01 (09-30-수정).hwp

Size: px

Start display at page:

Download "01 (09-30-수정).hwp"

경심 섭
5 years ago
Views:

1 J Koren So Foo Si Nutr 한국식품영양과학회지 43(1), 1~8(14) 인체피부섬유아세포에서자외선조사에대한녹차나무씨추출물의보호효과 김옥경 1 남다은 1 이민재 2 강남길 2 임재연 3 이정민 1,4 1 경희대학교의학영양학과, 2 ( 주 ) 뉴트리플랜 3 연세대학교생명공학과, 4 경희대학교임상영양연구소 Protetive Effets of Green Te See Extrt ginst UVB-irrite Humn Skin Firolsts Ok Kyung Kim 1, D-Eun Nm 1, Min-Je Lee 2, Nmgil Kng 2, Je-Youn Lim 3, n Jeongmin Lee 1,4 1 Dept. of Meil Nutrition, Kyung Hee University, Gyeonggi , Kore 2 NutriPln Co., Lt., Gyeonggi , Kore 3 Dept. of Biomterils Siene n Tehnology, Yonsei University, Seoul 1-749, Kore 4 Clinil Nutrition Institute, Kyung Hee University, Seoul 13-71, Kore ABSTRACT In this stuy, we investigte the protetive effets of green te see extrt (GSE) ginst UVB-inue skin mge in humn skin firolsts. GSE ws first nlyze for ntioxint tivity using 1,1-iphenyl-2pirylhyrzyl (DPPH) n 2,2'-zino-is(3-ethylenzthizoline-6-sulphoni i) (ABTS) ril svenging ssys. Tretment of UV-irrite firolst with GSE t 1~5 µg/ml signifintly inrese DPPH n ABTS ril svenging tivities in ose-epenent mnner. GSE tretment inhiite mtrix metlloproteinse (MMP-1, MMP-3, n MMP-9) expression n MMP-1 seretion use y UVB irrition. Moreover, tretment with GSE signifintly inrese type-1 ollgen expression n proution. We next exmine levels of ntioxitive enzymes (SOD, tlse, n GPx). Reue ntioxitive enzyme tivities use y UVB irrition were reovere y tretment with GSE t 3 µg/ml n 5 µg/ml. In onlusion, these results show tht GSE hs protetive effets ginst UVB-inue skin mge in humn skin firolsts y regulting ntioxitive efense systems n MMP expression. Key wors: green te see, ntioxint, photoging, UVB, firolst 서 피부는외부환경에직접노출되어있는조직이기때문에다양한외부적요인의영향을많이받는조직이다 (1). 온도, 습도, 바람, 자외선등의외부적인요인중자외선은피부의광노화를유발한다. 피부는항상노출되어자외선에의한영향을지속적으로받으면서광노화로인하여중요한피부노화의유발인자가된다 (2,3). 광노화에의한피부노화는굵고깊은주름이많이발생을하며피부가거칠어지고건조해지며탄력이감소하게된다 (4,5). 피부가과도한자외선에노출이되면피부표피에활성산소종 (retive oxygen speies, ROS) 이생성되며, 비정상적으로활성산소종이높아지면체내항산화방어체계가손상되어산화적스트레스를일으킨다 (6-8). 산화적스트레스는과산화지질을형성하여세포막을손상시키고, 유전자변형을초래하여결과적으로세포사멸을유도한다 (9). 또한증 Reeive 23 Septemer 13; Aepte 18 Novemer 13 Corresponing uthor. E-mil: jlee7@khu..kr, Phone: 론 가된활성산소종은표피의각질형성세포에서염증성사이토카인분비를촉진시켜진피의섬유아세포에서의 MMPs (mtrix metlloproteinses) 발현을증가시키고 proollgen의합성을감소시킨다. 결과적으로증가된 MMPs 와감소된 proollgen에의하여 ollgen 분해를증가시켜주름형성을촉진시키고탄력을감소시켜피부노화를일으키게한다 (1-12). 따라서이러한기전에근거하여광노화에서활성산소종의생성이중요한요인으로작용함으로, 항산화물질에의한활성산소제거와체내항산화작용의증가는피부노화방지와주름개선에긍정적인영향을미칠수있다 (13). 최근피부노화를억제하는기능성물질에대한연구는부작용이적은천연항산화물질에대한연구가활발하게진행되고있으며, 이들은대부분페놀성물질로서복합적인생물학적효과를가진다고보고되어왔다 (14). 천연항산화물질가운데녹차나무 (Cmelli sinensis) 는가장널리애용되고있으며높은폴리페놀성분을가져항산화 (15), 항비만 (16), 항암 (17) 등의다양한생리활성을지닌다고알려져있다. 이에따라녹차의수요가늘어나면서생산량도증가하

2 2 김옥경 남다은 이민재 강남길 임재연 이정민 였으나녹차나무잎외의다른부위에대한활용과기능성연구는미비한실정이다. 일부연구에서녹차나무씨기름의항산화 (18) 효능을입증하였으며항비만 (19), 항균및항종양 () 등의활성이보고된바있다. 또한녹차나무씨에는사포닌, 플라보노이드, 비타민등의생리활성성분이포함되어있다고보고되었다 (21). 이러한연구에근거하여녹차나무씨의광노화억제효능에대해기대할수있으며, 녹차나무씨의기능성입증으로녹차나무의활용을증가시킬수있다. 본연구에서는녹차나무씨추출물의자유라디칼소거능을측정하고, 인체섬유아세포에서자외선에의한 MMPs와 ollgen의합성변화및항산화효소활성에미치는영향을관찰하여광노화억제효능을검증함으로써기능성물질로활용하기위한기초자료로사용하기위해수행하였다. 재료및방법 재료및시약녹차나무씨의이물질을제거하여 7% 에탄올에 2시간동안 reflux한후회전진공농축기를사용하여에탄올을제거한후추출물을여과하였다. 여과된추출물을 5 Brix까지농축시킨후농축물 87.5% 와 extrin 17.5% 를혼합하여동결건조한다음 - o C에보관하며실험에사용하였다. ABTS[2,2'-zino-is(3-ethylenzthizoline-6- sulphoni i)] 와 DPPH(1,1-iphenyl-2-pirylhyrzyl), MTT[3-(4,5-imethylthizol-2-yl)-2,5-iphenyltetrzolium romie], potssium persulfte, DMSO 는 Sigm-Alrih Co.(St. Louis, MO, USA) 에서구입하여사용하였으며, 세포배양에사용된 DMEM(Duleo's moifie Egle's meium), FBS(fetl ovine serum) 및 ntiiotis는 Gio BRL(Grn Isln, NY, USA) 에서구입하였다. 모든시약및용매는일급또는특급이상의등급을사용하였다. ABTS 라디칼소거능측정 ABTS 라디칼소거능활성은 Re 등 (22) 의방법을변형하여측정하였다. Potssium phosphte uffer 용액 (ph 7.4) 에 7.4 mm ABTS와 2.6 mm potssium persulfte를용해시켜 ABTS + 라디칼용액을만들었으며, 96-well plte 각 well에제조된 ABTS + 라디칼용액 1 μl와녹차나무씨추출물 μl를넣어잘혼합하여실온에 3분간반응시킨후 732 nm에서흡광도를측정하였다. 각 ABTS 라디칼소거능은아래의식으로계산하여백분율로나타내었다. ABTS 라디칼 = 대조구흡광도-시료첨가구흡광도 소거능 (%) 대조구흡광도 DPPH 라디칼소거능측정 DPPH 라디칼소거능측정은 Blois 의방법 (23) 을변형하 여측정하였다. 96-well plte에녹차나무씨추출물 μl에 μm DPPH 용액 μl를첨가하여상온에서 3분간반응시킨후 miroplte reer(moleulr Devies, Sunnyvle, CA, USA) 를사용하여 515 nm에서흡광도를측정하였다. 각 DPPH 라디칼소거능은아래의식으로계산하여백분율로나타내었다. DPPH 라디칼 = 대조구흡광도-시료첨가구흡광도 소거능 (%) 대조구흡광도 세포배양 본실험에사용된인체피부진피에존재하는섬유아세포는 ATCC(Amerin Type Culture Colletion, Mnsss, VA, USA) 에서구입하였으며, 1% FBS와 peniillin( units/ml), streptomyin( g/ml) 이함유된 DMEM 배지를사용하여배양하였고, 37 o C, 5% CO 2, 95% humi ir 로조절된배양기 (Thermo Fisher Sientifi In., Pittsurgh, PA, USA) 에서배양하였다. 시료처리및자외선조사후세포생존율세포생존율은 Mosmnn 방법 (24) 을변형하여측정하였다. 인체피부섬유아세포를 ells/well 농도로 96- well plte에분주하여 24시간동안배양한후, 각 well에녹차나무씨추출물을농도별로투여하여 24시간배양시켜녹차나무씨추출물의독성을살펴보았다. 자외선조사는배지를제거한후 DPBS로세척하여 UVB lmp(5 Snkyo Denky G5T5 lmps, Snkyo Denki Co., Yokohm, Jpn) 를이용하여 25 mj/m 2, 5 mj/m 2 조사한후녹차나무씨추출물을농도별로투여하여 24시간배양시켜세포생존율을살펴보았고자외선에의한변화를관찰하였다. 24 시간후 MTT 용액 (5 μg/ml) 을첨가하고 4시간동안배양한후, 배지를제거하고 DMSO μl를첨가하여 5 nm에서흡광도를측정하였다. 항산화효소활성측정항산화효소인 SOD(superoxie ismutse), GPx(glutthione peroxise), tlse의활성을측정하였다. SOD 활성은 SOD ssy kit-wst(dojino, Kummoto, Jpn) 를이용하여측정하였다. 96-well plte에샘플을넣고 WST-1(2-(4-ioophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4- isulfophenyl)-2h-tetrzolium, mono-soium slt) 과 xnthine oxise working solution을첨가한후 37 C에서 분간배양하여 45 nm 파장에서흡광도를측정하였다. GPx 활성은 glutthione peroxise tivity ssy kit(biovision In., Mountin View, CA, USA) 를이용하여측정하였다. 96-well plte에 NADH, glutthione, glutthione reutse 용액을첨가한후 3 nm에서흡광도의변화값을측정하였다. Ctlse는 tlse ssy kit(bio- Vision In., Mountin View, CA, USA) 을이용하여활성을

3 녹차나무씨추출물의자외선에의한손상보호 3 관찰하였다. H 2O 2 를기질로사용하여반응되는변화값을 57 nm에서사용하였다. 모든항산화활성의결과값은총단백질양을보정하여비교하였다. Type-1 proollgen 생성량측정 Type-1 proollgen의생성량은 proollgen type I C-peptie EIA kit(mk11, Tkr, Tokyo, Jpn) 를사용하여지시대로진행하였다. 자외선조사와시료처리 24 시간후, 배지에유리된 type I proollgen을 enzyme linke immunosorent ssy 방법으로측정하여결과값을총단백질양으로보정하여비교하였다. MMP-1 생성량측정 UVB 조사에의해합성이증가되는 MMP-1의측정은 ELISA kit(merk & Co. In., Whitehouse Sttion, NJ, USA) 를이용하여 enzyme linke immunosorent ssy 방법으로실시하였다. 자외선조사와시료처리 24시간후, MMP-1에대한단클론항체로 oting된 miroplte의각 well에배지 μl씩분주하여 2시간실온에서배양후세척하였다. MMP-1에대한다클론항체를 μl씩분주하여 1시간실온에서배양시킨뒤세척후기질용액을분주하고 3분후 stop 용액을넣고 45 nm에서흡광도를측정하였고총단백질양으로보정하여비교하였다. TGT AAC TGT GTT-3', reverse primer 5'-GCC CCG GTG ACA CAT CAA-3'. Rel-time PCR 반응은총 μl 내에 DNA 1 μl와 1 μl의 2X SYBR mix, primer는각각 pmol/μl를 1 μl씩첨가하였고, 나머지는증류수로채워주었다. 모든유전자에대하여 PCR 증폭단계는다음과같고증폭 yle은 yle을실시하였다. Hot strt 를위해 95 C에서 1분, 증폭단계의 enturtion을 95 C 에서 15초, nneling을 55 C에서 3초, extension을 72 C에서 3초간반복하며, 각 yle의 extension 후에값이기록되었다. 모든 yle이완료된후 primer의특이성을확인하기위해 melting urve 분석을실시하였다. 결과의분석은 Applie Biosystems에서제공하는 One step system softwre v2.1로분석하였다. 통계처리본실험결과는 SPSS(Sttistil Pkge for the Soil Siene) version. 프로그램 (SPSS In., Chigo, IL, USA) 을이용하여분석하였다. 모든측정항목의결과는평균 (men)± 표준편차 (stnr evition, SD) 로표시하였고실험군간평균의차이는 Stuent t-test와 one-wy ANOVA로유의성을확인한후 Dunn's multiple rnge test를이용하여사후검증하였으며, P<.5 수준에서유의성의여부를검증하였다. RNA 추출및실시간정량 PCR 배양한섬유아세포의 RNA의추출은 RNesy Mini kit (Qigen, Vleni, CA, USA) 를이용하여추출하였다. DNA 합성은각시료에대하여 1 μl의 RNA를이용하여 isript DNA Synthesis kit(bio-r Lortories, In., Herules, CA, USA) 로합성하였다. 유전자들의발현을측정하기위하여 SYBR Green(iQ SYBR Green Supermix, Bio-R Lortories In.) 을이용한실시간정량 PCR (rel time quntittive PCR) 을실시하였고, 기기는 Rel- Time PCR(Applie Biosystems, Foster City, CA, USA) 을사용하였다. 모든유전자의 PCR 산물의크기는 p 내외로하였고, Tm(melting temperture) 값도 54 C 부근으로디자인하였다. 각각의유전자에대한 PCR primer의염기서열은다음과같다 : GAPDH forwr primer 5'-GGA CCT GAC CTG CCG TCT AG-3', reverse primer 5'- CCT GCT TCA CCA CCT TCT TGA-3'; MMP-1 forwr primer 5'-CCT CGC TGG GAG CAA ACA-3', reverse primer 5'-TTG GCA AAT CTG GCG TGT AAT-3'; MMP-3 forwr primer 5'-GAG GCA TCC ACA CCC TAG GTT-3', reverse primer 5'-ATC AGA AAT GGC TGC ATC GAT-3'; MMP-9 forwr primer 5'-GGA CGA TGC CTG CAA CGT-3', reverse primer 5'-TCA AAT ACA GCT GGT TCC CAA TCT-3'; type 1 ollgen forwr primer 5'-CTG TTC TGT TCC TTG 결과및고찰라디칼소거능측정세포실험에앞서녹차나무씨추출물의라디칼소거능측정을 Vit C와비교하여살펴보았다. 세포실험과는별개로녹차나무씨추출물의라디칼소거능의농도별에따른변화를관찰하기위하여라디칼소거능이적절하게나타났던농도인 µg/ml, 3 µg/ml, 5 µg/ml를비교관찰하였다. 양성대조군으로사용한 Vit C와비교하여녹차나무씨추출물의농도별 ABTS 라디칼소거능을측정한결과는 Fig. 1과같다. 녹차나무씨추출물 µg/ml, 3 µg/ml, 5 µg/ml는각각 31.42±.71%, 78.82±.41%, 94.±.13% 의소거활성능을보여농도의존적으로증가하였다. Vit C의 1 µg/ml 농도의소거활성능과비교하였을때녹차나무씨추출물 3 µg/ml와유의적인차이를보이지않았다. 반면 DPPH 라디칼소거능은녹차나무씨추출물 µg/ml, 3 µg/ml, 5 µg/ml는각각 21.43±2.8 %, 33.14±5.56%, 42.41±3.45% 로 ABTS보다낮은소거능을보였지만 ABTS의결과처럼농도의존적으로증가하였다 (P<.5)(Fig. 2). ABTS는양이온라디칼 (tion ril) 로유리기 (hyroxyl, peroxyl, lkoxyl) 들과반응하여상대적으로안정한 ABTS + 를형성한다. 항산화물질과반응하여청록색이

4 4 김옥경 남다은 이민재 강남길 임재연 이정민 1 ABTS tion ril. svenging tivity (%). Cell viility (%). * *** *** VitC 1 GSE GSE 3 GSE 5 μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml Fig. 1. Effet of green te see extrt (GSE) on ABTS tion ril svenging tivity. Vlues re men±sd. Different letters (-) on rs show signifintly ifferene t P<.5 s etermine y Dunn's multiple rnge test. 3 GSE onentrtion (µg/ml) Fig. 3. Viility of humn skin firolsts following 24 h of tretment with ifferent onentrtions of green te see extrt (GSE). The results were presente men±sd t lest three inepenent experiments, eh performe in triplite (n=3). Asterisks inite sttistilly signifint ifferenes from GSE µg/ml group ( * P<.5, *** P<.1). DPPH free ril. svenging tivity (%). VitC 1 GSE GSE 3 GSE 5 μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml Fig. 2. Effet of green te see extrt (GSE) on DPPH free ril svenging tivity. Vlues re men±sd. Different letters (-) on rs show signifintly ifferene t P<.5 s etermine y Dunn's multiple rnge test. 탈색되어흡광도값을변화시켜항산화능을측정할수있다. 반면 DPPH는안정적인자유라디칼 (free ril) 로, 함유황아미노산과 sori i, romti mine 등에의해 iphenylpirylhyrzine으로환원되어보라색에서무색으로변하는원리로 ABTS 라디칼소거능과함께항산화능측정에유용한방법이다 (25). DPPH 라디칼소거능과 ABTS 라디칼소거능측정은인위적으로라디칼을제거하는작용기작으로유의적인상관성을보이는것으로알려져있는데, DPPH가친수성항산화제에제한적으로반응하는반면 ABTS는친수성항산화제와소수성항산화제모두에서반응을하기때문에 ABTS의소거능이높게측정된다 (26,27). 녹차나무씨추출물의모든농도보다 Vit C의 1 µg/ml 그룹이유의적으로가장높은소거능을보인것으로보아녹차나무씨추출물의소수성항산화제존재를예상할수있다. 시료처리및자외선조사후세포생존율인체피부섬유아세포를이용하여녹차나무씨추출물의세포독성을 MTT ssy를이용하여측정하였다. 인체피부섬유아세포에대한녹차나무씨추출물의농도별세포 생존율은 Fig. 3에나타내었다. 녹차나무씨추출물 µg/ml에서 92.29±3.82% 생존율을보이면서유의적인차이를보이기시작하였고 (P<.5), µg/ml 이상의농도에서유의적으로크게생존율이감소하여독성을보였다 (P<.1). 따라서녹차나무씨추출물의자외선조사에의한보호효과를살펴보기위해독성을보이지않은농도인 5 µg/ml를가장높은농도로정하여실험을진행하였다. 자외선 25 mj/m 2 와 5 mj/m 2 를조사후녹차나무씨추출물 5 µg/ml의처리가세포생존율에미치는영향을살펴본결과는 Fig. 4와같다. 자외선조사를하지않고녹차나무씨추출물 5 µg/ml를처리한군과자외선 25 mj/m 2 조사하여시료를처리하지않은군, 시료를처리한군모두유의적인차이를보이지않았다. 반면자외선 5 mj/m 2 를조사하였을때유의적으로세포생존율이낮아져자외선조사량의존적으로독성을보였다 (P<.5). 따라서이러한독성시험결과추후진행하는인체피부섬유아세포를사용하는실험에서자외선조사량을 25 mj/m 2 로정하고녹차나무씨추출물의최고농도를 5 µg/ml로정하여 1 µg/ml, Cell viility (%) UVB ose (mj/m 2 ) GSE ug/ml μg/ml GSE 5 ug/ml μg/ml Fig. 4. Effet of green te see extrt (GSE) on humn skin firolsts viilities uner UVB irrition. Vlues re men± SD. Different letters (-) on rs show signifintly ifferene t P<.5 s etermine y Dunn's multiple rnge test.

5 녹차나무씨추출물의자외선에의한손상보호 5 3 µg/ml와함께진행하여비교분석하였다. 항산화효소활성흡연, 음주, 약물, 오염물질, 자외선등의외부요인이나체내에너지대사과정중생성되는활성산소종은체내항산화방어체계에의해제거되어균형을유지한다 (28). 하지만비정상적으로활성산소종의농도가높아지면산화적스트레스를유발시켜세포손상과사멸에의하여질병을일으키게된다 (29). 체내에는항산화효소계인 SOD, tlse, GPx 등이존재하여인체를보호하는것으로알려져있다. SOD는수퍼옥사이드를산소와과산화수소 (H 2O 2) 로전환시키는반응을촉매하는효소이며, 합성된과산화수소는 GPx 에의해물과산소로분해되고 (3) 과산화수소의농도가증가하면 CAT도작용하여분해되어해독화시킨다 (3,31). 따라서본실험에서는자외선에의한활성산소종의증가와산화적스트레스를유발시킨인체피부섬유아세포에서녹차나무씨추출물의처리가항산화방어체계에미치는영향을살펴보기위해 SOD, GPx, tlse의활성도를측정하였다. 녹차나무씨추출물이 SOD 효소활성도에미치는효과를관찰한결과는 Fig. 5와같다. 자외선을조사하지않은 norml ontrol군 (51.34±1.7%) 에비하여자외선을조사한 ontrol군 (42.83±3.41%) 에서 SOD 효소활성도가유의적으로감소하였음을관찰하였다. 양성대조군으로선택한 Vit C 1 µg/ml군이 65.15±2.76% 로유의적으로가장높은활성을보였으며, 녹차나무씨추출물을농도별로처리한그룹에서는농도의존적인결과는나타나지않았지만가장높은농도인 5 µg/ml에서 Vit C 1 µg/ml군과유의적인차이가없을정도로 SOD 효소활성도가높았다 (P<.5). GPx 효소활성도결과에서도 SOD 효소활성도와마찬가지로자외선을조사한 ontrol군이 norml ontrol군보다유의적으로감소하였으며 Vit C 1 µg/ml군에서감소된활성을유의적으로증가시켰음을확인하였다. 녹차나무씨 추출물 1 µg/ml의처리는자외선을조사한 ontrol군과유의적인차이를보이지않았지만, 5 µg/ml에서 GPx 효소활성도가증가하여 ontrol군과유의적인차이를보이면서 Vit C 1 µg/ml군과는유의적인차이를보이지않았다 (P<.5)(Fig. 6). Ctlse 효소활성도에미치는영향을살펴본결과, SOD와 GPx의활성도의변화와마찬가지로 norml ontrol군과비교하여자외선을조사한 ontrol군이유의적으로감소하였으며, Vit C 1 µg/ml군에서유의적으로증가되었다. 또한녹차나무씨추출물의처리는 Vit C 1 µg/ml 군과유의적인차이가없을정도로활성도를증가시켰으며, 그중 5 µg/ml군에서유의적으로가장높았다 (P<.5) (Fig. 7). 따라서이상의결과를살펴보았을때, 자외선조사에의하여항산화효소활성도가낮아졌음을확인하였고낮아진활성도를 Vit C와녹차나무씨추출물의처리로증가되었음을확인하였다. 이는 Vit C와녹차나무씨추출물의처리가자외선조사로인하여증가된활성산소종을제거하기위한 GPx tivity (mu/mg protein) Norml UVB VitC 1 GSE 1 GSE 3 GSE 5 ontrol ontrol μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml UVB irrition Fig. 6. Effets of green te see extrt (GSE) on glutthione peroxise (GPx) tivity ginst UVB-irrite humn skin firolsts. Vlues re men±sd. Different letters (-) on rs show signifintly ifferene t P<.5 s etermine y Dunn's multiple rnge test. SOD tivity (Inhiition rte %). Norml UVB VitC 1 GSE 1 GSE 3 GSE 5 ontrol ontrol μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml UVB irrition Fig. 5. Effets of green te see extrt (GSE) on superoxie ismutse tivity ginst UVB-irrite humn skin firolsts. Vlues re men±sd. Different letters (-) on rs show signifintly ifferene t P<.5 s etermine y Dunn's multiple rnge test. Ctlse tivity (mu/mg protein) Norml UVB VitC 1 GSE 1 GSE 3 GSE 5 ontrol ontrol μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml UVB irrition Fig. 7. Effets of green te see extrt (GSE) on tlse tivity ginst UVB-irrite humn skin firolsts. Vlues re men±sd. Different letters (-) on rs show signifintly ifferene t P<.5 s etermine y Dunn's multiple rnge test.

6 6 김옥경 남다은 이민재 강남길 임재연 이정민 활성에긍정적인영향을미쳤으며산화적스트레스로부터보호할수있다고사료된다. MMP-1과 type-1 ollgen 생성량변화피부는표피, 진피및피하지방의 3개층으로구성되어있다. 표피는각질형성세포 (kertinoyte), 멜라닌세포 (melnoyte), Lngerhns세포등으로구성되어있고, 진피는주로 ollgen fier, elstin fier로구성되는결체조직과기질 (erm mtrix) 로이루어지며, 이들은모두섬유아세포에의해만들어진다 (3). 진피의대부분을차지하는 ollgen은피부의탄력과강도를관장하여피부를보호하고유지시키는역할을하며피부 ollgen 중대부분을차지하는것은 type-1 ollgen이다. 따라서피부의 ollgen 감소는주름생성과탄력감소에영향을미치게된다 (32). 자외선조사에의하여피부진피의섬유아세포에서는 NF-κB pthwy와 AP(tivtor protein)-1의 DNA ining이촉진되어 MMPs를증가시킨다 (1,11,32). MMP-1은 ollgen을분해하는효소로 type-1 proollgen으로부터의합성된 ollgen을분해하여피부주름형성에영향을미친다 (33). 본연구에서는인체피부섬유아세포에서자외선조사에의하여변화되는 ollgen과 MMP-1 생성량이녹차나무씨추출물의처리에의해어떠한변화를일으키는지살펴보고자배양액의 ollgen과 MMP-1을측정하였다. Collgen의생성량을측정하기위하여 proollgen type-1 C-peptie EIA kit를사용하였다. 세포표면의 proollgen peptise에의하여 proollgen이 C-peptie와분해되어 ollgen이생성되는원리를사용하여 C- peptie의함량을측정함으로써 ollgen 생성량을측정하였다. 그결과자외선을조사하지않은군 (439.6±2.12 ng/ml) 과비교하여자외선을조사한 ontrol군 (298.53± ng/ml) 에서유의적으로 ollgen 생성량이감소되었다. 반면자외선조사에의해감소된 ollgen 생성량을 Vit C의처리로인하여 ±16.72 ng/ml로증가시켰다. 또한녹차나무씨추출물의처리도 Vit C군과유의적인차이를보이지않을정도로증가시켰다. 녹차나무씨추출물 5 µg/ml군이 7.93±27.73 ng/ml로 ollgen 생성량이가장유의적으로증가되었다 (P<.5)(Fig. 8). 인체피부섬유아세포에서자외선에의한 MMP-1의변화를살펴본결과는 Fig. 9와같다. Collgen을분해하는 MMP-1은자외선조사에의하여생성량 (16.9±1.3 ng/ ml) 이유의적으로증가하였다. 반면 Vit C 처리한군에서증가된 MMP-1이유의적으로감소되었으며, 녹차나무씨추출물 1 µg/ml와 3 µg/ml는 Vit C 1 µg/ml와유의적인차이가없을정도로감소되었다. 녹차나무씨추출물 5 µg/ml군이 Vit C 1 µg/ml군보다유의적으로낮은 MMP- 1 생성량을보여높은농도에서활성이컸음을살펴볼수있었다 (P<.5). 이상의결과를보았을때, 자외선조사에의하여 ollgen PIP proution in the ulture. meium (ng/ml). 5 3 Norml UVB VitC 1 GSE 1 GSE 3 GSE 5 ontrol ontrol μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml UVB irrition Fig. 8. Effets of green te see extrt (GSE) on proollgen type-1 C-peptie (PIP) proution ginst UVB-irrite humn skin firolsts. Vlues re men±sd. Different letters (-) on rs show signifintly ifferene t P<.5 s etermine y Dunn's multiple rnge test. MMP-1 proution in the ulture. meium (ng/ml) Norml UVB VitC 1 GSE 1 GSE 3 GSE 5 ontrol ontrol μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml UVB irrition Fig. 9. Inhiition of UVB-irrite MMP-1 proution y green te see extrt (GSE) in humn skin firolsts. Vlues re men±sd. Different letters (-) on rs show signifintly ifferene t P<.5 s etermine y Dunn's multiple rnge test. 의생성량은감소하고 MMP-1의생성량은증가하였음을살펴볼수있었으며, 녹차나무씨추출물이자외선에의해증가된 MMP-1의생성을감소시킴으로써 ollgen이분해되는것을보호하여 ollgen 생성량을증가시켰음을알수있었다. MMPs 와 type-1 ollgen mrna 발현변동인체피부섬유아세포에서자외선조사가 MMPs(MMP- 1, MMP-3, MMP-9) 와 type-1 ollgen의 mrna 발현에미치는영향을실시간정량 PCR을통하여측정하였다. 그결과자외선은조사하지않은 norml ontrol군에비하여자외선을조사한 ontrol군에서 MMP-1, MMP-3, MMP- 9 모두발현이증가하였음을살펴볼수있었다. 자외선조사에의하여증가한 MMPs의발현이 Vit C와녹차나무추출물의처리로감소되었다. MMP-1의발현변화에서는자외선조사에의해증가된발현량 (4.137±.11) 을녹차나무씨추출물 5 µg/ml(1.581±.) 의처리로인하여유의적으로가장감소시켰다. prommp-1을활성화시키는효소인

7 녹차나무씨추출물의자외선에의한손상보호 7 Tle 1. Effets of green te see extrt (GSE) on mrna expression of MMP-1, MMP-3, MMP-9 n type-1 ollgen ginst UVB-irrite humn skin firolsts UVB mrna expression reltive to GAPDH (fol of norml ontrol) Groups MMP-1 MMP-3 MMP-9 Type-1 ollgen Norml ontrol 1.± ± ± ±.78 UVB ontrol Vit C 1 µg/ml GSE 1 µg/ml GSE 3 µg/ml GSE 5 µg/ml 4.137± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±.41 e.757±.9.547±..564± ±. Vlues re men±sd. Different supersript letters (-e) within the sme olumn show signifintly ifferene t P<.5 s etermine y Dunn's multiple rnge test. MMP-3 발현에서는자외선조사에의해증가된발현량 (9.743±.949) 을 Vit C(3.289±.386) 와녹차나무추출물의모든농도 (1 µg/ml: 3.692±.285, 3 µg/ml: 3.564±.339, 5 µg/ml: 3.148±.468) 에서유의적으로감소시켰다 (P<.5). 하지만 Vit C 1 µg/ml군과녹차나무씨추출물의모든농도에서유의적인차이가없었다. Collgen 분해효소를조절함으로써 ollgen의분해를촉진시켜위의 MMP-1, MMP-3와함께주름형성을촉진시키고탄력을감소시키는 MMP-9의발현변화에서는자외선조사에의하여증가된발현량 (3.395±.324) 을 Vit C 1 µg/ml (1.875±.23) 의처리에의하여유의적으로가장감소시켰다. 녹차나무씨추출물의처리또한유의적인감소를보였지만농도의존적인감소는보이지않았다 (P<.5)(Tle 1). Type-1 ollgen의발현의변화를관찰한결과, 자외선조사에의해발현 (.314±.41) 이유의적으로크게감소하였음을관찰하였다 (P<.5). 반면녹차나무씨추출물 5 µg/ml군 (.891±.) 에서유의적으로가장크게발현되었으며, 1 µg/ml와 3 µg/ml군모두에서도자외선을조사한 ontrol군과비교하여 type-1 ollgen의발현이증가되었음을살펴볼수있었다 (P<.5)(Tle 1) 따라서자외선조사에의하여 MMP-1, MMP-3, MMP- 9의 mrna 발현이증가되었고감소량은정도의차이가있었으나녹차나무씨추출물의처리가발현을유의적으로감소시켰으며특히, 녹차나무씨추출물 5 µg/ml에서 MMP- 1 mrna 발현을크게감소되었음을살펴볼수있었다. Prk 등 (18) 은녹차나무씨의 kempferol에의하여항산화효능을지녔음을입증한바있으며, Rh 등 (21) 의연구에의하여사포닌, 플라보노이드, 토코페롤등의생리활성성분에대해분석된바있다. 본연구결과에서녹차나무씨추출물의자외선조사에의한보호효과는이러한항산화활성을지닌성분에의한효능으로예상된다. 따라서녹차나무씨추출물의항산화효소활성의증가에의하여자외선조사로증가한활성산소종을감소시켜산화적스트레스를억제시켰음을알수있다. 이러한효과로증가된 MMPs의발현과생성을감소시키고 ollgen 분해를억제시켜생성을증가시켰음을확인할수있었다. 이러한결과로녹차나무씨추 출물은자외선에의한광노화로부터보호하여주름형성을억제할수있을것이라고기대할수있다. 요 본연구는아직기능성입증이미비한녹차나무씨추출물을사용하여자외선을조사한인체피부섬유아세포에서항산화효능과 MMPs 및 ollgen의변화를살펴봄으로써광노화억제효능을평가하였다. 녹차나무씨추출물농도별라디칼소거능을살펴보기위하여 ABTS와 DPPH 라디칼소거능을측정한결과녹차나무씨추출물농도의존적으로소거능을증가시켰다. 25 mj/m 2 자외선을조사한인체피부섬유아세포에서녹차나무씨추출물의농도별 (1 µg/ ml, 3 µg/ml, 5 µg/ml) 처리가미치는영향을살펴보았다. 항산화효소 (SOD, GPx, tlse) 활성의변화를측정한결과에서자외선조사에의하여감소한활성을녹차나무씨추출물의처리가유의적으로증가시켰음을확인하였다. 또한녹차나무씨추출물의처리는 MMP-1의합성을감소시키고 ollgen의합성을증가시켰으며, MMP-1, MMP- 3, MMP-9의 mrna 발현을감소시키고 type-1 ollgen 의 mrna 발현을증가시켰다. 따라서녹차나무씨추출물은항산화활성을지녔으며자외선조사에의한활성산소종으로부터보호하여 MMPs 발현을감소시키고 ollgen 분해를억제시켜피부노화억제에긍정적인영향을미쳤으며, 이러한기능성입증으로녹차나무의활용증가를기대할수있다. 약 REFERENCES 1. Fisher GJ, Kng S, Vrni J, Bt-Csorgo Z, Wn Y, Dtt S, Voorhees JJ. 2. Mehnisms of photoging n hronologil skin ging. Arh Dermtol 138: Chung JH. 3. Photoging in sins. Photoermtol Photoimmunol Photome 19: Rittie L, Fisher GJ. 2. UV-light-inue signl ses n skin ging. Ageing Res Rev 1: Seite S, Zuhi H, Septier D, Igonjo-Then S, Senni K, Goeu G. 6. Elstin hnges uring hronologil n photo geing: the importnt role of lysozyme. J Eur A Dermtol Venereol :

8 8 김옥경 남다은 이민재 강남길 임재연 이정민 5. Fisher GJ, Wng ZQ, Dtt SC, Vrni J, Kng S, Voorhees JJ Pthophysiology of premture skin ging inue y ultrviolet light. N Engl J Me 337: Cstnet J, Ortonne JP Pigmentry hnges in ge n photoge skin. Arh Dermtol 133: Fisher GJ, Dtt SC, Tlwr HS, Wng ZQ, Vrni J, Kng S, Voorhees JJ Moleulr sis of sun-inue premture skin geing n retinoi ntgonism. Nture 379: Kovs D, Rff S, Flori E, Aspite N, Brignti S, Crinli G, Torrisi MR, Piro M. 9. Kertinoyte growth ftor own-regultes intrellulr ROS proution inue y UVB. J Dermtol Si 54: Hlliwell B, Gutterige JM Oxygen toxiity, oxygen rils, trnsition metls n isese. Biohem J 219: Shephr P, Mrtin G, Smol-Hess S, Brunner G, Krieg T, Smol H. 4. Myofirolst ifferentition is inue in kertinoytefirolst o-ultures n is ntgonistilly regulte y enogenous trnsforming growth ftor-β n interleukin-1. Am J Pthol 164: Brenneisen P, Sies H, Shrffetter-Kohnek K. 2. Ultrviolet-B irrition n mtrix metlloproteinses: from inution vi signling to initil events. Ann NY A Si 973: Ito S, Itog K, Ymto M, Akmtsu H, Okno T. 1. The o-pplition effets of fullerene n sori i on UV-B irrite mouse skin. Toxiology 267: Drr D, Friovih I Free rils in utneous iology. J Invest Dermtol 12: Msteikov R, Muselik J, Berntoniene J, Mjiene D, Sviks A, Mlinusks F, Berntoniene R, Peiur R, Chlupov Z, Dvorkov K. 8. Antioxint tivity of tintures prepre from hwthorn fruits n motherwort her. Cesk Slov Frm 57: Ruh RJ, Cheng SJ, Klunig JE Prevention of ytotoxiity n inhiition of interellulr ommunition y ntioxint tehins isolte from Chinese green te. Crinogenesis 1: Zheng G, Sym K, Okuo T, Junej LR, Oguni I. 4. Anti-oesity effets of three mjor omponents of green te, tehins, ffeine n thenine, in mie. In Vivo 18: Peng G, Dixon DA, Mug SJ, Smith TJ, Wrgovih MJ. 6. Green te polyphenol (-)-epigllotehin-3-gllte inhiits ylooxygense-2 expression in olon rinogenesis. Mol Crinog 45: Prk JS, Rho HS, Kim DH, Chng IS. 6. Enzyme preprtion of kempferol from green te see n its ntioxint tivity. J Agri Foo Chem 54: Kim NH, Choi SK, Kim SJ, Moon PD, Lim HS, Choi IY, N HJ, An HJ, Myung NY, Jeong HJ, Um JY, Hong SH, Kim HM. 8. Green te see oil reues weight gin in C57BL/6J mie n influenes ipoyte ifferentition y suppressing peroxisome prolifertor-tivte reeptorgmm. Pflugers Arh 457: Yoon WH, Choi JH, Lee KH, Kim CH. 5. Antimiroil n ntitumor tivities of see extrts of Cmelli sinensis L. Koren J Foo Si Tehnol 37: Rh HH, Bik SO, Hn SB, Bok JY Chemil ompositions of the see of Koren green te plnt (Cmelli sineis L.). J Koren Agri Chem So 35: Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pnnl A, Yng M, Rie-Evns C Antioxint tivity pplying n improve ABTS ril tion eoloriztion ssy. Free Ri Biol Me 26: Blois MS Antioxint etermintions y the use of stle free ril. Nture 181: Mosmnn T Rpi olorimetri ssy for ellulr growth n survivl: pplition to prolifertion n ytotoxiity ssys. J Immunol Methos 65: Snhez-Moreno C. 2. Methos use to evlute the free ril svenging tivity in foos n iologil systems. Foo Si Tehnol Int 8: Cno A, Aost M, Arno MB.. A metho to mesure ntioxint tivity in orgni mei: pplition to lipophili vitmins. Reox Rep 5: Arno MB, Cno A, Aost M. 1. The hyrophili n lipophili ontriution to totl ntioxint tivity. Foo Chem 73: Gutiérrez RMP, Mithell S, Solis RV. 8. Psiium gujv: review of its tritionl uses, phytohemistry n phrmology. J Ethnophrmol 117: Apel K, Hirt H. 4. Retive oxygen speies: metolism, oxitive stress, n signl trnsution. Annu Rev Plnt Biol 55: Mihiels C, Res M, Toussint O, Remle J Importne of Se-glutthione peroxise, tlse, n Cu/Zn- SOD for ell survivl ginst oxitive stress. Free Ri Biol Me 17: Deisseroth A, Doune AL Ctlse physil n hemil properties, mehnism of tlysis n physiologil role. Physiol Rev 5: Tlwr HS, Griffiths CEM, Fisher GJ, Hmilton TA, Voorhees JJ Reue type I n type III proollgens in photomge ult humn skin. J Invest Dermtol 15: Fisher GJ, Voorhees JJ Moleulr mehnisms of photoging n its prevention y retinoi i: ultrviolet irrition inues MAP kinse signl trnsution ses tht inue Ap-1-regulte mtrix metlloproteinses tht egre humn skin in vivo. J Investig Dermtol Symp Pro 3:

Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,