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지호 설
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1 J Koren So Food Si Nutr 한국식품영양과학회지 43(11), 1688~1694(214) 제주산한라봉과피추출물의지방세포에서의항비만효과 임희진 1 서지은 1 장윤희 1 한복경 2 정중기 2 박수범 2 최혁준 2 황진아 1 1 명지대학교식품영양학과 2 ( 주 )BKio Co. Ltd. Anti-Oesity Effets of Jeju Hllong Tngor (Citrus kiyomi ponkn) Peel Extrts in 3T3-L1 Adipoytes Heejin Lim 1, Jieun Seo 1, Yun-Hee Chng 1, Bok-Kyung Hn 2, Jung-Ky Jeong 2, Su-Beom Prk 2, Hyuk-Joon Choi 2, nd Jinh Hwng 1 1 Deprtment of Food nd Nutrition, College of Nturl Sienes, Myongji University 2 BKio Co. Ltd. Seongnm, Gyeonggi ABSTRACT Jeju Hllong Tngor (Citrus kiyomi ponkn) is Citrus speies with vriety of physiologil properties suh s nti-oxidnt, nti-inflmmtion, nti-ner, nd nti-oesity. We investigted the nti-oesity effets of Hllong Tngor peel extrts efore (HLB) nd fter (HLB-C) ioonversion with ytolse sed on modultion of dipoyte differentition nd lipid metolism in 3T3-L1 dipoytes. Tretment with ytolse deresed flvnone rutinoside forms (nrirutin nd hesperidin) nd inresed flvnone glyone forms (nringenin nd hesperetin). During dipoyte differentition, 3T3-L1 ells were treted with.5 mg/ml of Sinetrol ( positive ontrol), HLB or HLB-C. Adipoyte differentition ws inhiited in oth itrus groups, ut not in ontrol nd Sinetriol groups. HLB nd HLB-C tended to redue insulin-indued mrna levels of CCAAT/enhner-inding protein α (C/EBPα) nd sterol regultory element-inding protein 1 (SREBP1). Compred to the ontrol nd Sinetrol groups, HLB nd HLB-C mrkedly suppressed insulin-indued protein expression of C/EBPα nd peroxisome prolifertor-tivted reeptor gmm (PPAR γ). The HLB nd Sinetrol groups, ut not HLB-C group, signifintly inresed dipolyti tivity with higher relese of free glyerol ompred to the ontrol group in differentited 3T3-L1 dipoytes. These results suggest tht ioonversion of Hllong Tngor peel extrts with ytolse inreses glyone flvonoids. Irrespetive of ioonversion, oth Hllong Tngor peel extrts exert nti-oesity effets tht my ontriute to prevention of oesity through inhiition of dipoyte differentition or indution of dipolyti tivity. Key words: Hllong Tngor, Citrus kiyomi ponkn, ioonversion, nti-oesity, 3T3-L1 dipoytes 서 비만은전세계적으로심각한건강문제이며대사증후군의한지표로서제2형당뇨병, 고혈압, 심혈관계질환, 암등과밀접한관련이있다 (1,2). 국민건강영양조사에따르면우리나라의비만유병률은 21년전체평균 29.2% 였던것에비해 212년 32.8% 로점점증가하는추세를나타내고있으므로이의조절기전에대한연구가필요하다. 지방세포는우리몸에서에너지를저장하며지방조직과근육에서신호전달과정을조절하는다양한사이토카인들을분비한다 (3). 지방세포의분화는세포의형태, 호르몬민감성, 유전자발현의변화와관련이있다 (4,5). 지방분화초기에는유도제의 Reeived 8 July 214; Aepted 22 Septemer 214 Corresponding uthor: Jinh Hwng, Deprtment of Food nd Nutrition, College of Nturl Sienes, Myongji University, Yongin, Gyeonggi , Kore E-mil: jhwng@mju..kr, Phone: 론 일종인 AMP와 dexmethsone에의해서 CCAAT/enhner-inding proteins β(c/ebpβ) 와 C/EBPδ의발현량이일시적으로증가하게된다. 이들전사인자의발현은 peroxisome prolifertor-tivted reeptor γ(pparγ) 전사인자의발현을증가시키며, 이것은 C/EBPα의발현도증가시켜분화과정후반기에지방세포분화관련유전자들의발현을촉진시킨다 (6). PPARγ의표적유전자는지방조직특이유전자로밝혀진 dipoyte protein 2(P2), leptin 등이있다 (6). Sterol regultory element inding protein 1(SREBP1) 는지방산대사와지질생합성에주로관여하며지방세포의분화초기단계부터발현이유도되어분화를촉진시키며지방산대사관련유전자를증가시킨다 (6). 감귤류의과피는아시아에서기관지와천식환자에게사용되어왔으며, 감귤류플라보노이드는내당능을향상시키고혈장의지질수치와비만을감소시킨다고보고되었다 (7,8). 감귤류에존재하는플라보노이드는분자적인구조에

2 한라봉과피추출물의항비만효과 1689 따라플라본 (flvones), 플라바논 (flvnones), 플라보놀 (flvonols), 이소플라본 (isoflvones), 안토시아니딘 (nthoynidins), 플라바놀 (flvnols) 등 6개그룹으로분류할수있다 (9). Nringin, nrirutin, hesperidin 등과같은플라바논배당체 (flvnones glyone) 와 nringenin, hesperetin과같은플라바논비배당체 (flvnones glyone) 가감귤류플라보노이드의주된형태이며, 이들은과육보다과피와씨에더풍부하게함유되어있다 (1). Nringenin, hesperetin과같은비배당체는배당체형태보다좀더효과적으로우리몸에서흡수되기때문에플라바논의 rutinoside 형태의물질이가수분해과정을거쳐비배당체의형태로전환되면흡수가촉진되어혈장, 담즙, 소변등에더높은농도로존재한다 (1,11). Nringin과 nrirutin은 α-drhmnosidse와 β-d-gluosidse에의해서 nringenin 으로전환되고, hesperidin은 β-d-gluosidse나 α-drhmnosidse에의해서 hesperetin으로전환된다. Cytolse PLC5는 Aspergillus niger의배양물에서얻어진효소제제로서 petinses 외에 ellulse, hemiellulse, β- gluosidse 등의다양한활성을가지고있다. 상업적으로는산도가높은과실류가공시침전제거, 수율및여과력향상에주로사용된다. 또한당분해효소로서배당체형태의플라보노이드를비배당체형태로전환시켜추출효율을높일수있다 (12). 인삼추출물을 β-gluosidse와 ytolse 로효소반응시키면 ginsenosides의형태로전환되었고대식세포에서염증을억제시키고결장선암세포에서항암효과를나타내었다 (13,14). 감귤류의한종류인한라봉은그에대한선행연구가저장연구를중심으로이루어져있으며생리활성에관한연구는 21년농촌진흥청의항암, 항산화및항고혈압작용에관한효능이외에는거의미흡하다. 또한감귤류플라보노이드에대한항비만효능은많은연구가이루어져있으나과피추출물의비배당체로의효소반응처리에관한연구는이루어지지않았다. 이에따라본연구에서는 3T3-L1 지방전구세포에서한라봉과피추출물과 ytolse를이용하여효소처리한한라봉과피추출물의지방세포분화억제와중성지방의분해촉진을통한항비만효과를비교하여연구하였다. 재료및방법한라봉과피추출물의조제및분석한라봉과피추출물 (Hllong Tngor, Citrus kiyomi ponkn; HLB) 과 ytolse로효소처리하여가수분해한한라봉과피추출물 (HLB-C) 은 ( 주 )BKio(Seongnm, Kore) 로부터제공받았다. 한라봉과피는제주연구소에서공급받아과피분말 1 g을.5% 의 ytolse PCL5(DSM Food Speilties, Heerlen, The Netherlnds) 를첨가하여물을용매로 ph 4., 6 C에서 14시간동안효소처리후여과시켜잔사를제거하였다. 여기에 4배부피 (v/v) 의 8% ethnol을가하여 6 C에서 8시간동안교반추출후여과시켜분리된상층액만취해농축한다음동결건조하여분말화하였다. HLB와 HLB-C의플라보노이드구성성분의분석을위해고속액체크로마토그래피 (high performne liquid hromtogrphy; HPLC; YL91HPLC, Younglin, Anyng, Kore) 로 Elipse Plux C18 olumn(4.6 mm I.D. 25 mm; Agilent Co., Snt Clr, CA, USA) 을이용하였고, 시료주입량은 1 μl, olumn oven 온도는 35 C, 유속은 1 ml/min, 검출파장은 28 nm에서 6분동안분석하였다. 이동상은.5%(v/v) eti id/etonitrile과.5%(v/v) eti id/d-h 2O를 grdient 조건에따라사용하였다. 시료의플라보노이드함량을정량분석하기위해서 internl ontrols로 nringin, nrirutin, hesperidin, nringenin, hesperetin(sigm Chemil Co., St. Louis, MO, USA) 을이용하여비교분석하였으며, 이를위해서 YLClrity hromtogrphy sttion system을이용하였다. 지방전구세포의배양과분화 3T3-L1 지방전구세포 (ATCC, Mnsss, VA, USA) 는 Duleo's modified Egle's medium(dmem, Gio, Grnd Islnd, NY, USA) 에 1% lf serum(gio) 과 1% peniillin-streptomyin(ps, Lonz, Allendle, NJ, USA) 을혼합하여배양시켰다. 지방세포분화의시작은 1 μl/ ml insulin(gio), 1 μm dexmethsone(sigm Chemil Co.),.5 μm 3-isoutyl-1-methylxnthine(Sigm Chemil Co.) 을배지에혼합하여이틀간배양시킨다 (dy dy 2). 그후부터이틀간격으로 DMEM과 1% fetl ovine serum(gio) 배지를교환하여열흘간분화를시킨다 (dy 3 dy 1). HLB와 HLB-C는분화시작부터열흘간배지와함께처리하였으며이틀주기로교환하여처리하였다. Sinetrol(Fytexi, Vendres, Frne) 은양성대조군으로사용하였으며시료와동일하게처리하였다 (15). 세포생존율측정 24-well plte에 3T3-L1 지방전구세포를분주하고 2. mg/ml 농도의 Sinetrol, HLB 또는 HLB-C를 24시간동안처리한다. 3-(4,5-Dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrzolium romide(mtt, Amreso, Solon,, USA) 를 5 mg/ml 농도로 4시간동안 37 C에서반응시킨후시약을제거하고 isopropnol을첨가하여분광광도계 (Gen5.2, Biotek, Winooski, VT, USA) 를이용하여 57 nm에서흡광도를측정하였다. 지방세포염색지방전구세포를 6-well plte에서.5 mg/ml의농도의 Sinetrol, HLB 또는 HLB-C를분화배지에첨가하여함께분화시켰다. 분화가끝난후세포를 phosphte uffered sline(pbs) 으로씻어주고 1% formlin(merk, Drm-

3 169 임희진 서지은 장윤희 한복경 정중기 박수범 최혁준 황진아 stdt, Germny) 으로 1시간동안고정시킨다. 그리고 6% Oil red O(Sigm Chemil Co.) 로 3분간염색시킨후현미경을이용하여촬영하였으며, 염색된시약을 isopropnol 로녹여분광광도계 (Biotek) 를이용하여 52 nm에서흡광도를측정하였다. Reverse trnsription polymerse hin retion(rt- PCR) 을이용한 mrna 측정지방세포의 mrna는 Trizol regent(invitrogen, Grnd Islnd, NY, USA) 를이용하여추출하였고 reverse trnsription mster premix(elpis, Dejeon, Kore) 로역전사를진행시켜 DNA를합성시켰다. 유전자증폭을위한 primer는 C/EBPα forwrd 5'-TTACAACAGGCCAGG- TTTCC-3', kwrd 5'-AACTCCAGTCCCTCTGGG- AT-3', SREBP1 forwrd 5'-TGTTGGCATCCTGCTA- TCTG-3', kwrd 5'-CTCACCCTCTGGAAGACC- AC-3', GAPDH forwrd 5'-ACCACAGTCCATGCCAT- CAC-3', kwrd 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA- 3' 로제작하여실험하였다. Western lotting를이용한단백질검출 3T3-L1 지방전구세포를지방세포로완전히분화시킨후세포를분리하여 whole ell lystes를얻었다. 이것을 1% SDS-PAGE에전기영동을통해단백질을분리하고 polyvinylidene difluoride memrne(rohe, Seoul, Kore) 으로 trnsfer 과정을거친후에 C/EBPα, PPARγ, β- tuulin(snt Cruz, Texs, USA) 의항체를붙이고, 그후화학발광반응법을이용하여가시화시켰다. 결과및고찰한라봉과피추출물의효소처리에의한플라보노이드형태전환한라봉과피추출물에있는플라보노이드의형태가 ytolse를통해효과적으로전환되었는지를확인하기위해배당체 (glyone) 형태의 nrirutin, nringin, hesperidin과비배당체 (glyone) 형태의 nringenin과 hesperetin을 HPLC로분석하였다 (Tle 1). HLB와 HLB-C의총플라보노이드양은각각 24.66%, 23.8% 로비슷한수치를나타내차이가거의없는반면 glyone과 glyone 종류의수치가다르게나타남을확인하였다. Glyone 중 nringin과 nrirutin의수치가 HLB에서 HLB-C로전환시켰을때감소하였고 glyone 형태인 nringenin은.1% 에서 8.82% 로증가하였다. 또 glyone 형태의 hesperidin은효소처리전에는 21.42% 였으나처리후에 1.72% 로감소하였고대신 glyone인 hesperetin이효소처리전에는감지되지않다가처리후에 12.38% 로증가하였다 (Tle 2). 이것은 ytolse를이용한효소처리로 nringin과 nrirutin이 nringenin으로, 또는 hesperidin이 hesperetin으로변환된것으로사료된다 (Tle 1, 2). Aglyone 형태는 glyone 형 Tle 1. Chemil strutures of itrus flvnone Free glyerol 측정분화된지방세포에.5 mg/ml 농도의 Sinetrol, HLB 또는 HLB-C를 24시간동안처리한후함께배양했던배지를실험에이용하였다. 96-well plte에 glyerol 표준물질과배지를넣고 free glyerol ssy regent(cymn Chemil Compny, Ann Aror, MI, USA) 를섞어 15분간반응시킨후에분광광도계 (Biotek) 를이용하여 54 nm에서흡광도를측정하였다. 통계처리각실험은 3회이상반복실험을실시하였고결과는평균 ± 표준편차로표시하였다. 또한모든실험결과는 IBM SPSS (Ver. 2., IBM, Armonk, NY, USA) 를이용하여 Student's t-test와 one-wy ANOVA로분석하였다. 통계적유의성은 Sheffe's와 Dunn's multiple rnge test를이용하여검증하였고 5% 이내에서통계적유의성을제시하였다 (P<.5). Flvnone R 1 R 2 R 3 R 4 Glyone Nringin Nrirutin Hesperidin Aglyone Nringenin Hesperetin Neohesperidose Rutinose Rutinose H H H OCH 3 OCH 3 Tle 2. HPLC hromtogrms of Hllong Tngor peel extrts (unit: %) HLB 1) HLB-C Glyone Aglyone Nringin Nrirutin Hesperidin Nringenin Hesperetin Totl ) HLB: Hllong Tngor peel extrt, HLB-C: Hllong Tngor peel extrt fter ioonversion with ytolse.

4 한라봉과피추출물의항비만효과 1691 태보다더효과적으로흡수되어혈청과소변, 담즙에서더높은농도의 glyone 류가존재한다 (1,11). Nringin은 HLB에서거의검출되지않았는데이것은 nringin이한라봉의주요플라보노이드가아님을확인할수있었다. Rutinose가붙어있는 nrirutin과 hesperidin은쓴맛이거의없으나 neohesperidose가붙어있는 nringin은쓴맛이난다 (1). 양성대조군으로사용한 Sinetrol은감귤류의폴리페놀중플라보노이드의 nringin, nrirutin, hesperedin, neohesperedin으로주로구성되어있다 (15). 그중 nringin의양이가장많으며이것은 Sinetrol이강한쓴맛을내는것과연관이있어알약의형태를제외하고는산업적으로이용하는데많은제약이있다. 반면 HBL과 HBL-C는 nringin이거의없었으며관능검사에서도유의적이지는않지만쓴맛이감소하였다 (dt not shown). 한라봉과피추출물이세포생존율에미치는영향추출한시료의독성을평가하고적정농도를결정하기위해 HLB와 HLB-C를 2. mg/ml의농도로처리하였으며양성대조군으로프랑스에서생산, 판매되고있는다이어트보조식품인 Sinetrol을사용하였다 (15). 24시간동안시료를처리한결과세군모두.5 mg/ml 농도까지는세포생존율에유의적인변화가없었으나 HLB군과 HLB-C군의경우 1. mg/ml 이상의농도에서세포생존율이감소하였다 (Fig. 1). 한라봉과피추출물이지방세포분화에미치는영향감귤류플라보노이드의항비만효과는여러연구를통해보고되어있다. 감귤류플라보노이드중 hesperidin과 nringenin, noiletin은지방전구세포가지방세포로분화되는것을억제하였다 (16). 또비만쥐에게제주자생진귤 (Citrus unki) 과피추출물을 7일동안먹였을때 β-oxidtion의 증가와지방분화억제를통해항비만효과를나타내었다 (17). 감귤류종인한라봉과피추출물이지방세포분화에미치는영향을분석하기위해.5 mg/ml 농도의 Sinetrol, HLB 또는 HLB-C를열흘간처리하였고세포에축적된지질을 Oil red O 염색을통해확인하였다. 미처리대조군은 insulin에의해지방세포가분화되어지방전구세포에비해 3배로중성지방이증가하였다. 양성대조군인 Sinetrol은.5 mg/ml에서거의지방분화를억제하지못한반면 HLB 와 HLB-C 처리군은각각 24%, 21% 로미처리대조군에비해 5배정도지방세포분화가감소한것을확인할수있었다 (Fig. 2). HLB와 HLB-C는같은농도에서 Sinetrol보다는훨씬효과적으로동일하게분화를억제시켜효소처리전후의차이는없었다. Citrus urntium flvonoids 경우도지방전구세포에서지질축적을억제한다고보고되었고 (5), 이는한라봉과피추출물의주요플라보노이드인 nringenin과 hesperidin, hesperetin의작용으로인한것으로사료된다 (17). 양성대조군으로사용한 Sinetrol은프랑스의 Fytexi에서개발되어시판되고있는지방분해효과의식이보충제로감귤류와과라나로부터만들어지며, phosphodiesterse(pde) 억제를통해 AMP를증가시키고 hormone sensitive lipse(hsl) 를자극하기때문에지질대사중특히지방분해효과가있다고보고되었다 (15). 한라봉과피추출물이지방세포분화전사인자의발현에미치는영향앞서 HLB와 HLB-C가지방세포의분화를억제한다는결과를토대로이러한과정에영향을미치는여러인자들의분자생화학적기전을규명하기위해 C/EBPα, SREBP1의 Predipoytes Control Sinetrol HLB HLB-C Cell viility (% of ontrol) mg/ml.25 mg/ml.5 mg/ml 1 mg/ml 2. mg/ml Adipoyte differentition (%) Sinetrol HLB HLB-C Fig. 1. Effets of HLB nd HLB-C on ell viility. 3T3-L1 ells were treted with different onentrtions (~2. mg/ml) of Sinetrol, HLB or HLB-C for 24 hr. Sinetrol: positive ontrol. Cell viility ws mesured y MTT ssy. The viility of untreted ontrol ells ws defined s 1%. Eh r represents the men±sem (n=3). Different letters (,) ove the rs men signifint differene ording to ANOVA, Sheffe's test (P<.5). Predipoytes Control Sinetrol HLB HLB-C Differentition Fig. 2. Effets of HLB nd HLB-C on dipoyte differentition in 3T3-L1 ells. 3T3-L1 ells were treted with.5 mg/ml of Sinetrol, HLB or HLB-C in differentition medium during dipogenesis from to 1 dys. Sinetrol, positive ontrol. Eh r represents the men±sem (n=3). Different letters (,) ove the rs men signifint differene ording to ANOVA, Sheffe's test (P<.5).

1692 임희진 서지은 장윤희 한복경 정중기 박수범 최혁준 황진아 Differentition C/EBP SREBP1 GAPDH Fig. 3. Effets of HLB nd HLB-C on dipogeni genes expression in 3T3-L1 ells. Pre: predipoytes; Sin: Sinetrol.

5 1692 임희진 서지은 장윤희 한복경 정중기 박수범 최혁준 황진아 Differentition C/EBP SREBP1 GAPDH Fig. 3. Effets of HLB nd HLB-C on dipogeni genes expression in 3T3-L1 ells. Pre: predipoytes; Sin: Sinetrol. 3T3-L1 predipoytes were treted with.5 mg/ml of Sinetrol, HLB or HLB-C for 1 dys in differentition medium. RT-PCR ws performed using gene speifi primers. mrna와 C/EBPα와 PPARγ의단백질발현량을조사하였다. C/EBPα는지방세포에서특이적으로발현되는유전자이며지방조직의지질축적을증가시킨다 (6,18). 또한 SREBP1는주로지방과간에서지방산대사와지질생합성에주로관여하며지방세포의분화과정에서분화시작단계부터완료단계까지발현된다 (19,2). SREBP1의표적유전자로는 ftty id synthse(fas), lipoprotein lipse (LPL), etyl-coa roxylse(acc) 등이있으며이들은대부분지방산대사조절을담당하는효소이다 (21). 따라서지방분화의중간단계에서 C/EBPα와 PPARγ, SREBP1 는중요한전사인자이다 (22). 지질과탄수화물대사의중요한전자조절인자인 PPARγ는 hesperetin과 nringenin에의해서활성화되며 C/EBPα와 PPARγ의과발현은지질생성과정을촉진시킨다 (23,24). 지방전구세포에분화배지와함께한라봉과피추출물을열흘간처리한후 RT-PCR을통해지방세포분화전사인자인 C/EBPα와 SREBP1의 mrna를확인하였다. 그결과.5 mg/ml 농도의 HLB와 HLB-C 처리군에서 C/EBPα가대조군과 Sinetrol군에비해서발현량이감소하였고 SREBP1는감소하는경향이있었지만유의적인변화를보이지않았다 (Fig. 3). Western lot을이용하여단백질발현을측정한결과 C/EBPα와 PPARγ는지방전구세포가지방세포로분화되면서상당하게증가하였다. 양성대조군으로처리한 Sinetrol 은 1.5 mg/ml의농도로처리하였을때 C/EBPα와 PPARγ 의단백질발현량이감소하는것을확인하였으나 (dt not shown), 그보다더낮은농도인.5 mg/ml의농도로처리한 Sinetrol은변화를나타내지못했다. 반면에같은농도인.5 mg/ml로 HLB와 HLB-C를지방전구세포에처리한결과 C/EBPα와 PPARγ가두그룹에서모두거의발현되지않은것을확인할수있었다 (Fig. 4). 지방세포분화전사인자들의발현분석결과.5 mg/ml의 HLB와 HLB-C 처리군에서 1 mg/ml 이상의농도로처리한정제된감귤류플라보노이드들 (nringin, nringenin, hesperidin, hesperetin) 보다지방세포의분화와지질축적을억제시켰다 (dte not shown). 따라서한라봉과피추출물은 C/EBPα와 PPARγ 의단백질발현을억제함으로써지방전구세포가지방세포로의분화를저지하는것으로사료된다. 지방세포분화와마찬가지로 HLB와 HLB-C는같은농도에서 Sinetrol보다는훨씬효과적으로동일하게지방세포분화인자를억제시켰지만효소처리전후의차이는없었다. 한라봉과피추출물이지방분해에미치는영향지방세포는여분의에너지를 lipid droplet 안에중성지방의형태로저장하다가에너지가필요하게되면 dipose triglyeride lipse와 HSL, monoglyeride lipse와같은효소들에의해서지방산과 glyerol로분해되어에너지를생 C/EBP PPAR? ß-Tuulin ß-Tuulin C/EBPα/β-Tuulin protein. Expression PPARγ/β-Tuulin protein. Expression Differentition Differentition Fig. 4. Effets of HLB nd HLB-C on dipogenesis-relted protein expression of C/EBPα nd PPARγ. 3T3-L1 predipoytes were treted with.5 mg/ml of Sinetrol, HLB or HLB-C for 1 dys in differentition medium. Immunolotting ws performed with speifi ntiodies. Pre: predipoytes; Sin: Sinetrol. Eh r represents the men±sem (n=3). Different letters (-) ove the rs men signifint differene ording to ANOVA, Dunn's multiple rnge test (P<.5).

6 한라봉과피추출물의항비만효과 요 약 Free glyerol relese (%) d Fig. 5. Effet of HLB nd HLB-C on lipolyti tivity in 3T3-L1 dipoytes. The differentited 3T3-L1 dipoytes were ultured in the presene or sene of.5 mg/ml of Sinetrol, HLB or HLB-C for 24 hr. Cell ulture superntnts were ssyed for glyerol relese. Eh r represents the men±sem (n=3). Different letters (-d) ove the rs men signifint differene ording to ANOVA, Dunn's multiple rnge test (P<.5). 산하거나세포신호전달또는지방합성에이용한다 (22, 25). Free glyerol relese의측정은지방세포에축적된중성지방의분해효과를평가하기위한것이다. 지방전구세포를지방세포로완전히분화시키고분화가끝난후.5 mg/ml의농도로 Sinetrol, HLB 또는 HLB-C를 24시간동안처리하여 glyerol의양을측정하였다. Sinetrol 처리군은대조군과비교했을때 2배로 glyerol의양이증가하였고, HLB 처리군은 Sinetrol 처리군보다약하지만대조군에비해 glyerol의양이유의적으로증가한것을확인하였다. 반면효소처리과정을거친 HLB-C 처리군은대조군과비교하여 glyerol relese가증가되었지만유의적이지는않았다 (Fig. 5). 가장높은지방분해활성을나타낸 Sinetrol은지방세포에서 PDE 활성억제를통해 AMP와그표적효소인 HSL을자극함으로써유리지방산과 glyerol를증가시켜지방을효과적으로연소하는약물이다 (15). 이러한기능성을나타내는 Sinetrol은감귤류의폴리페놀중특히플라보노이드의 nringin, nrirutin, hesperedin, neohesperedin으로주로구성되어있다 (15). 이것은주로당이붙어있는 glyone의형태이며한라봉추출물들의구성성분과비교하면 HLB는 glyone, HLB-C는 glyone으로주로구성되어있다 (Tle 1, 2). 본실험결과 HLB 처리군은지방분해를증가시켰으나 HLB-C 처리군에서는유의적인효과가나타나지않았다. 이것을통해지방세포에서의지방분해는 glyon보다 glyone 형태에서더효과가있는것으로사료된다. 최근에는 Citrus sunki 과피추출물 (17) 과 Citrus urntium L. 추출물 (26,27) 이각각마우스모델과비만인모델의지방세포에서 β-산화와지질분해 (lipolysis) 를촉진함으로써 ody ft mss를감소시키는항비만효과가있음이보고되었다. 본연구는한라봉과피추출물과효소처리시킨한라봉과피추출물의 3T3-L1 지방전구세포에서의항비만효과를비교하여연구하였다. Cytolse 를이용한플라보노이드형태전환으로한라봉과피추출물에다량존재하던 nrirutin이 nringenin으로또는 hesperidin이 hesperetin으로변환되었다. 지방전구세포에분화배지와함께 1일간 HLB와 HLB-C, 양성대조군으로 Sinetrol을다양한농도로처리한결과모든세포군에서.5 mg/ml 농도에서는세포생존율에유의적인영향을미치지않았기때문에적정처리농도를.5 mg/ml로확정하였다. Oil red O 염색을통해지방세포의분화정도를측정한결과양성대조군인 Sinetrol 처리군보다같은농도의 HLB와 HLB-C 처리군이분화를억제시켰다. 지방세포분화억제의분자생화학적기전을규명하기위해분화관련유전자와단백질발현을 RT- PCR과 western lotting을통해서실험한결과,.5 mg/ml 농도의 HLB와 HLB-C 처리군에서대조군과 Sinetrol군에비해 C/EBPα, SREBP1의유전자가감소하는경향성을나타내었고 C/EBPα와 PPARγ의단백질발현이유의적으로감소하는것을확인하였다. 이미형성된지방세포의분해작용에 HLB와 HLB-C가영향을주는지평가하기위해완전히분화된지방세포에 24시간동안.5 mg/ml의농도로처리한결과 Sinetrol과 HLB는지방분해효과를나타내었으나 HLB-C는지방세포의분해작용에유의적인영향을주지않았다. 따라서이러한실험결과들은한라봉과피추출물이지방세포분화억제와지질분해활성이있고이는 ytolse 로효소처리를할경우에도비슷한결과를보였으며오히려지질분해활성은감소하였다. 한라봉과피추출물의 in vitro 상에서검증된항비만효능이향후에 in vivo 상에서지방분화억제와지방분해에미치는영향에대한추가검증이필요하다고사료된다. 또한향후한라봉뿐아니라다른감귤류를이용하여다양한 proiotis 미생물에존재하는효소와다른상업화효소등을통한물질전환효과를비교 연구하는것이필요하다고사료된다. 감사의글 본연구는 년에농림수산식품기술기획평가원공동연구사업과 214년명지대학교교책중점연구소지원사업에의해서수행한연구결과의일부이며이에감사드립니다. REFERENCES 1. Kopelmn PG. 2. Oesity s medil prolem. Nture 44: Ailhud G, Guesnet P, Cunnne SC. 28. An emerging risk ftor for oesity: does disequilirium of polyunsturted ftty id metolism ontriute to exessive dipose

7 1694 임희진 서지은 장윤희 한복경 정중기 박수범 최혁준 황진아 tissue development? Br J Nutr 1: Kershw EE, Flier JS. 24. Adipose tissue s n endorine orgn. J Clin Endorinol Met 89: Prk HS, Kim SH, Kim YS, Ryu SY, Hwng JT, Yng HJ, Kim GH, Kwon DY, Kim MS. 29. Luteolin inhiits dipogeni differentition y regulting PPARγ tivtion. Bioftors 35: Kim GS, Prk HJ, Woo JH, Kim MK, Koh PO, Min W, Ko YG, Kim CH, Won CK, Cho JH Citrus urntium flvonoids inhiit dipogenesis through the Akt signling pthwy in 3T3-L1 ells. BMC Complement Altern Med 12: Co Z, Umek RM, MKnight SL Regulted expression of three C/EBP isoforms during dipose onversion of 3T3-L1 ells. Genes Dev 5: Ejz S, Ejz A, Mtsud K, Lim CW. 26. Limonoids s ner hemopreventive gents. J Si Food Agri 86: Nihols LA, Jkson DE, Mnthey JA, Shukl SD, Hollnd LJ Citrus flvonoids repress the mrna for steroyl-coa desturse, key enzyme in lipid synthesis nd oesity ontrol, in rt primry heptoytes. Lipids Helth Dis 1: Peterson J, Dwyer J Flvonoids: dietry ourrene nd iohemil tivity. Nutr Res 18: Tripoli E, Gurdi ML, Gimmno S, Mjo DD, Gimmno M. 27. Citrus flvonoids: Moleulr struture, iologil tivity nd nutritionl properties: A review. Food Chem 14: Fuhr U, Kummert AL The fte of nringin in humns: A key to grpefruit juie-drug intertions? Clin Phrmol Ther 58: Sntmrí RI, Reyes-Durte MD, Bárzn E, Fernndo D, Gm FM, Mot M, López-Munguí A. 2. Seletive enzyme-medited extrtion of psiinoids nd rtenoids from hili gujillo puy (Cpsium nnum L.) using ethnol s solvent. J Agri Food Chem 48: Seo JY, Lee JH, Kim NW, Her E, Chng SH, Ko NY, Yoo YH, Kim JW, Seo DW, Hn JW, Kim YM, Choi WS. 25. Effet of fermented ginseng extrt, BST24, on the expression of ylooxygense-2 in murine mrophges. Int Immunophrmol 5: Yng G, Prk D, Lee J, Song BS, Jeon TH, Kng SJ, Jeon JH, Shin S, Jeong H, Lee H, Kim Y Suppressive effets of red ginseng preprtions on SW48 olon ner xenogrfts in mie. Food Si Biotehnol 2: Dlls C, Geri A, Ten G, Juhux F, Bernrd F. 28. Lipolyti effet of polyphenoli itrus dry extrt of red ornge, grpefruit, ornge (SINETROL) in humn ody ft dipoytes. Mehnism of tion y inhiition of AMPphosphodiesterse (PDE). Phytomediine 15: Knd K, Nihi K, Kdot A, Nishimoto S, Liu MC, Sughr T Noiletin suppresses dipoyte differentition of 3T3-L1 ells y n insulin nd IBMX mixture indution. Biohim Biophys At 182: Kng SI, Shin HS, Kim HM, Hong YS, Yoon SA, Kng SW, Kim JH, Kim MH, Ko HC, Kim SJ Immture Citrus sunki peel extrt exhiits nti-oesity effets y β- oxidtion nd lipolysis in high-ft diet-indued oese mie. Biol Phrm Bull 35: Lin FT, Lne MD CCAAT/enhner inding protein lph is suffiient to initite the 3T3-L1 dipoyte differentition progrm. Pro Ntl Ad Si U S A 91: Cowherd RM, Lyle RE, MGehee RE Jr Moleulr regultion of dipoyte differentition. Semin Cell Dev Biol 1: Prk J, Kim JB. 22. Moleulr insights into ft ell differentition nd funtionl roles of dipoytokines. Endorinol Met 17: Kim JB, Spiegelmn BM ADD1/SREBP1 promotes dipoyte differentition nd gene expression linked to ftty id metolism. Genes Dev 1: Rylm S, Dell-Fer MA, Bile CA. 28. Phytohemils nd regution of the dipoyte life yle. J Nutr Biohem 19: Liu L, Shn S, Zhng K, Ning ZQ, Lu XP, Cheng YY. 28. Nringenin nd hesperetin, two flvonoids derived from Citrus urntium up-regulte trsription of diponetin. Phytother Res 22: Akune T, Oh S, Kmekur S, Ymguhi M, Chung UI, Kuot N, Teruhi Y, Hrd Y, Azum Y, Nkmur K, Kdowki T, Kwguhi H. 24. PPARγ insuffiieny enhnes osteogenesis through osteolst formtion from one mrrow progenitors. J Clin Invest 113: Zehner R, Kieneserger PC, Hemmerle G, Zimmermnn R, Lss A. 29. Adipose triglyeride lipse nd the lipolyti tolism of ellulr ft stores. J Lipid Res 5: Hzz S, Fontine KR, Cutter G, Limdi N, Perumen-Chney S, Allison DB. 26. Citrus urntium nd synephrine lkloids in the tretment of overweight nd oesity: n updte. Oes Rev 7: Merder J, Wneq E, Chen J, Crpéné C Isopropylnorsynephrine is stronger lipolyti gent in humn dipoytes thn synephrine nd other mines present in Citrus urntium. J Physiol Biohem 67:

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α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를