김옥경 심태진 이점균 3 황권택 4 경희대학교임상영양연구소, ( 주 ) 진용 3 헬스밸런스 ( 주 ), 4 남부대학교 Inhiitory Effets of Chios Msti Gum on Gstri Aid Seretion y Histmine Relted Pthwy in Rt Model nd Primry Prietl Cells DEun Nm, Ok Kyung Kim, Te Jin Shim, Jum Kyun Lee 3, nd KwonTk Hwng 4 Deprtment of Medil Nutrition, Kyung Hee University Jinyong Co. Ltd. 3 Helth Blne Co. Ltd. 4 Deprtment of Food nd Nutrition, Nmu University ABSTRACT The ojet of this study ws to investigte the inhiitory effets of hios msti gum (MG) on gstri id seretion in n ethnolindued SD rt model nd primry prietl ells. Rts were rndomly divided into four groups: Vehile (norml group), Control (treted with ethnol), MG5 (treted with ethnol nd msti gum t 5 mg/kg.w), MG (treted with ethnol nd msti gum t mg/kg.w). Groups treted with oth MG5 nd MG showed ttenution of gstri muosl injury, suepithelil loss, hemorrhging, nd gstri juie seretion. We lso exmined the idity of gstri juie during gstri injury. Orl dministrtion of oth MG5 nd MG signifintly deresed idity of gstri juie y % nd %, respetively. To exmine the stimultory ftors relted to gstri id seretion, mrna expression levels of Hr, M3r, CCKr, nd H /K ATPse were mesured y reltime PCR. Compred with vehile group, mrna expression levels of Hr, CCKr, nd H /K ATPse lerly inresed in the ontrol group. However, levels of Hr, CCKr, nd H /K ATPse slightly ut signifintly deresed in MGtreted groups ompred with ontrol. Blood level of histmine signifintly deresed in MGtreted groups, whih indites the involvement of MG on in histminerelted id seretion. To identify the mode of tion of MG in regulting histminerelted pthwys, intrellulr level of AMP nd mrna levels of Hr, M3r, CCKr, nd H /K ATPse were mesured in primry prietl ells. While mrna levels of M3r nd CCKr remined unhnged, levels of Hr nd H /K ATPse signifintly deresed upon MG tretment. Susequently, intrellulr levels of AMP deresed. These results suggest tht msti gum hs the ility to inhiit gstri id seretion y regulting histminerelted pthwy. Key words: msti gum, gstri id, histmine, AMP, proton pump 서 위염은위점막염증성질환을총칭하는것으로 Helioter pylori 균감염, NSAID(nonsteroid ntiinflmmtory drugs), 스트레스, 알코올등에의해위점막을보호하는방어인자와손상시키는공격인자사이의균형이깨져발생이된다 (,). 최근 5년간실시된국민건강영양조사의자료를분석한결과에따르면위점막염증성질환에대한진료환자가연평균 4.9% 증가하였으며, 대여성에서더 Reeived August 4; Aepted 4 August 4 Corresponding uthor: KwonTk Hwng, Deprtment of Food nd Nutrition, Nmu University, Gwngju 5676, Kore Emil: hwngskt@nmu..kr, Phone: 869774 론 높은빈도로발생한것으로나타났다. 특히한국인에서맵고짠자극적인음식을선호하는식습관, 스트레스, 과도한음주문화, 약물오남용, 국물요리를함께섭취하는식습관등으로인해위장관의염증성질환발생이빈번하고만성적으로발생하는것으로나타났다 (35). 위점막을손상시키는공격인자의하나인알코올과다섭취는위장의출혈과염증발생을유발시켜급성위염을일으킬수있다 (6,7). 이러한알코올의자극은위장에직접적인손상을일으키게되며, 따라서높은농도의알코올처리는동물을이용한위염, 위산분비및위점막손상유발모델에서널리사용되고있다 (8). 위산분비의대표적인세가지경로로 histmine에의한 histmine reeptor(hr) 발현, etylholine에의한
매스틱검의위산분비억제효과 5 musrini etylholine reeptor M3(M3r) 활성화그리고 gstrin에의한 holeystokinin reeptor(cckr) 활성화가있다. 위의점막에존재하는위벽세포 (prietl ell) 에서히스타민, 아세틸콜린, 가스트린자극에의해 Hr, M3r 그리고 CCKr 이활성화되면서세포내 AMP와 C 농도가증가하고, 세포막에존재하는 proton pump인 H /K ATPse를활성화시킨다. 이로인해결국 HCl 분비가증가되면서위장점막의손상을가중시키는것으로알려져있다 (9). 이렇듯위염또는위궤양과같은위장질환에서는과도한위산분비에의한위점막의손상을최소화하기위하여제산제, 산분비억제제, H 수용체길항제또는 proton pump 억제제등을약물로사용하고있다 (3). 그러나이러한약물만으로근본적인원인에대한치료를할수없으며만성적인약물복용으로인한부작용및장기복용부담등이문제점으로나타나면서최근에는식품및천연물소재의생체방어증진물질에대한관심이높아지고있다. 매스틱검 (msti gum) 은위나장등의소화기관에미치는긍정적효과가뛰어나고, 그외구강건강, 항산화, 항염증등의다양한기능성을가지는것으로알려져있다 (5). 특히 H. pylori 균의저해활성및염증성사이토카인감소등에의한위장점막의손상을유의적으로감소시키는것으로알려져있다 (,). 또한동물에서 spirin, phenylutzone, reserpine, old stress에의한위장점막손상으로부터보호효과가있으며, 위염증및궤양정도를유의적으로감소시키는데효과적인것으로보고되고있다 (3). 이러한매스틱검의위장보호효과에대한연구결과를바탕으로, 매스틱검이알코올로유도한위손상에대한위산분비억제및위장점막보호효과를나타낼수있을것으로기대된다. 그러나매스틱검을이용한위장점막의손상과관련된메커니즘규명연구가미미한실정이며, 따라서본연구에서는매스틱검의투여가알코올처리로유도된위점막손상동물모델에서위액분비, 위점막손상, 위산분비촉진인자발현변화에미치는영향을관찰하고, 매스틱검의처리에따라 prietl ell에서관련수용체발현및 AMP 농도변화를관찰하여매스틱검의위산분비억제를통한위장보호기전을확인하고자하였다. 실험동물및처치본연구에사용한실험동물은경희대학교동물실험윤리위원회 (KHUASP(SE)4) 의승인을받아진행하였다. 대한바이오링크 ( 충북음성군, 한국 ) 로부터공급받은 5 g 내외의 7주령 SD rt 수컷을일주일동안설치류사육실에서적응시킨후적응기간중일반상태를관찰하여건강한개체만실험에사용하였다. 사육환경은온도 3±3 C, 습도 5±5% 에서 light yle은 시간으로유지하였다. 순화기간중건강하다고판정된동물에대하여체중을측정하고평균체중에가까운개체를선택하여무작위법을이용하여군분리를실시하였다. 군분리는정상대조군 (Vehile), 알코올성위자극시험대조군 (Control), 매스틱검 (MG) 5 mg/kg 투여군 (MG5), 매스틱검 mg/kg 투여군 (MG) 의총 4군으로군당 SD rt 8마리씩구성하여실험을진행하였다. Vehile 그룹은.5% CMC를, ontrol 그룹은.5% CMC와 4% 에탄올을, MG5과 MG 그룹은 7일동안시험물질과 4% 에탄올을 ml씩경구투여하여위를자극시켰다. 실험 4시간이전에모든식이공급을중단하여위를비우도록하였으며실험당일에 7% 알코올에 5 mm HCl을첨가하여 ml씩경구투여한후 시간뒤희생시켰다. 위점막손상면적측정 7% 알코올에 5 mm HCl을첨가하여 ml씩경구투여한다음 시간뒤희생시킨후개복하여방혈한다음위를적출하였다. 적출한위는대만부를따라절개한후식염수에씻어면봉으로잘펴서핀으로고정한뒤사진촬영을하였다. 촬영한사진은이미지프로그램 (AxioVs V 4.8., Axiovision, Crl Zeiss, Germny) 을이용하여위손상부위및위전체면적을측정하였고 Uler Index(%)= ( 손상면적 / 전체면적 ) 으로계산하였다. 위액분비량측정적출한위를사진촬영전유문부를조금절개하여 5 ml 튜브에위액을수집하여 3, rpm에 분 entrifuge 한후상층액을수집하여위액량 (ml) 을측정하였다. 재료및방법실험재료키오스매스틱검 (Chios msti gum: mnuftured y The Chios Gum Msti Growers Assoition) 은 ( 주 ) 진용 ( 수원, 한국 ) 으로부터분말형태로공급받아실험에사용하였다. 세포실험을위한실험재료의준비는분말형태의매스틱검을.% ethnol(merk, Drmstdt, Germny) 에녹여사용하였으며, 동물실험에사용된매스틱검은 CMC.5% 용액에분말그대로첨가후용해하여사용하도록하였다. 위액산도 (idity & ph) 측정위액분비량측정이끝난후상층액 ml를수집하고.5% dimethylminoenzene lohol 용액및 % phenolphthlein lohol 용액을각각 3방울씩가한다. 이때위액이붉은색을나타내면, urette을이용하여. N NOH 용액을첨가하여장미색조가나타날때까지의적정값을총산도로하여 meq/l로표시한다. Aidity의계산식은다음과같다. Aidity=(Volume of NOH Normlity of NOH )/.(meq / g)
5 남다은 김옥경 심태진 이점균 황권택 Tle. Primer set sequene used for reltime PCR Sequene nme Forwrd sequene Reverse sequene NCBI referene GAPDH Musrini etylholine reeptor (M3r) Histmine reeptor H (Hr) Choleystokinin reeptor (CCKr) H /K ATPse TGG CCT CCA AGG AGT AAG AAA C GCC TGG GTC TCT TAA TTC CTA TCA CCA TCC TGT ACG CTG CTC TCA GCG GAA ACG TGC TCA TCA T TGA CGG TGT CTC ATC TAT GGT TTG CAG CAA CTG AGG GCC TCT CT ATG GGA TCT GGA TGG ACA CTT T TGC GAA CTT GCA GTG GAA GA GGC GTT GGT GAC CGT TCT T ACG TTT GCC CTG ACT GGT CTT BC87743. M647. NM_965 NM_365 NM_59. Reltime polymerse hin retion에의한유전자발현측정적출한실험동물의위에서점막부분을분리한뒤수거하여 RNesy extrtion kit(qiagen, Germntown, MD, USA) 로제조사의 mnul에따라 totl RNA를추출하고 DNA의합성을위해 isript Selet DNA Synthesis Kit (BIORAD, Singpore, Singpore) 을이용하여 5 μg의 totl RNA에 5 isript selet retion mix를 4 μl, Oligo(dT) Primer set μl(tle ), RNA smple 5 μl, NuleseFree Wter 8 μl를각각넣고마지막에 isript Reverse Trnsriptse μl를넣어 pipette으로 up & down 하여골고루섞어주었다. 95 C에서 분간 hot strt 한후 95 C에서 5초간, 6 C에서 5초, 7 C에서 5초간 35 yling으로 PCR을수행한후마지막으로 95 C에서 5 초, 6 C에서 분, 95 C 5초 polishing step을거쳐 PCR 분석을시행하였다. 반응에사용한 primer는 Tle 에제시하였다. 고, ollgense(worthington type 4) mg/ml와 BSA mg/ml 농도로첨가하여 3분간 37 C에서보관하였다. 이렇게얻어진세포부유액을 nylon mesh(. mm) 를이용하여 fiter 한뒤에 5분간원심분리하여세포를분리하였다. 분리된세포는 4 µm pore size ell striner(bd Flon, Frnklin Lkes, NJ, USA) 에여과한후,6 rpm으로 분간원심분리를 회진행하였다. 이렇게분리된세포는 Complete Medium[DMEM/F(GIBCOBRL, Grnd Islnd, NY, USA), mm HEPES,.% BSA, mm gluose, insulintrnsferrinseleniuma(gibco), mm glutmine, U/mL peniillin/streptomyin, 4 μg/ml gentmiin sulfte, 5 mg/ml genetiin, ph 7.4] 을첨가하여다시,6 rpm으로 분간원심분리하였다. 이렇게분리된세포가 ollgenseisolted ells 이며, 이세포는 mtrigel(corning, Steuen County, NY, USA) 로 oting 한 plte에넣고 37 C, 5% CO 의조건하에서배양하였다. 혈장에서 histmine 측정동물에서매스틱검투여에따른 histmine 저해활성을측정하기위해실험동물에서분리한 plsm를이용하여 histmine을측정하였다. 측정을위해 SPIBIO(New South Wles, Austrli) 의 histmine enzyme immunossy kit (Bertin Phrm, Bretonneux, Frne) 을이용하여 SPI BIO의 protool을따라서실험을하였으며, ELISA reder (Moleulr Devies, Seoul, Kore) 를이용하여측정하였다. 위벽세포분리및배양위벽세포분리를위한실험동물은 Nkd 등 (4) 의방법에의해수행하였다. 먼저 5 g 내외의 7주령 SD rt 수컷을경추탈골하여 7% 알코올로피부를소독하여절개한후위조직을분리하였고, 이후위조직은 phosphte uffer sline(hylone Lortories, Logn, UT, USA) 용액에서보관하여 len enh로옮긴후 phosphte uffer sline 용액에서 회세척하였다. DMEM(Hylone Lortories) 에 mm HEPES와 5 M imetidine을첨가하 위벽세포에서 AMP level 측정 Mtrigel plte에서배양한세포를 4시간동안안정화시킨후, 매스틱검을 histmine. mm과함께 3분동안처리한다음 medi를제거한후 srper를이용해세포를분리해내었다. Pipette을이용하여 suspension 한뒤 분간원심분리하고그상층액을사용하였다. 측정을위해 AMP diret immunossy kit(biovision, Milpits, CA, USA) 을이용하여 Biovision의 protool을따라서실험을하였으며, ELISA reder(moleulr Devies) 를이용하여측정하였다. 위벽세포에서유전자발현측정 Mtrigel plte에서배양한세포를 4시간동안안정화시킨후, 매스틱검을 histmine. mm과함께 3분동안처리한후.5% trypsinedta로세포를수집하여 RNesy extrtion kit(qiagen, Germntown, MD, USA) 로제조사의 mnul에따라 totl RNA를추출하고 DNA의합성을위해 isript Selet DNA Synthesis Kit(BIO
매스틱검의위산분비억제효과 53 A B 4 Vehile Control Uler index (%). 6 8 4 Vehile Control MG5 MG MG5 MG Fig.. Effet of msti gum (MG) on gstri muosl dmge (A) nd uler index (B) (%, gstri lesion/ totl re ) in rts treted y ethnol. Vehile (norml group), Control (treted y ethnol), MG5 (ethnol nd pretretment of MG 5 mg/kg.w), MG (ethnol nd pretretment of MG mg/kg.w) groups. The results re presented mens±sd. Different letters () show signifint differene t P<.5 s determined y onewy ANOVA. RAD) 을이용하여 5 μg의 totl RNA에 5 isript selet retion mix를 4 μl, Oligo(dT) Primer set μl(tle ), RNA smple 5 μl, NuleseFree Wter 8 μl를각각넣고마지막에 isript Reverse Trnsriptse μl를넣어 pipette으로 up & down 하여골고루섞어주었다. 95 C 에서 분간 hot strt 한후 95 C에서 5초, 6 C에서 5 초, 7 C에서 5초간 35 yling으로 PCR을수행한후마지막으로 95 C에서 5초, 6 C에서 분, 95 C 5초간 polishing step을거쳐 PCR 분석을시행하였다. 반응에사용한 primer는 Tle 에제시하였다. 통계처리본실험결과는 SPSS(Sttistil Pkge for the Soil Siene) version.(ibm, Cmridge, MA, USA) 프로그램을이용하여분석하였다. 모든측정항목의결과는평균 (men)± 표준편차 (stndrd devition, SD) 로표시하였고실험군간평균의차이는 onewy ANOVA로유의성을확인하였으며 P<.5 수준에서유의성의여부를검증하였다. 결과위점막손상및형태학적변화위점막손상에대한형태학적인변화를살펴본결과 vehile 처리군에서는위점막손상이관찰되지않은반면, ontrol 그룹에서는위점막의손상과점막출혈을관찰할수있었다 (Fig. A). 이에따라 ontrol 그룹에서의위점막손상면적은전체면적의 3.75±.3% 를차지하였다 (Fig. B). 매스틱검을투여한그룹 (MG5, ) 에서 ontrol 그룹에비하여위점막손상과출혈이감소하였음을관찰하였다 (Fig. A). 위손상면적은매스틱검 5 mg/kg 투여한 MG5 그룹에서 6.98±.98%, 매스틱검 mg/kg 투여 한 MG 그룹에서는 6.8±.4% 로나타났으며 ontrol 그룹과비교하여손상면적이유의적으로감소된것을확인하였다 (P<.5)(Fig. B). 위액분비량변화위액분비량측정결과 vehile 처리군에서는.5±.3 ml로위액이소량분비되었으나 ontrol 그룹에서는위점막손상으로위액분비량이증가하여.73±.6 ml로측정되었다. 이는정상대조군과비교하여유의적인차이를보였다 (P<.5). 매스틱검 5 mg/kg을투여한 MG5 그룹의위액분비량은.3±.7 ml, 매스틱검 mg/kg을투여한 MG 그룹은.5±.5 ml로측정되었다. 따라서이러한결과로매스틱검의투여에따라위액분비량이감소되었음을확인하였다 (P<.5)(Fig. ). Gstri id volume (ml)..8.6.4. Vehile Control MG5 MG Fig.. Effet of msti gum (MG) on gstri id volume in rts treted y ethnol. Vehile (norml group), Control (treted y ethnol), MG5 (ethnol nd pretretment of MG 5 mg/kg.w), MG (ethnol nd pretretment of MG mg/kg.w) groups. The results were presented mens±sd. Different letters (,) show signifint differene t P<.5 s determined y onewy ANOVA.
54 남다은 김옥경 심태진 이점균 황권택 Tle. Histopthologil sore index of gstri inflmmtion Sore No inflmmtory response in muos nd sumuos Sore Mild infiltrtion of neutrophils in sumuos nd lower muos ut no gstri epithelil hnge Sore Moderte infiltrtion of neutrophils nd mrophges in muos s well s sumuos nd fol nerosis of gstri epitheli Sore 3 Severe infiltrtion of neutrophils nd mrophges in muos nd sumuos, nd multifol nerosis of gstri epitheli Sore 4 Severe infiltrtion of neutrophils nd mrophges in muos nd sumuos, nd mssive nerosis of the gret prt of gstri epitheli Sore 5 Severe infiltrtion of neutrophils nd mrophges in muos, sumuos, nd musle lyer, mssive nerosis of ll prt of gstri epitheli, nd presene of edem, erosion, nd uler 위조직의병리학적변화 ( 염증지수 ) 위조직의병리학적상태를수치화후평가하는지표를이용하여 (Tle ) 위조직의병리학적이상소견을점수화한결과에서 vehile 처리군에서는특이할만한조직병리학적소견은관찰되지않았으나 ontrol 그룹은 3.9±.9로유의적으로가장높았다 (P<.5). 매스틱검 5 mg/kg과 mg/kg 투여한군은각각.33±.88 및.8±.9로측정되었다. Control 그룹과비교하였을때매스틱검을투여한모든그룹에서점수가유의적으로감소하는경향을관찰할수있었다 (P<.5)(Tle 3). 위액산도변화위장점막에손상을주는위액의산도와 ph 변화를확인한결과총산도의경우 vehile 처리군 3.67±3.6 molr equiv.l / g, ontrol 그룹 79.33±7. molr equiv.l / g으로정상대조군에비해 ontrol 그룹의총산도가유의적으로증가한것으로확인되었다 (P<.5). 반면매스틱검 5 mg/kg을투여한 MG5 그룹은 5.67±5.73 molr equiv.l / g으로유의적으로감소하였으며, 특히매스틱검 mg/kg을투여한 MG 그룹에서총산도 37.33 ±7. molr equiv.l / g으로 vehile 처리군과유의적인차이가없을정도로감소되었음을확인하였다 (P<.5) (Tle 3). ph 측정결과에서도역시 vehile 처리군에서 3.8±.3, ontrol 그룹.3±.7로나타나 ontrol군의 ph가유의적으로감소되었음을확인하였다. MG5 그룹및 MG 그룹에서는각각.88±.5와 3.6±.5로 ontrol군에비해유의적으로 ph가증가하였으며, 특히 MG 그룹에서가장효과적으로 ph가증가하였음을확인하였다 (Tle 3). 실험동물혈장에서 histmine 농도와위점막의 H 수용체발현변화량측정위장점막에손상을주는위액분비와관련된인자인 histmine과그로인해영향을받는 H 수용체유전자의발현변화량을확인하였다. 먼저 histmine의경우 vehile 처리군에비해 ontrol 그룹에서 3.46±.4 nm로 ontrol 그룹의혈장에서 histmine의농도가통계적으로유의성있게증가한것으로확인되었다 (P<.5). 반면매스틱검 5 mg/ kg을투여한 MG5 그룹은.63±.38 nm, MG 그룹은.3±.3 nm로 ontrol군에비해유의적으로감소한것으로나타났으며, 매스틱검을투여한모든그룹에서 histmine 농도가효과적으로감소되었음을확인하였다 (P<.5) (Fig. 3A). Hr의발현량조사결과 vehile 처리군.3±.에비해 ontrol 그룹에서.±.5로 ontrol군의 Hr 발현이통계적으로유의성있게증가한것으로확인하였다 (P<.5). 반면 MG5 그룹은.37±., MG 그룹은.4±.로시험대조군에비해유의적으로 H 수용체발현이감소한것으로나타났으며, 매스틱검을투여한모든그룹에서효과적으로감소되었음을확인하였다 (P<.5)(Fig. 3B). 실험동물위점막의유전자발현변화량측정위장점막에손상을주는위액분비와관련된유전자의발현변화량을 reltime PCR을이용하여확인하였다. 먼 Tle 3. Effet of msti gum (MG) on histopthologil sore of gstri inflmmtion nd ulerogeni effets (ph nd idity) in rts in rts treted y ethnol Group Alohol tretment Histopthologil sore ph Vehile Control MG5 MG. 3.9±.9.33±.88.8±.9 3.8±.3.3±.7.88±.5 3.6±.5 Totl idity (Molr equiv.l / g) 3.67±3.6 79.33±7. 5.67±5.73 37.33±7. Vehile (norml group), Control (treted y ethnol), MG5 (ethnol nd pretretment of MG 5 mg/kg.w), MG (ethnol nd pretretment of MG mg/kg.w) groups. The results were presented mens±sd. Different supersript letters () in olumn show signifint differene t P<.5 s determined y onewy ANOVA.
매스틱검의위산분비억제효과 55 A 5 B Histmine (nm). 4 3 Reltive mrna Expression. of H reepter..5.5 Vehile Control MG5 MG Vehile Control MG5 MG Fig. 3. Effet of msti gum (MG) on plsm histmine (A) nd H reeptor (B) expression in rts treted y ethnol. Vehile (norml group), Control (treted y ethnol), MG5 (ethnol nd pretretment of MG 5 mg/kg.w), MG (ethnol nd pretretment of MG mg/kg.w) groups. The results were presented mens±sd. Different letters () show signifint differene t P<.5 s determined y onewy ANOVA. 저 CCKr 의유전자발현변화량에서는 vehile 처리군.7 ±.에비해 ontrol 그룹에서.±.4로 ontrol군의 CCKr 발현이통계적으로유의성있게증가한것으로확인되었다 (P<.5). 반면 MG5 그룹은.38±.5, MG 그룹은.44±.8로 ontrol군에비해유의적으로그발현이감소한것으로나타났으며, 매스틱검을투여한모든그룹에서효과적으로감소되었음을확인하였다 (P<.5)(Fig. 4A). 위산분비증가와관련있는 M3r에서도 vehile 처리군.56±.에비해 ontrol 그룹에서.±.로 ontrol군의 M3r 발현이통계적으로유의성있게증가한것으로확인되었다 (P<.5). 매스틱검투여그룹에서는 MG5 그룹이.89±.4, MG 그룹은.3±.6으로시험대조군과유의적인차이는나타나지않은것으로나타났다 (Fig. 4B). 위산분비에서중요한역할을하는 H /K ATPse 발현량에서도역시 vehile 처리군.7±.에비해 ontrol 그룹에서.±.로 ontrol군의 H /K ATPse 발현이통계적으로유의성있게증가한것으로확인되었다 (P<.5). 또한매스틱검투여그룹에서는 MG5 그룹은.76±., MG 그룹은.83±.로 ontrol군에비해유의적으로발현이감소한것으로나타났다 (P<.5) (Fig. 4C). 위벽세포에서유전자발현변화량측정 Histmine으로자극한위벽세포에서매스틱검처리에따른위산분비관련유전자발현의변화량을측정하였다. 먼저 CCKr의유전자발현변화량에서는 vehile 처리군.77±.9에비해 histmine 처리한 ontrol 그룹에서.±.8로 CCKr 발현이통계적으로유의성있게증가한것으로확인되었다 (P<.5)(Fig. 5A). 매스틱검 5 μg/ ml를처리한세포에서.9±.9, 매스틱검 μg/ml 처리세포에서.94±.5, 매스틱검 μg/ml 처리세포에서.4±.로나타났으나 ontrol 그룹사이에유의성은나타나지않은것으로확인되었다 (Fig. 5A). 또한 M3r에서도 vehile 처리군의.65±.7에비해 ontrol 그룹에서.±.5로유전자발현이통계적으로유의성있게증가하였으나, 매스틱검처리세포에서 ontrol 그룹과유의적인차이가나타나지않은것으로확인되었다 (Fig. 5B). Histmine에의해가장직접적으로영향을받는 Hr의발현량변화에서는 vehile 처리군의.3±.7에비해 ontrol 그룹에서.±.3으로 Hr 발현이통계적으로유의성있게증가한것으로확인되었다 (P<.5). 반면매스틱검 5 μg/ml를처리한세포에서.77±.9, 매스틱검 μg/ml 처리세포에서.6±., 매스틱검 μg/ml 처리세포에서.57±.7로나타나유의적으로발현이감소 A Reltive mrna Expression. of CCK reeptor..5.5 d Vehile Control MG5 MG B Reltive mrna Expression. of M3 reeptor..5.5 Vehile Control MG5 MG C Reltive mrna Expression. of H/K ATPse..5.5 d Vehile Control MG5 MG Fig. 4. Effet of msti gum (MG) on CCK reeptor (A), M3 reeptor (B), nd H /K ATPse (C) expression in rts treted y ethnol. Vehile (norml group), Control (treted y ethnol), MG5 (ethnol nd pretretment of MG 5 mg/kg.w), MG (ethnol nd pretretment of MG mg/kg.w) groups. The results were presented mens±sd. Different letters (d) show signifint differene t P<.5 s determined y onewy ANOVA.
56 남다은 김옥경 심태진 이점균 황권택 Reltive mrna Expression. of CCK reepter..5.5 Histmine. mm A Vehile Control 5 Conentrtion (μg/ml) Reltive mrna Expression. of M3 reepter..5.5 Histmine. mm B Vehile Control 5 Conentrtion (μg/ml) Reltive mrna Expression. of H reepter..5.5 Histmine. mm C d Vehile Control 5 Conentrtion (μg/ml) Fig. 5. Effet of msti gum (MG) on CCK reeptor (A), M3 reeptor (B), nd H reeptor (C) expression in primry ultured prietl ells. Vehile (norml group), Control (. mm histminetreted group), 5 (histmine nd tretment of MG 5 µg/ml), (histmine nd tretment of MG µg/ml), (histmine nd tretment of MG µg/ml). The results were presented mens±sd. Different letters (d) show signifint differene t P<.5 s determined y onewy ANOVA. 한것을확인하였으며, 특히매스틱검처리에따라농도의존적으로감소되었음을확인하였다 (P<.5)(Fig. 5C). 위벽세포에서 AMP level 및 H /K ATPse 발현량측정 Histmine으로자극한위벽세포에서매스틱검처리에따른 AMP 농도변화량과그에따른 H /K ATPse 발현량변화를측정하였다. 먼저세포수준에서 AMP level을측정한결과, vehile 처리군 74.8±6.7 fmol/mg protein 에비해 ontrol 그룹에서 58.5±7.4 fmol/mg protein으로 AMP level이유의적으로증가한것으로나타났다 (P<.5). 반면매스틱검 5 μg/ml를처리한세포에서 34.±.6 fmol/mg protein, 매스틱검 μg/ml 처리세포에서 8.6±7.4 fmol/mg protein, 매스틱검 μg/ ml 처리세포에서.7±4.3 fmol/mg protein으로 histmine으로자극시킨세포에비해유의적으로그발현이감소한것으로나타났으며, 매스틱검처리에따라농도의존적으로감소되었음을확인하였다 (P<.5)(Fig. 6A). AMP 농도에의해영향을받는 H /K ATPse 발현변화량을측정한결과, vehile 처리군.44±.7에비해 histmine 으로자극시킨 ontrol 그룹에서.±.로유전자발현량이유의적으로증가한것으로나타났다 (P<.5). 반면매 스틱검 5 μg/ml를처리한세포에서.84±.7, 매스틱검 μg/ml 처리세포에서.7±., 매스틱검 μg/ ml 처리세포에서.68±.5로시험대조군에비해유의적으로그발현이감소한것으로나타났으며, 이러한결과는앞선 AMP level 측정결과와비슷한양상으로농도의존적으로감소한것으로확인되었다 (Fig. 6B). 고찰위점막염증성질환은한국사회에서가장흔한질환으로위의모든부분에서병변이일어날수있으며지속될경우만성위염, 위궤양, 위암으로까지진행할수있는질병이다. 스트레스와과음이가장큰원인으로나타나며, 이전연구결과들을살펴보면알코올과다섭취가위장의출혈및위점막손실을일으켜급성및만성위염이발생하는것으로나타났다. 또한이러한자극이위산분비를더욱증가시키고위내부 ph 증가와위산에의한위장점막의손상을심화시키는것으로알려져있다 (,). 이번연구에서알코올로위를자극한동물의위산분비와위점막조직손상에매스틱검투여에대한효과를확인하기위하여위점막조직의형태학적, 병리학적변화, 위산분비량및위액의산도를측 A 4 B intrellulr AMP. (fmol/mg protein). 8 6 d Reltive mrna Expression. of H/K ATPse..5.5 d Histmine. mm Vehile Control 5 Conentrtion (μg/ml) Histmine. mm Vehile Control 5 Conentrtion (μg/ml) Fig. 6. Effet of msti gum (MG) on intrellulr AMP level (A) nd H /K ATPse (B) expression in primry ultured prietl ells. Vehile (norml group), Control (. mm histminetreted group), 5 (histmine nd tretment of MG 5 µg/ml), (histmine nd tretment of MG µg/ml), (histmine nd tretment of MG µg/ml). The results were presented mens±sd. Different letters (d) show signifint differene t P<.5 s determined y onewy ANOVA.
매스틱검의위산분비억제효과 57 정하였다. 실험결과, 알코올로위를자극한동물의위점막조직이현저히손상되어 uler index( 손상면적 ) 가유의적으로증가한것으로나타났으며, 위액분비량및위액산도역시유의적으로높아진것으로나타나알코올의영향으로위액분비증가와위점막조직손상이심화된것을확인할수있었다. 반면매스틱검을투여한그룹에서는 ontrol군과비교하여유의적으로 uler index가낮아졌고위액분비량과위액산도역시유의적감소를보였으며, 이러한결과는알코올로위를자극한동물모델에서매스틱검투여에따라위점막의보호효과가나타난것으로생각된다. 특히실험농도인 5 mg/kg 투여그룹과 mg/kg의매스틱검을투여한그룹에서모두유의적으로효과가나타났으며, 이는이전실험결과와동일한것으로확인되었다 (5,6). 최근여러연구에서위산분비증가와관련하여위점막조직의수용체활성이위의 ph를증가시키고위병변을일으키는중요한인자로작용한다고보고되고있다. 위산분비는스트레스등의다양한원인에의해히스타민, 아세틸콜린, 가스트린분비가증가되고관련수용체인 Hr, M3r 및 CCKr이증가되면서더욱심화된다 (7,8). Histmine에의해 Hr이증가되면세포내 AMP 농도가증가하게되고, 또한 M3r과 CCKr에의해세포내 C 농도가증가한다. 결국위벽세포의 H /K ATPse를활성화시켜 HCl 분비가활발히진행되면서위산자극에의한위점막손상이심화된다 (9). 그러므로수용체활성을조절하는것이위조직의손상을치료하고보호하는데중요한역할을하고, 이와관련된약물을치료에사용하고있다 (3). 이번연구에서실험동물의혈장에서 histmine 농도를측정한결과알코올로위를자극시킨동물의혈장 histmine 농도가정상대조군에비하여유의적으로높아진반면, 매스틱검투여그룹에서는 ontrol 그룹과비교하여혈장 histmine 농도가유의적으로낮아진것을확인하였다. Histmine 분비에의해조절되는 Hr의유전자발현량을비교한결과에서도역시혈장 histmine 농도와비슷한양상으로매스틱검투여그룹에서그발현이유의적으로감소한것을확인하였다. 이러한실험결과는앞서확인한위점막조직의손상, 위액분비량및위액산도를확인한결과와일치하였으며, 이는매스틱검의투여가 histmine 분비를조절함으로써위산분비증가와관련된 Hr의발현에도영향을미쳐결국위산분비를감소시키고위점막조직의보호효과가나타난것으로생각된다. 위산분비와관련된다른수용체의발현을확인하기위해위염이유발된실험동물의위점막조직에서유전자발현정도를비교하였다. 그결과알코올로위를자극한동물의위조직의 CCKr 및 H /K ATPse의발현정도가정상대조군에비하여유의적으로높아져알코올에의한위점막의손상에영향을준것을확인하였다. 반면매스틱검을투여한모든실험군 (MG5, MG) 에서위산분비관련수용체의발현이유의적으로감소하여위점막손상에대한 보호효과가나타난것을확인하였다. 이전연구결과에서는매스틱검및그추출물에의하여 pylori 균, spirin 등의약물에의한위궤양및위염에서개선작용을나타내었으며, 염증관련인자인 inos, COX 등의발현을억제하는등위장점막보호효과를나타낸것으로보고하였다 (3,3). 이로써매스틱검의항염증활성을증명한바있으며, 매스틱검의기능성분에대한연구를통해 resin 등풍부한식이섬유가염증억제및위점막의보호활성을나타낸것으로보고하였다 (3,3). 따라서이번연구에서알코올로위를유발시킨동물에서매스틱검의처리로인하여위손상을감소시킨결과는매스틱검의점막보호활성및위산분비억제활성으로인한결과로예상할수있다. 동물실험결과를바탕으로세포수준에서위산분비와관련된기전적연구를추가적으로진행하였다. 동물의위조직에서분리한 prietl ell에서 histmine 자극에의한수용체발현을확인하였으며, 실험결과 Hr과 H /K ATPse 는정상세포에비해 histmine으로자극한세포에서발현량이유의적으로증가하였고, 반면매스틱검처리에따라농도의존적으로 Hr과 H /K ATPse의발현을유의적으로감소시킨것으로나타났다. 그러나 M3r 및 CCKr의발현에서는 histmine으로자극한세포와매스틱검을처리한세포사이에유의적인차이가나타나지않았으며, 이는수용체의특성에따른것으로보인다. CCKr과 M3r에서는각각 gstrin과 etylholine에의한자극에더욱민감하게반응할것으로생각되며, 이러한부분은추후실험을통해확인되어야할것이다. Histmine 자극에따른세포내 AMP 농도변화를측정한결과에서 histmine 자극에의해높아진세포내 AMP 농도가매스틱검의처리에따라유의적으로감소한것으로나타났으며, 세포수준에서 H /K ATPse 발현변화량과비슷한결과가나타났음을확인하였다. 이러한결과를바탕으로 histmine에의해위산분비와관련된인자의활성이조절되며, 매스틱검이이러한인자의발현증가에대한자극을감소시켜결국위산분비를저해하는효과가나타난것으로생각된다. 이상의실험결과를살펴보면매스틱검의위산분비억제및위장점막보호효능이나타난것으로생각되는데, 이러한효능은식이섬유가풍부한매스틱검의물질적특성을고려할때직접적조절효과라고할수있는결과는아직확실치않지만최소한간접적인조절효과가함께작용했을것으로보인다. 즉풍부한식이섬유가위장점막을덮어보호함으로써자극이감소하게되고, 이러한자극감소는 histmine 분비를감소시켜결국위산의생성및분비가줄어들어위점막조직을자극으로부터보호하는효과를더욱증가시키는것으로생각된다. 따라서매스틱검섭취시위산분비억제및점막보호활성효능을지니는기능성소재로써활용가치및실용가능성이있을것으로기대할수있다.
58 남다은 김옥경 심태진 이점균 황권택 요 본연구는위벽세포 in vitro 실험모델과알코올로위를자극한 in vivo 실험모델을이용하여매스틱검의위산분비억제및위장점막보호효과를확인하고자하였다. 위조직의병리학적인관찰을통하여효과를관찰한결과알코올로위를자극한군에서위점막조직의손상과표면상피세포의손실을관찰할수있었으나, 매스틱검 5 및 mg/kg 투여한군에서모두 ontrol 그룹과비교했을때손상이회복되었음을확인할수있었다. 위액분비량및위액산도를비교한결과에서도알코올의자극으로인하여증가한위액분비량과위액산도를매스틱검이유의적으로감소시켰음을확인할수있었다. 혈장 histmine 농도와그로인해영향을받은 Hr 발현량변화로위산분비관련인자를확인한결과에서도매스틱검을투여한그룹에서유의적으로그농도가감소한것을확인하였다. 또한위벽세포에서위산분비증가와관련된수용체인 CCKr과 H /K APTse 발현변화도역시매스틱검의투여가효과적으로발현을억제한것으로나타났다. 이러한동물실험결과를바탕으로세포수준에서의기전규명을위한연구를추가적으로진행하였으며, 세포내 AMP 농도, H /K APTse 및 Hr의발현변화를관찰한결과매스틱검의처리가효과적으로이들의발현을감소시켰음을확인하였다. 따라서매스틱검의위산분비억제및점막보호활성효과는형태학적및병리학적관찰, histmine 분비억제, 수용체발현억제효과등으로확인한결과, histmine을통한위산분비경로를조절함으로써위산분비및위장점막손상에대해보호효과를나타내었으며이는이전실험결과들과동일한농도에서효과가나타났음을확인하였다. 약 REFERENCES. Ky HH, Grindle KM, Mgness RR.. Ethnol exposure indues oxidtive stress nd impirs nitri oxide vilility in the humn plentl villi: possile mehnism of toxiity. Am J Ostet Gyneol 8: 68688.. Bilii D, Süleymn H, Bnoğlu ZN, Kiziltunç A, Avi B, Ciftçioğlu A, Bilii S.. Meltonin prevents ethnolindued gstri muosl dmge possily due to its ntioxidnt effet. Dig Dis Si 47: 85686. 3. Covi A, Telford JL, Del Giudie G, Prsonnet J, Rppuoli R. 999. Helioter pylori virulene nd geneti geogrphy. Siene 84: 38333. 4. Kim JH, Kim HY, Kim NY, Kim SW, Kim JG, Kim JJ, Roe IH, Seo JK, Sim JG, Ahn H, Yoon BC, Lee SW, Lee YC, Chung IS, Jung HY, Hong WS, Choi KW.. Seroepidemiologil study of Helioter pylori infetion in symptomti people in South Kore. J Gstroenterol Heptol 6: 969975. 5. Kim MS, Kim N, Kim SE, Jo HJ, Shin CM, Lee SH, Prk YS, Hwng JH, Kim JW, Jeong SH, Lee DH, Kim JM, Jung HC. 3. Longterm followup Helioter pylori reinfetion rte nd its ssoited ftors in Kore. Helioter 8: 354. 6. Bujnd L.. The effets of lohol onsumption upon the gstrointestinl trt. Am J Gstroenterol 95: 3374338. 7. Szo S, Trier JS, Brown A, Shnoor J. 985. Erly vsulr injury nd inresed vsulr permeility in gstri muosl injury used y ethnol in the rt. Gstroenterology 88: 836. 8. Liu ES, Cho CH.. Reltionship etween ethnolindued gstritis nd gstri uler formtion in rts. Digestion 6: 339. 9. Chew CS. 99. Intrellulr mehnisms in ontrol of id seretion. Curr Opin Gstroenterol 7: 85686.. Mårdh S, Song YH, Crlsson C, Björkmn T. 987. Mehnisms of stimultion of id prodution in prietl ells isolted from the pig gstri muos. At Physiol Snd 3: 589598.. Chew C. 993. Peptidergi regultion of gstri id seretion. In Gstrointestinl Regultory Peptides. Springer, Berlin, Heidelerg, Germny. p 995.. Helnder HF, Keeling DJ. 993. Cell iology of gstri id seretion. Billieres Clin Gstroenterol 7:. 3. Uedo N, Tkeuhi Y, Ymd T, Ishihr R, Ogiym H, Ymmoto S, Kto M, Ttsumi K, Msud E, Tmi C, Ymmoto S, Higshino K, Iishi H, Ttsut M. 7. Effet of proton pump inhiitor or n Hreeptor ntgonist on prevention of leeding from uler fter endosopi sumuosl dissetion of erly gstri ner: prospetive rndomized ontrolled tril. Am J Gstroenterol : 6 66. 4. Benhmmou N, Bekkr FA, Pnovsk TK. 8. Antioxidnt nd ntimiroil tivities of the Pisti lentisus nd Pisti tlnti extrts. Afr J Phrm Phrmol : 8. 5. Giginis C, Theohris S.. Current evidene on the ntiner potentil of hios msti gum. Nutr Cner 63: 7484. 6. Klior AC, Stthopoulou MG, Trintfillidis JK, Dedoussis GV, Andrikopoulos NK. 7. Altertions in the funtion of irulting mononuler ells derived from ptients with Crohn's disese treted with msti. World J Gstroenterol 3: 63636. 7. Mhmoudi M, Erhimzdeh MA, Nvi SF, Hfezi S, Nvi SM, Eslmi SH.. Antiinflmmtory nd ntioxidnt tivities of gum msti. Eur Rev Med Phrmol Si 4: 765769. 8. Tkhshi K, Fukzw M, Motohir H, Ohii K, Nishikw H, Miyt T. 3. A pilot study on ntiplque effets of msti hewing gum in the orl vity. J Periodontol 74: 555. 9. Trintfyllou A, Chvirs N, Sergentnis TN, Protopp E, Tsknis J. 7. Chios msti gum modultes serum iohemil prmeters in humn popultion. J Ethnophrmol : 4349.. Trintfyllou A, Bikineyev A, Diklov A, Nzrewiz R, Lerkis S, Diklov S.. Antiinflmmtory tivity of hios msti gum is ssoited with inhiition of TNFlph indued oxidtive stress. Nutr J : 64.. Kottkis F, KouziKolikou K, Pends S, Kountours J, CholiPpdopoulou T. 9. Effets of msti gum Pisti lentisus vr. Chi on innte ellulr immune effetors. Eur J Gstroenterol Heptol : 4349.. AlSid MS, Ageel AM, Prmr NS, Triq M. 986. Evlution of msti, rude drug otined from Pisti lentisus for gstri nd duodenl ntiuler tivity. J Ethnophrmol 5: 778.
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