534 PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT, KCDC 당뇨병성신증연구를위한동물모델 Animal Models of Diabetic Nephropathy 질병관리본부국립보건연구원생명의과학센터대사영양질환과이대연, 김지연, 이유정, 김원호 Ⅰ. 들어가는말 당뇨병은말기신부전증의가장주요한원인으로꼽힌다. 2011 년을기준으로미국의전체말기신부전증환자중당뇨병으로기인된비율이 50% 를넘었고, 우리나라도 47.1% 에이르는것으로나타났으며이러한비율은지속적인증가세를보이고있다 [1,2]. 하지만이러한증가세에도불구하고제1형과제2형당뇨병환자전체중 20-40% 에서만당뇨병성신증이발병하는것으로보아이질환의발생과진행에유전적인혹은환경적인요인이분명히작용하고있는것으로생각할수있다. 따라서이질환의예방과치료를위하여발생원인인자또는예측인자와이들의조절기전을규명하는것이무엇보다중요하다. 현재까지당뇨병성신증의발생과진행에대한많은연구가이루어져이해의폭이넓혀져온것은사실이나아직도뚜렷한원인인자와예측인자및조절기전을규명하는데있어그성과에한계가있어왔다. 그이유중의하나가바로사람에게발생하는당뇨병성신증을동일하게재현할수 Ⅱ. 몸말 최근 30여년동안신장질환연구에이용된동물의수를종별로살펴보면마우스 (mouse) 가랫트 (rat) 나토끼에비해지속적으로증가하고있음을알수있다 (Figure 1)[3]. 이는마우스가상대적으로소동물이기때문에경제적인면이나사육시설의면적측면에서장점이있기때문이기도하지만이기간동안특정유전자를삽입하거나제거하는기술이마우스에서일반화된것도주요한원인일것으로생각된다. 실제로 AMDCC 에서개발되어특성분석이완료되었거나개발되는동물모델의종도전부마우스임을알수있다. 하지만랫트의경우마우스에비해스트렙토조토신 (Streptozotocin, STZ) 에의한당뇨병유발이더잘일어나고상대적으로수술이용이하다는점, 반복적인분석에필요한 RNA나단백질등시료를충분히확보할수있다는점등이마우스와비교할때장점으로꼽혀당뇨병성신증연구에여전히많이이용되고있는종이다. 있는신뢰할만한동물모델이거의없다는것이다. 이러한 문제점을극복하기위하여 2001 년미국 NIH 에서는당뇨병합병증 동물모델컨소시움 (Animal Model of Diabetic Complications Consortium, AMDCC) 을구성하여당뇨병합병증동물모델을개발하고그특성을분석하여데이터베이스화하는작업을해오고있다. 이러한노력들을통하여사람에게발생하는당뇨병성신증의특성과보다유사한동물모델이개발되고있으며향후이러한동물모델은당뇨병성신장질환의원인과예측인자규명을통한예방과치료법개발에크게기여할수있을것으로기대된다. 본글에서는현재당뇨병성신증연구에많이이용되고있거나유용하게이용될수있는동물들에대한연구동향과각동물모델별장점과단점을비롯한특징을간략히소개하고자한다. No.of publications 12000 Mouse Rat 10000 Rabbit 8000 6000 4000 2000 0 1980 1984 1988 1992 1986 2000 2004 2008-83 -87-91 -95-99 -03-07 -11 Year Figure 1. Estimated animal use in kidney research, by species [3].
주간건강과질병 PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT, KCDC 535 당뇨병의유발실험동물에당뇨병을유발하는방법중가장일반적인방법은스트렙토조토신 (STZ) 을처리하는것이다. STZ를투여한동물은인슐린을분비하는췌장의베타세포가파괴됨으로써당뇨병이발생하는모델로사람에서의제1형당뇨병과유사한증상을보이는것으로잘알려져있다. STZ는그투여량에따라비특이적인부작용이나타날수있고강한독성으로인하여개체의사망까지유발할수있다. 이러한문제들을최소화하기위해서상대적으로저용량을투여하거나다양한유전적인접근법을적용한모델들을함께이용하고있다. 이러한동물에는인슐린유전자에돌연변이가생긴 Akita 마우스나칼슘결합단백질인칼모듈린 (calmodulin) 을과발현하는형질전환마우스 OVE26 등이있다. 이동물들은인슐린의분비를막거나기능을손상시키는것으로제1형당뇨병에해당한다고할수있다. 반면제2형당뇨병모델은 db/db 1) 나 ob/ob 2) 마우스가주로이용된다. db/db 마우스는식이와에너지항상성에중요한역할을하는호르몬인렙틴의수용체를생산하는유전자에돌연변이가있는계통이고, ob/ob 마우스는렙틴자체유전자에돌연변이가있는계통으로렙틴신호전달에문제가생겨비만과당뇨병이발생한다. 따라서이두계통은비만과당뇨병을포함한다양한대사질환연구에많이이용되고있다 [4]. 그러나이두동물모델은그자체로는신장질환증상이약하게일어나기때문에추가적으로유전자를조작한동물모델들이개발되고있는데, 이를포함하여각각의동물들에대한장단점및특징은뒤에상세히기술하고자한다. 당뇨병성신장질환동물모델의평가기준앞서언급한동물들을포함한당뇨병성신증동물모델들은거의다고혈당과함께신장의기능과형태학적인이상소견을보이는데, 기능이상으로는단백뇨를, 형태학적이상으로는사구체기저막의비후화화사구체간질 (mesangium) 의확장을들수있다. 그러나이러한특징들은사람의당뇨병성신증의초기와는유사하지만, 신장질환이잘발생하지않는설치류의특성상기능적으로사구체여과율의감소와형태학적으로결절성사구체경화증같은진행된당뇨병성신증 (advanced diabetic nephropathy) 으로까지진행하는경우는드물다. AMDCC 에서는이러한문제를해결하고자동물의증상을평가할수있는기준과표준화된실험법을제시하고있다. 우선사구체여과율, 알부민뇨그리고사구체간질의조직학적인병변을기준으로평가하되질환이더진행된상태를추가적인조직학적형태를관찰하여평가한다 (Table 1)[5]. 그러나현재로서는이기준들을모두만족하는동물은없어아직은이를당뇨병성신증모델의필요조건이라기보다는최종목표로보는것이타당하다고생각된다. 당뇨병성신장질환동물모델 STZ 단독투여모델은제 1형당뇨병모델로가장많이이용되는것은 STZ를투여한마우스또는랫트이다. 이동물에서는글루코스와구조가유사한 STZ가췌장베타세포의사멸을유도하고인슐린분비가이루어지지않아제1형당뇨병과유사한증상을보인다. 이와함께당뇨병성신증의조직학적소견도볼수가있는데 Sprague Dawley 랫트의경우 STZ를단일 Table 1. Validation criteria (AMDCC)[5] 1. Criteria for validating a progressive mouse model of diabetic nephropathy Greater than 50% decline in GFR over the lifetime of the animal Greater than 10-fold increase in albuminuria compared with controls for that strain at the same age and gender Pathology of kidneys advanced mesangial matrix expansion ±nodular sclerosis and mesangiolysis any degree of arteriolar hyalinosis glomerular basement membrane thickening by >50% over baseline tubulointerstitial fibrosis 2. Additional histologic phenotype for diabetic nephropathy models with advanced disease Quantification of mesangial matrix expression, ideally with morphometric analyses, and with mesangiolysis and microaneurysms detected with appropriate tissue stains Exclusion of immune complex disease with immunohistochemistry on frozen sections for IgG, IgM, and IgA Demonstration of glomerular basement membrane thickening by electromicroscopy Demonstration of podocyte loss by a reasonable morphometric system Abbreviation: GFR= Glomerula Filtration Rate 1) db : diabetes ( 당뇨병 ) 2) ob : obesity ( 비만 )
536 PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT, KCDC 적절하지않다. 여기서한가지주의할점은 db/db 마우스의유전적인바탕이되는계통 (background genetic strain) 이무엇이냐에따라서신장의병변정도가다르게나타난다는것인데예를들어 DBA/2 계통과교잡종인 C57BL/6 KS의경우에 C57BL/6 계통에비해신장손상이더잘일어나는것으로알려져있다. ob/ob 마우스는렙틴유전자에돌연변이가생겨비만과제2형당뇨병이발생하는동물모델이다. 신장의구조와기능손상이약하게일어나는것으로보고되었으나 db/db 마우스와같은이유로현재신장질환연구에서는추가적인유전자조작없이그자체로는잘사용되지않는종이다. Figure 2. Morphological changes of glomerulus in STZ-injected rat (Periodic acid-schiff stain). Yellow arrow indicates mesangial expansion. 투여하고 8 주가지나면사구체간질의확장등의형태학적이상을 관찰할수있다 (Figure 2). STZ 에대한반응은마우스보다는랫트에서보다잘나타나는 것으로알려져있어두종간의투여량과투여기간에차이가 있으며, 개체간반응의차이가좀심한편이어서많은연구자들이 약물투여후혈당이충분히오르지않는개체는실험군에서 제외하여야한다. 이러한단점에도불구하고질환유발시간이나 경제적측면에서가장효용성이높아현재까지당뇨병성신증 모델로서가장많이사용되고있다. db/db 마우스는렙틴수용체에돌연변이가생겨지방세포에서 분비하는호르몬인렙틴의신호전달이일어나지않아비만과 제 2 형당뇨병이발생하는동물모델이다. 이동물에서신장의 기능이중점적으로연구되었는데인간의당뇨병성신장질환 초기 ( 제 1 기 - 제 3 기 ) 와유사한특성을보인다 [6]. 이동물이보이는당뇨병성신장질환의주요증상은알부민뇨, 사구체낭족세포의사멸, 사구체간질의확장등이다. 이중 사구체간질의확장은상대적으로느리게나타나는데보통반년 이상이되어야완전하게볼수있다. 또한일반적으로사구체간질의 용해 (mesangiolysis) 또는결절성사구체경화증으로진행되지 않는다. 따라서이모델은신증발생기간이오래소요되어경제적 효용성측면에서도적합하지않으며그증상의정도도심하지 않아사람의당뇨병성신장질환의초기변화를연구하는데에는 훌륭한모델이될수있으나진행된말기신부전모델로는 OVE26 마우스는이동물은췌장베타세포에서칼슘결합단백질인칼모듈린을과발현시키도록유전자를조작한마우스이다. 그결과칼슘이제역할을하지못해서인슐린분비가이루어지지않아제1형당뇨병이발생한다. OVE26 마우스는당뇨병으로인해세뇨간질섬유화가조기에유도되는계통인 FVB 마우스를유전적바탕으로개발되었는데이때문에알부민뇨, 사구체간질의기질이매우높은수준으로증가하고사구체염이폭넓게나타나며족세포수의감소와약한정도의세뇨간질섬유화를볼수있다. 또한진행된당뇨병성신증에서관찰되는결절성사구체경화병변이나타난다. 따라서진행된형태의말기신부전모델로 db/db 에비해서적합하다. 그러나이러한병변은 C57BL/6 또는 DBA/2 계통에서는동일한유전자조작을하더라도약하게나타난다는단점이있다 [7]. Akita 마우스는인슐린유전자 (Ins2) 에돌연변이가생겨서인슐린의정상적인 3차구조형성이이루어지지않고따라서췌장베타세포로부터인슐린이분비되지않아결국제1 형당뇨병이생기는모델이다. C57BL/6 계통에서만들어진 Akita 마우스의경우보통수준의알부민뇨와사구체간질기질증가, 기저막비후화가나타나는것으로알려져있다. 또한당뇨병성신증초기에족세포의사멸이현저하게나타난다 [7]. 이동물모델또한어떠한계통을바탕으로개발되느냐에따라그특성이약간씩차이를보인다. 예를들어 C57B/6, DBA/2 그리고 129/SvEv 계통을바탕으로이유전자조작을할경우혈당수치는계통간에서로유사한수준이지만 DBA/2 마우스는다른두계통보다알부민뇨수치가더높고, 다른두계통은사구체간질기질의증가가더심하다. 그러나현재까지진행된사람의신부전증의구조적인특징인사구체간질의용해또는
주간건강과질병 PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT, KCDC 537 Table 2. Summary of commonly studied mouse models [4]. Mouse model Advantages Disadvantages STZ-wildtype db/db Inexpensive, Easy to breed, Suitable for rapid wildtype throughput studies Widely used, Predictable elevation in albuminuria and mesangial expansion Magnitude of renal injury is strain dependent, Mild/modest renal injury under most circumstances, Off-target effects of STZ, STZ is a biohazard Autosomal recessive trait, Homozygotes are infertile, Albuminuria may not be progressive Akita Autosomal dominant trait, Avoids off-target effects of STZ Modest renal injury on a C57BL/6 background enos 마우스의또다른모델은 C57BL/6 계통을유전적바탕으로가진 enos-/- 에 STZ를투여하여제1형당뇨병을유발한것이다. 원래 C57BL/6 계통이당뇨병성신장질환이잘일어나지않는특성을지녔음에도불구하고이종에서 enos를제거하면고혈압, 알부민뇨, 사구체간질기질의증가, 사구체간질의용해, 사구체간질내결절형성과같은진행된당뇨병성신증소견을보이는것으로보고되었다. 따라서 enos- /-/db/db 와마찬가지로진행된당뇨병성신증의기전을연구하는데중요한모델이될수있다. 그러나투여하는 STZ의용량에따라변이가크다는단점이있고고용량으로투여할경우치사율이높고저용량을투여하였을때는신장병변이약하게나타난다는보고가있었다 [7]. enos 결핍마우스는이외에도여러단점이존재하지만현재까지당뇨병성신증동물모델로가장최적의모델로꼽히고있다. BTBR 3) ob/ob 마우스는췌장베타세포의증식과혈중인슐린농도가증가함과동시에혈당수치가 350-400mg/dl 수준을나타내는인슐린저항성을보인다. 신장조직은 8주령까지초기에족세포가소실되고, 10주가되면사구체간질의확장이일어나며, 18주까지는서서히단백뇨의증가를보이는, 사람의당뇨병성신증의초기증상을보인다. 시간이더경과하면단백뇨가현저하게증가하고, 사구체간질의확장심화, 사구체간질용해, 지속적인족세포소실, 기저막비후등의소견을보이고보통정도의세뇨간질의섬유화등진행된당뇨병성신증의증상을관찰할수있다 [7]. STZ-eNOS-/- db/db-enos-/- OVE26 BTBR ob/ob Rapid onset heavy albuminuria, enos-/- commercially available Heavy albuminuria, hypertension, GFR decline, nodular glomerulosclerosis and sensitivity to renin angiotensin system blockade Heavy albuminuria, hypertension, GFR decline, nodular glomerulosclerosis and tubulointerstitial fibrosis have been described, Available on the more sensitive FVB background Progressive nephropathy development over approximately 18weeks, Reversible renal injury with leptin replacement Progressive histopathological changes may not be robust and may be dependent on the STZ protocol Double knock-out mice are difficult to breed, Small litter size, Difficulty in generation may impede their utility for the evaluation of novel therapies May be difficult to breed and maintain, Requirement for FVB background for phenotype impedes breeding of OVE26 mice with knockout mice on other backgrounds Infertile, Difficulty in breeding impedes use for interventional studies 결절성사구체경화증을보이는 Akita 마우스는보고된바없다. 이모델을이용할때한가지유의해야할사항은사구체내 IgA의침착을보인다는것인데이는사람의신장질환에서사구체병변의주요원인이기때문인데이것이당뇨병이원인인지사구체간질에서의이상면역반응인지구분하기어려워결과해석에문제를야기할수있다는것이다. enos 결핍마우스의산화질소 (Nitric Oxide, NO) 는혈관저항 (vascular tone) 을조절하는데중요한물질이며혈관내에 NO가부족할경우혈압의상승과함께여러가지혈관질환을유발하는것으로알려져있다. 따라서당뇨병으로인한미세혈관질환의하나인당뇨병성신증또한이 NO의결핍과관련이있는데이 NO를혈관에서생성하는효소가바로내피세포산화질소합성효소 (Endothelial NO synthase, enos) 이다. 당뇨병성신증동물모델개발의주요발전중의하나가 db/db 마우스에이 enos 유전자를제거하여사람의신장질환과보다유사한동물모델을만든것이다. enos-/-/db/db 마우스는제2 형당뇨병, 비만뿐만아니라고혈압, 알부민뇨, 사구체간질의확장, 사구체간질용해의소견을보인다 [7]. 이러한특징들때문에이모델은진행된당뇨병성신증의특징으로발전하는얼마안되는모델중하나이고이질환의진행을연구하는데매우유용한도구로잠재적인유용성을갖고있다. 그러나이모델은두가지유전자를동시에제거 (double knock-out) 하기때문에한배새끼의마리수가적고키우기가매우어렵다는단점이있다. 3) Black and Tan Brachyuric, 검은색과갈색이혼합된털색과짧은꼬리를갖는것이특징인계통
538 PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT, KCDC 이동물모델의가장큰장점은진행된당뇨병성신증으로, 상대적으로빨리진행되어이질환의병변을완화시킬수있는방법을실험하는데용이하다는것이다. 또한이동물모델만의특징은렙틴투여에의한당뇨병성신증의치료연구에적합하다는것인데렙틴수용체가결여된동물과달리렙틴이결여된동물에서렙틴을외부로부터투여하였을때신장질환이가역적으로치료되는기전을연구하는데매우유용하다. 당뇨병성신장질환랫트모델일반적으로랫트는마우스에비해 STZ에의한당뇨병효과가더잘나타나는것으로알려져있고몇몇제2형당뇨병이있는랫트모델은신장손상도보이고있다. Zucker Diabetic Fatty (ZDF) 랫트는렙틴수용체유전자에돌연변이를갖고있고고혈당소견을보인다. 이동물은 22주령이될때까지점진적으로알부민뇨가나타나며사구체염과함께사구체여과율이감소하는것으로알려져있다. Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) 랫트와 Goto Kakizaki (GK) 랫트는제2형당뇨병모델동물로알부민뇨, 사구체염, 세뇨관간질섬유화가보고되었다. 그러나질환이발병하기까지의시간이상대적으로길어 (1년이상 ) 실질적으로연구에응용하기어려운점이있다. Ⅲ. 맺는말 당뇨병성신증극복을위한연구전략을수립하는데있어지금까지개발된동물모델의특성을보다잘이해하고연구목적에최대한부합하는동물을선정하는것은매우중요한일이라생각된다. 따라서본글에서는현재당뇨병성신증연구에많이이용되는설치류동물모델과각각에대한특징, 장단점을살펴보았다 (Table 2). 당뇨병을유발시킨설치류는대부분사람의당뇨병성신증을어느정도는재현할수있다. 그러나재현의범위가사람의당뇨병성신증의증상중에초기에한정될수밖에없으며아직까지초기와말기모두를재현할수있는모델은많지않다. 현재로서는 enos-/-, OVE26 FVB, BTBR ob/ob 마우스정도가진행된당뇨병성신증과유사한특징을보이는가장최적의모델로여겨지고있다 [8]. 근본적인종의특성상사람의 신장질환에서관찰되는병변을모두재현해내는것은분명히쉽지않은일이라생각된다. 특히말기신부전으로이어지는신부전증의진행에있어서는더욱그렇다. 그러나향후다양한종간교배와유전자조작기술을이용한새로운동물모델의개발은결국사람의당뇨병성신증과가장유사한동물을만드는데기여할것이다. 또한당뇨병환자를대상으로신장질환의발병유무로그룹을나누어유전체, 단백체, 대사체등을분석하여발굴된지표를역으로동물모델개발에적용함으로써당뇨병성신증발생의예방및치료기술개발연구에보다유용한동물모델을생산할수도있을것으로기대된다. Ⅳ. 참고문헌 1. US Renal Data System. USR. 2013. 2013 Annual Data Report: Atlas of chronic kidney disase in the United States, National Institute of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Disease. 2. 만성신부전등록사업위원회, 대한신장학회. Current renal renal replacement therapy in Korea. 대한신장학회. http://www.ksn.or.kr 3. Gavin J. Becker and Tim D.Hewitson. 2013. Animal models of chronic kidney diseas: useful but not perfect. Nephrol Dial Transplant. 28:2432-2438. 4. Tamadher Alghamdi and Andrew Advani. Animal and cell culture models in diabetic nephropathy. Diapedia. http://www.diapedia.org 5. Animal models of diabetic complications consortium. 2009. Mouse models of diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 20:2503-2512 6. Maria Jose Soler, Marta Riera and Daniel Batlle. 2012. New experimental models of diabetic nephropathy in mice models type 2 diabetes: Efforts to replicate human nephropathy. Experimental Diabetes Research. 616-313 7. Charles E.Alpers and Kelly L. Hudkins. 2011. Mouse models of diabetic nephropathy. Curr Opin Nephrol Hypertens. 20(3):278-284. 8. Schlondorff D. 2010. Choosing the right mouse model for diabetic nephropathy. Kidney Int. 77:749-750