The Korean Journal of Pathology 2010; 44: 259-66 DOI: 10.4132/KoreanJPathol.2010.44.3.259 만성육아종성염증의파라핀포매조직에서다양한항산균검출법의비교 이현승 이형남 임소영 이연수이교영 최영진 가톨릭대학교의과대학병원병리학교실 Comparison of Various Detection Methods of Mycobacterium Species in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue with Chronic Granulomatous Inflammation Hyun Seung Lee Hyoungnam Lee Soyoung Im Yun Su Lee Kyo Young Lee Yeong Jin Choi Department of Hospital Pathology, The Catholic University of Korea College of Medicine, Seoul, Korea 접수 : 2009년 10월 19일게재승인 : 2009년 11월 30일 책임저자 : 최영진우 137-701 서울시서초구반포동 505 가톨릭대학교서울성모병원병리과전화 : 02-2258-1616 Fax: 02-2258-1628 E-mail: mdyjchoi@catholic.ac.kr Background : To determine the most effective method for detecting mycobacteria in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue, we compared the results of Ziehl-Neelsen stain (ZNS) and mycobacterial culture with those of polymerase chain reaction () and real-time quantitative (RQ-). Methods : We analyzed 54 cases diagnosed as chronic granulomatous inflammation. In all cases, ZNS and nested using three different primers, IS6110, Mpb64 and were done. RQ- with the primer was done in 51 cases. Results : Mycobacteria were identified by ZNS in 15/54 (27.8%) cases. RQ- had the highest sensitivity (80.0%) compared to with IS6110 (73.3%), Mpb64 (60.0%) and (73.3%). Specificity was higher in all experiments (79.5-82.1%) than in RQ- (69.4%) experiments. The false negative rate was lowest for RQ- (20.0%) than for with IS6110 (26.7%), Mpb64 (40.0%) and (26.7%). The false positive rate was highest for RQ- (30.6%) compared to with IS6110 (20.5%), Mpb64 (17.9%) and (20.5%). Conclusions : RQ- had the highest sensitivity, and the lowest false negative rate, but it also had a higher false positive rate than for detection of mycobacteria in FFPE tissues. Key Words : Polymerase chain reaction; Stain; Mycobacterium; Granulomatous disease, chronic 항산균감염 (mycobacterial infection) 은결핵성 (Mycobacterium tuberculosis, MTB) 과비결핵성 (non-tuberculous mycobacterium, NTM) 감염으로나뉜다. 결핵은만성육아종성염증을일으키는대표적질환으로국내유병률이높아최근대한결핵협회에서보고한 2008년통계에의하면국내결핵신환자율은 100,000명당 70.3명에달하고있다. 또한최근들어다양한면역억제제의사용및 human immunodeficiency virus (HIV) 감염등에의하여비결핵성감염도증가하고있다. 1-3 병리조직에서만성육아종성염증의소견을보이는경우, 항산균을포함한다양한원인균을감별하는것이필요하므로흔히사용되는파라핀포매조직에서항산균을검출하고확인하는것은환자의치료에있어매우중요한요소라할수있다. 현재포르말린고정파라핀포매병리조직에서항산균을검출하기위한방법으로는 Ziehl-Neelsen염색, 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, ) 및실시간중합효소연쇄반응 (real-time quantitative, RQ-) 이주로이용되고있다. Ziehl-Neelsen염색은병리조직에서항산균감염여부를확진하는방법으로값이싸고간편한방법이지만, 균을확인하기위해서는많은시간과노력을들여야한다. 4,5 병리진단에주로사용되는파라핀포매조직에서의 또는 RQ-의유용성에대해서는다양한보고가있으나, 연구자에따라문제점도제기되고있다. 5,6 방법은항산균 DNA의특정부위를증폭한후측정하므로빠른시간안에항산균을검출할수있다는장점이있고, 일반적으로민감도및특이도가높다고알려져있는데, 이는각각 83.5-100%, 70-99% 로다양하게보고되고있다. 5,7-11 또한 RQ-은실시간으로항산균 DNA의증폭을측정하며, 특정표지자를사용하므로기존 법에비해높은특이도와민감도를보인다고보고되고있다. 12-16 259
260 이현승 이형남 임소영외 3 인 항산균에대한 primer로는 IS6110, Mpb64 및 Rpob 부위가주로사용되고있는데, IS6110과 Mpb64 부위가결핵균에만존재하는반면, Rpob 부위는모든항산균에존재하므로이를통해서비결핵성항산균도확인할수있다. 이중 IS6110 유전자부위는 MTB complex에속하는대부분의균주 (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis bacillus Calmotte-Guerin, M. africanum, M. microti) 에존재하며결핵균을진단할수있는유용한표적유전자로, 4,6 2마리의결핵균 (10 fg) 만있으면양성띠가나타날수있다고하였다. 17-19 또한 Mpb64 유전자부위는 MTB complex 중 M. tuberculosis와 M. bovis에서관찰되며, IS6110보다높은감수성을가진다고보고되고있다. 20 본연구는항산균에의한만성육아종성염증을확진하기위한최적의방법을알아보기위하여만성육아종성염증으로진단된파라핀포매조직에서 Ziehl-Neelsen 염색을시행하고결핵균배양유무를확인하였으며, 항산균검출을위해 MTB- (IS6 110, Mpb64), MTB/NTM () 및 MTB/ NTM RQ- () 을시행하여결과를비교분석하였다. 재료및방법재료 2005년 3월부터 2008년 3월까지가톨릭대학교강남성모병원에서병리조직검사상만성육아종성염증으로진단된 54예를선별하였다. 증례의연령은 10대에서 80대까지다양하게분포되어있었고, 부위는두경부 (7예), 기관지점막 (4예), 폐 (3예), 림프절 (10예), 흉막 (4예), 대장 (9예), 연부조직 (10예), 기타 (7예) 등이었다. 방법 Ziehl-Neelsen 염색에의한항산균확인및결핵균배양결과확인 54증례모두에서 Ziehl-Neelsen 염색을시행하여광학현미경상배율 ( 1,000) 로항산균의유무를확인하였다. 또한모든환자에게서검사기록을확인하여결핵균배양유무를확인하였으며, 총 24증례에서결핵균배양이시행되었다. 파라핀포매조직에서 DNA 추출및농도측정크기가 1.0 1.0 cm 이상의포르말린고정파라핀포매조직에서는 5장이상, 크기가작은경우는 10장이상을 5-10 mm로분절한뒤사용하였다. DNA추출은 QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) 를사용하였고, DNA 농도는 Nano drop을이용하여측정한후사용하였다. 이때조직에서추출한 DNA 농도는증례에따라차이가있었는데, DNA 총량 은약 2-5 mg이었고, 에사용된최종 DNA의양은 100 ng이었다. 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction) 추출한조직 DNA 의적절성여부를확인하기위해 GAPDH에대한 을병행하여실시하였다. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자 primer의염기서열 (5 3 ) 은 forward TTGGTCGTATTGGGCGCCT와 reverse TTC- CATTGATGACAAGCTTC였고, 은 95 에서 3분간변성시킨후, 94 에서 30초, 55 에서 30초, 72 에서 30초주기로 35회시행하고 72 에서 7분연장하였다. 이때증폭산물의크기는 272 bp였다. IS6110 primer를이용한 MTB IS6110 primer를이용한 은 Biocore 키트 (Seoul, Korea) 를사용하였으며, 프로토콜에따라 nested 을시행하였다. 즉첫번째 혼합액 15 ml당추출한 DNA 100 ng을혼합한후 95 에서 5분간변성시키고, 94 에서 45초, 68 에서 45 초, 72 에서 45초주기로 35회시행하였으며, 72 에서 5분간연장하였다. 또 결과는 2% agarose gel에서전기영동을하여그양성여부를확인하였다. 이때일차 산물은 256 염기쌍에서, 이차 산물은 181 염기쌍에서증폭이확인되었다. Mpb64 primer를이용한 MTB Mpb64 primer를이용한 은 Biocore 키트를사용하였으며, 프로토콜에따라추출한 DNA 100 ng을넣고 혼합액을총 20 ml로혼합한후 one tube nested 을시행하였다. 그리고 95 에서 5분간변성시킨후, 94 에서 40초, 66 에서 40초, 72 에서 40초주기로 15회시행하고, 다시전 cycle을 35회반복한뒤 72 에서 5분연장하였다. 결과는 2% agarose gel 에서전기영동하여양성여부를확인하였다. 이때 MTB 산물은 170 염기쌍에서증폭이확인되었다. 또한 수행여부의적절성을확인하기위해 human HLA-DRB clone plasmid 및 HLA-DRB primer를 internal control로사용하였는데, 산물은 276 염기쌍에서확인되었다. primer를이용한 MTB primer를이용한 은 Biocore 키트를사용하였으며, 프로토콜에따라 nested 을시행하였다. 즉첫번째 혼합액 15 ml당추출한 DNA 100 ng을혼합한후, 95 에서 5분간변성시키고 94 에서 45초, 68 에서 45초, 72 에서 30초주기로 35회시행한다음 72 에서 5분간연장하였다. 결과는 2% agarose gel에서전기영동을하여양성여부를확인하였는데, MTB 양성인경우는 235 염기쌍및 158 염기쌍모두에서증폭되거나, 158 염기쌍에서증폭이확인되었다. 그리고 NTM 에의한감염인경우는 235 염기쌍에서증폭이관찰되었다.
만성육아종성염증의파라핀포매조직에서다양한항산균검출법의비교 261 실시간중합효소연쇄반응 (real-time quantitative polymerase chain reaction) AdvanSure TB/NTM real time 키트 (LG Life Science, Seoul, Korea) 를이용하였으며, 13,000 rpm에서 3분간원심분리하여분리된상층액 5.0 ml를 에사용하였다. 그리고 2 mixture가 10 ml씩분주되어있는 200 ml 튜브를시료의수만큼준비한뒤, primer 5 ml를각각의 튜브에첨가하고추출한 DNA 100 ng을첨가하였다. 그리고이를원심분리한후 vortex하여섞은뒤, 50 에서 2분, 95 에서 10분간변성시키고 95 에서 10초, 62 에서 40초주기로 35회시행하였다. 반응의결과분석은 3개의 channel을이용하여각각의 channel에서 FAM (MTB), Hex (NTM), Cy5 (internal control) 등 3개파장의 signal 형성을확인하고그반응의유효성과양성, 음성을분석하였다. 이때 Ct 값은 internal control의경우 26-28 사이를나타냈으며, 35 미만을양성으로하였다. 각 signal 중 NTM Ct 값이 MTB Ct 값보다클경우는 MTB만존재하는것으로보고, 작은경우는 MTB와 NTM의중복감염으로해석하였다. 결과모든증례에대한 Ziehl-Neelsen염색, 및 RQ- 검사와결핵균배양결과를 Table 1에기술하였다. 결핵균배양이실시된 24예중배양양성인경우는 15예였는데, 이중 Ziehl- Neelsen 염색에양성인경우는 7예로염색의민감도는 46.6% 였다. 또결핵균배양검사상음성인경우는 9예였는데, 이중 Ziehl- Neelsen 염색에양성인증례가 3예, 음성인증례가 6예로염색의특이도는 66.6% 였다. 결핵균배양결과에따른 Ziehl-Neelsen 염색, 및 RQ- 검사의민감도및특이도비교는 Table 2에정리하였다. 본연구에사용된 54개의증례중 15예 (27.8%) 가 Ziehl- Neelsen 염색에서양성이었고 (Fig. 1), 나머지 39예 (72.2%) 는음성이었다. 또한 IS6110과 Mpb64 및 primer로 을실시한결과 (Fig. 2), 전체 54증례중 19예 (35.2%), 16 예 (29.6%), 19예 (35.2%) 에서각각양성이었고, 35예 (64.8%), 38 예 (70.4%), 35예 (64.8%) 에서음성을나타냈다. 그리고 IS6110/ Rpob에대한 결과가양성인 19예중 2예에서 NTM이확인되었다 (Table 3). 한편 RQ-은 DNA가불충분한 3예를제외하고 51예에서만시행되었는데 (Fig. 3), 이중 23예 (45.1%) 에서양성이었고 28 예 (54.9%) 에서음성이었다 (Table 4). 에대한 RQ- 에서양성인 23예중 1예에서 NTM이양성 (Ct 값, 28.45) 으로확인되었는데, 이는 에서는음성이었다. Table 1. Results for Ziehl-Neelsen stain, MTB (IS6110 and Mpb64), MTB/NTM (), MTB/NTM RQ- () and culture of mycobacteria Ziehl- Neelsen stain IS6110 Mbp64 Real-time RQ- Culture of Mycobacterium Positive + + MTB+ MTB+ Not done + + MTB+ MTB+ Not done + + MTM+ MTB+ Not done + + MTB+ MTB+ Not done + + MTM+ - Not done + + MTB+ - Not done + + MTB+ - - + + MTB+ - - + + MTB+ - - + + MTB+ - - Negative + - MTB+ MTB+ - + - MTB+ MTB+ Not done - - - MTB+ Not done - - - - + - - - - + - - - - - - - - MTB+ Not done - - - MTB+ - - - - MTB+ Not done - - MTB+ - Not done - - - - + - - - Not done Not done - - - Not done Not done - - - MTB+ - - - - - - - - - Not done Not done RQ-, real-time quantitative polymerase chain reaction.
262 이현승 이형남 임소영외 3 인 Table 2. Comparative analysis of Ziehl-Neelsen stain, MTB/NTM and RQ- according to the results of mycobacterial culture in conjunction with previously reported cases Case No. Our cases Culture positive Culture negative Sensitivity (%) Specificity (%) 24 15 9 Ziehl-Neelsen stain Positive 10 7 3 46.6 66.6 Negative 14 8 6 IS6110 Positive 13 7 6 46.6 33.3 Negative 11 8 3 Mbp64 Positive 11 6 5 40.0 44.4 Negative 13 9 4 IS6110/RRpob Positive 12 6 6 40.0 33.3 Negative 12 9 3 IS6110/RRpob RQ- Positive 16 12 4 80.0 55.5 Negative 8 3 5 Reported cases (Park et al. 21 ) 152 71 81 Ziehl-Neelsen stain Positive 46 41 5 57.7 93.8 Negative 106 30 76 IS6110 Positive 61 60 1 84.5 98.8 Negative 91 11 80 Reported cases (Selva et al. 22 ) 49 45 4 Ziehl-Neelsen stain Positive 25 25 0 55.6 100 Negative 24 20 4 IS6110 Positive 45 41 4 91.9 100 Negative 4 4 0 RQ-, real-time quantitative polymerase chain reaction. M 1 4 6 7 8 9 11 13 15 18 P N IS6110 300 bp 200 bp 100 bp 158 bp (IS6110) Mpb64 300 bp 200 bp 100 bp (internal control) 276 bp 170 bp (Mpb64) IS6100/ Rpob 300 bp 200 bp 100 bp 235 bp (Rpob) 158 bp (IS6110) 1 4 6 7 8 9 11 13 15 18 N P M GAPDH 272 bp 300 bp 200 bp 100 bp Fig. 1. Ziehl-Neelsen stain reveals several red-colored acid-fast bacilli (arrows) in a paraffin embedded tissue section diagnosed as a mycobacterial infection with chronic granulomatous inflammation in subcutis from the neck. MTB- 과 RQ- 과의민감도및특이도비교 Ziehl-Neelsen 염색상양성인 15증례중에서 IS6110과 Mpb64 및 의 결과는각각 11예 (73.3%), 9예 (60.0 %), 11예 (73.3%) 에서양성을보였다. 또한 RQ- 은 15증례중 12예 (80.0%) 에서양성을보였다. 이때민감도는각각 73.3%, 60.0%, 73.3%, 80.0% 로 RQ-이가장 Fig. 2. Results for 2% agarose gel electrophoresis for MTB/NTM and GAPDH. The pictures show discrepancies in two cases (samples 4 and 7) by the difference of primers, IS6110, Mpb64 and., polymerase chain reaction. 높았다. 한편 Ziehl-Neelsen 염색상음성인 39증례중 IS6110과 Mpb64 및 결과는각각 31예 (79.5%), 32 예 (82.1%), 31예 (79.5%) 에서음성이었다. 또한 RQ-은 36 증례중 25예 (69.4%) 에서음성이었으며, 특이도는각각 79.5%, 82.1%, 79.5%, 69.4% 로모든 이 RQ-보다높았다 (Fig. 4).
만성육아종성염증의파라핀포매조직에서다양한항산균검출법의비교 263 Table 3. Comparative analysis of results for Ziehl-Neelsen stain, MTB (IS6110 and mpb64) and MTB/NTM () Ziehl-Neelsen stain Positive (%) Negative (%) Total No. (%) Total No. 15 (27.8) 39 (72.2) 54 (100) IS6110 Positive 11 (73.3) 8 (20.5) 19 (35.2) Negative 4 (26.7) 31 (79.5) 35 (64.8) Mpb64 Positive 9 (60.0) 7 (17.9) 16 (29.6) Negative 6 (40.0) 32 (82.1) 38 (70.4) Positive 11 (73.3) 8 (20.5) 19 (35.2) Negative 4 (26.7) 31 (79.5) 35 (64.8) DRn 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 Amplification plot MTB-IC MTB NTM, polymerase chain reaction. 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 Cycle Table 4. Comparative analysis of results for Ziehl-Neelsen stain and MTB/NTM RQ- () Ziehl-Neelsen stain Positive (%) Negative (%) Total No. (%) Fig. 3. Results for MTB/NTM RQ-. (A) An MTM-positive and NTM-negative case. The Ct value for the internal control (MTB-IC) is 26-28; the Ct value for MTB is 32.9. (B) An MTB-negative and NTM negative case. RQ-, real-time quantitative polymerase chain reaction. Total No. 15 (29.4) 36 (70.6) 51 (100) RQ- Positive 12 (80.0) 8 (30.6) 23 (45.1) Negative 3 (20.0) 25 (69.4) 28 (54.9) RQ-, real-time quantitative polymerase chain reaction. 또결핵균배양양성인 15예중에서 IS6110과 Mpb64, IS6110/ Rpob 및 RQ-의민감도는각각 46.6% (7예), 40% (6예), 40% (6예), 80% (12예 ) 였고, 특이도는 33.3% (3예), 44.4% (4예), 33.3% (3예), 55.5% (5예) 였다. DRn 0.75 0.70 0.65 0.60 0.55 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 Amplification plot MTB-IC NTM MTB MTB- 과 RQ- 과의위양성률및위음성률비교 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 Cycle Ziehl-Neelsen 염색에서양성인 15증례중 IS6110과 Mpb64 및 결과는 15증례중 4예, 6예, 4예에서음성을보였다. 한편 RQ-의경우는 15증례중 3 예가음성이었다. 또한위음성률은각각 26.7%, 40.0%, 26.7%, 20.0% 로 RQ-에서가장낮았다. Ziehl-Neelsen 염색에음성인 39증례중각각 8예, 7예, 8예가양성이었으며, RQ- 의경우는 36증례중 11예가양성이었다. 또한위양성률은 20.5%, 17.9%, 20.5%, 30.6% 였다 (Fig. 5). MTB-과 RQ-과의양성예측도와음성예측도 IS6110과 Mpb64 및 과 RQ-에서각각의양성예측도는 57.9%, 56.3%, 57.9%, 52.2% 였고, 음성예측도는 88.6%, 84.2%, 88.6%, 89.3% 였다 (Fig. 6). Fig. 4. Sensitivity and specificity of polymerase chain reaction () and real-time quantitative (RQ-). RQ- shows the highest sensitivity and Mpb64 shows the highest specificity. MTB, Mycobacterium tuberculosis; IC, internal control; NTM, non-tuberculous mycobacterium. 고 병리조직에서만성육아종성염증의소견을보이는경우, 항산균을포함한다양한원인균을감별하는것이필요하므로이에파라핀포매조직에서항산균을검출하기위한 Ziehl-Neelsen 염색이시행되고있으며최근에는 및 RQ-도시행되고있다. 본연구에서는 Ziehl-Neelsen의염색결과를각각의방법을비교분석하는기준으로삼았으나, Ziehl-Neelsen 염색의민감도나특이도가높지않다고알려져있어결핵균배양결과도참조하여비교분석하였으며, 파라핀포매조직에서기존에보고된자료와도상호비교하였다 (Table 2). 결핵균배양이실시된증례의파라핀포매조직에서 IS6110 찰
264 이현승 이형남 임소영외 3 인 100 Sensitivity Specificity 100 PPV NPV 90 90 80 80 70 70 60 60 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 0 IS6110 Mpb64 RQ- 0 IS6110 Mpb64 RQ- Fig. 5. False-positive and false-negative rate of polymerase chain reaction () and real-time quantitative (RQ-). Mpb64 shows the lowest false-positive rate and RQ- shows the lowest false-negative rate. Fig. 6. Positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) of polymerase chain reaction () and real-time quantitative (RQ-). Three different s show the higher PPVs than RQ-. NPV is similar in all s and RQ-s. primer를사용한 결과 21,22 에서 의민감도는 84.5-91.1%, 특이도는 98.8-100% 로보고되었다. 그러나본연구에서결핵균배양이시행된 24예의 민감도는 40.0-46.6%, 특이도는 33.3-44.4% 로매우낮은반면, RQ-에서는 80% 의민감도와 55.5% 의특이도를보였다. 이러한결과와기존보고와의차이를완전히설명하기는어려우나, 이는파라핀포매조직이갖는한계나조직에있는항산균의개수나분포등에따른차이라고생각된다. 또한본연구에서 MTB/NTM 에사용된 primer 및방법은기존보고와큰차이가없었다. 파라핀포매조직에서 Ziehl-Neelsen 염색으로항산균을확인한빈도가기존의연구보고 13,14 에서는 0-35% 로낮았는데, 이는조직제작과정중사용되는자일렌과포르말린이항산균염색성을감소시킨결과라고보여진다. 23,24 또한본연구에서도전체 54증례중 15예 (29.4%) 에서항산균이관찰되어기존보고와유사한빈도를보였다. 최근에파라핀포매조직에서항산균검출에 또는 RQ- 이유용하다고알려졌으나반면문제점도제기되고있다. 5,6 또한항산균검출에흔히사용되는 primer인 IS6110, Mpb 64 및 Rpob 부위에따른결과도연구자에따라차이가보고되고있다. 5,7-11 실제본연구를시행하게된계기도본연구자들이항산균진단에사용하던 primer를 Mpb64에서 IS6110으로바꾸면서 primer에따른결과의차이가발견되었기때문인데, 이는임상에서환자를치료하는데매우중요한결과이므로항산균검출에사용되는 및 RQ-을포함하는다양한방법의검증이필요하게되었다. 의경우기존의연구들이민감도를 83.5-100% 로보고한반면, 본연구의민감도는 IS6110과 Mpb64 및 primer에서각각 73.3%, 60.0%, 73.3% 로나타나기존의보고에비해낮게관찰되었다. 반면특이도는 70-99% 로보고한다른연구와비교할때각각 79.5, 82.1%, 79.5% 로비슷한결과를보였다. 5,7-11 한편 Ziehl-Neelsen 염색이일반적으로민감도가높지않은방법이라고알려져있어본연구에서는결핵균배양 검사결과도추가분석하였는데, 결핵균배양검사가양성인 15 예에 IS6110과 Mpb64 및 primer를사용한 결과는각각 7예 (46.6%), 6예 (40%), 6예 (40%) 에서양성으로나타나오히려 Ziehl-Neelsen 염색을기준으로하였을때보다더욱낮은민감도를보였다. 한편 RQ-은 Taqman chemistry의형광량측정법을이용하므로항산균검출시기존 법에비해뛰어난감도를보인다고보고되고있는데, 16 Beqaj 등 6 은파라핀포매조직에서 Ziehl-Neelsen 염색과 RQ-을시행하여민감도및특이도를비교해본결과, Ziehl-Neelsen 염색에양성을보인검체의 RQ- 민감도는 92%, 특이도는 100% 라고보고하였다. 실제로본연구에서도 RQ-의민감도는 80.0% 로다른 방법에비해서는높은민감도를보였으나, 기존보고에비하면낮게관찰되었다. 또한특이도는 69.4% 로다른 방법보다낮았고, 100% 로보고한기존보고에비해서도매우낮았다. 하지만결핵균배양검사상양성인 15예를분석하였을때 RQ-에서양성인경우가 12예 (80%) 로나타나다른 방법에비하여높은민감도를보여 RQ- 방법이파라핀포매조직에서항산균검출에가장민감한것을확인할수있었다. 이에 Fukunaga 등 5 은 RQ- 이민감도와특이도가높다하더라도 Ziehl-Neelsen 염색과달리검체내모든항산균 DNA를발견해내므로살아있는항산균뿐만아니라대식구에탐식된균이나죽어서기질내에침착되어있는균까지모두측정하게되어항산균감염에의한질병의활성도를반영하지는못함을지적하였다. 본실험에서 Ziehl-Neelsen 염색에음성이었으나, IS6110과 Mpb64 및 및 RQ- 결과가양성인위양성률은각각 20.5%, 17.9%, 20.5%, 30.6% 였다. 특히 RQ- 에서양성이었던 3증례중 2예는기존 방법들에서는모두음성이었다. 이들 2증례의 Ct 값은한계값인 35에매우근접한 34.9 및 33.41이어서실제로도위양성일가능성이의심되었다. 이에대해 Kim 등 25 은 RQ-의경우증폭후증폭산물을조작하는과정이없어서위양성의가능성이원칙적으로매우낮
만성육아종성염증의파라핀포매조직에서다양한항산균검출법의비교 265 으나, 다만환자검체의 Ct 값이기준치즉한계값에가까이있는경우위양성의가능을고려하여결과를신중히해석하여야한다고하였다. 또한나머지 1예는 RQ-에서 Ct 값이 31.46 으로확실한양성이었고모든 방법에서도양성이었으며, 이환자의흉부사진상우측폐에서공동이관찰되었고항결핵제복용후병변이완치되었으므로위양성이아닌결핵으로판정할수있었다. 이는아마도조직에서항산균의숫자가너무적어 Ziehl-Neelsen 염색에서관찰되지않았을것으로판단되었다. 또한본연구에서 및 RQ-의위음성률은 26.7%, 40.0%, 26.7%, 20.0% 로높았는데, 그중 RQ-에서가장낮게관찰되었다. Cho 등 4 도 Ziehl-Neelsen 염색에서항산균이관찰되었으나, 의경우는추출한결핵균 DNA의양이충분하지않거나 DNA가온전하지않음에기인한다고하였다. 본연구에서도이들증례에서는대부분항산균이매우드물게적은숫자로관찰되었으므로실험에항산균이포함되지않았거나, 또한파라핀포매조직이므로조직제작단계에서항산균 DNA의손상으로 이음성일가능성이의심되었다. 특히 multiplex 인경우는검체의 DNA양이좀더많이요구되므로미량의 DNA인경우결과가음성으로나올가능성이알려져있다. 결론적으로파라핀포매조직에서항산균감염여부를확인하는방법으로 RQ- 방법이다른 방법보다민감도가높고, 위음성률이낮으며, 음성예측률이높고결핵성및비결핵성항산균을모두검출할수있다는점에서 보다더유용하다고판단되었다. 그러나 RQ- 방법이특이도에서오히려다른 방법보다낮다는점과위양성률이높다는점은파라핀포매조직에서항산균진단시유의해야될점으로생각된다. 참고문헌 1. Charles M, Pape JW. Tuberculosis and HIV: implications in the developing world. Curr HIV/AIDS Rep 2006; 3: 139-44. 2. Chemlal K, Portaels F. Molecular diagnosis of nontuberculous mycobacteria. Curr Opin Infect Dis 2003; 16: 77-83. 3. Baba K, Pathak S, Sviland L, et al. Real-time quantitative in the diagnosis of tuberculosis in formalin-fixed paraffin-embedded pleural tissue in patients from a high HIV endemic area. Diagn Mol Pathol 2008; 17: 112-7. 4. Cho MS, Lee SN, Sung SH, Han WS. Comparison of Ziehl-Neelsen stain and TB- on detection of mycobacterium tuberculosis in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues of chronic granulomatous inflammation. Korean J Pathol 2003; 37: 379-83. 5. Fukunaga H, Murakami T, Gondo T, Sugi K, Ishihara T. Sensitivity of acid-fast staining for Mycobacterium tuberculosis in formalin-fixed tissue. Am J Respir Crit Care Med 2002; 166: 994-7. 6. Beqaj SH, Flesher R, Walker GR, Smith SA. Use of the real-time assay in conjunction with MagNA Pure for the detection of mycobacterial DNA from fixed specimens. Diagn Mol Pathol 2007; 16: 169-73. 7. Kim CS, Son HD, Park MR, Seo JY, Cho DI, Rheu NS. Usefulness of study in AFB smear negative patients on admission. Tuberc Respir Dis 1997; 44: 1001-10. 8. Schluger NW, Kinney D, Harkin TJ, Rom WN. Clinical utility of the polymerase chain reaction in the diagnosis of infections due to Mycobacterium tuberculosis. Chest 1994; 105: 1116-21. 9. Choi YJ, Hu Y, Mahmood A. Clinical significance of a polymerase chain reaction assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis. Am J Clin Pathol 1996; 105: 200-4. 10. Brugière O, Vokurka M, Lecossier D, et al. Diagnosis of smear-negative pulmonary tuberculosis using sequence capture polymerase chain reaction. Am J Respir Crit Care Med 1997; 155: 1478-81. 11. Eisenach KD, Sifford MD, Cave MD, Bates JH, Crawford JT. Detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum samples using a polymerase chain reaction. Am Rev Respir Dis 1991; 144: 1160-3. 12. Ahmed A, Engelberts MF, Boer KR, Ahmed N, Hartskeerl RA. Development and validation of a real-time for detection of pathogenic leptospira species in clinical materials. PLoS One 2009; 4: 7093. 13. Guckian JC, Perry JE. Granulomatous hepatitis: an analysis of 63 cases and review of the literature. Ann Intern Med 1966; 65: 1081-100. 14. Harrington PT, Gutiérrez JJ, Ramirez-Ronda CH, Quiñones-Soto R, Bermúdez RH, Chaffey J. Granulomatous hepatitis. Rev Infect Dis 1982; 4: 638-55. 15. Drews SJ, Eshaghi A, Pyskir D, et al. The relative test performance characteristics of two commercial assays for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex in paraffin-fixed human biopsy specimens. Diagn Pathol 2008; 3: 37. 16. Hillemann D, Galle J, Vollmer E, Richter E. Real-time assay for improved detection of Mycobacterium tuberculosis complex in paraffin-embedded tissues. Int J Tuberc Lung Dis 2006; 10: 340-2. 17. Scarpellini P, Racca S, Cinque P, et al. Nested polymerase chain reaction for diagnosis and monitoring treatment response in AIDS patients with tuberculous meningitis. AIDS 1995; 9: 895-900. 18. Thierry D, Brisson-Noël A, Vincent-Lévy-Frébault V, Nguyen S, Guesdon JL, Gicquel B. Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence, IS6110, and its application in diagnosis. J Clin Microbiol 1990; 28: 2668-73. 19. Eisenach KD, Cave MD, Bates JH, Crawford JT. Polymerase chain reaction amplification of a repetitive DNA sequence specific for Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis 1990; 161: 977-81. 20. Therese KL, Jayanthi U, Madhavan HN. Application of nested polymerase chain reaction (n) using MPB 64 gene primers to detect Mycobacterium tuberculosis DNA in clinical specimens from extra-
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