(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C05F 1/00 (2006.01) C05F 11/00 (2006.01) (21) 출원번호 10-2013-0091806( 분할 ) (22) 출원일자 2013 년 08 월 01 일 심사청구일자 2013 년 08 월 01 일 (62) 원출원특허 10-2013-0049400 원출원일자 심사청구일자 (56) 선행기술조사문헌 KR1020020006548 A* JP 평성 07115893 A KR100532153 B1 2013 년 05 월 02 일 2013 년 05 월 02 일 * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2013년12월16일 (11) 등록번호 10-1341721 (24) 등록일자 2013년12월09일 (73) 특허권자 황재호 전라남도여수시소호 5 길 39, 304 동 1004 호 ( 소호동, 주은금호아파트 ) (72) 발명자 황재호 전라남도여수시소호 5 길 39, 304 동 1004 호 ( 소호동, 주은금호아파트 ) 김진영 전라남도여수시선원동 999 오성빌라 301 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 강창원 전체청구항수 : 총 6 항심사관 : 홍상표 (54) 발명의명칭부산물을이용한아미노산비료조성물의제조방법 (57) 요약 본발명은부산물을이용한아미노산비료조성물제조방법에관한것으로, 어피부산물로부터아미노산비료조성물과고분자콜라겐및저분자콜라겐펩타이드를제조할있으며, 이에따라폐기되는어피를이용하여아미노산이풍부한비료조성물과고분자콜라겐및저분자콜라겐펩타이드를경제적으로제조할수있다. 대표도 - 도 8-1 -
(72) 발명자 라성주 전라남도여수시소호동주은금호아파트 4 동 1006 호 한경호 전라남도여수시국동 193-410 김선재 전라남도여수시미평동선경아파트 307 동 1204 호 신태선전남여수시신월동 60 금호아파트 12동 902호박복재전라남도여수시소호동 - 2 -
특허청구의범위청구항 1 수산부산물을이용한아미노산비료조성물의제조방법으로서, 하기단계를포함하는것을특징으로하는방법 : (S1) 어피부산물을분쇄하여어피분말을형성하는분쇄단계 ; (S2) 상기어피분말을알칼리추출하여단백질이함유된탈알칼리용액을수득하는단계 ; (S3) 상기탈알칼리용액을알칼리가수분해하여아미노산염용액을수득하는단계 ; (S4) 상기아미노산용액을중화반응시켜아미노산액상비료를수득하는단계 ; 및 (S5) 상기아미노산액상비료에미량요소를첨가하는단계. 청구항 2 제 1항에있어서, 상기수산부산물이농어, 조피볼락, 넙치및참돔으로이루어진군에서선택된하나이상의어류이고, 어류의머리, 꼬리, 내장및껍질로이루어진군에서선택된하나이상인것을특징으로하는방법. 청구항 3 제 1 항에있어서, 상기단계 (S2) 에서알칼리추출을 0.05 내지 0.2M 농도의수산화나트륨, 수산화칼슘또는수산화칼륨을이용하여수행하는것을특징으로하는방법. 청구항 4 제 1 항에있어서, 상기단계 (S3) 에서수득된탈알칼리용액 10 내지 50 중량 % 에대해수산화나트륨, 수산화칼슘또는수산화칼륨을함유한 10 내지 30% 알칼리수용액 50 내지 90중량 % 를혼합하여알칼리가수분해를수행하는것을특징으로하는방법. 청구항 5 제 4 항에있어서, 상기알칼리가수분해를상압또는가압조건하에 30 내지 200 의온도로반응시켜탈알칼리용액에함유된불용성단백질이외에올리고펩타이드염또는아미노산염을포함하는혼합물로수득하는것을특징으로하는방법. 청구항 6 제 1 항에있어서, 상기단계 (S4) 에서중화반응을인산, 염산및황산으로이루어진군에서선택된무기산또는아세트산의유기산을사용하여수행하는것을특징으로하는방법. 청구항 7 삭제청구항 8 삭제 - 3 -
청구항 9 삭제 명세서 [0001] 기술분야 본발명은부산물을이용한아미노산비료조성물의제조방법에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] [0011] 배경기술어업및양식어류의가공공정에서발생되는수산부산물 ( 머리, 꼬리, 내장등 ) 은단백질함량이매우높아유기성비료로활용되거나, 고온건조과정을거친후수분조정제와함께발효시켜서사료의단백질원인어분으로활용되고있다. 종래의수산부산물어분제조방법을살펴보면, 어업및양식어류및수산부산물을수증기로증숙하거나고온에서건조한후미강 ( 쌀겨 ) 이나야자박등의수분조정제를첨가하여장시간동안발효시켜서어분을제조하게된다. 이러한수산부산물어분은수분조정제첨가및발효과정등으로인해제조원가및제조공정시간이증가되어채산성이떨어지는문제가있다. 또한발효과정중에악취및침출수등의발생으로인해, 작업위생이떨어지고환경에도악영향을미치게된다. 또한, 수산부산물어분은어류의내장을포함하기때문에내장에들어있는효소들에의해단백질이변성되거나부패될수있고, 뼈에들어있는인성분에의해사료로이용시대상어들의소화불량을야기하여소화장애및성장장애를일으킬수있다는문제점이있다. 최근에는아미노산액상비료를통한제조산업이주를이루고있으며, 시판되는제품의경우 아미노산종합영양제 로작물을더욱튼튼하게하거나아미노산액비직접사용으로질소효율을높이고생육증진효과에도도움을주는제품이있다. 또한뿌리착근활착촉진, 낙과방지, 과실비대효과에도우수한성능을주는제품이생산되고있다. 식물은아미노산을식물체내에서자체적으로합성하거나외부로부터흡수하여단백질형태로저장또는대사에너지로전환, 생리활성등다양한용도로사용한다. 또한토양미생물의영양원으로작용하여미생물의증식을활발하게하며식물의뿌리활력과토양부식을증대시킨다. 토양부식은보수력을향상시키고, 각종영양원을고정화하여토양의생산력을높이는효과가있다. 특히, 현재사용하는질소비료는토양중에서질산태 ( 질산 ) 로전환되어흡수되지만작물체내의질소는대부분아미노산과같은유기태질소 ( 유기산 ) 가우선적으로엽록체나단백질로전환되어생육에작용한다. 유기질소가이용되어일정수준이하가되면뿌리로부터질산태질소를흡수하여다시아미노산등으로전환하는과정이반복되므로아미노산액비를직접사용하는경우질소효율이높고단기간내에생육효과가나타나게된다. 아미노산비료로개발된것으로는대개식물이나동물의단백질을가수분해하여얻는데, 그러한방법이개시되어있는주요한특허로는곡물을염산과황산혼합물로가수분해하여아미노산혼합물을얻는방법에관한미국특허 2,555,276호가있고, 단백질을무수유기용제-암모니아혼합물로가수분해하여아미노산을얻는방법에관한미국특허 4,665,158호등이있다. 이러한방법들은순수한아미노산을얻기위하여제조과정에서발생하는불순물을제거하기위한과정을가지고있고, 가수분해시간이오래걸리며, 수율이높지않아얻어지는아미노산의가격이높다는단점을가지고있으며, 또한살균력이없다는단점이있다. 콜라겐은동물체내에가장풍부하게존재하는단백질로서체단백질의약 30% 이상을차지하며, 최소 19종류 (Type Ⅰ-ⅩⅨ) 이상인것으로밝혀져있다 (Nakamura, Y.N. et al., Relationship among collagen amount, distribution and architecture in the M. Longissimus thoracis and M. pectoralis profundus from pigs. Meat Science, 64, pp 43-50, 2003). 또한, 콜라겐은동물의결합조직의주요단백질이며, 조직이나장기를지탱하게하고체표를둘러싸고있어체형을유지시키는역할을한다. 특히생체에서피부, 연골, 뼈등의결합조직의주요한구성성분으로 40% 는피부, 20% 는뼈와연골, 그외혈관과내장등전신에넓게분포되어있다. 콜라겐은 2중나선구조를하고있는근원섬유단백질과는달리 3중나선구조로, 그직경이약 14~15 nm, 길이는 - 4 -
280~300 nm, 평균분자량은약 300 KDa이며 (Lehninger, A.L. Biochemistry, 2nd ed., pp.145, 1975), (Gly-X- Y)n과같은규칙적인형태의아미노산배열을가지며섬유상단백질의기본단위분자인트로포콜라겐 (tropocollagen) 분자내또는트로포콜라겐 (tropocollagen) 분자간의공유결합성교차결합 (crosslinking) 에의해물리적, 생물학적으로안정한구조를형성하고있다 (McClain, P.E. et al., Amino acid composition and cross-linking characteristics of collagen intramuscular connective tissue of striated muscle(bos taurus). International Journal of Biochemistry, 2(7), pp 121-124, 1971). [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] 콜라겐은예전부터피혁이나젤라틴의원료로서응용되어왔고최근에는그응용분야가더욱다양해지고있다. 식품산업에서는가식성케이징 (casing) 원료로소세지 (sausage), 살라미 (salami) 등육의포장재에이용되고있다. 의약품에응용되는콜라겐은화상이나상처에의해손상된피부에대해치유효과가있는것으로보고되고있다 (Jeyanthi, R. et al., Solid tumour chemotherapy using implantable collagen-poly (HEMA) hydrogel containing 5-fluorouracil. Journal of Pharmacy & Pharmacology, 43, pp.60-62, 1991). 이처럼콜라겐은식품, 의약품의기능성소재로이용되고있을뿐만아니라피부의보습성을높이는기능이있어화장품의기초재료등다양한분야에널리이용되고있다. 유통되는콜라겐은대부분소, 돼지, 닭등의육상가축유래콜라겐으로광우병, 돼지콜레라, 조류인플루엔자와같은병원성인자에대한안전성문제가대두되어일본에서는해양생물유래콜라겐 ( 이하마린콜라겐 ) 으로대체되고있는실정이다. 최근의여러논문을통하여단백질가수분해물로부터얻어진펩타이드가주름개선, 보습증진, 탄력증가와특정피부효능을나타낼수있는잠재적인소재로활용되고있으며, 대표적인것이콜라겐가수분해물이다. 콜라겐펩타이드라는명칭으로불리는콜라겐가수분해물은돈피, 어류의비늘등에서고분자콜라겐을추출한후, 효소분해등의후처리과정을통해가수분해시켜펩타이드형태로저분자화시킨것을말하며최근에는분자량을 1,000~5,000 정도까지낮춘콜라겐제품들이판매되고있다. 한편, 현재까지어피부산물은음식물쓰레기로분류되어일반음식물과같이퇴비로대부분활용되었다. 건조한어피는단백질을포함한유용물질함량이 90% 이상이어서활용도가매우높아콜라겐추출, 화장품, 건강보조식품, 접착제등다양하게이용할수있다. 근래콜라겐을이용한건강보조제, 화장품등다양한상품이상용화되고있으나많은부분수입에의존하고있다. 국내 1인당수산물소비가세계 1위인일본과앞뒤를다투는상황에서점차증가하는어피부산물의활용은수입대체및양질의수산단백질, 콜라겐의공급으로경제적상승효과및친환경적산업개발에매우적합하다. 또한, 콜라겐, 알부민, 미오신, 엘라스틴등다양한고분자단백질을다량으로함유하고있어, 고품질의콜라겐으로활용이가능하며, 어피부산물의단백질원으로서이용은생선회의소비가높은국내에서수거가용이하며, 국내해산어양식도꾸준히이루어지고있는만큼안정된수량확보를기대할수있어해산어류어피부산물의유효이용가능성에대한평가가절실한상황이다. 이에본발명자들은상기한문제점을해결하고폐기되는수산부산물의제로이미션을목적으로개발된것으로어류의껍질인어피부산물을이용하여마린콜라겐을분리해냄으로써필수아미노산이풍부한비료조성물을제조하고, 상기알칼리추출후알카리잔사를산추출, 펩신소화공정등을통한마린콜라겐을추출하고이온교환크로마토그래피로정제하여고순도마린콜라겐을분리할수있음을발견하여본발명을완성하게되었다. 발명의내용 [0020] [0021] [0022] 해결하려는과제따라서, 본발명에서해결하고자하는기술적과제는부산물을이용하여아미노산이풍부한비료조성물및고부가가치의마린콜라겐을제조하는방법을제공하기위한것이다. 또한, 본발명에서해결하고자하는다른기술적과제는상기방법에따라제조된아미노산비료조성물을제공하기위한것이다. 또한, 본발명에서해결하고자하는또다른기술적과제는상기방법에따라제조된고분자또는저분자마린콜라겐을제공하기위한것이다. 과제의해결수단 - 5 -
[0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] 상기한기술적과제를달성하기위하여, 본발명에서는부산물을이용한아미노산비료조성물제조방법을제공한다. 바람직하게, 본발명의아미노산비료조성물은하기단계를포함하는방법에의해제조될수있다 : (S1) 어피부산물을분쇄하여어피분말을형성하는분쇄단계 ; (S2) 상기어피분말을알칼리추출하여단백질이함유된탈알칼리용액을수득하는단계 ; (S3) 상기탈알칼리용액을알칼리가수분해하여아미노산염용액을수득하는단계 ; (S4) 상기아미노산용액을중화반응시켜아미노산액상비료를수득하는단계 ; 및 (S5) 상기아미노산액상비료에미량요소를첨가하는단계. 바람직하게, 본발명의고분자마린콜라겐은하기단계를포함하는방법에의해제조될수있다 : (S1) 어피부산물을분쇄하여어피분말을형성하는분쇄단계 ; (S2) 상기어피분말을알칼리추출하여비콜라겐성단백질이제거된알칼리잔사를수득하는단계 ; (S3) 상기알칼리잔사에산용액을가하여산추출하여산가용성콜라겐을수득하는단계 ; (S4) 상기산가용성콜라겐을펩신을사용하여소화시켜펩신가용화콜라겐을수득하는단계 ; 및 (S5) 상기펩신가용화콜라겐을이온교환크로마토그래피를수행하여고분자마린콜라겐을수득하는단계. 또한, 바람직하게, 본발명의아미노산비료조성물은하기단계를포함하는방법에의해제조될수있다 : 상기아미노산비료조성물의제조가하기단계를포함하는것을특징으로하는방법 : (S1) 어피부산물을분쇄하여어피분말을형성하는분쇄단계 ; (S2) 상기어피분말을알칼리가수분해하여아미노산염용액을수득하는단계 ; (S3) 상기아미노산용액을중화반응시켜아미노산액상비료를수득하는단계 ; 및 (S4) 상기아미노산액상비료에미량요소를첨가하는단계. 또한, 본발명의저분자마린콜라겐은하기단계를포함하는방법에의해제조될수있다 : (S1) 어피부산물을분쇄하여어피분말을형성하는분쇄단계 ; (S2) 상기어피분말을알칼리가수분해하여알칼리잔사를수득하는단계 ; (S3) 상기알칼리잔사에산용액을가하여산추출하여산가용성콜라겐을수득하는단계 ; (S4) 상기산가용성콜라겐을펩신을사용하여소화시켜펩신가용화콜라겐을수득하는단계 ; 및 (S5) 상기펩신가용화콜라겐을이온교환크로마토그래피를수행하여저분자마린콜라겐을수득하는단계. 상기한다른기술적과제를달성하기위하여, 본발명에서는상기방법에따라제조된아미노산비료조성물을제공한다. 상기한또다른기술적과제를달성하기위하여, 본발명에서는상기방법에따라제조된고분자또는저분자마린콜라겐을제공한다. [0050] 발명의효과본발명은어피부산물폐기물을발생시키지않는제로이미션을목적으로하는것으로어피부산물로부터아미노산비료조성물과고분자콜라겐및저분자콜라겐펩타이드를제조할수있으며, 이에따라폐기되는부산물을이용하여아미노산이풍부한비료조성물과고분자콜라겐및저분자콜라겐펩타이드를경제적으로제조할수있다. [0051] 도면의간단한설명 도 1 은열풍건조한넙치어피분말의 100 배광학현미경사진이고, - 6 -
도 2는동결건조한넙치어피분말의 100배광학현미경사진이고, 도 3은농어의등쪽및배쪽피부조직절편을나타내는사진이고, 도 4는넙치의등쪽피부조직절편을나타내는사진이고, 도 5는넙치의배쪽피부조직절편을나타내는사진이고, 도 6은조피볼락의등쪽및배쪽피부조직절편을나타내는사진이고, 도 7은참돔의등쪽및배쪽피부조직절편을나타내는사진이고, 도 8은본발명의전체공정을도식화하여나타낸것이다. [0052] [0053] [0054] [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] 발명을실시하기위한구체적인내용상기한기술적과제를달성하기위하여, 본발명에서는부산물을이용한아미노산비료조성물및마린콜라겐생산을통한제로이미션방법을제공한다. 본발명에서제로이미션이란어류와같은수산물의내장, 꼬리, 머리, 껍질등의폐기물을발생시키지않고제로화될수있도록수산물의부산물을가공처리하는것을의미한다. 바람직하게, 본발명에서상기수산물은농어, 조피볼락, 넙치및참돔으로이루어진군에서선택된하나이상의어류인것을특징으로하며, 어류의머리, 꼬리, 내장및껍질로이루어진군에서선택된하나이상인것을특징으로한다. 본발명에서는바람직하게수산부산물로서어피부산물을사용하는것을특징으로한다. 본발명에서는수산부산물의알칼리추출잔사로고분자콜라겐수득방법과수산부산물의알칼리가수분해잔사로저분자마린콜라겐펩타이드수득단계를포함하는것을특징으로한다. 본발명에서아미노산비료조성물의제조는하기단계를포함하는것을특징으로한다 : (S1) 어피부산물을분쇄하여어피분말을형성하는분쇄단계 ; (S2) 상기어피분말을알칼리추출하여단백질이함유된탈알칼리용액을수득하는단계 ; (S3) 상기탈알칼리용액을알칼리가수분해하여아미노산염용액을수득하는단계 ; (S4) 상기아미노산용액을중화반응시켜아미노산액상비료를수득하는단계 ; 및 (S5) 상기아미노산액상비료에미량요소를첨가하는단계. 바람직하게, 본발명에서는상기단계 (S2) 에서알칼리추출을 0.05 내지 0.2M 농도의수산화나트륨, 수산화칼슘또는수산화칼륨을이용하여수행하는것을특징으로한다. 바람직하게, 본발명에서는상기단계 (S3) 에서수득된탈알칼리용액 10 내지 50 중량 % 에대해수산화나트륨, 수산화칼슘또는수산화칼륨을함유한 10 내지 30% 알칼리수용액 50 내지 90중량 % 를혼합하여알칼리가수분해를수행하는것을특징으로한다. 바람직하게, 본발명에서는상기알칼리가수분해를상압또는가압조건하에 30 내지 200 의온도로반응시켜탈알칼리용액에함유된불용성단백질이외에올리고펩타이드염또는아미노산염을포함하는혼합물로수득하는것을특징으로한다. 바람직하게, 본발명에서는상기단계 (S4) 에서중화반응을인산, 염산및황산으로이루어진군에서선택된무기산또는아세트산의유기산을사용하여수행하는것을특징으로한다. 바람직하게, 본발명에서는상기고분자마린콜라겐의제조가하기단계를포함하는것을특징으로한다. (S1) 어피부산물을분쇄하여어피분말을형성하는분쇄단계 ; (S2) 상기어피분말을알칼리추출하여비콜라겐성단백질이제거된알칼리잔사를수득하는단계 ; (S3) 상기알칼리잔사에산용액을가하여산추출하여산가용성콜라겐을수득하는단계 ; (S4) 상기산가용성콜라겐을펩신을사용하여소화시켜펩신가용화콜라겐을수득하는단계 ; 및 - 7 -
[0072] [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] [0086] [0087] [0088] (S5) 상기펩신가용화콜라겐을이온교환크로마토그래피를수행하여고분자마린콜라겐을수득하는단계. 바람직하게, 본발명에서는상기단계 (S2) 에서알칼리추출을 0.05 내지 0.2M 농도의수산화나트륨, 수산화칼슘또는수산화칼륨을이용하여수행하는것을특징으로한다. 바람직하게, 본발명에서는상기단계 (S3) 에서산용액이초산인것을특징으로한다. 바람직하게, 본발명에서는상기단계 (S3) 에서알칼리잔사와산용액을 1:5 내지 10의중량비로혼합한다음실온에서 12 내지 24시간동안교반한후원심분리기를이용하여상등액을분리하여산가용성콜라겐을수득하는것을특징으로한다. 또한, 본발명에서는하기단계를포함하는것을특징으로하는아미노산비료조성물의제조방법을제공한다 : (S1) 어피부산물을분쇄하여어피분말을형성하는분쇄단계 ; (S2) 상기어피분말을알칼리가수분해하여아미노산염용액을수득하는단계 ; (S3) 상기아미노산용액을중화반응시켜아미노산액상비료를수득하는단계 ; (S4) 상기아미노산액상비료에미량요소를첨가하는단계. 또한, 본발명에서는하기단계를포함하는것을특징으로하는저분자마린콜라겐펩타이드의제조방법을제공한다 : (S1) 어피부산물을분쇄하여어피분말을형성하는분쇄단계 ; (S2) 상기어피분말을알칼리가수분해하여알칼리잔사를수득하는단계 ; (S3) 상기알칼리잔사에산용액을가하여산추출하여산가용성콜라겐을수득하는단계 ; (S4) 상기산가용성콜라겐을펩신을사용하여소화시켜펩신가용화콜라겐을수득하는단계 ; 및 (S5) 상기펩신가용화콜라겐을이온교환크로마토그래피를수행하여저분자마린콜라겐을수득하는단계. 한편, 본발명에서는상기방법에따라제조된아미노산비료조성물을제공한다. 또한, 본발명에서는상기방법에따라제조된고분자또는저분자마린콜라겐을제공한다. [0089] [0090] [0091] 이하에서는본발명을보다상세히설명하고자한다. < 알칼리추출 > 본발명의어피부산물을이용한아미노산비료조성물및마린콜라겐의제조방법에서상기알칼리가수분해는 0.05 내지 0.2M 농도의수산화나트륨, 수산화칼슘또는수산화칼륨과같은알칼리금속이온을사용하여수행되며, 더욱바람직하게는 0.1 M의수산화나트륨을사용한다. [0092] [0093] [0094] [0095] [0096] < 알칼리가수분해 > 1. 알칼리가수분해조건확립수산부산물의유용화자원화를위한조건으로는부산물의완전분해를통하여 2차적인부산물이발생하지않고, 반응물및생성물의활용성이우수하며, 공정이단순하여작업시간과처리시간이짧아야하며, 유해성이없어야한다. 부산물수급이양호하며, 생산품의시장성이있고, 자원화비용이경제성이있어야한다. 이러한조건에부합하는수산부산물인어피 ( 어류피부조직 ) 의가수분해를통한아미노산비료제조가가장적합하다. 단백질의가수분해는단백질의펩타이드결합을산이나알칼리로가수분해하여아미노산또는펩타이드를생성하는화학반응으로서, 프로테올리시스 (proteolysis) 라고도한다. 현재단백질을가수분해하는방법으로는열가수분해, 산-가수분해, 알카리-가수분해, 효소를이용한가수분해가알려져있으며산-가수분해가많다. - 8 -
[0097] [0098] [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] 2. 가수분해반응메커니즘단백질을포함하는폐기물또는부산물을알칼리가수분해하면반응용기내에는생성된아미노산염및과량의알칼리가존재하게된다. 알칼리가수분해반응식은다음반응식 1과같다. [ 반응식 1] NH 2 -CHR-CO-(NH-CHR-CO)n-2-NH-CHR-COOH + nmoh nnh 2 -CHR-COOM 상기식에서, M은나트륨, 칼슘, 칼륨이온등의금속이온을의미하며, R은알킬기이고, n과 m은정수를의미한다. [0104] 상기반응식 1 은아미노산염을생성하기위한가수분해반응식이다. 아미노산염에산을첨가하게되면하기반 응식 2 내지 4 와같은반응으로중화반응을거쳐등전점을지나산영역에서새로운음이온염이아미노산의 아민염형태로되어금속이제거된다. [0105] [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [ 반응식 2] nnh 2 -CHR-COOM + amoh + aha nnh 2 -CHR-COOM + ama [ 반응식 3] nnh 2 -CHR-COOM + nha nnh 3 +-CHR-COO- + MA [ 반응식 4] nnh 3 +-CHR-COO- + nha na-nh 3 +-CHR-COOH [0111] [0112] [0113] 상기식에서, M 은금속이온, HA 는산을의미하며, n 과 a 는정수를의미한다. [0114] 상기반응식 2 는가수분해된아미노산염과과량의알칼리에산을적정하여과량의알칼리를제거하는반응식이 다. 반응식 3 은아미노산염에산을가하면등전점 (isoelectric point) 을지나아미노산이형성되는반응식이다. 반응식 4 는과량의산과아미노산의양쪽성에의해새로운음이온염이형성되는반응식이다. [0115] [0116] 3. 가수분해를위한압력조건알칼리추출부산물의가수분해를통한아미노산을제조하기위한조건을확립하기위하여압력과가수분해물질에따른단백질의분해능을확인하고아미노산의함량및성분을분석한다. 반응압력에따른아미노산의농도와분자량을수산화나트륨 (NaOH) 및수산화칼륨 (KOH) 을이용해규명하고자한다. [0117] [0118] < 중화공정 > 비료로서사용하기위해서는 ph 6.5~9.0 정도로사용되어야토질의산성화및과다염류축적을예방할뿐만아니라염류장애가이미발생한토양의친환경적복원에도기여가가능하다. 상기중화공정에는알칼리가수분해용액의 ph를조절하기위하여염산, 인산, 황산등무기산및유기산을사용할수있다. 더욱바람직하게는액상비료의원료가되는인산을사용한다. - 9 -
[0119] [0120] [0121] [0122] [0123] [0124] [0125] [0126] [0127] [0128] [0129] [0130] [0131] [0132] < 마린콜라겐제조 > 펩신가용화콜라겐의조제어류의피부조직은마린테크노에서자체개발한방법 ( 특허 10-1035727) 으로건조및분말화하여 10배량의 0.1 M 수산화나트륨으로균질화하여알칼리추출을통해비콜라겐성단백질과내인성콜라겐분해효소를효율적으로제거한다. 증류수로세척한알칼리잔사는다시 0.5 M 초산에서돼지펩신 (EC 3.4.23.1; crystallized and lyophilized, Sigma, MO) 으로교반한다음원심분리 (10,000g, 20분 ) 후얻어진상등액에 2.0M 염화나트륨을넣어침전된콜라겐획분을증류수로투석하여펩신가용화콜라겐을얻을수있다. 보다구체적으로, 어피분말을알칼리용액으로수산화나트륨또는수산화칼륨용액을이용할수있다. 어피분말과알칼리용액을 1:5 내지 10의중량비로혼합한다음실온 (20~25 ) 에서 12 내지 24시간동안교반한후원심분리기를이용하여비콜라겐성단백질이제거된알칼리잔사를분리한다. 수득한알칼리잔사를증류수로세척한다음산용액을가해콜라겐을추출한다. 산용액으로염산, 황산등의무기산또는아세트산등의유기산을이용할수있다. 알칼리잔사와산용액을 1:5 내지 10의중량비로혼합한다음실온 (20~25 ) 에서 12 내지 24시간동안교반한후원심분리기를이용하여상등액을분리하여산가용성콜라겐을수득한다. 이어서, 이온크로마토그래피시스템을이용하여아래와같이진행한다. 펩신가용화콜라겐은 20 mm Na2HPO4에서투석하여펩신을불활성화한다음 2 M 요소를포함한 50 mm 초산용액 (ph 4.8) 에서투석하여인산셀률로오스 (P11, Whatman, Maidstone, UK) 를충진한컬럼에서 0600 mm NaCl의 linear gradient(60 ml/h) 로진행한다. 230 nm에서용출된획분은 2.0 M NaCl을포함한 0.5 M 초산용액으로침전시켜원심분리로회수한다음증류수로투석, 동결건조한다음고순도마린콜라겐을수득할수있다. 본발명에적용된어피는모든어류의껍질이적용될수있으나, 바람직하게는농어, 조피볼락, 넙치, 참돔을포함하는어류에서선택된적어도어느하나이다. 상기 4종류의어류는국내양식어류의약 90% 이상 (2009년기준 ) 을차지하므로상대적으로확보가용이하다. 더욱바람직하게어피는넙치의껍질이다. 넙치의껍질은다른 3종류의어종 ( 농어, 조피볼락, 참돔 ) 과비교해양식생산량이 2배이상높아원료확보가용이하고, 넙치는대부분횟감으로사용후, 뼈는매운탕으로활용되는경우는있으나껍질은활용되는경우가없다. 또한 3종류어종의껍질과비교해비늘을포함해도회분함량이낮게나타나, 비늘제거과정이필요가없으며, 단백질함량과함께지질함량도높아다른어종의어피에비해성분조성에도유리하다. 본발명은어피부산물을알칼리추출후불용성단백질 ( 콜라겐획분 ) 이외를알칼리가수분해하는것을특징으로하는비료조성물의제조방법을제공하며, 이에따라폐기되는어피부산물을이용하여아미노산이풍부한비료조성물을경제적으로제조할수있다. 본명세서에서, " 비료 " 는식물에영양분을공급하고식물의성장을촉진하는조성물을의미한다. 본발명의조성물은액상이거나분말상등고체상일수있다. 특히액상의농축물일수있으며, 사용시에는물등의액체로, 또는흙, 모래, 토탄등의고체로희석시켜사용할수있다. 바람직하게는물로희석시켜사용하는경우이다. 본발명의조성물은수분의흡수와유지를위하여습윤제를추가로포함할수있다. 사용될수있는습윤제의예로서는프로판디올, 폴리에틸린글리콜, 폴리프로필렌글리콜 (polypropylene glycol), 디프로필렌글리콜 (dipropylene glycol) 등의다가알콜과, 글리세린, 글리세롤, 솔비톨등을들수있다. 이러한습윤제도본발명의비료조성물 1kg 당 0.001kg 내지 0.5kg 범위로포함될수있다. 본발명의조성물은표면장력을줄여본발명의조성물의식물에의한흡수를촉진시키기위하여계면활성제를추가로포함할수있다. 사용될수있는계면활성제로서는폴리옥시에틸렌솔비탄지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌지방산에스테르, 디에탄올아민, 로릴황산나트륨 (sodiumlaurylsulfate), 디에탄올아민 (diethanolamine), 알킬벤젠술폰산나트륨, 알킬염화암모늄 (alkyl ammonium chloride) 등을들수있다. 이러한계면활성제는본발명의비료조성물 1kg 당 0.0001kg 내지 0.05kg 범위로포함될수있다. 본발명의조성물은무기영양원소를추가로포함할수있는데, 예컨대그러한무기영양원소로서는칼륨, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 구리, 철, 망간, 몰리브덴, 아연등일수있다. 본발명의조성물은공지의살충제, 제초제, 식물호르몬등을추가로포함하거나이들과혼합되어사용될수 - 10 -
있다. [0133] [0134] [0135] [0136] [0137] [0138] [0139] [0140] [0141] [0142] [0143] 본발명의조성물은쌍자엽식물과단자엽식물모두에적용될수있다. 바람직하게는농작물특히식용작물에적용될수있다. 본발명의조성물이적용될수있는식물의구체적인예로서는멜론, 대두, 애기장대, 담배, 가지, 고추, 페튜니아, 감자, 토마토, 배추, 유채, 양배추, 목화, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 사과, 배, 호박, 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파, 바나나, 감, 복숭아, 감귤, 무화과, 오이, 잔디등을포함한다. 본발명의조성물은통상적인비료조성물과동일한방법으로식물에시비될수있다. 본발명의조성물을작물에시비할때는 1~3,000배, 바람직하게는 500~2,000 배까지희석하여사용될수있으며, 재배기간동안 1~7 회범위로시비될수있다. 본발명의조성물의적절한시비방법이나시비량은식물의종류, 본발명의조성물의성상, 희석농도, 시비횟수, 식물의생장정도등에달라질수있으며, 당업자는그의통상의능력범위내에서적절한시비방법이나시비량을결정할수있다. 본발명의조성물은식물재배시통상적으로사용하는무기질또는유기질성분을포함할수있으며, 바람직하게는질소, 인산, 칼륨이함유된것, 더욱바람직하게는질소, 인산, 칼륨, 무기물및미량원소가함유될수있으나식물재배시통상적으로사용하는것을사용하는것으로이에제한되지않는다. 상기무기물은칼슘, 마그네슘, 황, 철중에서선택된어느하나이상일수있고, 상기미량원소는망간, 구리, 아연, 붕소, 몰리브덴중에서선택된어느하나이상일수있다. 이하, 본발명의내용을하기실시예및실험예를통하여구체적으로설명한다. 이는본발명을보다상세하게설명하기위한것으로, 본발명의권리범위를하기의실시예및실험예로한정하는것은아니다. < 어피의특성 > 농어, 넙치, 조피볼락, 참돔으로부터분리한어피를제 1, 제 2, 제 3, 제 4시험시료로이용하였다. 1. 일반성분분석 4종류의어피에대해일반성분을분석하여하기표 1에나타냈다. 일반성분분석은 AOAC(2000) 방법에따라분석하였다. 수분은 105 건조법, 회분은 550 직접회화법, 지방은 soxhlet 추출법, 단백질은 micro-kjeldahl법을적용하였다. 표 1 [0144] 구분수분 (%) 건중량 (%) 조단백질 조지방 회분 제 1시험시료 81.10 ±0.43 72.81 ±0.43 25.47 ±2.59 1.80 ±0.17 제 2시험시료 80.87 ±1.07 88.91 ±3.64 17.07 ±0.45 1.97 ±0.15 제 3시험시료 79.37 ±0.56 80.59 ±1.68 5.10 ±0.71 10.90 ±1.87 제 4시험시료 76.11 ±0.31 94.11 ±0.31 4.10 ±1.36 0.70 ±0.00 [0145] [0146] [0147] [0148] 상기표 1을살펴보면, 4종의어류중넙치의어피가단백질함량이높으면서도지질함유량도높은것으로나타났다. 2. 아미노산분석구성아미노산을분석하기위해시료 0.5g을 18ml test tube에칭량하여 6N HCl 3ml를가한다음진공펌프를이용하여 test tube를 sealing하였다. sealing한 test tube는 121 로 setting된 heating block에 24시간동안가수분해시킨다. 가수분해가끝난시료는 50, 40 psi의 rotary evaporator로산을제거한후 Sodium loading buffer로 10ml 정용한다음, 이중 1ml를취하여 membrane filter로여과하여아미노산분석기로정량분석하여그결과를하기표 2에나타냈다. - 11 -
[0149] 구성아미노산 표 2 제 1 시험시료제 2 시험시료제 3 시험시료제 4 시험시료 (mg/100g) Asp 3334 3187 3362 3088 Thr 1579 1391 1358 1424 Ser 2072 2204 2509 2268 Glu 5745 5216 5221 4249 Pro 6940 5737 5271 5744 Gly 11384 10845 10383 11080 Ala 5159 4628 4206 4835 Cys 112 153 195 193 Val 1373 1325 1448 1205 Met 1110 1144 990 1128 Ile 834 763 807 594 Leu 1820 1643 1677 1415 Tyr 479 446 461 441 Phe 1475 1336 1352 1300 His 1086 1010 1099 9248 Lys 2052 1943 1946 1968 Arg 4589 4199 4051 4202 Total 53332 48779 78217 56413 * EAA 15918 14754 14727 22484 [0150] [0151] [0152] [0153] [0154] [0155] [0156] *EAA( 필수아미노산 ):Thr, Val, Met, Ile, Leu, Phe, His, Lys, Arg 상기표 2의결과를살펴보면, 구성아미노산인프롤린, 글리신등의수치가높게나타났는데, 이는어피의주성분이콜라겐으로구성되어있음을나타내는것이다. 4. 조직학적관찰광학현미경표본제작을위해어류의피부를절취한시료들은 Drury and Wallington(1980) 의방법에따라 aqueous Bouin's solution에 12시간동안고정한다음, 24시간동안수세하였다. 그후 ethanol을이용한단계별탈수후 Paraplast(McCormick, USA) 에포매하였다. 포매된시료는 microtome(rm2235, Leica, Germany) 을이용하여 4-6μm 두께로연속절편하여조직표본을만들었다. 제작된조직표본은 Mayer's hematoxylin-eosin(h-e) 염색, alcian blue-periodic acid and Schiff's solution(ab-pas, ph 2.5) 반응, Masson's trichrome 염색을한후광학현미경으로관찰하였고, 그결과를도 1 내지도 5에서보여주고있다. 각사진에서 Cc: 곤봉상세포 (Club cell), Cf: 교원섬유 (collagen fiber), Dl: 진피층 (dermal layer), El: 상피층 (epidermal layer), Mc: 점액세포 (mucous cell), Mf: 근섬유 (muscle fiber) 을의미한다. 도 1은농어의등쪽및배쪽피부를나타내는것으로서, A는등쪽피부조직의 AB-PAS reaction 후사진이고, B 는등쪽피부조직의 Masson's trichrome 염색후사진이고, C는배쪽피부조직의 AB-PAS reaction 후사진이고, D는배쪽피부조직의 Masson's trichrome 염색후사진이다. 도 2는넙치의등쪽피부를나타내는것으로서, A는 H-E 염색후사진이고, B는 AB-PAS reaction 후사진이고, C는 Masson's trichrome 염색후사진이다. 도 3은넙치의배쪽피부를나타내는것으로서, A는 H-E 염색후사진이고, B는 AB-PAS reaction 후사진이고, C는 Masson's trichrome 염색후사진이다. 도 4는조피볼락의등쪽및배쪽피부를나타내는것으로서, A 및 B는등쪽피부조직의 Masson's trichrome 염색후사진이고, C 및 D는배쪽피부조직의 Masson's trichrome 염색후사진이다. 도 5는참돔의등쪽및배쪽피부를나타내는것으로서, A 및 B는등쪽피부조직의 Masson's trichrome 염색후사진이고, C는 H-E 염색후사진이고, D는 Masson's trichrome 염색후사진이다. 도 3 내지도 7을참조하면, 참돔, 농어의등쪽과배쪽피부계는상피층, 진피층, 피하조직층및근육층으로이루어져있었고, 농어의진피층은등쪽과배쪽모두잘발달된교원섬유로이루어져있었다. 넙치의등쪽, 배쪽피부계는일반적인구조인상피층과진피층으로구성되어있었고, 진피층은교원섬유로이루어져있었다. 조피볼락의등쪽과배쪽피부계역시상피층과진피층으로이루어져있었고, 등쪽의진피층은교원섬유와일부근 - 12 -
섬유가포함된구조를하고있었으며, 배쪽은잘발달된교원섬유로이루어져있었다. 이렇듯 4종류의어종모두등쪽또는배쪽의진피층에콜라겐섬유인교원섬유가주로발달된것을알수있었고, 어류의피부두께로보았을때, 상피에서진피층의두께가가장두꺼운것으로나타나, 넙치어피가이용가능부피가넓어콜라겐섬유단백질을활용할수있는가장좋은재료원임을확인할수있었다. [0157] 참고로, 4 종의어류의피부두께는하기표 3 과같다. [0158] 구분 부위 상피 ~ 진피층 (um) 상피층 (um) 등쪽 485.44 72.380 농어 넙치 조피볼락 참돔 표 3 배쪽 490.278 75.823 등쪽 540.237 49.231 배쪽 736.923 43.077 등쪽 367.098 20.127 배쪽 528.481 23.418 등쪽 287.447 18.515 배쪽 407.595 67.599 [0159] [0160] < 실시예 1> 아미노산비료조성물제조농어로부터분리된어피를세척한후 -45 에서 15시간동안급속동결시킨다음 0.5torr의진공도를가진동결건조기에서 -40 로 48시간동안건조시킨후분쇄하여어피분말을제조하였다. 어피분말과 0.1M의수산화나트륨용액을 1:10의중량비로혼합한다음 20 에서 18동안교반한후원심분리기를이용하여아미노산염용액을수득하였다. [0161] [0162] < 실시예 2 내지 4> 아미노산비료조성물제조 상기실시예 1 과동일한방법으로비료조성물을제조하되, 농어대신에넙치, 조피볼락, 참돔으로부터각각분 리된어피분말을이용하였다. [0163] [0164] [0165] [0166] [0167] [0168] < 실시예 5> 마린콜라겐제조농어로부터분리된어피를세척한후 -45 에서 15시간동안급속동결시킨다음 0.5torr의진공도를가진동결건조기에서 -40 로 48시간동안건조시킨후분쇄하여어피분말을제조하였다. 어피분말과 0.1M의수산화나트륨용액을 1:10의중량비로혼합한다음 20 에서 18동안교반한후원심분리기를이용하여비콜라겐성단백질이제거된알칼리잔사를분리하였다. 그리고알칼리잔사를증류수로세척한다음알칼리잔사와 0.5M 초산용액을 1:10의중량비로혼합한다음 20 에서 18동안교반한후원심분리기를이용하여상등액을분리하여산가용성콜라겐 (ASC) 을수득하였다. 그리고산가용성콜라겐 5중량 %, 정제수 94.5중량 %, 에탄올 0.5중량 % 를혼합하여제 1시료를준비하였다. < 시험예 1> 상기실시예 1 내지실시예 4에서제조된비료조성물에대하여성분검사를수행하여하기표 4에나타내었다. [0169] 주요지표 단위 최종개발목 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 표 1. 중금속 ( 납으로서 ) ppm 20 이하 13 12 11 13 2. 비소 ppm 2 이하 1 1 1.2 0.9 3. 일반생균수 CFU/g 5,000 3,000 3,400 2,900 3,700 4. 대장균수 CFU/g 5,000 2,000 2,300 1,700 2,500 5. 곰팡이 효모수 개 /g 10 8 7 8 9 6. 질소전량 % 3.2 3.1 3.0 2.7 3.1 표 4-13 -
7. 수용성인산 % 2.2 2.2 2.3 2.1 2.0 8. 수용성칼리 % 6.2 6.0 5.8 6.1 6.2 9. 기능성비료수율 % 30 30 30 30 30 [0170] 상기표 4 에서보듯이, 본발명에따라제조된비료조성물은최종목표로하는기준치에모두부합되는우수한 비료조성물로서아미노산성분이풍부하고금속성분이제거된것을알수있다. 또한, 비료수율면에서도월 등히향상되었음을알수있다. [0171] [0172] [0173] [0174] < 시험예 2> 상기실시예 1에서수득한샘플 A를살포용액으로준비하고, 살포대상은벼 ( 동안벼 ) 와옥수수로선정한후, 벼의경우에는환경변화에따른수확량변화를조사하기위하여실험실내에페트 (PET) 용기에서재배하는경우와직접노지에서재배하는경우를비교하였다. 또한, 분얼이이미완료된개체에대하여살포함으로써수확량에미칠수있는분얼의차이효과를배제하였다. 본발명에서각작물에살포한비료의식물생장촉진효과를확인하기위하여벼의경우에는수확후의간장, 무게, 알곡무게, 천립중등을기록하였고, 옥수수의경우에는수확후의개체무게를기록하여분석하였다. [0175] 구분벼의총무게 표 5 무처리구대비 알곡총무게 무처리구대비 ( 평균, g) 무게증가량 (%) ( 평균, g) 수확증가량 (%) 샘플 A 119.1 21.6 19.2 44.4 무처리구 97.9 0.0 13.3 0.0 [0176] [0177] 표 5는실시예 1에서제조된본발명의어피부산물을함유하는비료조성물을희석하여살포한처리구의경우, 무게증가량은무처리구와비교하였을때 20% 이상증가하는경향을나타내고, 특히알곡총무게는 40% 이상증가하여무처리구대비수확량의증가는더욱현저함을알수있다. 삭제 [0178] 삭제 [0179] 삭제 [0180] [0181] 이상, 본발명은일실시예를참고로설명되었으나이는예시적인것에불과하며, 당해기술분야에서통상의 지식을가진자라면이로부터다양한변형및균등한실시예가가능하다는점을이해할것이다. 따라서, 본발명의진정한보호범위는첨부된청구범위에의해서만정해져야할것이다. [0182] 산업상이용가능성본발명은어피부산물을비롯한수산가공부산물의제로이미션을목적으로하는것으로부산물로부터아미노산비료조성물과고분자콜라겐및저분자콜라겐펩타이드를제조할있으며, 이에따라폐기되는폐기물을이용하여아미노산이풍부한비료조성물과고분자콜라겐및저분자콜라겐펩타이드를경제적으로제조할수있다. - 14 -
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