(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2014-0021789 (43) 공개일자 2014년02월20일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A23C 9/123 (2006.01) (21) 출원번호 10-2012-0087911 (22) 출원일자 2012 년 08 월 10 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 3 항 2012 년 08 월 10 일 (71) 출원인 임실군 전라북도임실군임실읍중동 1 길 14 재단법인임실치즈과학연구소 전북임실군성수면도인리 3-3 (72) 발명자 정후길 전라북도임실군임실읍운수로 33-22 신우아파트 713 호 김명진 전라북도임실군관촌면관촌리 405 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 고만호 (54) 발명의명칭프로바이오틱스유산균을활용한발효유제조방법 (57) 요약 본발명은프로바이오틱스유산균을활용한면역활성증진발효유및그제조방법에관한것으로, 원유를이용한발효유제조방법에있어서, 프로바이오틱스유산균인 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 및 ABT-5 유산균을동시에접종하여발효시키는단계를포함하는것을특징으로하는프로바이오틱스유산균을활용한면역활성증진발효유제조방법을개시한다. 대표도 - 도 1-1 -
(72) 발명자 허창기 전라남도순천시조례연동길 5 연동대주파크빌 3 차아파트 3 차 315 동 40 호 최희영 전라북도임실군임실읍운수로 33-22 신우아파트 1206 호 박종혁 전북전주시덕진구거북바우 3 길 15, 108 동 603 호 ( 금암동, 금암중앙하이츠아파트 ) 오현희 전라북도전주시완산구우전 1 길 40 풍림아이원아파트 103 동 904 호 양희선 전라북도전주시완산구용머리로 20 현대아파트 106 동 1202 호 김경희 전라북도임실군임실읍운수로 33-22 신우아파트 1005 호 오전희 전라북도전주시완산구거마평로 139 삼성효자타운 102 동 1012 호 이승구 전라북도임실군임실읍이도리 736-2 번지 3 층 30 1 호 최하늘 경상남도진주시금산면금산로 22 ( 진주금산진흥더루벤스 ) 104 동 602 호 - 2 -
특허청구의범위청구항 1 발효유제조방법에있어서, 프로바이오틱스유산균인 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주및 ABT-5 균주를동시에접종하여발효시키는단계를포함하는것을특징으로하는프로바이오틱스유산균을활용한면역활성증진발효유제조방법. 청구항 2 제1항에있어서, 상기접종되는 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P와 ABT-5 균주의첨가량은원유 100중량부에대하여 0.01중량부인것을특징으로하는프로바이오틱스유산균을활용한면역활성증진발효유제조방법. 청구항 3 제1항또는제2항에있어서, 상기 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P와 ABT-5 균주의혼합비율은중량비로 0.3~0.7 대 0.7~0.3인것을특징으로하는프로바이오틱스유산균을활용한면역활성증진발효유제조방법. 명세서 [0001] 기술분야본발명은프로바이오틱스유산균을활용한면역활성증진발효유및그제조방법에관한것으로, 원유를이용한발효유제조방법에있어서, 프로바이오틱스유산균인 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 및 ABT-5 유산균을동시에접종하여발효시키는단계를포함하는것을특징으로하는프로바이오틱스유산균을활용한면역활성증진발효유제조방법에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] 배경기술현재건강과장수에대한관심증가로인해소비자들의건강기능성소재나제품에대한수요가많아지고있는실정이며, 연구가이루어지고있는기능성분야도매우다양화되고있는추세인데, 그중면역활성증진소재발굴및제품개발연구도한부분을차지하고있다. 발효유제품은최근신세대식품문화서구화에힘입어소비증대탄력성이높고새로운미래식량으로자리잡아가고있다. 하지만최근한미및한EU간 FTA 체결로인하여국내낙농산업에미치는영향을보면국산원유가격이국제가격보다 2~3배높고, 이로인해유제품의제조원가도수입유제품가격보다 2배이상높아지기때문에많은영향을받을것으로전망하고있다. 따라서, FTA 대비국산발효유제품의제품경쟁력을위해서는기능성, 원가절감, 소비자기호성부응으로극복해야한다. 현재프로바이오틱스유산균은건강을추구하는현대인에게성인병관련질병예방및치료측면에서각광을받고있다. 프로바이오틱스란체내에들어가서건강에좋은효과를주는살아있는미생물을말한다. 프로바이오틱스로이용되는미생물의현재까지알려진유형을보면유산균이 Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Bifidobacterium 속으로프로바이오틱스미생물중가장높은비율을차지하고있고, 효모 Saccharomyces, Tornlopsis 속, 곰팡이 Aspergillus 속, 세균 Bacillus, Clostridium 속등이프로바이오틱스효과가있다고보고되어있다. 프로바이오틱유산균은면역증강능을비롯해병원성세균억제능, 콜레스테롤저하능, 항돌연변이원성및항암효과가있는것으로보고되어있다. 또한감염증치료및예방, 소화기능증진, 항콜레스테롤작용, 항암작용, 숙주면역기능자극, 질감염증억제, 항알레르기작용, 비타민섭취증진, 변비예방등에다양한효능이있는것으로밝혀지고있는실정이다. - 3 -
[0007] [0008] [0009] [0010] 이에따라본연구를통하여면역기능을가지는프로바이오틱스를이용한기능성발효유를개발하여유가공분야의저변확대를도모하고, 유가공업체의경쟁력을향상시킬수있는토대를마련하고자하는데그목적이있다. 유럽과일본에서는 L. rhumnosus GG (Valio, Finland), L. casei Shirota (Yakult, Japan) 등의유산균을분리하여우수한기능을가진프로바이오틱스로개발하였으며, L. brevis, L. reuteri, L. sali-varius, L. gallinarum 등의균주를대상으로다양한기능에대한연구가활발히진행되고있다. 국내에서도마찬가지로김치등의발효식품, 동물, 인체유래균주를분리하여프로바이오틱스로사용하기위한연구가활발히진행중이며, 기능성유제품개발또한연구가이루어지고있는실정이다. 2008년프로바이오틱스 (probiotics) 시장은 159억달러로 2013년까지 196억달러로연평균 4.3% 성장이예상되고있다. 이중일본이전세계프로바이오틱스시장의 39.5% 를점유하고있으며위궤양원인균감소요구르트, 충치균억제유산균첨가과자, 알러지감소음료등을개발하였다. 유럽, 일본등선진국에서는유전자재조합에의한기능성강화프로바이오틱유산균를이용한식품개발및의학적적용을집중적으로추진중에있고, 특히유럽은프로바이오틱스와항산화제가기능성식품시장을주도하고있으며 90년대부터 60여개연구소가참여, 프로바이오틱스유산균을집중연구하는프로젝트를진행중에있다. 이렇게프로바이오틱스시장이점차커지고있는실정에맞춰본연구팀또한프로바이오틱스제품개발을통해시장경쟁력을갖추고자한다. 종래에기능성재료를함유한발효유가개발되었는바, 등록특허공보제10-064139호에는칡추출물을이용한소플라본이강화된기능성칡유산균발효유의제조방법이개시되어있고, 공개특허공보제10-2010-0137918호에는인삼분말을이용한식초분해인삼을활용한기능성발효유제조방법이개시되어있으며, 공개특허공보제10-2007-0109185호에는브로콜리새싹추출물을이용하여헬리코박터파이로리균저해능을가진유산균발효유의제조방법이개시되어있고, 공개특허공보제10-2007-0087786호에는흰털오가피추출물을함유하는발효유및그제조방법이개시되어있다. 발명의내용 [0011] [0012] 해결하려는과제본발명은프로바이오틱스유산균의면역활성효과를측정하고, 이를유산균발효유에적용하여면역활성기능성유제품을제공하는데그목적이있다. 또한, 본발명은유가공분야의저변확대를도모하고, 유가공업체의경쟁력을향상시킬수있는토대를마련하는데그목적이있다. [0013] [0014] [0015] 과제의해결수단상기와같은목적을달성하기위하여, 본발명에따른프로바이오틱스유산균을활용한면역활성증진발효유제조방법은발효유제조방법에있어서, 프로바이오틱스유산균인 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 및 ABT-5 유산균을동시에접종하여발효시키는단계를포함하는것을특징으로한다. 또한, 본발명에서접종되는 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P와 ABT-5 유산균의첨가량은원유 100중량부에대하여 0.01중량부인것을특징으로한다. 또한, 본발명에서상기 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P와 ABT-5는혼합비율은중량비로 0.3~0.7 대 0.7~0.3 인것을특징으로한다. [0016] [0017] [0018] 발명의효과본발명에따르면, 프로바이오틱스유산균을활용하여산면역활성증진발효유를제공할수있다는효과가있다. 또한, 본발명은가공분야의저변확대를도모하고, 유가공업체의경쟁력을향상시킬수있다는효과가있다. 또한, 본발명은면역력약화로인한다양한질병에노출된현대인에게면역활성증진발효유를이용하여편리하고부담없는소비로면역력증진을기대할수있다는효과가있다. - 4 -
[0019] 도면의간단한설명 도 1 은본발명에따른본발명에따른 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를첨가한발효유제조공정. 도 2는 RAW 264.7 세포에서 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액에대한 RAW 264.7 세포의증식정도를알아본결과를나타낸그래프. 도 3은배양액의농도변화에따른 RAW 264.7 세포의형태변경사진. 도 4는 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액이 NO 생성에미치는영향을조사하기위하여 RAW 264.7 세포에배양액을 0~2.5 mg/ml의농도로처리하여 2시간미리반응시킨후 LPS 1 ug/ml의농도로 24시간더자극하여농도에따른 NO의생성량을측정한결과그래프. 도 5a 내지 5c는 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극에의하여염증성사이토카인 (IL-1β, IL-6 및 TNF-α) 이생성되는과정에서프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액의효과를 ELISA법으로확인한결과. 도 6은 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액이 RAW 264.7 세포에서 heme oxygenase-1의발현에관여하는지확인하기위해배양액을농도별 (0~2.5 mg/ml) 로처리하여 heme oxygenase-1의발현여부를 ELISA법으로측정한결과. 도 7은도 7은 RAW 264.7 세포에서농도의존적으로 heme oxygenase-1의발현을유도함으로써 NO 및염증성사이토카인 (IL-1β, IL-6 및 TNF-α) 의생성억제모델. 도 8은본발명에따른 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P를첨가한발효유의발효과정에서의 ph 변화를나타낸그래프. 도 9는 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와상용균주 (ABT-5) 의혼합비율을달리한발효유의발효중총산함량측정결과. [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] 발명을실시하기위한구체적인내용본발명은프로바이오틱스유산균을활용한면역활성증진발효유제조방법에관한것으로, 원유에프로바이오틱스유산균과 ABT-5를혼합첨가하여발효시켜제조되는발효유제조방법에관한것이다. 본발명에따른발효유의제조는원유 100중량부에대하여정백당 5중량부와탈지유 3중량부를혼합 (Mixing) 하여 95, 5분간살균후 43 로냉각한다음프로바이오틱스유산균인 Probacillus sp YH KCCM 10887P 균주와널리사용되고있는상용균주인 ABT-5(Lactobacillus acidophilus, Bifidobacteria, Streptococcus thermophilus, Chr. Hansen, Denmark) 균주를각각 0.1g:0g, 0.03g:0.07g, 0.05g:0.05g, 0.07g:0.03g 및 0g:0.1g 비율로 0.01%(0.1g/kg) 씩을접종하여 37 ~ 43 에서 5시간배양하여제조하였다. 이후 15~20 까지냉각하고 4 에서보관한다. 본발명에따른프로바이오틱스유산균을활용한면역활성증진발효유개발이라는목적을달성하기위하여본발명에서의개발범위는다음과같다. 1. 프로바이오틱스유산균배양액면역활성평가 (in-vitro) (1) Nitric acid 생성억제능을측정한다. (2) 염증성사이토카인생성억제능을측정한다. (3) Heme oxygenase-1의발현여부를측정한다. 2. 프로바이오틱스유산균을첨가한발효유의최적제조조건확립 (1) 상업적균주 ABT-5와프로바이오틱스유산균의혼합비율에따른발효유를제조한다. (2) 혼합비율에따른발효유의최적제조조건을확립한다. 3. 프로바이오틱스유산균을첨가한발효유의품질분석 (1) 혼합비율에따른발효유의 ph, 적정산도, 점도등을측정하여품질특성을확인한다. (2) 혼합비율에따른발효유의유산균수를측정하여프로바이오틱스유산균의배양상태를확인한다. - 5 -
[0033] [0034] [0035] [0036] [0037] 4. 발효유의영양성분분석및기준규격검사 (1) 발효유의영양성분을분석한다. (2) 발효유의기준규격검사를실시한다. 5. 발효유의관능평가 (1) 발효유에대한관능평가를실시한다. [0038] 본발명에따른면역활성증진발효유개발에사용한프로바이오틱스유산균은전남대학교동물자원학과에서분리한 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P를사용하였고 ( 특허제10-0979917호 ), 상업용균주는 ABT- 5(Lactobacillus acidophilus, Bifidobacteria, Streptococcus thermophilus, Chr. Hansen, Denmark) 를사용하였다. 발효유제조에사용된우유는임실지역목장형유가공업체에서착유한우유를사용하였으며, 면역활성효과측정에사용된재료로는 HO-1 발현은 EIAab (China), 염증성사이토카인 (IL-1β, IL-6 및 TNF-α) 의발현은 R&D system (USA) ELISA kit를각각구입하여정량에사용하였다. 세포배양에사용된 RPMI 1640 배지, FBS 와 PrestoBlue TM cell viability reagent 는 Gibco (USA), NO 측정을위한 Griss reagent system 은 Promega (USA) 에서구입하여사용하였다. [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] 본발명에사용되는 Lactobacillus sp YH는특허제10-0979917호에개시된미생물수탁번호 KCCM 10887P로기탁된미생물이며. 그상세한내용은특허제10-0979917호의특허공보에기재되어있다. 본발명을위하여연구진행의개요는다음과같다. 1. Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의면역활성증진효능평가가. 배양액조제프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의배양액조제는 5 ml MRS 액체배지에접종하여 37 에서 24시간동안정치하면서전배양하였다. 100 ml MRS 액체배지에 1% 의전배양액을접종하고 37 에서 24 시간동안본배양한후배양액을 4 에서원심분리 (9,500 g, 15 min) 하여얻은상등액을 0.45μm membrane filter(advantec MFS, Inc., Japan) 로제균한후상등액을동결건조하였다. 동결건조후 4 에보관하며필요시덜어활성측정용으로사용하였다. [0044] [0045] 나. 세포배양 실험에사용한 RAW 264.7 세포는한국세포주은행에서분양받아형태를관찰하며 10 회이하로계대배양한세포를 실험에사용하였다. RAW 264.7 세포는 10% FBS 가첨가된 RPMI 1640 배지를사용하여 37, 5% 의 CO 2 인큐베이터 에서 2~3 일마다계대배양하며실험에사용하였다. [0046] [0047] 다. 세포증식능측정 프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 의배양액이 RAW 264.7 세포성장에미치는영향을판 정하기위해 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 4 10 5 cells/well의수로계대배양하고 24시간안정화시켰다. 프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의배양액을농도별 (0~10 mg/ml) 로처리하여 24시간반응후 PrestoBlue TM 시약을 10μl씩첨가하였다. 반응 20분후 ELISA reader (DYNEX, USA) 로 570 nm (reference 600 nm) 에서흡광도를측정하였다. 세포의증식정도는대조군의흡광도에대한백분율로나타냈다. [0048] [0049] 라. NO 생성량측정프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의배양액이 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극을통해생성되는 NO를억제할수있는지확인하기위해 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 4 10 5 cells/well의수로계 - 6 -
대배양하고 24시간안정화시킨다. 세포독성실험을통해독성을보이지않는프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의배양액을농도별 (0~2.5 mg/ml) 로희석하여처리하고 2시간후 1 μg/ml의농도로 LPS를처리하여 24시간더반응시켰다. 반응종료후세포배양액 100 μl와동량의 Griess reagent를첨가하여 20분후 ELISA reader (DYNEX, USA) 로 530 nm에서흡광도를측정하였다. Nitrite의농도는 sodium nitrite를이용하여 64 μm까지 2배씩희석하여얻은표준곡선과비교하여계산하였다. [0050] [0051] 마. 염증성사이토카인생성량측정프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의배양액이 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극을통해생성되는염증성사이토카인 (IL-1, IL-6 및 TNF-α) 을억제할수있는지확인하기위해 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 4 10 5 cells/well의수로계대배양하고 24시간안정화시켰다. 세포독성실험을통해독성을보이지않는프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의배양액을농도별 (0~2.5 mg/ml) 로희석하여처리하고 2시간후 1 μg/ml의농도로 LPS를처리하여 24시간더반응시켰다. 반응종료후 ELISA kit를이용하여염증성사이토카인의발현량을측정하였다. IL-1β의농도는 400 pg/ml, IL-6의농도는 250 pg/ml, 그리고 TNFα의농도는 700 pg/ml까지 2배씩희석하여얻은표준곡선과비교하여계산하였다. [0052] [0053] 바. Heme oxygenase-1 발현 RAW 264.7 세포내에서프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의배양액에의한 heme oxygenase-1의발현여부를확인하기위해 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 4 10 5 cells/well의수로계대배양하고 24시간안정화시킨다. 세포독성실험을통해독성을보이지않는프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의배양액시료를농도별 (0~2.5 mg/ml) 로희석하여처리하고 18시간반응후 ELISA kit를이용하여 heme oxygenase-1의발현량을측정하였다. Heme oxygenase-1의농도는 5 ng/ml까지 2배씩희석하여얻은표준곡선과비교하여계산하였다. [0054] [0055] [0056] 발효유제조가. 발효유제조용스타터균제조발효유제조용스타터균제조는전남대에서분양받은프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P를 100 ml MRS 액체배지에접종하여 37 에서 24시간동안정치하면서 1차배양하고, 1 L MRS 액체배지에 1차배양액을접종하여 37 에서 24시간동안계대배양하였다. 배양된액을원심분리하여상등액을제거한다음남은균체를멸균된 0.85% saline 용액을사용하여현탁시켜세척하였다. 동일한방법으로세척과정을반복한후마지막원심분리된균체를동결건조기를사용하여동결건조하였다. 동결건조된시료의스타터균제 조용으로적합성유무를판별하기위해 0.1 g 을사용하여균수측정결과 1.0 10 11 /g 으로요구르트제조용스타 터균주로사용가능함을확인하였다. 동결건조된균을초저온냉동고 (-80 ) 에보관하여발효유제조에사용 하였다. [0057] [0058] [0059] [0060] 나. 프로바이오틱스유산균과시판스타터 (Starter) 첨가비율에따른발효유제조조건확립 1) 발효유제조방법발효유의제조는원유 1000g에정백당 50g와탈지유 30g를혼합 (Mixing) 하여 95, 5분간살균후 43 로냉각한다음 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와 ABT-5(Lactobacillus acidophilus, Bifidobacteria, Streptococcus thermophilus, Chr. Hansen, Denmark) 균주를각각 0.1g:0g, 0.03g:0.07g, 0.05g:0.05g, 0.07g:0.03g 및 0g:0.1g 비율로 0.01%(0.1g/kg) 씩을접종하여 43 에서 5시간배양하여제조하였다. 이후 15 까지냉각하고 4 에서보관하였다. 본발명에따른 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를첨가한발효유제조공정이도 1에도시되어있다. - 7 -
[0061] [0062] [0063] 2) 발효유의품질특성확인 가 ) ph 측정 ph 는 ph meter [istek. Co. Ltd, Model ph-200l, Korea] 를이용하여측정하였다. [0064] [0065] 나 ) 적정산도 (Titratable Acidity) 측정적정산도는발효유 10 g에증류수 10 ml를혼합하여현탁액을만든후이현탁액을 NaOH를첨가하여 ph 8.3까지적정하고사용된 NaOH의적정량을 0.05 ml까지정밀하게기록하여적정산도측정법 ( 산업자원부기술표준원 ) 의계산식에의한방법으로 NaOH의소비량에유산의환산계수인 0.9를곱한후검체의무게 (g) 를나누어나타낸값을적정산도 (%) 로하였다. [0066] [0067] 다 ) 점도측정 발효유의점도측정은 Brookfield-Viscometer (DVⅡ+pro, Brookfield Engineering, U. S. A) 를사용하여 spindle No. 63, speed 30 rpm 조건으로 3 분간씩 3 반복측정하였다. [0068] [0069] 라 ) 유산균수의측정 유산균수측정은발효유전후시료를십진희석법으로희석하여평판배양법으로 BCP 한천배지 (Difco, U.S.A.) 에 1 ml 씩분주하고 37 에서 48 시간동안배양하여노랑색콜로니를계수하여유산균수로표시하였다. [0070] [0071] [0072] 3) 영양성분분석과기준규격검사가 ) 영양성분분석발효유의영양성분은식품공전에준하는분석법에의해열량을포함한 9대영양성분을분석하였다. 표 3은본발명에따른 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P를첨가한발효유의영양성분분석항목이다. [0073] 분석항목영양소열량, 조지방, 조단백, 총탄수화물, 나트륨, 수분, 회분, 포화지방, 당류, 콜레스테롤, 트랜스지방 표 3 [0074] [0075] 나 ) 기준규격검사발효유의기준규격검사는식품공전및축산물위생시험법에준하는분석법에의해유고형분, 보존료, 살모넬라, 리스테리아모노사이토제네스, 대장균에대한기준규격검사를실시하였다. 모든검사는식품공전및축산물위생시험법에준하는분석법에의해분석하였다. 표 4는본발명에따른 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 를첨가한발효유의기준규격분석항목이다. 표 4 [0076] 분석항목발효유유고형분 유산균수 살모넬라 리스테리아모노사이토제네스 대장균 [0077] 4) 관능검사 - 8 -
[0078] 발효유의상품화를위한최적공식 (Formulation) 을선발하기위하여다음과같은발효유를제조하여관능검사를실시하였다. 평가는전북대학교, 순천대학교학생과임실군민을대상으로 9점척도법을사용하며대단히좋아함 9점, 아주좋아함 8점, 보통좋아함 7점, 약간좋아함 6점, 좋지도싫지도않음 5점, 약간싫어함 4점, 보통싫어함 3점, 아주싫어함 2점, 대단히싫어함 1점으로검사하였다. 결과의통계처리는 SPSS program을이용한 Duncan's multiple range test로유의성을검증하였다. 표 5는본발명에따른 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P를첨가한발효유의관능검사분석항목이다. [0079] 샘플번호 A100K0 A70K30 A50K50 A30K70 A0K100 1. 색감 (Color) 2. 향미 (Flavor) 3. 맛 (Taste) 4. 조직감 (Texture) 5. 전체적인선호도 (Overall) 표 5 [0080] [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] 연구결과및고찰 1. Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의면역활성증진효능가. RAW 264.7 세포증식능 RAW 264.7 세포에서프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액에대한 RAW 264.7 세포의증식정도를알아본결과는도 2와같다. 배양액을 0~10 mg/ml의농도로희석하여 RAW 264.7 세포에 24시간동안반응시킨결과, 2.5 mg/ml의농도까지는대조군과비교하여세포의성장에영향을미치지않았으며 5 mg/ml 이상의농도에서는 RAW 264.7 세포의성장을억제하였다. 또한형태학적인관찰에서도배양액이 2.5 mg/ml 농도까지는 RAW 264.7 세포의형태를변화시키지않은반면, 5 mg/ml의농도이상에서는 RAW 264.7 세포의성장을둔화되고형태가변화됨을확인할수있었다 ( 도 3). 이에 RAW 264.7 세포에대한프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액의면역관련실험에사용할농도는독성을보이지않는안전한농도인최대 2.5 mg/ml까지로결정하였다. 도 2는 RAW 264.7 세포에서프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액에대한 RAW 264.7 세포의증식정도를알아본결과를나타낸그래프이다 (Data shown are the means±sd. * p<0.05, ** 0.01 versus a media alone treated group. culture medium of probiotic lactic acid bacteria.). 도 3은배양액의농도변화에따른 RAW 264.7 세포의형태변경사진이다 ( 확대율, 200). 여기에서 (A): None, (B): 1 mg/ml, (C): 2.5 mg/ml, (D): 5 mg/ml, (E): 10 mg/ml이다. [0086] [0087] 나. NO 생성량프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액이 NO 생성에미치는영향을조사하기위하여 RAW 264.7 세포에배양액을 0~2.5 mg/ml의농도로처리하여 2시간미리반응시킨후 LPS 1 ug/ml의농도로 24 시간더자극하여농도에따른 NO의생성량을측정한결과는도 4와같다 ( * p<0.05, ** p<0.01 versus a LPS alone treated group.). LPS를단독투여한대조군에서 NO의생성이 39.47±1.18 um이었으나, 배양액을 0.25, 0.50, 1 및 2.5 mg/ml의농도로처리하였을때각각 37.49±1.50 um 33.79±3.93 um, 34.96 ±0.56 um, 21.69 ±0.91 um로측정되어프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액이농도의존적으로 NO의생성을억제하는것을확인하였다. 이는 LPS 자극으로부터 NO의생성을억제하는것으로프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액이외부자극에대한산화스트레스로부터세포를보호할수있음을알수있는결과라할수있다. [0088] [0089] 다. 염증성사이토카인생성량 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극에의하여염증성사이토카인 (IL-1β, IL-6 및 TNF-α) 이생성되는과정에서프로 - 9 -
바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액의효과를 ELISA법으로확인한결과는도 5a 내지 5c와같다. RAW 264.7 세포에배양액을 0~2.5 mg/ml의농도로처리하여 2시간미리반응시킨후 LPS 1 ug/ml의농도로 24시간더자극하여농도에따른염증성사이토카인의생성량을측정하였다. LPS를첨가한 RAW 264.7 세포에서 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의생성량이모두유의적으로증가하였다. 그러나 LPS와함께프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액을첨가한경우에는염증성사이토카인의생성이농도의존적으로감소하는경향을보였다. 특히 IL-1β과 IL-6의경우, 2.5 mg/ml의농도에서 IL-1β는 45%, IL-6은 24% 의유의적인감소를보였다. 이는프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액이 LPS로활성화된 RAW 264.7 세포에서염증성사이토카인의생성을감소시켜세포를보호한다는것을알수있는결과라할수있다. 그러나염증성사이토카인억제에관한프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액의보다정확한결과를얻기위해서 RNA 및단백질수준에서의추가적검증이필요할것으로사료된다. [0090] 도 5a 내지 5c는 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극에의하여염증성사이토카인 (IL-1β, IL-6 및 TNF-α) 이생성되는과정에서프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액의효과를 ELISA법으로확인한결과이며, (A): IL-1β, (B): IL-6, (C): TNF-α이다 (Data shown are the mean±sd. * p<0.05, ** p<0.01 versus a LPS alone treated group.). [0091] [0092] [0093] 라. Heme oxygenase-1 발현프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액이 RAW 264.7 세포에서 heme oxygenase-1의발현에관여하는지확인하기위해배양액을농도별 (0~2.5 mg/ml) 로처리하여 heme oxygenase-1의발현여부를 ELISA법으로측정한결과는도 6과같다 (Data shown are the mean±sd. * p<0.05, ** p<0.01 versus a media alone treated group.). 프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액을농도별로첨가하고 18시간후 heme oxygenase-1의농도는시료를첨가하지않은대조군 (1.54±0.11 ng/ml) 에비해농도의존적으로발현이증가하였다. 이상의결과들을종합하여볼때, LPS로자극된 RAW 264.7 세포에서프로바이오틱스유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액은 2.5 mg/ml 이하에서농도의존적으로 heme oxygenase-1의발현을유도함으로써 NO 및염증성사이토카인 (IL-1β, IL-6 및 TNF-α) 의생성을억제하는것으로판단되었다 ( 도 7). 도 7은 RAW 264.7 세포에서농도의존적으로 heme oxygenase-1의발현을유도함으로써 NO 및염증성사이토카인 (IL-1β, IL-6 및 TNF-α) 의생성억제모델이다. [0094] [0095] [0096] [0097] 2. 발효유의품질특성가. ph Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와상용균주 (ABT-5) 의혼합비율을달리한발효유의발효중 ph 측정결과는도 8과같다. 발효시간에따른 ph 변화를보면 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 단일균주로발효한발효유는 ph 변화가보이지않았고, 그외시료군에서는발효가진행된후 1시간째부터급격히감소하는경향을보였다. 발효가완료되는시점을보면 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 단일균주로발효시킨시료를제외한 4개시료군은발효 4시간후발효종말점인 4.6이하에도달하였으나 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 단일균주로발효시킨시료구는발효 4시간후에도 6.5로종말점에도달하지못했고발효 24시간째종말점인 4.6이하에도달하였다. 도 8은 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P를첨가한발효유의발효과정에서의 ph 변화를나타내며, 여기에서 A100K0는 ABT-5 0.1g을첨가한것이고, A70K30는 ABT-5 0.07g과 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 0.03g을첨가한것이며, A50K50는 ABT-5 0.05g과 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 0.05g을첨가한것이고, A30K70는 ABT-5 0.03g과 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 0.07g을첨가한것이며, A0K100는 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 0.1g을첨가한것이다. [0098] [0099] 나. 적정산도 (%) Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와상용균주 (ABT-5) 의혼합비율을달리한발효유의발효중총산함량 - 10 -
측정결과는도 9와같다. 발효시간에따른총산함량변화를보면 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 단일균주로발효한발효유는총산함량변화가보이지않았고, 그외시료군에서는발효시간이경과할수록높아졌다. 발효 4시간후시료구별총산함량은 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 단일균주로발효시킨시료구는 0.19% 로가장낮은함량을보였고, Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 단일균주로발효시킨시료구를제외한 4개시료군은 0.56~0.59% 로유의적차이를보이지않았다. [0100] [0101] 다. 점도 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와상용균주 (ABT-5) 의혼합비율을달리한발효유의점도 (cps) 측정결과는표 8과같다. 발효전의점도는모든시료구에서유의적인차이를보이지않았고발효 4시간후에는 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 단일균주로발효한발효유를제외한 4개의시료군에서점도가급격히증가하였다. Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 단일균주로발효한발효유의경우는발효전점도와발효 4시간후의점도가비슷한값을나타냈다. [0102] 표 8 Fermentation A100K0 A70K30 A50K50 A30K70 A0K100 time(hrs) 0 320 320 480 160 320 4 16,796 18,876 17,916 18,556 240 [0103] [0104] 라. 유산균수 발효유에서유산균수는품질을평가하는데핵심적으로작용하는요인중에하나로서 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와상용균주 (ABT-5) 의혼합비율을달리한발효유의발효중유산균수 (CFU/mL) 측정결과는표 9 와 같다. 발효전의유산균수를보면 1.8 10 4 ~6.7 10 4 CFU/mL로유의적인차이를보이지않았으나발효 4일째의시료구별유산균수는유의적인차이를보였다. Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를단독배양한시료구의경우 3.4 10 5 CFU/mL 로발효전의유산균수와비교해큰차이를보이지않았다. 이는 ph 및적정산도측정에서도정상적인값을보이지않아발효가정상적으로진행되지않았거나발효진행속도가늦어짐을알수있었다. 정상적으로발효된 4개의시료군중상용균주 (ABT-5) 100% 를사용한시료구의경우 1.8 10 7 CFU/mL 를나타난반면 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와상용균주 (ABT-5) 를혼합배양한시료구의경우는 2.5 10 9 ~2.9 10 9 CFU/mL 로상용균주 (ABT-5) 100% 를사용한시료구보다오히려높은유산균수를보였다. 이러한결과를볼때면역활성증진효과가있는 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주단독배양만으로는발효유제조가다소어려울것으로판단되지만상용균주와의적절한혼합비율을찾아제조한다면상용균주만을사용해제조한발효유보다품질이향상될뿐만아니라기능성또한부여될것으로판단된다. [0105] Fermentation time(hrs) 0 1 2 3 4 표 9 A100K0 A70K30 A50K50 A30K70 A0K100 4.8 10 4 6.7 10 4 5.4 10 4 5.6 10 4 1.8 10 4 9.3 10 4 5.0 10 5 9.7 10 5 7.7 10 5 4.5 10 4 1.4 10 5 5.5 10 6 3.4 10 6 7.5 10 6 3.3 10 4 6.5 10 6 8.5 10 8 7.9 10 8 8.8 10 8 5.1 10 4 1.8 10 7 2.5 10 9 2.8 10 9 2.9 10 9 3.4 10 5 [0106] [0107] 마. 영양성분과기준규격 1) 9 대영양성분 - 11 -
[0108] [0109] Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와상용균주 (ABT-5) 의혼합비율을달리한발효유의영양성분을측정한결과는표 10과같다. 앞서 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를단독배양한시료구의경우발효가정상적으로진행되지않아영양성분검사및품질기준규격검사에는제외를시켰다. Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를단독배양한시료구를제외한 4개의시료군에대한 9대영양성분을측정한결과 100 g을기준으로열량 86~88 kcal, 수분 81.40~82.04 g, 조지방 3.35~3.56 g, 포화지방 2.39~2.54 g, 조단백 3.54~4.19 g, 회분 0.78~0.80 g, 탄수화물 9.90~10.24 g, 콜레스테롤 11.01~12.32 mg이었고, 비중은 1.062~1.063 이었으며, 시료군에대한유의적인차이를보이지않았다. Table 10. Nutritive components of yogurt added Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 표 10 [0110] 검사항목 A100K0 A70K30 A50K50 A30K70 열량 (Kcal/100g) 86 87 87 86 수분 (g/100g) 82.04 81.91 82.02 81.97 회분 (g/100g) 0.78 0.79 0.80 0.78 탄수화물 (g/100g) 10.13 10.08 9.90 10.11 조단백질 (g/100g) 3.54 3.70 3.72 3.79 조지방 (g/100g) 3.52 3.56 3.56 3.35 트랜스지방 (g/100g) 0.0918 0.0926 0.0945 0.0882 당류 (g/100g) 8.4731 8.1953 8.5272 8.1617 포화지방 (g/100g) 2.5152 2.5460 2.5453 2.3980 콜레스테롤 (mg/100g) 11.0184 12.3244 12.1645 11.4920 비중 1.063 1.062 1.062 1.062 [0111] [0112] 2) 품질기준규격 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와상용균주 (ABT-5) 의혼합비율을달리한발효유가식품공전상의품질기준규격에적합한지를판정하기위해무지고형분, 유산균수, 대장균군, 살모넬라, 리스테리아모노사이토제네스총 5개항목에대하여검사를실시한결과는표 11과같다. 무지고형분은 10.08~10.90% 로공전규격상 3.0% 보다 3 배 % 가량많았으며, 유산균수역시모든샘플이기준규격인 10 7 이상이었다. 또한살모넬라, 리스테리아모노사 이토제네스및대장균에서도음성으로나타나발효유제품에대한기준규격을만족하였다. 이러한결과를볼때 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를첨가하여제조한발효유는제품화함에적합하다고판단된다. 표 11 [0113] 검사항목 공전규격 A100K0 A70K30 A50K50 A30K70 무지고형분 (%) 3.0이상 10.30 10.18 10.25 10.42 유산균수 1ml당 10 7 이상 2.0x10 7 1.6x10 9 1.8x10 9 1.7x10 9 대장균군 n=5, c-=2, m=0, M=10 0 0 0 0 살모넬라 음성이어야한다. 음성 음성 음성 음성 리스테리아모노 음성이어야한다. 음성 음성 음성 음성 사이토제네스 [0114] [0115] 바. 관능검사 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와상용균주 (ABT-5) 의혼합비율을달리한발효유의관능검사결과는표 12와같다. Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를단독배양한시료구의경우색, 향, 맛, 조직감및전체기호도항목모두가장낮은기호도를보였다. 이는앞서품질측정결과에서언급했듯이 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를단독배양했을경우발효가정상적으로이루어지지않아나타난결과라사료된다. Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를단독배양한시료구를제외한 4개시료군의관능평가결과를보면색은유의적차이를보이지않았고, 향, 맛, 조직감및종합기호도는 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와상용균주 (ABT-5) 0.07 g: 0.03 g (0.1 g/l) 비율로첨가한시료구가가장높은기호도를보였다. 이러한결과를통해면역활성효과가확인된 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를이용해발효유를개발할경우 - 12 -
Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와상용균주 (ABT-5) 0.07 g: 0.03 g (0.1 g/l) 비율로제조하는방법이 적당한방법이라판단된다. 표 12 [0116] Sample Sensory evaluation Color Flavor Taste Texture Overall A100K0 7.2±0.79 1)b)2) 7.0±1.15 bc 7.2±1.37 bc 6.8±1.43 b 7.0±1.53 b A70K30 A50K50 A30K70 A0K100 7.2±0.85 b 6.8±1.16 bc 6.9±1.46 bc 6.6±1.40 b 6.8±1.45 b 7.2±0.97 b 6.6±1.06 b 6.6±1.65 b 6.5±1.49 b 6.5±1.43 b 7.4±1.00 b 7.2±1.28 c 7.4±1.36 c 7.5±1.47 c 7.7±1.35 c 6.5±1.29 a 4.8±1.50 a 4.1±1.57 a 4.0±1.47 a 4.4±1.43 a [0117] 1) All values are mean±sd. 2) Mean±SD with different superscript within a column are significantly different(p<0.05) by Duncan's [0118] multiple range test. a<b<c. [0119] [0120] 본발명은관련분야에다음과같은기여를할것으로기대된다. 임실지역유가공산업의경쟁력을강화시킬수있는독자적인면역증진용프로바이오틱스유산균주를확보하였고, 본연구결과물을임실지역목장형유가공업체로기술이전을통해고부가가치창출이가능할것으로기대된다. 또한, 면역력약화로인한다양한질병에노출된현대인에게면역활성증진발효유를이용하여편리하고부담없는소비로면역력증진을기대할수있다. 도면 도면 1-13 -
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