Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2014; 47(1): 1 ~ 11 pissn / eissn Resear

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1 Journl of Nutrition n Helth (J Nutr Helth) 214; 47(1): 1 ~ 11 pissn / eissn Reserh rtile ipogenesis 관련유전자발현감소와 Cell Cyle rrest 를통한 EGCG 와 Gluosmine-6-Phosphte 의 nti-oesity 효과 * 김꽃별 1 장성희 2 서울의료원의학연구소, 1 소아청소년과 2 nti-oesity effet of EGCG n gluosmine-6-phosphte through erese expression of genes relte to ipogenesis n ell yle rrest in 3T3-L1 ipoytes* Kim, Kkot yeol 1 Jng, Seong hee 2 1 Deprtment of Meil Reserh Institute, 2 Peitris, Seoul Meil Center, Seoul , Kore STRCT Purpose: Severl stuies hve proven tht EGCG, the primry green te tehin, n gluosmine-6-phosphte (PGl) reue triglyerie ontents in 3T3-L1 ipoytes. The ojetive of this stuy is to evlute the omintion effet of EGCG n PGl on eline of umulte ft in ifferentite 3T3-L1 ipoytes. Methos: EGCG n PGl were ministere for 6 y for ifferentition of 3T3-L1 ipoytes. Cell viility ws mesure using the CCK ssy kit. In ition, TG umultion in ulture 3T3-L1 ipoytes ws investigte y Oil Re O stining. We exmine the expression level of severl genes n proteins ssoite with ipogenesis n lipolysis using rel-time RT-PCR n Western lot nlysis. flow ytometer Clir ws use to ssess the effet of EGCG n PGluo on ell-yle progression of ifferentiting 3T3-L1 ells. Results: Intrellur lipi umultion ws signifintly erese y omintion tretment with EGCG μm n PGl 2 μg/m ompre with ontrol n EGCG tretment lone. In ition, use of omintion tretment resulte in iretly erese expression of PPRγ, C/EPα, n SREP1. In ition, it inhiite ipoyte ifferentition n ipogenesis through ownstrem regultion of ipogeni trget genes suh s FS, CSL1, n LPL, n the inhiitory tion of EGCG n PGl ws foun to inhiit the mitoti lonl expnsion (MCE) proess s eviene y impire ell yle entry into S phse n the S to G2/M phse trnsition of onfluent ells n levels of ell yle regulting proteins suh s ylin n CDK2. Conlusion: Comintion tretment of EGCG n PGl inhiite ipoyte ifferentition through erese expression of genes relte to ipogenesis n ipogeni n ell yle rrest in erly stge of ipoyte ifferentition. KEY WORDS: 3T3-L1, EGCG, gluosmine-6-phosphte, ipogenesis, ell yle rrest. 서론 비만은 가장 심각한 사회경제적인 건강 문제 중 하나로써 널리 인식되어져왔다 비만은 체지방세포에 지방의 과도한 축적으로 인한 것으로 그 심각성의 정도는 제 형 당뇨 고혈압 암 심혈관 질환 등 비만과 연관된 질병의 위험도를 크게 증가 시킨다 이러한 비만의 예방 및 치료를 위한 항비만 전략은 크게 가지 카테고리로 구분되어 질 수 있다 음식 섭취의 감소 영양소 흡수의 억제 증가 지방 또는 단백질 대사 또는 각 각의 저장에 대한 조절 등이 그것이다 전지방세포 분화의 감소 감소 증가와 지방세포의 유도 등은 항비만 전략들 중 지방 저장의 조절에 대한 카테고리에 들어가는 것 중 하나이다 * : 214 The Koren Nutrition Soiety

2 2 / EGCG 와글루코사민의 nti-oesity Effet 지방세포는 중성지방 저장과 유리지방산의 방출에 의해 지질대사의 항상성과 에너지 균형을 조절하는 중요한 역할을 하며 지방세포 분화와 지방축적의 양은 비만의 발생과 발전에 연관되어있다 이러한 이유들로 - 지방세포를 통해 비만관련 연구들이 많이 진행되어왔다 - 지방세포는 를 통해서 에서 로 분화가 유도되며 이 과정을 라고 한다 - 는 상태에서 고농도 - 로 자극하면 - 에 의해 성장 억제가 되었던 세포가 다시 증식을 시작한다 이를 이라고 하는데 이 과정은 유전자 발현 과정을 위한 의 과정이라 하고 이 과정에 이상이 생긴다면 정상적인 가 이루어질 수 없다 천연물로부터 얻어진 성분을 이용하여 지방생성을 억제하는 것은 부작용을 줄이며 비만을 예방하는데 유용 할 것이다 그동안 많은 연구들에서 비만치료 또는 체중조절을 위한 건강기능성 성분을 찾기 위한 연구가 이루어져왔으며 천연식품 등에서 유래된 많은 성분들이 밝혀졌다 녹차는 많은 질병을 예방하여 건강을 향상시키는 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있어 세계적으로 널리 음용되고 있으며 섭취가 간편하며 섭취에 제한이 따르지 않아 오래전부터 습관처럼 일상의 음용수로 음용되어 왔다 녹차는 항산화 작용 항암작용 항염증작용 혈청콜레스테롤농도 저하기능 등에 효과가 있는 것으로 보고되어있으며 체중 조절과 에너지 소비에도 영향을 미친다고 보고된 바도 있다 녹차 내 의 카테킨 성분 중 특히 는 역학적 임상적 연구조사에서 비만과 당뇨병에 효과가 있다는 보고가 있으며 지방세포와 비만동물모델에서 항비만 효과를 실험한 결과에서도 지방세포의 분화와 증식에 영향을 미치며 비만동물에서는 지방합성 지방량 체중 혈청 지질 포도당 인슐린 렙틴 함량 감소와 지방산 산화와 체내 열 생성 증가를 보고하고 있다 글루코사민은 관절염 치료제 혹은 관절염 예방제로 널리 알려져 있는 건강기능성 식품 성분으로 허브 칼슘 비타민 등과 함께 우리나라의 건강기능식품시장에서 선호되는 건강 기능성식품 중 하나이다 글루코사민은 바다의 무척추동물의 외골격에서 발견된 인 키틴으로부터 분리할 수 있으며 과 같은 글 루코사민 유도체가 존재하며 관절염치료제로서의 고유의 효 과 뿐 아니라 새로운 기능성에 대한 연구도 보고되어있다 본 연구에서는 녹차와 글루코사민이 일상에서의 노출이 용 이하고 섭취 빈도가 높다는 점에서 녹차의 카테킨 중 와 글루코사민유도체 중 시판되는 건강기능성 식품 제조에 많 이 사용되는 형태인 - 을 이용 하여 - 지방세포에서 두 가지 성분이 지방세포의 분화와 세포 내 지방 합성 및 분해 관련 인자들의 발현에 미치는 영향 뿐 아니라 차원에서의 접근을 통해 유도와 그에 따른 분화 억제효과여부 등 항비만 효과 를 확인 하고자한다 또한 두 성분을 병합하여 처리하였을 때 기대되 어지는 항비만 효과에 대한 상승효과 에 대해 서도 확인하고자 한다 연구방법 재료 - 전지방세포주는 에서 구입하 였다 세포배양에 사용된 - 와 는 - 에서 구입하였다 지방세포에 처 리할 - 와 는 - 에서 구입하였고 - - 은 - 의 제품을 사용하였다 추출은 - 을 합성 는 의 제품을 이용하였다 은 - 의 - 와 를 이용하였 으며 γ 와 β- 는 - 에서 - - 와 - - 는 에서 구입하였다 분석 을 위해서는 - - 제품을 사용하였다 3T3-L1 지방세포주의배양과분화유도및처치 - 전지방세포주는 - 이 첨가된 - 배지에 농도로 부유시켜 시간동안 배 양하여 상태가 되게 에서 배양

3 Journl of Nutrition n Helth (J Nutr Helth) 214; 47(1): 1 ~ 11 / 3 로 교체하여 일 μ 한다 분화배지 μ - μ 을 이용하여 일 - 으로 일 동안 분화를 유도하였다 와 - 는 농도별로 배지교체시기마다 함 께 처리해주었다 생존율측정 (CCK-8 ssy) - 전지방세포주를 μ 로 을 농도별로 처리하여 시간 배양한 후 에 분주하여 시간 배양 후 와 을 μ 처 리하여 시간 배양 후 에서 - 를 이용하여 측정한다 Oil Re-O 염색 은 - 와 의 - - 을 섞어 여과시킨 후 에서 보관하였다 은 에서 보관된 - 과 멸균증류수를 로 섞어 여과시킨 후 사용하였다 내의 배지를 제거한 뒤 로 세정하고 - 처리한 후 분간 상온에서 방치하였다 내의 를 제거하고 새로운 을 넣 은 상태에서 시간 이상 상온에서 두었다 다시 - 을 제거한 후 - 로 세정하고 완전히 건 조시킨다 건조 후 에 을 넣 고 분간 상온에서 하였다 분 후 로 번 세정하고 를 관찰하면 지방덩어리들을 볼 수 있었다 이 때 현미경 관찰 후 이미지를 획득하고 - 을 넣어 탈 염색하여 에서 를 이용하여 측정한다 Rel time-reverse Trnsriptse Polymerse Chin Retion (RT-PCR) ssy 처치한 - 세포에서 을 이용하여 를 추 출한다 추출한 를 - 를 이용하여 을 시켜 로 만들어 준다 이렇게 합성된 는 희석하여주고 - 와 함께 혼합하여 Tle 1. Primer sequenes use for RT-PCR Gene Primer Sequene PPRγ Forwr 5 -C GCC CTT TC CC GT TG-3 에 분주하여 장비를 이용하여 분 석을 실시한다 5 -CG GTT CT CTT TG TCG CC TT-3 C/EPα Forwr 5 - C CGC C GTG GG GCG GTC TT GTC CT GGT C-3 SREP1 Forwr 5 -C CG G CTC G CG G-3 5 -TTT CT GCC CTC CT G C-3 Perilipin Forwr 5 -CG GG CTG G CTG GG TG-3 5 -GG CC GTT CTC CTG CTC -3 FS Forwr 5 -GCT GCT GTT GG GT CG C-3 5 -GT GTT CGT TCC TCG GCG TG-3 LPL Forwr 5 -CG GT TTG CC GCC TTC C-3 5 -T TTG CTT TCG TG TCT GG -3 HSL Forwr 5 -TGC TCT TCT TCG GG GTG T-3 5 -GT GGC GG TGT G CTG G-3 CSL1 Forwr 5 - GT GGC TGG TT CC CG-3 5 -CG T TCT TC GG TGC CT T-3 β-tin Forwr 5 -CT GG CC CC GTG G-3 5 -CC G GGC T CG GG C-3 Western lot nlysis 처치한 - 세포에 배양액을 제거하고 로 세척한 후 에 의 를 이용하여 을 준 비한다 단백질 농도는 방법 - 을 이용하여 측정하였다 - 을 이용하여 단백질을 분리하고 에 를 한 뒤 - 혼합된 - 로써 을 실시한다 - 가 혼 합된 - 에 희석시킨 를 에서 동안 반응시킨 후 - - 를 상온에서 시간 동안 처리하고 을 처리하여 반응을 시킨 뒤 결과를 확인한다 유세포분석 (FCS) - 세포를 가 되도록 배양한 후 로 교체하여 분화 유도를 시작한다 로 교체한 이후 시간마다 세포를 수거하여 - 을 이용하여 로

4 4 / EGCG 와글루코사민의 nti-oesity Effet 염색한 후 유세포분석기 를 이용하여 세포주기를 측정하였다 이와 동일한 방법으로 - 와 - 을 농도별로 단일 또는 병합 하여 처리하고 시간 후 세포주기를 측정하였다 통계분석본 실험에서 얻은 결과는 을 이용하여 분석하였 다 - 와 - 후 에 의해 < 수준에서 각 실험군 간의 유의성을 검증 하였으며 모든 결과는 ± 으로 표시하였다 결 지방세포의세포생존율관찰 - 에 와 - - 의 여러 농도로 처리하여 - 를 통해 시간에 서의 세포생존율을 측정하였다 는 μ 이상 에서부터 유의적으로 감소하는 결과를 보였고 μ 에서 ± μ ± 감소 - - 는 농도에 따른 세포생존율의 차이를 보이지 않았다 지방세포내중성지방축적억제 을 통해 지방세포의 을 확 HO Cell viility (%) O O CO (-)-Epigllotehin-3-gllte (EGCG) ** 과 HO O P OCH 2 HO O NH 2 Gluosmine 6-phosphte EGCG onentrtion (μm) (H) Fig. 1. : Struture of EGCG n Gluosmine 6-phosphte. : The hnge of ell viility in 3T3-L1 preipoyte in onition of EGCG of seril onentrtions. Vlue represent the men ± SEM. **: p <.1, vs. EGCG μm. 인하고 - 로 를 용출하여 에서 흡광도를 측정하였다 결과에서 의 경우는 농도가 높아 질수록 이 감소됨을 확인할 수 있었다 특히 - μ 에서 ± 감소 μ 에서 ± 감소되어 아무것도 처리하지 않고 분화만 유도한 된 지방세포 와 비교했을 때 통계적으 로도 유의적으로 감소되었다 - 를 처 리한 경우 은 과 거의 비슷하였다 와 - 을 병합하여 처리 결 과를 보면 는 μ 과 - - μ 을 병합한 경우 보다 ± 유 의적으로 감소하였다 또한 는 μ 만 단독으로 처 리한 경우 ± 감소 보다 약 정도 더 감소되었 으며 통계적으로도 유의하게 지방축적 감소효과가 상승됨을 확인하였다 ipogenesis 와 ipgeni 및 lypolyti gene 의 mrn 발현지방세포 내 지방축적의 감소 결과를 보였던 μ μ - μ 의 단독 또는 병합처리 시 및 관련 유전자 의 발현을 확인하였다 된 지방세포에서의 γ 와 α 발현을 과 을 통해 분석 하였다 관련 유전자인 γ 와 α 의 에서의 발현은 를 μ 로 단독처리 γ ± α ± - ± 감소 와 μ - μ 로 병합처리 γ ± α ± ± 감소 에서 감 소되었다 비록 γ 발현은 를 단독처리에 서 좀 더 높은 감소를 보였지만 을 통한 에서의 γ 발현을 확인한 결과 에서는 - 과 비교하여 μ 단독처리에서 감소 - μ - μ 병합처리 에서 감소로 병합처리에서 더 높은 감소를 나타냈다 μ 의 경우에서는 γ 와 α 의 발현이 증가하는 경향을 보이기도 하였으나 에서의 γ 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다 의 에서 유전자인 의 발현 역시 γ 와 α 와 비슷한

Journl of Nutrition n Helth (J Nutr Helth) 214; 47(1): 1 ~ 11 / 5 Dy Dy 6 ontrol E2 P1 P2 E4 E4 P1 E4 P2 E E P1 E P2.25 **.25 **.2.2 5 nm OD.15.1 5 nm OD.15.1.5.5 Control E2 E4 E P1 P2 Dy Dy 6 Fig. 2. Effet of EGCG & Gluosmine 6-phosphte on lipi umultion in 3T3-L1 ells.

5 Journl of Nutrition n Helth (J Nutr Helth) 214; 47(1): 1 ~ 11 / 5 Dy Dy 6 ontrol E2 P1 P2 E4 E4 P1 E4 P2 E E P1 E P2.25 **.25 ** nm OD nm OD Control E2 E4 E P1 P2 Dy Dy 6 Fig. 2. Effet of EGCG & Gluosmine 6-phosphte on lipi umultion in 3T3-L1 ells. : Cell were sujete to Oil Re O stining, C: These ells were then sujete to quntittive nlysis of interellur lipi umultion. Vlue represent the men ± SEM. ** : p <.1, vs. ontrol. : p <.5, E4 vs. E. : p <.5, E vs. EP2. E: EGCG, P: Gluosmine 6-phosphte. C Control E4 E4P1 E4P2 E EP1 EP2 Dy Dy 6 양상으로 μ 단독처리 ± ± ± 감소 및 μ - - μ 와의 병합처리 ± ± ± 감소 에서 발현이 감소했다 과 에서 와 - 가 지질분해 에는 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다 와 - 처리에 따른 의 발현은 에서의 발현과 비슷하거나 증가하였다 반면 의 발현은 과 비교했을 때 μ 단독 처리에서 ± 감소 μ - - μ 병합처리에서 ± 감소하여 두 그룹 모두에서 감소하였으며 특히 병합처리에서 더 낮은 발현을 나타냈다 MCE 단계에서 ell yle rrest - 를 상태가 되도록 배양하여 성장을 억제시킨 후 시간동안 배지에 노출 시켜 분화 를 유도했을 때 단계를 거치 는데 이때 변화를 관찰하였다 를 통 해 얻어진 히스토그램을 통해 분화가 진행됨에 따라 에서 로 에서 로 - 이 변화하며 약 시간 무렵에서 이 시간에서의

6 6 / EGCG 와글루코사민의 nti-oesity Effet PPRγ mrn expression level (fol ontrol) f e Control E4 E4 P2 E E P2 P2 PPRγ β-tin Control E4 E4 P2 E E P2 P2 C/EPα mrn expression C level (fol ontrol) Control E4 E4 P2 E E P2 P2 Fig. 3. Effet of EGCG & Gluosmine 6-phosphte on ipogenesis trnsription ftors. PPRγ expression in 3T3-L1 ells s exmine y rel time PCR () n western lot () nlysis. C/EPα n SREP1 expression in 3T3-L1 ells s exmine y rel time PCR (C). Confluent 3T3-L1 preipoytes in meium with or without ifferentition onentrtions of GCG & Gluosmine 6-phosphte for 6 ys (from y to y 6) were ifferentite into ipoytes. Vlue represent the men ± SEM. Mens with ifferent letters (-f) t eh mrn re signifintly ifferent (p <.5) y Dunn s multiple rnge test. Control: fully ifferentite ontrol ipoytes, E: with EGCG, P: Gluosmine 6-phosphte. SREP1 mrn expression level (fol ontrol) Control E4 E4 P2 E E P2 P2 상태로 돌아옴을 확인하였다 그리고 이렇게 시간별로 관찰한 결과를 바탕으로 단계의 분포를 그래프로 나타낸 결과를 통해서도 분화가 진행됨에 따른 의 변화를 확실하게 확인할 수 있다 지방세포의 분화유도과정인 단계에서 정상적인 변화에 대하여 와 - 가 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 에 두 가지 물질을 단독 또는 병합으로 처리하여 을 관찰하였다 대부분 분화 중인 세포는 지방세포의 분화 유도 시간 이후에 은 로 들어간다고 알려져 있고 의 결과에서 시간에서 의 변화가 두드러졌기 때문에 시간에서의 처리 결과를 관찰하였다 이때 - 에 대한 확인을 위해 와 같은 조절자의 발현의 변화를 함께 확인하였다 와 의 결과에서 과 비교했을 때 농도가 높아질수록 단계의 세포의 수가 증가되고 μ μ μ μ 와 μ μ 의 세포 수가 감소되었다 이러한 증가와 감소의 변화는 μ 와 - μ 병합처리에서 가장 컸다 또한 와 의 단백질 발현 변화 관찰에서 의 결과와 같이 과 비교하여 μ 단독처 리의 경우에서 각 각 와 감소되었고 μ - μ 병합처리 한 경우에서 각 각 와 로 발현이 감소되었다 μ 단독처리와 와 - 병합처리 한 결과를 비교해보면 발현은 더 감소하였으며 발현은 거의 비슷한 수준이었다 고찰 본 실험에서 지방세포를 분화시키는 동안에 와 를 농도별로 처리하여 지방세포 내 지방축적 정도를 확인한 결과에서 낮은 농도 μ 에서는 과 차이가 없었지만 μ 과 μ 에서는 지방축적이 감소하였다 이러한 에 의한 지방축적 감소는 농도가 높아질수록 더 많이 감소하였다 μ < μ 선행연구들 의 결과에서도 μ 농도 이상에서 지방축적이 감소하기 시작하며 μ 이상에서는 유의적인 지방축적 감소를 보였고 농도가 높아질수록 지방축적 감소의 정도가 컸다 또한 등의 연구 에 의하면 μ 로 처리하였을 때 - 가 유도되며 이로 인한 세포 수의 감소는 지방축적을 감소시킨다고 보고하고 있다 본 연구에서는 농도 증가에 따른 및 정도를 측정하지는 않았으나 농도가 높아질수록 세포생존율이 감소하는 의 결과를 통해 농도와 지방축적 감소와의 관계에 있어 세포생존율감소가 관련이 있다고 생각된다

7 Journl of Nutrition n Helth (J Nutr Helth) 214; 47(1): 1 ~ 11 / FS CSL1 LPL mrn expression level (fol ontrol) e Control E4 E4 P2 E E P2 P2 mrn expression level (fol ontrol) FS CSL1 Control E4 E4 P2 E E P2 P2 Fig. 4. Effet of EGCG & Gluosmine 6-phosphte on FS, CSL1 n LPL expression () n HSL n perilipin expression () s exmine y rel time PCR nlysis. Confluent 3T3-L1 preipoytes in meium with or without ifferentition onentrtions of GCG & Gluosmine 6-phosphte for 6 ys (from y to y 6) were ifferentite into ipoytes. Vlue represent the men ± SEM. Mens with ifferent letters (-) t eh mrn re signifintly ifferent (p <.5) y Dunn's multiple rnge test. Control: fully ifferentite ontrol ipoytes, E: with EGCG, P: Gluosmine 6-phosphte 이러한 의 지방축적 효과에 반해 는 단독적으로는 감소에 영향을 미치지는 못하였다 등의 연구 에 따르면 는 그 농도가 높아질수록 지방세포의 지방축적이 감소되었으나 본 연구에서는 의 단독효과를 확인할 수 없었다 그러나 μ 과 μ 병합 처리했을 때에는 감소효과를 약간 상승시켰다 지방세포의 분화는 특정 유전자 발현에 대한 프로그램된 변화의 연속에 의해 유도되며 지방세포가 분화되는 동안 유전자 발현은 를 위한 중요한 활성자로 알려져 있고 초기에 변화를 보인다 γ 와 α 과 같은 전사인자는 지방세포가 분화되는 동안 를 위한 중요한 활성자로 알려져 있다 이 전사인자 의 과발현은 지방세포의 분화를 가속화시킬 수 있다 - γ와 α 은 대부분 지방세포 특정 유전자의 전사활성을 유도하고 는 γ 에 결합하는 리간드를 활성화시키고 와 지방산 탈포화에 관여하는 효소의 발현을 조절한다 이러한 분화전사인자들의 발현에 있어 의 고농도에서는 의 영향력이 강하게 나타났지만 μ 과의 병합처리가 분명한 상승효과를 준다고 할 수 있다 다시 말해 μ 의 단독처리와 μ 와의 병합처리를 통해서 지방세포의 분화가 가속화되 는 것을 억제한다고 할 수 있다 γ α 은 - 과 같은 을 상승적으로 활성화시킨다 는 지방산합성효소로 지방세포분화의 로 알려져 왔으며 활성화된 γ 와 이 의 발현과 의 - 를 가능하도록 이끈다 혈중 중성지방은 지방세포에서 중성지방 합성을 위한 유리지방산으로 대사되는데 이때 중성지방의 가수분해작용을 촉매작용을 하는 것이 - 이라는 지방분해 효소이다 지방조직 은 에서 중성지방 저장의 정도와 관련되고 지방세포에서 활성의 은 비만과 밀접한 연관이 있다 그리고 는 - - 로 중성지방합성을 위한 - 를 제공하는 효소이다 본 연구결과에서 μ 를 단독 또는 μ 와 병합처리 하였을 때 γ α 의 발현이 감소되었을 뿐 아니라 이러한 분화전사 인자들과 매개되어 과 같은 유전자의 발현도 감소시키는 경향을 보였다 즉 관련 전사인자들의 발현에만 영향을 주는 것이 아닌 이와 매개된 - 유전자에 대한 발현 억제를 통해 지방세포 내 지

8 8 / EGCG 와글루코사민의 nti-oesity Effet 방생성 및 축적을 억제하는 효과도 나타낸다고 볼 수 있다 지질 분해 는 의 인산화와 으로의 과 같은 중요한 과정에 의해 유도된다 은 중성지방에서 지방산과 글리세롤로의 가수분해를 매개하는 과 같은 천연 지방분해효소로부터 지방세포에서 을 보호하는 하는 단백질이다 그렇기 때문에 분화과정동안의 과 의 발현을 확인을 통해서 를 확인할 수 있다 의 발현은 된 지방세포에서의 발현보다 모두 낮았고 특히 μ μ 에서 가장 낮았다 그러나 의 발현은 μ 와 μ μ 에서 증가한 결과를 보였다 등의 연구 에 따르면 지방세포에 μ 을 처리했을 때 유전자 발현의 직접적인 - 을 통해 를 가지며 이로 인해 지방축적을 억제한다고 보고하고 있다 또한 등의 연구 에서 - 에 의해 - 된 발현을 통해 지방축적 억제 작용을 한다고 보고하고 있다 즉 의 발현 증가를 통해 가 증가하고 이것이 곧 지방축적 억제로 이 어진다는 것이다 그러나 본 연구 결과에서 μ 에서와 μ μ 에서 유전자 발현이 증가하는 것으로 보아 두 물질이 을 가진다는 것은 확인할 수는 있었으나 앞의 결과 에서 효과를 보였던 μ 와 μ μ 에서는 오히려 유전자의 낮은 발현을 나타냈으므로 해당 농도에서 을 통한 는 감소한다고 할 수 있다 비록 μ 와 μ μ 에서 지방세포의 지질분해를 촉진하는 의 발현은 비록 감소하였지만 을 보호하는 의 발현 억제를 통해 부분적인 를 가진다고 할수 있다 그리고 지방세포의 분화와 지방축적 감소에 대한 측면에서의 접근을 위해 중요한 개념이 - 이라는 과정이다 의 분화과정은 몇 가지 단계를 거친다 고농도의 - 이나 과 같은 호르몬 자극 직후 - 는 - 이라 불리우는 의 과정으로 다시 들어간다 을 유도하기 3 24 hr hr hr hr hr FL2-22 hr FL2-24 hr FL2-38 hr FL2-48 hr 2 4 FL FL2-2 4 FL2-2 4 FL2-2 4 FL2-18 hr 1 8 Phse (%) 4 2 G/G Time post- (hr) S G2/M Fig. 5. Mitoti lonl expnsion uring the 3T3-L1 preipoyte ifferentition inution proess. 3T3-L1 preipoyte ifferentition ws inue with the stnr inution protool. FCS nlysis for DN ontent of 3T3-L1 preipoytes uring mitoti lonl expnssion fter the ifferentition inution. : Stine with PI for DN histogrms generte with flow ytomtri nlysis. : Cell yle phse istriution plotte over time follow in exposure. Dotte lines through phse intersetions pproximte the kinetis of phse trnsitions. : sug1 phse, : G/G1 phse, : S phse, : G2/M phse.

Journl of Nutrition n Helth (J Nutr Helth) 214; 47(1): 1 ~ 11 / 9 3 24 18 3 24 18 + E 4 μm 3 24 18 + E μm 3 24 18 + E μm P 2 μg/ml 3 24 18 + P 2 μg/ml 2 4 FL2-2 4 FL2-2 4 FL2-2 4 FL2-2 4 FL2-1% sug1

9 Journl of Nutrition n Helth (J Nutr Helth) 214; 47(1): 1 ~ 11 / E 4 μm E μm E μm P 2 μg/ml P 2 μg/ml 2 4 FL2-2 4 FL2-2 4 FL2-2 4 FL2-2 4 FL2-1% sug1 Control E4 E E P2 P2 Cell popultion 8% % 4% 2% G2/M S G/G1 Cylin CDK2 % Control E4 E E P2 P2 β-tin 18 hr Fig. 6. Cell yle nlysis of EGCG n gluosmine-6-phosphte trete 3T3-L1 ell uring th MCE proess of ipoyte ifferentition. Two y postonfluent 3T3-L1 ell were inite with the ipogeni oktil in the presene or sene of vrious onentrtion n lone or omintion of EGCG n gluosmine-6-phosphte. fter 18hr of tretment, ifferentiting ell were stine with propiium ioine (PI). These ells were then sujete to flow ytometri ell-yle nlysis () n quntittive nlysis of ells in ifferent phses in ell yle (). Dt were nlyze using CellQuest Pro softwre. (C) The protein levels of ylin n CDK2 in these ells were etete y immunolot ssy using their speifi ntioy, β-tin ws use s loing ontrol. : sug1 phse, : G/G1 phse, : S phse, : G2/M phse. Control: fully ifferentite ontrol ipoytes, P: with Gluosmine 6-phosphte. C 위한 유전자 발현과정은 기간 동안이나 그 이후에 개시된다 지방세포의 분화유도과정인 단계에서 정상적인 변화에 대하여 와 가 어떠한 영향을 미치는지 확인하였을 때 농도가 높아질수록 단계의 세포의 수가 증가되고 와 의 세포 수가 감소되었으며 이러한 변화는 μ 와 μ 병합처리에서 가장 컸다 이는 다시 말해 - 단독처리 농도가 높아질수록 그리고 μ 와 병합처리 한 경우에서 더욱 의 세포주기 정지가 증가하였고 로의 세포주기 이행은 물론 로의 이행도 방해가 되었음을 뜻한다 즉 μ μ 병합처리를 통해 단계에서의 세포증식이 억제되는 것을 확인할 수 있는 결과였다 또한 분석결과에 대한 정확한 기전을 확인하기 위하여 에 필수적인 세포주기 조절자로 알려져 있는 와 의 발현 변화를 관찰했을 때 μ 을 단독으로 처리한 경우와 μ μ 병합처리 한 경우에서 와 의 발현이 감소되었다 특히 μ μ 병합처리에서 더 낮은 발현을 나타낸 것으로 보아 병합처리에 의한 세포주기의 억제 효과가 강한 것을 확인하였다 즉 단계의 정지로 인한 와 로의 이행이 억제되고 이러한 단계에서의 세포증식이 원활이 이루어지지 않아 지방세포의 분화가 억제되고 지방 세포내 지방축적이 감소되는 것으로 볼 수 있다 등 의 연구와 등 의 연구 결과에서도 지방세포 축적이 감소하고 지방세포분화 관련 유저자의 발현이 감소했던 와 처리 농도에서 의 세포주기 정지하고 로의 이행이 방해되는 결과를 보였고 이때 와 발현도 감소되는 결과를 보였다 이는 본 연구에서 와 에 의한 가 지방세포의 분화와 지방축적을 억제하는 기전 중 하나라는 것을 뒷받침한다고 할 수 있다 결론적으로 와 의 병합처리는 전사인자의 직접적인 발현 억제 뿐 아니라 유전자의 발현 감소를 통해 지방세포의 분화와 지방축적을 억제와 유전자의 발현 조절을 통한 부분적인 지방분해 효과에 있어 단독처리보다 효과적이었다 또한 과정 중 단계에서 정지와 및 로의 세포주기 이행을 방해 하여 지방세포의 분화진행을 억제하는 효과에서도 두 물질의 병합처리에 의한 상승효과를 볼 수 있었다 이로써 와 글루코사민의 병합처리는 항비만 효과에 대한 상승효과를 가진다는 것을 확인하였다 그러나 글루코사민의 효과에 비하여 의 효과의 영향력이 상대적으로 컸던 것을 감안하면 보다 강력한 상승효과를 가지는 또 다른 기능성성분과의 병합처리에 대하여 추가적인 연구가 뒷받침될 필요가 있다고 사료된다 요약 널리 음용되고 있는 녹차의 과 우리나라 국민의 상당

10 1 / EGCG 와글루코사민의 nti-oesity Effet 수가 복용하고 있는 건강기능성 식품 성분인 글루코사민은 이 전의 연구들을 통해서 지방세포의 분화를 억제하는데 효과가 있다고 보고되어왔다 이 두 물질의 병합처리로 기대되어지는 지방세포에서의 및 지방축적감소에 대한 상승효 과는 검증된 바 없으며 효과에 대한 차원에서의 접 근은 없었다 본 연구 결과에서 와 - - 는 전사인자인 γ α 에 대한 직접적인 발현 억제 뿐아니라 γ α - 와 매개된 과 같은 유전자의 발현 감소를 통하여 지방세포의 분화와 지방세포 내 지방축적을 감소시키는 효과를 나타냈다 그리고 과 - 의 발현조절을 통해 부분적인 도 나타냈 다 또한 지방세포의 분화가 개시되는데 있어 중요한 의 과정인 과정 중 단계에서 정지 유도와 그로인한 및 로 세포주기이행의 방해를 통해 지방세포가 분화되는 것은 억제하였다 이러한 효과들은 농도가 높 아질수록 그리고 를 단독으로 처리한경우보다 - - 와 병합하였을 때 효과적이었다 따라서 단독처리 및 - 와의 병합처리 는 지방세포에서 와 관련 유전자들의 발현 억제 및 단계의 를 통해 지방세포 의 분화를 억제하고 지방축적을 감소시켜 항비만 효과를 나 타냈으며 이러한 효과는 두 성분의 병합처리에서 조금 더 효 과적이었다고 할 수 있다 비록 두 성분의 병합처리가 기대했 던 만큼은 아니었으나 항비만 효과에 대한 상승효과가 있다고 볼 수 있다 Referenes 1. Vissher TL, Seiell JC. The puli helth impt of oesity. nnu Rev Puli Helth 21; 22: Lee WJ, Koh EH, Won JC, Kim MS, Prk JY, Lee KU. Oesity: the role of hypothlmi MP-tivte protein kinse in oy weight regultion. Int J iohem Cell iol 25; 37(11): ry G, Trtgli L. Meiinl strtegies in the tretment of oesity. Nture 2; 44(6778): Spiegelmn M, Flier JS. Oesity n the regultion of energy lne. Cell 21; 14(4): révol, lé C, Slvó MJ, rol L. Chnges in lipolysis n hormone-sensitive lipse expression use y proyniins in 3T3-L1 ipoytes. Int J Oes Relt Met Disor 2; 24(3): lku, Vlensi P, Eshwège E, Slm G. review of the metoli synrome. Dietes Met 27; 33(6): Giri S, Rttn R, Hq E, Khn M, Ysmin R, Won JS, Key L, Singh K, Singh I. ICR inhiits ipoyte ifferentition in 3T3L1 n restores metoli ltertions in iet-inue oesity mie moel. Nutr Met (Lon) 26; 3: Jeon T, Hwng SG, Hiri S, Mtsui T, Yno H, Kw T, Lim O, Prk DK. Re yest rie extrts suppress ipogenesis y ownregulting ipogeni trnsription ftors n gene expression in 3T3-L1 ells. Life Si 24; 75(26): Chon JW, Sung JH, Hwng EJ, Prk YK. Chlorell methnol extrt reues lipi umultion in n inreses the numer of poptoti 3T3-L1 ells. nn N Y Si 29; 1171: Qiu Z, Wei Y, Chen N, Jing M, Wu J, Lio K. DN synthesis n mitoti lonl expnsion is not require step for 3T3-L1 preipoyte ifferentition into ipoytes. J iol Chem 21; 276(15): Hrmon W, Hrp J. Differentil effets of flvonois on 3T3- L1 ipogenesis n lipolysis. m J Physiol Cell Physiol 21; 28(4): C87-C MDougl O, Lne MD. Trnsriptionl regultion of gene expression uring ipoyte ifferentition. nnu Rev iohem 1995; 64: Kim SH, Prk HS, Lee MS, Cho YJ, Kim YS, Hwng JT, Sung MJ, Kim MS, Kwon DY. Vitisin inhiits ipoyte ifferentition through ell yle rrest in 3T3-L1 ells. iohem iophys Res Commun 28; 372(1): Crespy V, Willimson G. review of the helth effets of green te tehins in in vivo niml moels. J Nutr 24; 134(12 Suppl): 3431S-344S. 15. Lio S, Ko YH, Hiipkk R. Green te: iohemil n iologil sis for helth enefits. Vitm Horm 21; 62: Lin J, Dell-Fer M, ile C. Green te polyphenol epigllotehin gllte inhiits ipogenesis n inues poptosis in 3T3-L1 ipoytes. Oes Res 25; 13(6): hm N, Mukhtr H. Green te polyphenols n ner: iologi mehnisms n prtil implitions. Nutr Rev 1999; 57 (3): Ko YH, Hiipkk R, Lio S. Moultion of enorine systems n foo intke y green te epigllotehin gllte. Enorinology 2; 141(3): Ngo T, Komine Y, Sog S, Meguro S, Hse T, Tnk Y, Tokimitsu I. Ingestion of te rih in tehins les to reution in oy ft n mlonilehye-moifie LDL in men. m J Clin Nutr 25; 81(1): Kim JD, Lee I, Jeon YH, k JP, Jin HL, Lim O. nti-oxitive n nti-inflmmtory effets of green te mixture n ietry fier on liver of high ft iet-inue oese rts. Koren J Me Crop Si 21; 18(4): Grhm HN. Green te omposition, onsumption, n polyphenol hemistry. Prev Me 1992; 21(3): Chn CY, Wei L, Cstro-Muñozleo F, Koo WL. (-)-Epigllotehin-3-gllte loks 3T3-L1 ipose onversion y inhiition of ell prolifertion n suppression of ipose phenotype expression. Life Si 211; 89(21-22): Ngo T, Meguro S, Hse T, Otsuk K, Komiko M, Tokimitsu I, Ymmoto T, Ymmoto K. tehin-rih everge improves oesity n loo gluose ontrol in ptients with type 2 ietes. Oesity (Silver Spring) 29; 17(2): Kim SO, Lee HE, Choe WK. The effets of ginseng sponin-re, R n green te tehine; ECGC (Epigllotehin gllte) on leptin, hormone sensitive lipse n resistin mrn expressions in 3T3-L1 ipoytes. Koren J Nutr 26; 39(8): Moon HS, Lee HG, Choi YJ, Kim TG, Cho CS. Propose mehnisms of (-)-epigllotehin-3-gllte for nti-oesity. Chem iol Intert 27; 167(2): Lee CS. Helth funtionl foo tehnology n reserh sttus in omesti n foreign. ull Foo Tehnol 25; 18(4): Kong CS, Kim J, Kim SK. nti-oesity effet of sulfte glu-

11 Journl of Nutrition n Helth (J Nutr Helth) 214; 47(1): 1 ~ 11 / 11 osmine y MPK signl pthwy in 3T3-L1 ipoytes. Foo Chem Toxiol 29; 47(1): Kong CS, Kim J, Eom TK, Kim SK. Phosphorylte gluosmine inhiits ipogenesis in 3T3-L1 ipoytes. J Nutr iohem 21; 21(5): Kim MM, Menis E, Rjpkse N, Kim SK. Gluosmine sulfte promotes osteolsti ifferentition of MG-63 ells vi nti-inflmmtory effet. ioorg Me Chem Lett 27; 17(7): Gregoire FM, Sms CM, Sul HS. Unerstning ipoyte ifferentition. Physiol Rev 1998; 78(3): Tng QQ, Lne MD. tivtion n entromeri loliztion of CCT/enhner-ining proteins uring the mitoti lonl expnsion of ipoyte ifferentition. Genes Dev 1999; 13(17): Kim H, Skmoto K. (-)-Epigllotehin gllte suppresses ipoyte ifferentition through the MEK/ERK n PI3K/kt pthwys. Cell iol Int 212; 36(2): Sung HY, Hong CG, Suh YS, Cho HC, Prk JH, e JH, Prk WK, Hn J, Song DK. Role of (-)-epigllotehin-3-gllte in ell viility, lipogenesis, n retinol-ining protein 4 expression in ipoytes. Nunyn Shmieeergs rh Phrmol 21; 382 (4): Lts MJ, Moon YS, Kim KH, Sul HS. Nutritionl regultion of the ftty i synthse promoter in vivo: sterol regultory element ining protein funtions through n upstrem region ontining sterol regultory element. Pro Ntl Si U S 2; 97(19): Luong, Hnnh VC, rown MS, Golstein JL. Moleulr hrteriztion of humn etyl-co synthetse, n enzyme regulte y sterol regultory element-ining proteins. J iol Chem 2; 275(34): Rosen ED. The trnsriptionl sis of ipoyte evelopment. Prostglnins Leukot Essent Ftty is 25; 73(1): Rosen ED, Wlkey CJ, Puigserver P, Spiegelmn M. Trnsriptionl regultion of ipogenesis. Genes Dev 2; 14(11): Plmer DG, Rutter G, Tvré JM. Insulin-stimulte ftty i synthse gene expression oes not require inrese sterol response element ining protein 1 trnsription in primry ipoytes. iohem iophys Res Commun 22; 291(3): ulló M, Grí-Lor P, Peino-Onsure J, Hernánez M, Del Cstillo D, rgilés JM, Sls-Slvó J. TNFlph expression of suutneous ipose tissue in oese n mori oese femles: reltionship to ipoyte LPL tivity n leptin synthesis. Int J Oes Relt Met Disor 22; 26(5): Kim SK, Kong CS. nti-ipogeni effet of ioxinoehyroekol vi MPK tivtion in 3T3-L1 ipoytes. Chem iol Intert 21; 186(1): Lee MS, Kim CT, Kim IH, Kim Y. Inhiitory effets of green te tehin on the lipi umultion in 3T3-L1 ipoytes. Phytother Res 29; 23(8): Reihert M, Eik D. nlysis of ell yle rrest in ipoyte ifferentition. Onogene 1999; 18(2): Kim CY, Le TT, Chen C, Cheng JX, Kim KH. Curumin inhiits ipoyte ifferentition through moultion of mitoti lonl expnsion. J Nutr iohem 211; 22(1): Li X, Kim JW, Grønorg M, Urlu H, Lne MD, Tng QQ. Role of k2 in the sequentil phosphoryltion/tivtion of C/EPet uring ipoyte ifferentition. Pro Ntl Si U S 27; 14(28): Kim SI, Prk CS, Lee MS, Kwon MS, Jho EH, Song WK. Cylinepenent kinse 2 regultes the intertion of xin with ettenin. iohem iophys Res Commun 24; 317(2): ul C, Fernnes KM, Morrison RF. Skp2-meite p27 (Kip1) egrtion uring S/G2 phse progression of ipoyte hyperplsi. J Cell Physiol 27; 211(1):

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Æ¯ÇãÃ» '' - 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - ' - 6 - - 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - Super-Bio Co., Ltd. KWON, Suk-Tae Thermostable DNA Polymerase-encoding Gene from Thermus sp. X-1 an d Amino Acid Sequence