Metschnikowia persimmonesis (KIOM G15050 strain) KCTC 12991BP을 이용한 한약자원식물 방제기술 개발

韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2018;6(1):51-64. pissn 2288-5161 / eissn 2288-5293 Metschnikowia persimmonesis (KIOM G15050 strain) KCTC 12991BP 을이용한한약자원식물방제기술개발 강다정 1, 이경민 2, 김대욱 3, 강영민 4,5* 1. 한남대학교생명시스템과학과 2. 경북대학교농업생명과학대학응용생명과학부 3. 우석대학교약학대학한약학과 4. 과학기술연합대학원대학교(UST), 한국한의학연구원캠퍼스, 한의생명과학전공 5. 한국한의학연구원한약연구부 Development of herbal medicine plants for control technology using Metschnikowia persimmonesis (KIOM G15050 strain) KCTC 12991BP Kang Dajung 1, Lee Gyungmin 2, Kim Dae Uk 3, Kang Youngmin 4,5* 1. Bio-Science & Technology, Hannam Univ., Daejeon, Rep. of Korea 2. School of Applied Biosciences, Kyungpook National Univ., Daegu, Rep. of Korea 3. Oriental Pharmacy, College of Pharmacy, Woosuk Univ., Jeonbuk, Rep. of Korea 4. Univ. of Science & Technology (UST), Korean Medicine Life Science Major, Campus of Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon, Rep. of Korea 5. Division of Herbal Medicine, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon, Rep. of Korea Abstract Industrial applications using natural microorganism resources are being attempted in various industries. One of the most useful microorganisms is the Metschnikowia persimmonesis KCTC 12991BP which is from Calyx of Diospyros kaki. This strain is a highly anti-bacterial yeast that has recently been separated by a Korean research team for the first time. In this study, antimicrobial activity of the strain against plant-contaminated microorganisms was tested. Microorganisms that can occur in the strain and plants were cultured by pure isolation and then competition tests of them were done. As a result, these tests were established that the Metschnikowia persimmonesis KCTC 12991BP has Correspondence: Kang Youngmin University of Science & Technology (UST), Korean Medicine Life Science Major, Campus of Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon 34054, Rep. of Korea Tel: +82-42-868-9684, Fax: +82-42-863-9434, E-mail: ymkang@ust.ac.kr Received 2018-04-19, revised 2018-05-01, accepted 2018-05-04, available online 2018-05-08 doi:10.22674/khmi-6-1-5 51

강다정외. Metschnikowia persimmonesis KCTC 12991BP 을이용한한약자원식물방제기술개발 antimicrobial activity against not only Botrytis cinerea and Fusarium oxysporum which were already been reported before, but also Fungal endophyte, Paecilomyces inflatus, Colletoirichum higginsianum, Sclerotinia sclerotiourm, and Alternaria alternata. Based on the mycostasis effects of this strain, it can be used as natural preservatives which is much more safer than chemical preservatives. Doing so will ensure the nation s safety and furthermore, it is believed that it will be served as a first mover in the global herbal medicine market by establishing medicinal values from microorganisms separated from herbal medicine resources. Keywords: biotechnology, herbal medicine, plant, microorganism, biopesticide 서론 최근다양한생필품에서유해화학물질이검출되는사태로인한 케미컬포비아 ( 화학물질공포증) 가 확산되는가운데, 화학원료의역할을대체하기위해, 다양한분야에서천연미생물자원을이용한산업 적응용이시도되고있다. 이러한시도는최근의건강한삶을추구하는소비문화의정착에따른사회적 분위기를대변해주고있는데특히농업과임업, 축산업과수산업, 그리고환경분야와의학분야에서 미생물자원을활용한활발한산업적움직임이나타나고있다 1). 예를들어, 농업과임업에서는유용미생물발효에의한유기비료와유기퇴비를사용하여고품질다수 확의작물을재배하고화학농약을대체하여병충해를예방하는동시에토양의개량으로연작을가능하 게하는시도가행해지고있다 1-6). 또한축산업과수산업에서는사료나음용수에유용미생물을첨가하 여가축과어류의병원성미생물에대한내성을증가시키고, 육질을개선시키려는시도도행해지고 있다 1,7-9). 환경분야에서는미생물을이용하여수질정화, 악취제거및음식물쓰레기의효율적처리를도모 하고있고 1,10-12), 의학분야에서도미생물로발효시킨항산화음료인 EM- 를사용하여인체내활성 산소를제거하여노화를방지하고염증수치를낮추려는시도를하고있다 1,13,14). 이처럼다양한산업 분야에서친환경적인접근법의필요성이부각되면서필연적으로미생물제재의개발과사용량이증가 하고있다 15). 위와같은산업에이용될수있는유용미생물중에는시체( 柿蔕 ) 라는한약재에서분리된 Metschnikowia persimmonesis KCTC 12991BP 균도속한다고볼수있는데, 이균주는최근에국내 연구팀에서최초분리하여동정한항균활성이높은효모균이다 16). 방제효과라는것은다양한생물적 기법을이용한병해방제법을의미하는데, 병원체에대한교차방어이용, 길항미생물도입등을이용하 고있다 17,18). 특히최근의생물학적방제에는산생물자재에의해병원체의생존이나활성을저하시켜 병해를감소시키는방법이사용되고있는데이생물학적방제에는크게 3 가지방법이있다. 첫번째로 자연적인생물적방제, 두번째는길항생물도입, 그리고세번째로환경개선, 원래토양에생식한 길항미생물의영양을위한유기물을토양에첨가, 토양수분, 토양산도의교정, 열또는화학물질을 이용한부분살균에의한길항미생물의증식등의방법이사용되고있다 17-20). 본연구에서는시체( 柿蔕 ) 에서분리된 Metschnikowia persimmonesis KCTC 12991BP 균을이용하 여식물감염미생물에대한항균력을알아보고, 실험결과를토대로여러천연농약, 방부제등에이용 되어한약자원식물의방제기술개발가능성을알아보기위하여실험을진행하였다. MP 52

韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2018;6(1):51-64. pissn 2288-5161 / eissn 2288-5293 (Metschnikowia persimmonesis KCTC 12991BP) 균과식물체에서발생할수있는균을순수분리하 여배양한후, 각각 MP 균과식물에서발생할수있는균을대치배양하였다. 또한, 부분적으로대치배 양의방법을다양하게수행하여여러측면에서의실험결과를도출하였고이를이용하여 MP 균이가진 항균력으로인체에무해하고환경문제로부터자유로운저렴한한약기반의천연항균제의개발가능성 을살펴보았다. 본론 1. MP 균배양 실험에앞서대치배양에사용된 Metschnikowia persimmonesis (KIOM G15050 Strain) KCTC 12991BP 을 Stricking 하여계대배양하였다. MP 균주는 2016 년 10 월 21 일국내특허출원( 출원번 호: 10-2016-0137873) 와국제출원 PCT ( 출원번호: PCT/KR2017/003811) 로출원된, 감나무묵은꽃 받침에서분리한 Metschnikowia persimmonesis 특허균주이다. 미생물순수배양을위해 LB (Luria-Bertani) broth 배지와 PD (Potato Dextrose) broth 배지에서공동배양하였다. 배양조건은 50mL tube 에 15mL 배지를넣은후 100rpm 암조건에서 48 시간 incubation 하였다. 현탁된배양액 2mL 을 transfer 하여 agar 가포함된 LB 와 PD 배지에 1 차계대배양하였다. 자세한배양방법및 균생육방법은 Kang et al. (2017) 16) 과 Choi et al. (2018) 21) 에확인할수있다. 1 차적으로계대된미생물들은 single colony 를얻기위해멸균된 streaking stick 을이용하여 3-4 회이상지속적으로계대배양을하였다. 최종적으로 LB 에서자란미생물과 PD 에서자란미생물들은 각각 1.5mL E-tube 에보관하여대치배양진행전까지 glycerol 25% 에현탁하여실험전까지 20 에보관하였다. 2. 식물오염미생물순수분리및균주동정 식물조직배양실험중발생한미생물오염을바탕으로 PDA (Potato Dextrose Agar) 배지와 LBA (Luria-Bertani Agar) 배지에각각배양하였다. 각배지에서생육된미생물을바탕으로육안으로확인 할수있는미생물들을각각분리하였다(Fig. 1). 육안으로확인가능한종류의미생물들만남아있다고 보일때까지계대배양을실시하였다. 한종류의균만남아있다고확인될때, 각각의균들을유전자 동정하기위한샘플링을실시하였다. 순수분리를통해배양한균들을 PDA 와 LBA 배지별로시료확인번호를부여하였다. PDA 와 LBA 배지에서순수분리된박테리아와곰팡이는각각 16s rdna 와 18s rdna 를통하여염기분석을실시 하였다. 본연구에서사용된 DNA sequencing 은 Kang et al. 16) 과 Kim et al. 19) 의논문에서사용된 분석법을이용하였다. 이때사용한 16s rdna 의 universal primer 는 27F (5 -AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3 ) 와 1492R (5 -GGTTACCTTGTTACGACTT-3) 이고, 18s rdna 의 universal primer 는 27F (5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ) 와 492R ('GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ) 이다. 각각의 대상시료는 Nucleotide BLAST (NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 를이용하여균동정을실시 하였다. 동정되지않은미생물의경우재분석을통해분류하였으며, 그후동정된시료는 Table 1 에 나타내었다. 53

강다정외. Metschnikowia persimmonesis KCTC 12991BP 을이용한한약자원식물방제기술개발 Figure 1. 식물조직배양중발생한미생물( 위) 과순수분리된미생물( 아래) 54

韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2018;6(1):51-64. pissn 2288-5161 / eissn 2288-5293 Table 1. DNA sequencing 결과 S/NO Scientific name rdna type 1 Arthrobacter protophormiae 16s 2 Bacillus aryabhattai 16s 3 Curtobacterium citreum 16s 4 Exiguobacterium acetylicum 16s 5 Klebsiella oxytoca 16s 6 Kurthia gibsonii 16s 7 Microbacterium sp. 16s 8 Pantoea agglomerans 16s 9 Pantoea sp 16s 10 Pantoea vagans 16s 11 Staphylococcus saprophyticus 16s 12 Stenotrophomonas rhizophila 16s 13 Streptococcus sp. 16s 14 Actinoplanes sp. 16s 15 Pseudomonas sp. 16s S/NO Scientific name rdna type 1 Aureobasidium pullulans 18s 2 Aureobasidium sp. 18s 3 Bacillus safensis 18s 4 Coprinellus radians 18s 5 Discosia sp. 18s 6 Fungal endophyte 18s 7 Fusarium oxysporum 18s 8 Pestalotiopsis mangiferae 18s 9 Rhizopus oryzae 18s 10 Verticillium dahliae 18s 11 Ganoderma mirabile 18s 12 Phanerochaetesordida 18s 13 Paecilomyces inflatus 18s 14 Chaetomiaceae sp. 18s 15 Plectosphaerella cucumerina 18s 55

강다정외. Metschnikowia persimmonesis KCTC 12991BP 을이용한한약자원식물방제기술개발 3. 대치배양 처음으로계대배양을실시한 Metschnikowia persimmonesis 과이전연구에소개된 19) 식물오염 미생물 group 을 bacteria 는 bead, fungi 는 punch 를이용하여대치배양을실시하였고, 균의특성으 로인해두가지방법모두를이용하였다. 그예로 MP 균과 identification 된식물오염미생물을 각각 stricking 혹은 drop 시켜서접종하는두방법을이용하여대치배양을실시하였다. 또한한천배지에시험균주를골고루접종시키고일정양의항균제를처리한페이퍼디스크등을올려 세균을배양한후항균제가페이퍼디스크로부터한천배지로확산되는원리를이용하였다. 페이퍼디스 크등으로부터멀리확산되어갈수록항균제의농도는낮아지며미생물의생장이이루어지게된다. 이때세균의생장이가능한최소의농도를 MIC( 최소저해농도) 라고하며생장이이루어지지않는 구역을생장저해구역(Zone of Inhibition) 이라고한다. 생장저해구역의직경은페이퍼디스크에가한 항균제의농도및용해도, 확산상수및전반적인효능에비례하며이러한직경의크기를비교함으로써 항균제의활성정도를비교할수있다. 또한농업및임업에서문제가되고있는 4 종병원성 Botrytis cineria, Colletoirichum higginsianum, Sclerotinia sclerotiourm 그리고 Alternaria alternata 과 배양결과전체적으로 MP 균의길항효과를실험하였고대치 4 종모두저해하는길항효과를나타내고있음을확인할수있었다. Table 2. 유전자 identification 된식물오염균과 Metchnichonia persiomensis 의대치배양결과 No. rdna Scientific Name Korean Name Control Result of test Treatment Inhibition 1 16s Arthrobacter protophormiae 아르테르박테르속균 2 16s Bacillus aryabhattai 바실러스아리아바타이 3 16s Curtobacterium citreum 코르토박테리아 - - - 56

韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2018;6(1):51-64. pissn 2288-5161 / eissn 2288-5293 4 16s Exiguobacterium acetylicum 엑시구옴박테리움 5 16s Klebsiella oxytoca 클레브시엘라옥시토카 6 16s Kurthia gibsonii 쿠르티아기브소니 7 16s Microbacterium sp. 마이크로박테리움 - - - 8 18s Pantoea agglomerans 등나무혹병균 9 16s Pantoea sp. 판토에아속균 - - - 10 16s Pantoea vagans 판토에아속균 11 16s Staphylococcus saprophyticus 비병원포도상구균 57

강다정외. Metschnikowia persimmonesis KCTC 12991BP 을이용한한약자원식물방제기술개발 12 16s Stenotrophomonas rhizophila 스테노트로포모나스라이조필라 - - - 13 16s Streptococcus sp. 연쇄상구균 14 16s Actinoplanes sp. 액티노플레인즈 - - - 15 16s Pseudomonas sp. 슈도모나스속균 No. rdna Scientific Name Korean Name Control Results of test Treatment Inhibition 1 18s Aureobasidium pullulans 흑효모 2 18s Aureobasidium sp. 아우레오바시즘속균 3 18s Bacillus safensis 바실러스사펜시스 58

韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2018;6(1):51-64. pissn 2288-5161 / eissn 2288-5293 4 18s Coprinellus radians 노랑쥐눈물버섯 5 18s Discosia sp. 디스코시아속균 6 18s Fungal endophyte 균질내생식물 O 7 18s Fusarium oxysporum 토마토시들음병균 8 18s Pestalotiopsis mangiferae 페스탈로티옵시스 - - - 9 18s Rhizopus oryzae 누룩곰팡이 10 18s Verticillium dahliae 시들음병균, 딜리애균 59

강다정외. Metschnikowia persimmonesis KCTC 12991BP 을이용한한약자원식물방제기술개발 11 18s Ganoderma mirabile 애귀방귀버섯 12 18s Phanerochae tesordida 파네로차에테소디다 - - - 13 18s Paecilomyces inflatus 패실로마이세스속균 O 14 18s Chaetomiaceae sp. 체토미아세균 15 18s Plectosphaerella cucumerina 내생진균속균 Luria-Bertani Agar (LBA) and Potato Dextrose Agar (PDA) was used for this study. O: Highly Inhibited, : Medium Inhibited, : Not Inhibited, : Over growth 60

韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2018;6(1):51-64. pissn 2288-5161 / eissn 2288-5293 Fig 2. Botrytis cineria 외 3종의병원성균에대한 MP균의대치배양결과 61

강다정외. Metschnikowia persimmonesis KCTC 12991BP 을이용한한약자원식물방제기술개발 결론 최근소비자의건강지향적성향과함께천연물에대한수요가급증하고있는데, 이와같은경향과 일치하게천연항균제등천연물을이용한다양한제품을요구하는소비자의욕구를충족할수있는 고기능성자원의개발이필요하다. 특히화장품, 의약품, 식품등에들어가는인공합성보존제의사용을 가능한한줄이려는추세이고, 화학보존제를대체할역할로안정성이확보된천연방부제의개발이 필수적이다. 세계화장품용방부제시장규모는 2014 년 39 억달러규모에서 2016 년에는 43 억달러 규모로, 국내화장품용방부제시장은 2014 년 1,03 억달러에서 2017 년에는 1.12 억달러규모로성장 할것으로보인다. 더나아가각종한약재의저장성향상과안정성확보라는견지에서도천연방부제의개발의중요성이 강조되고있는데현재까지한약재의포장, 보관및가공후저장시충해와곰팡이같은미생물생장의 억제는주로이산화황과같은화학약제의살포로이루어졌다. 비록이산화황이한약재를탕제로달인 경우거의검출되지않아안전하지만, 우리나라소비되는한약재의 70-80% 가수입한약재로서원료 한약재를직접사용하는환, 산제의경우이산화황 10ppm 이상을흡수하게되면몸속에서산으로 바뀌어위염, 위궤양, 인후통을일으키는부작용이있을수있다. 또한 Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nomious 등의 Aspergillus 속곰팡이에의해생성된아플라톡신과같은맹독 소에의한오염을다방지할수는없는실정이다. 그래서한약유래천연물질의항균제로한약재의 포장, 유통, 저장시안전하게품질을관리할수있는보존제의개발이필요한실정이다. 따라서본연구의목적은인체에무해하고환경문제로부터자유로운저렴한한약기반의천연항균제 를개발하는것으로서, 이를위해시체( 柿蔕 ) 추출물로부터분리된 Metschnikowia persimmonesis KCTC 12991BP 균을이용하여항균력을알아보았다. 그결과 MP 균주의항균활성은기보고된 Botrytis cinerea 및 Fusarium oxysporum 곰팡이균뿐만아니라, 본연구에서추가적으로 Fungal endophyte, Paecilomyces inflatus, Colletoirichum higginsianum, Sclerotinia sclerotiourm 그리고 Alternaria alternata 에대한항균활성을가진것으로나타났다. 이특허균주및길항물질이가지는 정균작용 ( 靜菌作用, mycostasis) 22) 과선택적방제효과를이용해식품, 의약품, 화장품에활용되는화 학보존제를대체하여안정성이확보된한약재유래천연방부제를개발할수있을것이다. 그렇게 한다면한약재유래미생물천연보존제이용확대로인한국민보건및안정성이확보되고더나아가 한약자원으로부터분리된미생물에대한약용가치를발굴하여산업소재화를하여세계전통의약시장 을선점하는역할을할것으로사료된다. 감사의글 본연구는한국한의학연구원기술수요맞춤형한약재유래특허균주(KIOM G15050 Strain) 를이용한 화장품보존제개발(K18720&K18721) 및아토피피부염한의치료기술과학적근거구축을위한장내 미생물-면역- 대사융합분석연구(K18211) 의지원을받아수행하였으며, 또한 UST 연구쉽에서함께 연구한학생들과지도교사, 경남과학기술대학교홍점규교수님께깊은감사를드립니다. 62

韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2018;6(1):51-64. pissn 2288-5161 / eissn 2288-5293 참고문헌 1. 문윤희, 이광배, 김영준, 구윤모. 유용미생물 (EM, Effective Microorganisms) 의활용현황. KSBB Journal, 2011;26(5):365-73. 2. 안승원, 이국환. 유용미생물및생광석처리가쪽파의생육및항산화물질생성에미치는영향. 한국 환경과학회추계학술발표회지 2005;14(2):119-23. 3. 강봉균, 송창길. 미생물제액비의엽면시비에따른알타리무의생육및수량형질변화. 한국유기농 업학회지. 2003;11(3):65-73. 4. 석운영, 오주성, 김도훈, 정원복, 정순재. EM 활성액, 키토산및목초액처리가토양미생물상의 변화및잎상추의생육에미치는영향. 한국유기농업학회지. 2004;12(4):427-36. 5. 정순재, 오주성, 석운영, 김정완, 김도훈, 정원복. 키토산, 목초액및 EM 처리가토양미생물상의 변화및토마토의초기생육에미치는영향. 한국유기농업학회지. 2006;14(4):433-43. 6. 윤성탁, 박상헌, 김영휘. 미생물제제를이용한친환경벼생산체계에관한연구 -EM 등친환경농자 재처리수준이벼생육및수량에미치는영향-. 한국유기농업학회지. 2007;15(2):207-18. 7. 한승관. 유용미생물(Effective Microorganisms; EM) 로사양한 EM pork 의육질개선효과. 한국식 품영양과학회지. 2005;34(5):734-7. 8. 강경호, 감상규, 허철구, 이민규. 양돈장분뇨의부숙과정에서 DO 변화와 EM 의첨가에따른오염 물질및악취저감효과의비교. 한국환경과학회지. 2006;15(6):563-9. 9. 문상옥, 나오수, 강봉조, 이영돈. EM( 유용미생물) 첨가사료에의한넙치, Paralichthys olivaceus 의 성장효과. 한국어업기술학회 2000 년도춘계수산관련학회공동학술대회발표요지집. 2000:294-5. 10. 정병곤. 소규모오수처리시설의효율향상을위한 EM(Effective Microorganism) 적용기술. 한국 폐기물자원순환학회지. 2008;25(4):302-9. 11. 이장훈, 정준오, 박승호. 음식폐기물퇴비화에서유효미생물분리및첨가에관한연구. 한국환경 위생학회지. 2000;26(3):1-10. 12. 이은주, 이상모, 이군택, 김인성, 김용학. 태안유출원유의생물정화를위한유용미생물적용. 한국 환경과학회지. 2008;17(7):795-9. 13. 한승관. 돼지고기에대한 EM(Effective Microorganism) 함초발효액의항산화효과. 한국축산식 품학회지. 2004;24(3):298-302. 14. Do Jeong-Su, Choi Youn-Hwa, Seo Hyo-Jung, Ryoo Jae-Hwan, Nam Sang-Yun. Journal of Bacteriology and Virology. 2006;36(1):1-10. 15. 박종명, 박종한, 유영현. 친환경농업을위한농업분야유용미생물확보 연구현황및이에따른 농산물선도관리방안탐색. 농업생명과학연구, 2016;50(1):1-22. 16. Young Min Kang, Ji Eun Choi, Richard Komakech, Jeong Hwan Park, Dae Wook Kim, Kye Man Cho, Seung Mi Kang, Sang Haeng Choi, Kun Chul Song, Chung Min Ryu, Keun Chul Lee and Jung Sook Lee. Characterization of a novel yeast species Metschnikowia persimmo nesis KCTC 12991BP (KIOM G15050 type strain) isolated from a medicinal plant, Korean persimmon calyx (Diospyros kaki Thumb). AMB Express. 2017;7(1):199. 17. 황연성, 최준수, 김연호. Creeping Bentgrass 에서미생물제에의한 Pythium Blight, Brown Patch 및 Dollar Spot 방제효과. 한국식물병리학회지. 1996;12(2):237-44. 63

강다정외. Metschnikowia persimmonesis KCTC 12991BP 을이용한한약자원식물방제기술개발 18. 정수정. 목재부후균(Gloeophyllum trabeum) 에대한길항미생물선발및생물적방제효과조사. 강원대학교대학원. 2015. 19. 김현주, 강주형, 공혜영, 전서연, 김민혜, 박영주, 리차드, 최지은, 강영민. 한약자원식물기반유용 미생물소재개발. 한약정보연구회지, 2017;5(1):49-66. 20. 남승우. 한국잔디의라지패취병원균(Rhizoctonia solani) 에대한길항미생물분리및생물학적 방제. 건국대학교농축대학원. 2006. 21. J.E Choi, S.H Choi, J.S Lee, K.C. Lee, S.M Kang, J.I Kim, M.S Choi, H.G Kim, W.T Seo, K.Y Lee, B.C Moon and Y.M Kang. Analysis of microbial communities in local cultivars of astringe nt persimmon (Diospyros kaki) fruits grown in Gyeongnam Province of Korea. Journal of Environmental Biology. 2018;39(2):237-246. 22. R.C Cooke, V. Satchuthananthavale. Sensitivity to mycostasis of nematode-trapping hyphom ycetes. Transactions of the British Mycological Society. 1968;51(3):555-61. c The Author(s) 2018, khmi.or.kr 64