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학철 추
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1 J Koren So Food Si Nutr 한국식품영양과학회지 43(2), 216~223(14) RAW 세포에서발효울금추출물의면역조절효과 유선아 1 김옥경 1 남다은 1 김용재 2 백흠영 2 전우진 3 이정민 1,4 1 경희대학교의학영양학과, 2 한국인스팜 ( 주 ) 중앙연구소 3 전남대학교식품영양학과, 4 경희대학교임상영양연구소 Immunomodultory Effets of Fermented Curum long L. Extrts on RAW Cells Seon A Yoo 1, Ok Kyung Kim 1, D-Eun Nm 1, Yongje Kim 2, Humyoung Bek 2, Woojin Jun 3, nd Jeongmin Lee 1,4 1 Dept. of Medil Nutrition, Kyung Hee University, Gyeonggi , Kore 2 Kore INSPhrm Reserh Institute, Jeonnm , Kore 3 Dept. of Food nd Nutrition, Chonnm Ntionl University, Gwngju 5-757, Kore 4 Clinil Nutrition Institute, Kyung Hee University, Seoul 13-71, Kore ABSTRACT Curum long L. (CL) is well known trditionl mediinl plnt tht is lso used in urries nd mustrds s oloring nd flvoring gent. However, CL is not usully used s food soure due to its itter tste. We investigted the immunomodultory effet of CL fermented y Aspergillus oryze (FCL) on RAW ells. FCL ws extrted with old wter (CW), hot wter (HW), % ethnol (% EtOH) nd % ethnol (% EtOH), fter whih its effets on phgoyti tivity, tumor nerosis ftor-lph (TNF-α), nitri oxide (NO) prodution, nturl killer (NK) ell tivity nd mrna expression of LP-BM5 eo were investigted. Phgoyti tivity ws inresed in HW nd % EtOH when ompred to the ontrol. The seretion of nitri oxide (NO) from RAW ells did not hnge signifintly reltive to the ontrol. However, TNF-α ws signifintly inresed y the ddition of FCL extrts. Moreover, FCL % ethnol extrt showed four fold inrese in NK ell ytotoxity reltive to the ontrol group. Finlly, we oserved suppressed mrna expression of LP-BM5 eo in FCL extrts, espeilly in the % ethnol extrts group. These results indite tht the FCL extrts n e used s funtionl mteril due to their effetive immunomodulting tivities. Key words: fermented Curum long L., immunomodulting tivity, RAW ell, mrophge, NK ell 서 인체는외부병원체등의각종외부물질의침입을식별하고이를제거함으로써몸을보호하며항상성을유지하는자기방어체계인면역작용을한다 (1). 이러한면역작용은면역을억제조절하는면역관용과면역을증진하는면역반응으로나눌수있다. 이두가지의면역작용에의하여면역조절, 즉항상성이이루어진다. 여러원인에의하여면역조절이불균형을일으키게되면질병을발생시키게된다. 면역기능이결핍되거나저하된상태에서는면역반응이제대로활성화되지못하고체내의이물질에대한반응을제대로못하여감염을일으키게된다. 이와반대로일부의면역반응이과하게반응하면면역체계가불균형을이루어결과적으로자가면역질환, 알레르기반응등을일으키게된다 (2,3). 따라서 Reeived 23 Septemer 13; Aepted 17 Deemer 13 Corresponding uthor. E-mil: jlee7@khu..kr, Phone: 론 인체의면역반응은균형을이루어조절이정상적으로되어야건강함을유지할수있다. 병원균이인체에침입하여조직내에서복제를시작하면대식세포의활성이일어나박테리아나바이러스, 암세포등을인지하고이에대한탐식작용 (phgoytosis) 을일으켜제거함으로써방어작용을하며, 뿐만아니라면역반응및염증반응에기여하는 nitri oxide(no) 와 tumor nerosis ftor-α(tnf-α) 등의 ytokines을생산한다 (4-6). 정상적으로발현되는 NO는생체내에서혈압조절, 신호전달등다양한작용을한다. 이물질이침입하였을때에는 NO를이용하여박테리아나바이러스등을막아생체방어기전에중요한조절자로서역할을하지만 lipopolyshride(lps) 와같은자극에의해활성화될경우과도한 NO가생성되고이는염증에관여하여유전자변이, 신경손상등을유발한다 (7-9). 활성화된대식세포에의해분비되는 TNF-α는질병에있어면역을증강시키고염증반응을매개하며이물질을감염부위로유인하여방어작용을하는 ytokine이지만,

2 발효울금추출물의면역조절효과 217 전신적으로유리되어과도하게생성될때염증성질환을유발시킬수있다 (1,11). 이러한대식세포에의해생산된 ytokines이나바이러스증식을방해하는 interferon에의해 NK 세포의활성화가일어나바이러스에감염된세포를선별적으로사멸시키게된다 (12). 따라서대식세포에의한 NO와 TNF-α 등의적절한생성은면역체계를조절하는데중요한역할을한다. 면역체계의상호간균형이깨졌을때발생할수있는질병을예방하기위해면역조절제개발이추진되고있으나부작용및문제점이제기되어져왔다. 이러한문제점을해결하고자최근에는안전성이보고된천연물의면역조절효능연구가다양하게진행되고있다 (13). 이러한천연물중하나인울금 (Curum long L., tumeri) 은생강과에속하는다년생초본식물로노란색향신료로사용될뿐만아니라염료와식품의착색제로사용되고있으며중국, 인도, 일본등다른아시아국가에서널리재배되고있다 (14-18). 울금의뿌리에서추출된커큐민 (urumin) 은가장대표적인성분으로항균활성과항산화효과 (17,19), 항염증 (), 항암 (21), 면역조절 (14,22,23) 등이보고되고있다. 이러한울금의여러기능성에도불구하고쓴맛, 강한향으로인해소비자선호와이용률이낮아지고있어이러한문제점을해결하고자본연구는 Aspergillus oryze를이용하여맛과향을개선한발효울금추출물의기능성을확인하고자한다. 주로울금의커큐민성분에대해많은기능성연구가보고되어져왔으나발효울금에대한연구로는간독성에대한보호효과 (15), 항비만 (24), 피부관련생리활성효과 (25) 등으로미비하게진행되었으며면역조절에관한연구는아직미흡한실정이다. 따라서본연구에서는발효울금의용매별추출물을이용하여면역조절에효능을확인하고기능성소재로서의가능성을제시하고자한다. 재료및방법실험재료본연구에사용된울금은한국인스팜 ( 주 )(Hwsun, Kore) 에서제공받았으며, A.oryze는충무발효 ( 주 )(Ulsn, Kore) 에서구입하였다. 발효에사용할원료는정밀히칭량해 121 C에서 분간가압멸균하였다. 울금중량대비 2% A. oryze를접종한후발효조를 분회전하여혼합하고 25±2 C, 습도 5±5% 에서 36시간동안발효시켰다. 추출물제조는분말상태인시료에용매 ( 정제수, % 에탄올, % 에탄올 ) 를첨가하고실온추출물 (CW) 제조는실온에서 5시간추출, 열수추출물 (HW) 제조는 1 C에서 4시간추출, % 주정추출물 (% EtOH) 제조는 95 C에서 4시간추출, % 주정추출물 (% EtOH) 제조는 75 C에서 4시간추출후, 감압여과장치에서뜨거운상태로여과한후감압농축기를사용하여추출용매를제거한후동결건조하여실험에사용하였다. 세포배양실험에사용한 RAW 세포와 SC-1 세포는 Amerin Type Culture Colletion(ATCC, Mnsss, VA, USA) 에서분양받아사용하였고 YAC-1 세포는경기대학교 (Suwon, Kore) 에서분양받아사용하였다. RAW 세포와 SC- 1 세포는 1% fetl ovine serum(hylone Lortories, Logn, UT, USA), 2 mmol/l glutmine, 1 mg/l peniillin-streptomyin을첨가한 DMEM(Hylone Lortories) 을이용하였고, YAC-1 세포는 1% fetl ovine serum(hylone Lortories), 2 mmol/l glutmine, 1 mg/l peniillin-streptomyin을첨가한 RPMI 16 (Hylone Lortories) 을이용하여 37 C, 5% CO 2 로조절된 inutor(hereus BB15, Thermo Sientifi, Wlthm, MA, USA) 에서배양하였다. 세포독성발효울금추출물의 RAW 세포에대한독성을측정하기위해 96 well plte에 ells/well이되도록분주한후발효울금추출물을농도별로처리하고 24시간배양하였다. 3-(4,5-methylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrzolium romide(mtt; Sigm-Aldrih Co., St. Louis, MO, USA) 시약을 μl 처리하여 37 C, 5% CO 2 의조건하에서 3시간배양한후상층액을제거하고, DMSO(Sigm- Aldrih Co.) μl를가하여 5 nm에서 ELISA reder(versamaxsl-, Moleulr Devies, Seoul, Kore) 를이용하여측정하였다. RAW 세포에서의탐식작용활성측정 RAW 세포를 96 well plte에 ells/well씩분주한후 24시간동안배양시켜 Cytoselet 96 well phgoytosis ssy kit(cell iols In., Sn Diego, CA, USA) 를이용하여대식세포의탐식능을측정하였다. 본실험에서대식세포를활성화시켜탐식능을증가시키기위해 kit에포함된 zymosn 입자를사용하였다. Zymosn을첨가하고 CW μg/ml, HW μg/ml, % EtOH μg/ml, % EtOH 1 μg/ml로처리하여 15분동안배양하였다. 그후 serum free DMEM으로세척후 fixtion solution을첨가하고 5분동안상온에방치하였다. 모든 well을 Duleo's phosphte uffered sline(dpbs; Welgene, Degu, Kore) 으로세척후 1X loking regent를첨가하고 oritl shker(dihn Sientifi Co., Ltd., Wonju, Kore) 를이용하여 분동안방치하였다. 모든 well을 DPBS로세척후 1X permeiliztion solution을첨가하고 5분동안상온에방치하였다. 모든 well을 DPBS로세척후 1X detetion regent를첨가한후 oritl shker를이용하여 분동안방치하였다. 모든 well을 DPBS로세척후 detetion uffer를첨가하고 oritl shker를이용하여 1분동안방치후 sustrte를첨가하

3 218 유선아 김옥경 남다은 김용재 백흠영 전우진 이정민 고 1분동안배양하였다. ELISA reder(versamaxsl -, Moleulr Devies) 를이용하여흡광도 5 nm에서측정하였다. NO와 TNF-α분비량측정 RAW 세포를 ells/well의농도로 96 well plte에분주하고 24시간배양한후에 CW μg/ml, HW μg/ml, % EtOH μg/ml, % EtOH 1 μg/ ml로처리하였다. NO는양성대조군으로.1 μg/ml의 LPS(Sigm-Aldrih Co.) 를처리하여 72시간배양한후상층액 5 μl와동량의 Griess regent(sigm-aldrih Co.) 를혼합하여 15분후 ELISA reder를이용하여 5 nm에서흡광도를측정하였다. TNF-α의경우양성대조군으로는 1 μg/ml의 LPS를처리하여 2시간배양한후생성된 TNFα 양을 DuoSet sndwih ELISA mouse TNF-α kit(r&d System, MKinley Ple NE, MN, USA) 를이용하여측정하였다. YAC-1 에대한 nturl killer(nk) 세포활성측정 C57BL/6 마우스로부터비장을적출하여마쇄한후 1% fetl ovine serum, 2 mmol/l glutmine, 1 mg/l peniillin-streptomyin을첨가한 RPMI 16으로세척한후 red lood ell lysing uffer(sigm-aldrih Co.) 로적혈구를용혈시켜비장세포부유액을만들어 96 well plte 에각 well당 ells/well씩분주한후 effetor 세포로이용하였다. Trget 세포는 YAC-1 세포를이용하였으며 effetor 세포와 trget 세포의비율을 5:1로조정하고 CW μg/ml, HW μg/ml, % EtOH μg/ml, % EtOH 1 μg/ml로처리하였다. 37 C, 5% CO 2 에 4시간동안배양한후유리된 ltte dehydrogense(ldh) 를 ytotox 96 non rdiotive ytotoxiity ssy kit (Promeg Corportion, Mdison, WI, USA) 를사용하였다. ELISA reder를이용하여흡광도 49 nm에서측정하여계산하고 YAC-1세포의사멸정도를 NK ell tivity (%) 로나타내었다. Rel-time polymerse hin retion에의한 LP-BM5 eo 발현측정 SC-1 세포를 6 well plte에 ells/well의농도로 1% FBS를첨가한 DMEM 배지에분주하여 12시간동안안정화시킨후 CW μg/ml, HW μg/ml, % EtOH μg/ml, % EtOH 1 μg/ml를세포에분주하였다. 4시간후 trypsin.25% solution(hylone Lortories) 으로세포를수집하여 RNesy extrtion kit(qigen, Githersurg, Mrylnd, USA) 로제조사의 protool에따라 RNA 추출을실시하였다. isript DNA synthesis kit (Bio-Rd Lortories, In., Herules, CA, USA) 를사용하여 DNA를합성하였다. 유전자들의발현을측정하기위 하여 SYBR Green(iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rd Lortories In.) 을이용한실시간정량 PCR을실시하였고, 기기는 Rel-Time PCR(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 을사용하였다. 각각의유전자에대한 PCR primer의염기서열은다음과같다 : GAPDH forwrd primer 5 CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA 3, reverse primer 5 GCG GCA CGT CAG ATC CA 3, LP-BM5 eo forwrd primer 5 CCA ATG TGT CCA TGT CAT TT 3, reverse primer 5 GCG ATG AGC AGA GAG AGA AAG 3. Rel-time PCR 반응은총 μl 내에 DNA 2 μl와 2X SYBR mix 1 μl, forwrd, reverse primer는각각 1 pmol/μl를 1 μl씩첨가하였고, 나머지는 H 2O로채워주었다. 모든유전자에대하여 PCR 증폭단계는다음과같고증폭 yle은 yle을실시하였다. Hot strt를위해 95 C에서 8분, 증폭단계의 denturtion을 95 C에서 15초, nneling을 C에서 45초, extension을 72 C에서 45초간반복하며, 각 yle의 extension 후에값이기록되었다. 모든 yle이완료된후 primer의특이성을확인하기위해 melting urve 분석을실시하였다. 결과의분석은 Applied Biosystems에서제공하는 One step system softwre v2.1로분석하였다. 통계처리본연구에서는 SPSS(Sttistil Pkge for Soil Siene, version., SPSS In., Chigo, IL, USA) 통계프로그램을이용하여각실험군의평균 ± 표준편차 (men ±SD) 로표시하였고, 그룹간의통계적유의성을 Dunn's multiple rnge test로실시하였다. 두그룹간의차이는 Student's t-test를이용하여분석하였으며각실험군간에유의성을 P<.5 수준에서검정하였다. 결과세포독성발효울금추출물의적정농도를결정하기위해발효울금 % 주정추출물 (% EtOH) 은 μg/ml, 나머지추출물은 1, μg/ml 농도로 RAW 세포에처리한후세포의생존율을측정하였다. 실험결과 Fig. 1에서나타난바와같이 CW와 % EtOH는 μg/ml 농도에서각각 81.81±4.% 와 88.38±2.85%, HW는 μg/ml 농도에서.17±7.7%, % EtOH는 1 μg/ml 농도에서 86.68±3.11% 의생존율을보였다. 따라서이러한각용매별추출물의오차범위를감안하여 ~1% 이상생존율을보인농도를선택하여추후실험에사용하였다 (Fig. 1). RAW 세포에서의탐식작용활성측정탐식작용을자극시키는 zymosn을처리한군 (positive ontrol) 에서의탐식작용활성을 1% 로비교하였을때정

4 발효울금추출물의면역조절효과 219 (A) (B) Cell viility (%). 1 Cell viility (%). 1 (C) 1 FCL-CW Conentrtion (μg/ml) (D) 1 FCL-HW Conentrtion (μg/ml) Cell viility (%). 1 Cell viility (%). 1 1 FCL-% EtOH Conentrtion (μg/ml) FCL-% EtOH Conentrtion (μg/ml) Fig. 1. Effet of fermented Curum long L. (FCL) extrts on the ell viility of RAW ell. The results re men±sd of triplite from representtive experiment ( P<.5; signifintly different from the ontrol). (A) FCL old wter extrt, (B) FCL hot wter extrt, (C) FCL % ethnol extrt, (D) FCL % ethnol extrt. 상군의 37.23±3.21% 보다유의적으로 63% 증가된것으로 1 보아 zymosn이정상적으로작용하였음을확인할수있었다 (P<.5). HW와 % EtOH에서는 zymosn만처리한군에비해각각유의적으로약 ±4.71%, ± 11.21% 증가하였음을알수있었다 (P<.5). 반면 CW는 13.38±2.91%, % EtOH는 14.23±1.69% 로 zymosn 만처리한군과유의적으로차이가없었다 (Fig. 2). Phgoyti tivyty (%). NO와 TNF-α분비량측정 LPS 처리는염증반응을일으켜 NO와 TNF-α 등의관련인자의생성을촉진하는것으로알려져있다. 과생성된 NO 와 TNF-α는전신적염증을유발하여생체에여러가지부정적영향을미치기도한다. 하지만적정량의 NO와 TNF-α 의생성은오히려선천성면역의중요한인자로여겨지기때문에, 본연구에서는 LPS를처리한군과비교하여 LPS를처리하지않은정상세포에발효울금을처리할때선천성면역을활성화시킬정도의 NO와 TNF-α가생성되는지 RAW 세포를사용하여관찰하였다. NO의경우 LPS가처리되지않은정상군 (ontrol) 에비해 LPS만처리된군 (LPS) 에서유의적으로약 배많은 NO를생성하였다. 반면 CW.67±.44 μm, HW 1.25±.18 μm, % EtOH.87±.13 μm, % EtOH.58±.15 μm의 NO 생성을각각나타내었으며통계적유의성은보이지않았다 (Fig. 3). Control ontrol positive ontrol CW HW % EtOH % EtOH Fig. 2. Effets of fermented Curum long L. (FCL) extrts on the phgoytosisi of RAW ells. All dt re presented s men±stndrd devition. Sttistil nlyses were performed y Dunn's multiple rnge tests fter one-wy ANOVA using SPSS softwre. Differenes were onsidered sttistilly signifint t P<.5. Control: ell only, Positive ontrol: ell+ zymosn, CW: ell+fcl old wter μg/ml, HW: ell+fcl hot wter μg/ml, % EtOH: ell+fcl % ethnol μg/ml, % EtOH: ell+fcl % ethnol 1 μg/ml. TNF-α의경우 NO와마찬가지이유로정상세포에발효울금추출물만을처리하였을때 LPS를처리한군 (LPS) 의경우 LPS가처리되지않은정상군에비해약 35배유의적으로높은 TNF-α를생성하였다. CW, HW, % EtOH만을처리한경우각각 1,313.7±254. pg/ml, 1,256.69± pg/ml, ± pg/ml로 LPS를처리한

5 2 유선아 김옥경 남다은 김용재 백흠영 전우진 이정민 Nitri oxide (μm) NK ell tivity (%). Control ontrol LPS CW HW % EtOH % EtOH Control CW HW %EtOH %EtOH Fig. 3. Effets of fermented Curum long L. (FCL) extrts on the nitri oxide prodution y RAW ells. All dt re presented s men±stndrd devition. Sttistil nlyses were performed y Dunn's multiple rnge tests fter one-wy ANOVA using SPSS softwre. Differenes were onsidered sttistilly signifint t P<.5. Control: ell only, Positive ontrol: ell+lps.1 μg/ml, CW: ell+fcl old wter μg/ml, HW: ell+fcl hot wter μg/ml, % EtOH: ell+fcl % ethnol μg/ml, % EtOH: ell+fcl % ethnol 1 μg/ml. Fig. 5. Effets of fermented Curum long L. (FCL) extrts on the NK ell tivity y splenoyte. Effetor ell : YAC-1= 5:1. All dt re presented s men± stndrd devition. Sttistil nlyses were performed y Dunn's multiple rnge tests fter one-wy ANOVA using SPSS softwre. Differenes were onsidered sttistilly signifint t P<.5. Control: ell only, CW: FCL old wter μg/ml, HW: FCL hot wter μg/ ml, % EtOH: FCL % ethnol μg/ml, % EtOH: FCL % ethnol 1 μg/ml. 군 (LPS) 보다는유의적으로낮았다 (P<.5). 반면 % EtOH를처리한경우 222.7±79.4 pg/ml로정상군과유의적으로차이가없었다 (Fig. 4). YAC-1 에대한 NK세포활성측정 YAC-1 세포의사멸정도를측정함으로써 NK 세포의활성을평가하였다. 대조군과 CW, % EtOH는군간유의적인차이를보이지않았다. 반면정상군과비교하여 HW는약 2배, % EtOH는약 4배높은활성을보이면서통계적으로유의적인차이를보였다 (P<.5)(Fig. 5). Rel-time PCR에의한 LP-BM5 eo 발현측정 LP-BM5 바이러스에감염된 SC-1 세포를이용하여발효울금추출물이 LP-BM5 eo 발현억제에영향을미쳤는지관찰하였다. 발효울금추출물을처리하지않은 LP-BM5 바이러스에감염된 SC-1 세포 (ontrol) 의 LP-BM5 eo 발현과비교하여발효울금을처리한군에서 CW는.599±.99, HW는.7±.134, % EtOH.321±.79, % EtOH.598±.73으로모든군에서유의적으로발현이감소되었다 (P<.5). 특히 % EtOH이가장유의적으로발현이억제되었음을관찰할수있었다 (P<.5)(Fig. 6). TNF-α level (pg/ml). 1 d Reltive expression BM5 eo d Control ontrol LPS CW HW % EtOH % EtOH Control CW HW %EtOH %EtOH Fig. 4. Effets of fermented Curum long L. (FCL) extrts on the TNF-α prodution y RAW ells. All dt re presented s men±stndrd devition. Sttistil nlyses were performed y Dunn's multiple rnge tests fter one-wy ANOVA using SPSS softwre. Differenes were onsidered sttistilly signifint t P<.5. Control: ell only, Positive ontrol: ell+lps 1 μg/ml, CW: ell+fcl old wter μg/ml, HW: ell+fcl hot wter μg/ml, % EtOH: ell+fcl % ethnol μg/ml, % EtOH: ell+fcl % ethnol 1 μg/ml. Fig. 6. Effets of fermented Curum long L. (FCL) extrts on geneti expression of LP-BM5 eotropi virus in SC-1 ell. All dt re presented s men±stndrd devition. Sttistil nlyses were performed y Dunn's multiple rnge tests fter one-wy ANOVA using SPSS softwre. Differenes were onsidered sttistilly signifint t P<.5. Control: SC-1/LP- BM5 virus ell, CW: FCL old wter μg/ml, HW: FCL hot wter μg/ml, % EtOH: FCL % ethnol μg/ml, % EtOH: FCL % ethnol 1 μg/ml.

6 발효울금추출물의면역조절효과 221 고찰울금의줄기, 뿌리성분은항산화및다양한생리적활성을지녔다고연구보고되었으며이러한효능은울금의주성분인커큐민에의하여나타난다고보고되었다. 커큐민은병리학적인상태에서선천면역과적응면역에서큰영향을미치며, T 세포, B 세포, 백혈구, 대식세포등의기능을조절하는데효과적이라연구된바있다 (23). 이러한뛰어난생리적활성을지닌울금은특유의맛과향으로인해이용률이낮아산업적으로문제점을지니고있다. 이러한문제점을보완하기위해이번연구에서 A. oryze를이용하여발효시킨후각용매별로추출하여사용하였으며, 이러한발효울금추출물에서도면역조절효능이있는지확인하고자하였다. 따라서 RAW 세포를이용하여대식세포의탐식작용활성, NO 분비량, TNF-α 분비량, NK 세포활성능, LP-BM5 바이러스에감염된 SC-1 세포를이용한바이러스억제능을측정함으로써발효울금추출물의면역조절효능을평가하였다. 대식세포는거의모든조직에존재하여체내에외부물질이침입하면탐식작용을함으로써내재면역의중요한일차방어로작용한다. 탐식작용을하는동안대식세포에서는탐식된병원균을죽이기위하여다양한독성물질들을생산한다. 중요한독성물질중하나가 NO이며, 선천면역과적응면역간경계에서중요한역할을하여세균, 바이러스, 미생물등의병원균을사멸시키는매개체로작용한다 (26). 하지만과량의 NO는정상적인세포조직에게독성물질로작용할수있으며염증질환및자가면역질환등의면역관련질환과패혈성쇼크를일으킬수있다 (27). 활성화된대식세포는 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-12 등의 ytokines를분비하여면역계세포를활성화시키고적응면역반응을유발시킴으로써감염인자를제거하는염증반응을활성화시킨다. 이중 TNF-α는감염을국소화하는중요한역할을한다. 정상적인면역계에서는 TNF-α가감염부위에작용해염증반응을일으켜다양한방법으로효과적인숙주방어의역할을담당하게된다. 하지만과량의 TNF-α 분비가일어나면전신적으로염증을유발시켜염증성질환을일으키게하거나혈관확장, 혈압강하, 혈관의투과성증가에의해쇼크를일으킬수있다 (28-3). 따라서대식세포에의한 NO와 TNF-α의적당한분비는면역반응을조절하는데있어서중요한역할을하게된다. 본연구에서는발효울금추출물의처리만으로대식세포활성에미치는영향과 NO와 TNF-α의분비량을측정함으로써면역조절에미치는영향을확인하였다. 그결과대식세포의탐식작용과 TNF-α의분비가추출용매별로차이를보였지만증가되었음을확인하였다. TNF-α 분비량의증가는 LPS로분비를자극시킨군보다낮은분비량을보이면서정상군보다높은분비량을유도시켜면역반응을증가시켰음을볼수있다. Bisht 등 (31) 의연구에서커큐민을처리했 을때정상군보다 TNF-α가유의적으로증가하였으며, 이러한결과는기초적으로염증이나면역반응을증가시키는것으로보고하였다. 발효하지않은울금의커큐민함량은약 2.5 mg/g이었으며, A. oryze를이용하여발효한발효울금의커큐민함량은약 2.2 mg/g으로측정되었다고보고된바있다 (24). 따라서발효울금추출물의 TNF-α 분비증가의결과는발효울금에포함된커큐민의효능이라고예상할수있다. 또한대식세포의활성화에의한 TNF-α 분비량의증가로볼수있으며이러한결과는발효울금추출물이면역반응을증가시켰음을알수있게하였다. 바이러스와같은병원균은체내에들어와복제를위해숙주세포내로침투한다. 이러한병원균이세포로들어가는것을차단하거나들어간세포를찾아제거함으로써질병의발생을막는면역반응이일어나야한다. 따라서정상적인면역계의상태에서는병원균이세포에들어가기전에대식세포의탐식작용에의하여제거되거나 NK 세포의감염된세포를인지하여사멸시키는반응이일어난다. NK 세포는 interferon이나대식세포유래 ytokines에의하여활성화되며 MHC lss І 발현의변화를인식하여비감염세포에대한활성화를막음으로써감염세포만선택적으로세포사멸을유도시킨다 (32). 본연구에서는암세포인 YAC-1 세포를사용하여 NK 세포의 YAC-1 세포사멸효능을측정함으로써 NK 세포의활성을살펴보았다. 그결과열수추출물과 % 주정추출물에서각각 2배, 4배가까운유의적활성을관찰할수있었다. 결과적으로바이러스복제가억제되었는지살펴보기위해 murine leukemi virus(mulv) 혼합체중하나인 LP-BM5 eo의발현을측정하였다. 실험에사용된 LP-BM5 virus는비장비대증, 림프비대증, T 세포와 B 세포의면역기능장애등에의해특징지어진 murine leukemi retro virus이다 (33). LP-BM5 virus에노출시킨 SC-1 세포에서바이러스의복제정도를측정하기위해 LP-BM5 eo의발현을측정하는방법을사용하였다. 그결과정상군에비해발효울금추출물의처리가유의적으로 LP-BM5 eo 발현을억제한것을알수있었으며, 특히 % 주정추출물이가장많이억제시켰음을확인할수있었다. 본연구에서는발효울금추출물이면역관련세포의활성인자로작용하며결과적으로바이러스의복제를억제시켰음을확인하였다. 이러한효능을통하여발효울금은억제된면역을증가시켜염증성질환을예방하고면역과민반응을감소시켜면역조절및항상성을유지하여자가면역질환및알레르기를억제시킬수있을것이라고사료된다. 따라서추후면역조절기능성식품의상업화에기초자료가되어국내기능성소재로서의활용을기대할수있다. 요약본연구에서는울금의선호도및이용율을높이기위해 Aspergillus oryze를이용하여발효시킨후용매별추출을

7 222 유선아 김옥경 남다은 김용재 백흠영 전우진 이정민 통하여얻은발효울금추출물들을사용하여면역조절효과를살펴보았다. MTT ssy를이용하여실온추출물 μg/ml, 열수추출물 μg/ml, % 주정추출물 μg/ml, % 주정추출물 1 μg/ml의농도가적정하다고판단되어추후실험에사용하도록하였다. 면역조절효과를보고자대식세포의탐식작용능력, nitri oxide(no), TNFα 생성, NK 세포활성, SC-1 세포에서발현되는 LP-BM5 virus의 LP-BM5 eo 유전자발현을측정하였다. NK 세포의활성을측정한결과 NK 세포는 YAC-1 세포에대한 ytotoxity를관찰했을때 % 주정추출물이가장활성을나타내는것으로확인하였다. 발효울금추출물중열수추출물과 % 주정추출물은대식세포를활성화시킴으로써탐식능력을증가시켰다. NO 생성을관찰했을때발효울금처리에의해활성화된대식세포는효과를나타내지않았으나 % 주정추출물을제외한추출물에서 TNF-α 생성을정상군에비해유의적으로증가시켰다. SC-1 세포에있는 LP-BM5 eo 유전자발현을비교하여바이러스복제억제능을측정한결과모든추출물이유의적으로억제되었으며, 특히 % 주정추출물이가장많이억제하고있는것을확인할수있다. 이러한연구결과로부터발효울금이면역조절효과를가진천연기능성소재로개발에있어기초자료로활용할수있을것으로기대할수있다. 감사의글 본연구는농림수산식품부기술사업화지원사업에의해이루어진것으로이에감사드립니다. REFERENCES 1. Hogquist KA, Bldwin TA, Jmeson SC. 5. Centrl tolerne: lerning self-ontrol in the thymus. Nt Rev Immunol 5: Bnhereu J, Steinmn RM Dendriti ells nd the ontrol of immunity. Nture 392: Gonzlez-Rey E, Chorny A, Delgdo M. 7. Regultion of immune tolerne y nti-inflmmtory neuropeptides. Nt Rev Immunol 7: Rosenthl AS Determinnt seletion nd mrophge funtion in geneti ontrol of the immune response. Immunol Rev : Huer C, Bthelor JR, Fuhs D, Husen A, Lng A, Niederwieser D, Reinegger G, Swetly P, Troppmir J, Whter H Immune response-ssoited prodution of neopterin. Relese from mrophges primrily under ontrol of interferon-gmm. J Exp Med 1: Shevh EM, Rosenthl AS Funtion of mrophges in ntigen reognition y guine pig T lymphoytes. II. Role of the mrophge in the regultion of geneti ontrol of the immune response. J Exp Med 138: Ding AH, Nthn CF Relese of retive nitrogen intermedites nd retive oxygen intermedites from mouse peritonel mrophges: omprison of tivting ytokines nd evidene for independent prodution. J Immunol 141: Shrm JN, Al-Omrn A, Prvthy SS. 7. Role of nitri oxide in inflmmtory diseses. Inflmmophrmol 15: Korhonen R, Lhti A, Knknrnt H, Molinen E. 5. Nitri oxide produtionl nd signling in inflmmtion. Curr Drug Trgets 4: Medzhitov R, Jnewy CA JR Innte immunity: impt on the dptive immune response. Curr Opin Immunol 9: An CS, Jin HL, Jeon YH, Bk JP, Kim JD, Yoon JH, Lim BO. 1. Immunoregultory effets of wter extrts of Inonotus oliquus in ron tetrhloride-indued liver dmge niml model. Kor J Med Cro Si 18: Che JH, Hooker NA, Mildenstein KL, Krieg AM, Cowdery JS Bteril DNA-indued NK ell IFN-gmm prodution is dependent on mrophge seretion of IL-12. Clin Immunol Immunopthol 84: Tong H, Song X, Sun X, Sun G, Du F. 11. Immunomodultory nd ntitumor tivities of grpe seed pronthoynidins. J Agri Food Chem 21: Go X, Kuo J, Jing H, Dee D, Liu Y, Divine G, Chpmn RA, Dulhvsky SA, Gutm SC. 4. Immunomodultory tivity of urumin: suppression of lymphoyte prolifertion, development of ell-medited ytotoxiity, nd ytokine prodution in vitro. Biohem Phrmol 68: Kim YJ, You YH, Jun WJ. 12. Heptoprotetive tivity of fermented Curum long L. on gltosmine-intoxited rts. J Koren So Food Si Nutr 41: Kim MS, Chun SS, Kim SH, Choi JH. 12. Effet of tumeri (Curum long) on ile id nd UDP-gluuronyl trnsferse tivity in rts fed high-ft nd holesterol diet. J Life Si 22: Kim HJ, Lee JW, Kim YD. 11. Antimiroil tivity nd ntioxidnt effet of Curum long, Curum romti nd Curum zedori. Koren J Food Preserv 18: An BJ, Lee JY, Prk TS, Pyeon JR, Be HJ, Song MA, Bek EJ, Prk JM, Son JH, Lee CH, Choi KI. 6. Antioxidnt tivity nd whitening effet of extrtion onditions in Curum long L. Koren J Mediinl Crop Si 14: Selvm R, Surmnin L, Gythri R, Angyrknni N The nti-oxidnt tivity of tumeri (Curum long). J Ethnophrmol 47: Chinni-Wu N. 3. Sfety nd nti-inflmmtory tivity of urumin: omponent of tumeri (Curum long). J Altern Complement Med 9: Ryu SR, Hn KJ, Jng HD. 5. Seprtion nd purifition of effetiveness omponents from ulgeum (Curum long) & the test study of ntiner effets tht use its. Appl Chem 9: Vrlkshmi Ch, Ali AM, Prdhsrdhi BV, Srivstv RM, Singh S, Khr A. 8. Immunomodultory effets of urumin: in vivo. Int Immunophrmol 8: Srivstv RM, Singh S, Duey SK, Misr K, Khr A. 11. Immunomodultory nd therpeuti tivity of urumin. Int Immunophrmol 3: Ho JN, Jng JY, Yoon HG, Kim Y, Jun W, Lee J. 12. Anti-oesity effet of stndrdized ethnol extrt from Curum long L. fermented with Aspergillus oryze in o/o mie nd primry mouse dipoytes. J Si Food Agri 92: Oh SJ, Mo JH. 13. A study on skin relted physiologil tivity of Curum long nd fermented Curum long

8 발효울금추출물의면역조절효과 223 extrts. J Koren So Beuty nd Art 14: Ghosh DK, Stuehr DJ Mrophge NO synthse: hrteriztion of isolted oxygense nd redutse domins revels hed-to-hed suunit intertion. Biohemistry 34: Szó C Altertions in nitri oxide prodution in vrious forms of irultory shok. New Horiz 3: Nm SH, Rhee YK, Hong HD, Lee YC, Kim YC, Shin KS, Cho CW. 12. Immuno-modultory tivity of the rude polyshride from wild ginseng dventitious root. Koren J Food & Nutr 25: Kim JJ, Lee HJ, Yee ST. 12. Effet of Puerri thunergin extrts on the tivtion of immune ells. J Life Si 22: Trey KJ, Cermi A Tumor nerosis ftor: pleiotropi ytokine nd therpeuti trget. Annu Rev Med 45: Bisht K, Choi WH, Prk SY, Chung MK, Koh WS. 9. Curumin enhnes non-inflmmtory phgoyti tivity of RAW ells. Biohem Biophys Res Commun 379: Dokun AO, Kim S, Smith HR, Kng HS, Chu DT, Yokoym WM. 1. Speifi nd nonspeifi NK ell tivtion during virus infetion. Nt Immunol 2: Chttopdhyy SK, Sengupt DN, Fredrikson TN, Morse HC 3rd, Hrtley JW Chrteristis nd ontriutions of defetive, eotropi, nd mink ell fous-induing viruses involved in retrovirus-indued immunodefiieny syndrome of mie. J Virol 65:

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386-390.hwp 386 HANYANG MEDICAL REVIEWS Vol. 29 No. 4, 2009 우리나라 미숙아의 통계와 의료비용 Statistics and Medical Cost of Preterm in Korea 윤혜선 을지대학교 노원을지병원 소아청소년과학교실 Hye Sun Yoon, M.D., Ph.D., Department of Pediatrics, Nowon