(51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) C07K 16/18 (2006.01) G01N 33/569 (2006.01) C12Q 1/70 (2006.01) (21) 출원번호 10-2009-7009163 (22) 출원일자 2007 년 10 월 04 일 심사청구일자 없음 (85) 번역문제출일자 2009 년 05 월 01 일 (86) 국제출원번호 PCT/US2007/080498 (87) 국제공개번호 WO 2008/043052 국제공개일자 (30) 우선권주장 2008 년 04 월 10 일 60/849,626 2006 년 10 월 04 일미국 (US) 60/918,030 2007 년 03 월 13 일미국 (US) 전체청구항수 : 총 25 항 (54) 인간메타뉴모바이러스를중화시키는인간항체 (57) 요약 (11) 공개번호 10-2009-0088871 (43) 공개일자 2009년08월20일 (71) 출원인 더스크립스리서치인스티튜트 미국캘리포니아주 92037 라졸라노스토리파인로드 10550 반더빌트유니버시티 미국 37212 테네시주내쉬빌에스 105 샤우쓰 17 번애브뉴 1207 (72) 발명자 윌리엄슨안토니알 미국 92037 캘리포니아주라졸라첼시스트리트 5329 천즈펑 미국 92083 캘리포니아주비스타캔디스플레이스 134 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 특허법인코리아나 본발명은 HMPV F-단백질에면역특이적으로결합하는항체를포함하는, 인간메타뉴모바이러스 (HMPV) 폴리펩티드에대한항체를생성하는방법을개시한다. 본발명은또한 HMPV 감염에관련된증상을예방, 치료또는개선시키는방법을개시한다. - 1 -
(72) 발명자 산나피트로파올로 미국 92106 캘리포니아주샌디에고휘티어스트리트 3443 버튼데니스알 미국 92037 캘리포니아주라졸라보몬트애비뉴 6044 크로우제임스 미국 37212 테네시주내시빌사우스 20 번애비뉴 2101 윌리엄스존브이 미국 37221 테네시주내시빌스톤크릭로드 9620-2 -
특허청구의범위청구항 1 인간메타뉴모바이러스 (HMPV) 융합당단백질 (F-단백질) 에특이적으로결합하는단리인간항체. 청구항 2 제 1 항에있어서, F-단백질이 SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34 및 SEQ ID NO:36에서설명하는바와같은아미노산서열로이루어지는군에서선택되는단리항체. 청구항 3 제 1 항에있어서, 항체가 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26 또는 SEQ ID NO:28에서설명하는바와같은 HCDR3 아미노산서열을포함하는단리항체. 청구항 4 제 1 항에있어서, 항체가 HMPV 유전자군 A1, A2, B1 및 B2를중화시키는단리항체. 청구항 5 제 1 항에있어서, 항체가 HMPV 유전자군 A2를중화시키는단리항체. 청구항 6 제 3 항에있어서, 항체가 SEQ ID NO:12에서설명한바와같은 HCRD3 아미노산서열을포함하는단리항체. 청구항 7 제 1 항에있어서, 검출가능한표지를추가로포함하는단리항체. 청구항 8 제 1 항에있어서, 항체가인간화항체인단리항체. 청구항 9 제 1 항에있어서, 항체가 CDR-이식항체인단리항체. 청구항 10 제 1 항에있어서, 항체가항체절편인단리항체. 청구항 11 제 10 항에있어서, 항체절편이 Fab, Fab', F(ab') 2 또는 Fc 절편인단리항체. 청구항 12 제 1 항에있어서, 항체가단클론항체인단리항체. 청구항 13 하기를포함하는, 중화항체를확인하기위한방법 : i) 융합단백질 (F-단백질) 의재조합, 미숙및성숙형태에대한항체의패널을생성함 ; ii) 경쟁분석에의해 F-단백질의각형태에대한항체의결합을비교함 ; iii) F-단백질의각형태에대한패널에서의각항체에대한 K d 를측정함 ; - 3 -
iv) K d 가 F-단백질의성숙형태보다 F-단백질의재조합또는미숙형태에대해 10배이상으로더높은패널에서의하나이상의항체를확인함 ; 및 v) 단계 (iv) 에서확인된하나이상의항체의중화효능을측정함, 여기서중화항체는, 비중화항체보다 F-단백질의성숙형태에대해더낮은결합상수를가짐. 청구항 14 제 13 항에있어서, F-단백질이 SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34 및 SEQ ID NO:36에서설명하는바와같은아미노산서열로이루어지는군에서선택되는방법. 청구항 15 제 13 항에있어서, 항체가 HMPV 유전자군 A2를중화시키는방법. 청구항 16 제 15 항에있어서, 항체가 HMPV 유전자군 A1 또는 B1을중화시키는방법. 청구항 17 HMPV를중화시키는항체를대상에투여하는것을포함하는, 대상에서인간메타뉴모바이러스 (HMPV) 감염에의해야기되는호흡기상태를치료하는방법. 청구항 18 제 17 항에있어서, 항체가 HMPV 유전자군 A1, A2, B1 및 B2를중화시키는방법. 청구항 19 제 18 항에있어서, 항체가 HMPV 유전자군 A2를중화시키는방법. 청구항 20 제 19 항에있어서, 항체가 SEQ ID NO:12에서설명하는바와같은 HCRD3 아미노산서열을포함하는방법. 청구항 21 제 17 항에있어서, 대상이포유류인방법. 청구항 22 제 21 항에있어서, 포유류가인간인방법. 청구항 23 인간메타뉴모바이러스 (HMPV) 융합당단백질 (F-단백질) 에특이적으로결합하는하나이상의인간항체를포함하는백신. 청구항 24 제 23 항에있어서, 하나이상의항체가 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26 또는 SEQ ID NO:28에서설명하는바와같은 HCDR3 아미노산서열을포함하는백신. 청구항 25 하기를포함하는, 시료중인간메타뉴모바이러스 (HMPV) 의존재를측정하기위한진단키트 : a) 하나이상의항체및하나이상의 HMPV F-단백질사이에복합체를형성시키는조건하에, 하나이상의 HMPV 융합당단백질 (F-단백질) 에특이적으로결합하는하나이상의인간항체를생물학적시료에접촉시키기위한 - 4 -
장치 ; b) 비복합항체를제거하는하나이상의시약 ; c) 항체를인지하는하나이상의시약 ; d) 항체및시약의사용에대한절차를제공하는사용설명서 ; 및 e) 하나이상의항체, 시약및사용설명서를수납하는용기. 명세서 <1> 기술분야본발명은일반적으로항체, 및보다특히인간메타뉴모바이러스 (Human Metapneumovirus, HMPV) 폴리펩티드에특이적으로결합하는항체또는이의절편, 및 HMPV 감염과관련된증상을예방, 치료또는개선시키는방법에관한것이다. <2> <3> <4> <5> <6> <7> 배경기술배경정보인간메타뉴모바이러스 (HMPV) 는영유아, 노인및면역력이약화된개인에서의심각한호흡기질환의주요한세계적원인으로현재공지된, 최근발견된호흡기병원체이다. 임상적으로, HMPV 호흡기질환은인간호흡기융합바이러스 (HRSV) 에의한것과매우유사하며, 두병원체는밀접하게연관된다. 인간메타뉴모바이러스는 2001년에최초로기재되었으며, 미정의병인을갖는급성호흡기질환의증상을나타내는유아로부터단리되었다. 기록환자시료를이용한네덜란드에서의혈청학적연구는지난 50년이상동안바이러스가인간내에서순환하고있었음을나타낸다. 또한, 항체양성률분석은바이러스가 2세까지의소아의 50% 초과를감염시키고, 거의모든유아를 5세전에 1회이상감염시킨다는것을나타낸다. 이의발견이래집중적인연구로세계적인환자시료에서 HMPV를검출하였고, 소아및성인에서의급성호흡기도질환의주요원인으로서의병원체 (HRSV를제외하고는두번째 ) 를확인하였다. HRSV로의경우에서와같이, HMPV 감염비율은온도기후중계절적으로다양하여, 겨울철초내지중반동안에최고이며초봄으로연장된다. HMPV 감염을통해명백해진질환부하의전체범위가정식으로측정되지는않았지만, HMPV가입원한영유아에서의호흡기질환의대략 5 내지 15% 를차지하는것으로예측된다. 상기군내에서, 2세아래의유아가 HMPV 감염에따른심각한질환에대해가장위험한것으로나타난다. 성인집단에서는, 노인및면역력이약화된사람이특히 HMPV 감염에따른문제를겪는경향이있다. 예를들어, HMPV는다른공지된병원체없이만성폐쇄폐질환 (COPD) 을갖는노인에게서발견되었다. HMPV는또한혈액암을갖는성인및유아에서중증및때때로치명적인호흡기도질환을일으키는것으로나타났다. 또한, HMPV 감염이천식상태를유도하거나또는악화시킬수있다는증거가있다. 또한, HMPV는 SARS 코로나바이러스에의해야기된중증급성호흡기증후군의아집단에서의공-병원체, 및치명적뇌염의경우병인에대한공인자로서제시되어왔다. 주어진증상의관찰횟수가특정 HMPV 환자코호트사이에다양함에도불구하고, 전형적으로 HMPV 감염환자는 HRSV 감염에서나타나는것과매우유사한질환의스펙트럼을나타낸다. 유아에서하호흡기도및상호흡기 도모두의 HMPV 감염은또한수반성중이염의 12 내지 50% 발생과연관된다. 특히중증호흡기도질환을야기하는악화가 HMPV 및 HRSV로공감염된일부유아에서관찰되었으나, 다른경우에서는관찰되지않았다. 그러므로 HMPV 및 HRSV로의공감염이이들의발병및중복되는겨울전염병에서흔할것같음에도불구하고, 상승작용의병리학이이들두바이러스사이에일어날수있는지또는없는지는현재불명확한채로남아있다. 중요하게는, 바이러스가호흡기질환을암시하는증상없이소아또는성인에게드물게나타나는것을측정한, 중합효소연쇄반응 (PCR) 에근거한활성 HMPV 감염의진단은, 이들두군에서무증상적또는준임상적 HMPV 감염이없음을제시한다. HMPV는뉴모비리니에 (Pneumoviriniae) 아과 (subfamily), 파라믹소비리데 (Paramyxoviridae) 과 (family) 및모노네가바이랄 (Mononegavirales) 목 (order) 의메타뉴모바이러스속 (genus) 에속한다. 상기바이러스는메타뉴모바이러스속의유일한다른일원인조류메타뉴모바이러스 (AMPV) ( 칠면조에서의중증비기관염의원인물질일뿐아니라, 닭및꿩도감염시킴 ), 및뉴모비리니에 (Pneumoviriniae) 과의다른속인뉴모바이러스 (Pneumovirus) 속에속한 HRSV와가장밀접하게관련된다. - 5 -
<8> <9> <10> <11> <12> <13> <14> 다른뉴모바이러스와같이, G- 및 F-단백질이감염단계를인도한다. G-당단백질은유형 II 뮤신성분자의형태를갖지만이의 HRSV 및 AMPV 동족체에서발견되는시스테인잔기군이없어, 숙주세포막과바이러스성외피막의 F-당단백질촉진융합으로표적세포수용체의바이러스결합매개를도우며, 따라서바이러스성 RNA가표적세포세포질에들어가도록촉진시킨다. 그러나 G- 및표면단백질유전자 (SH) 단백질이없는 HMPV는아프리카녹색원숭이 ( 비인간영장목숙주 ) 에서성공적으로복제되는데, 이는바이러스결합기능이또다른바이러스성단백질에의해서도궁극적으로수행될수있음을제시한다. 인간메타뉴모바이러스 (HMPV) F-단백질은 HMPV 감염에대한효과적인중화및보호를매개하는주요항원성결정기로여겨진다. HMPV F-단백질은광범위한교차직계중화및보호를매개할수있는주요항원성결정기이다. F-단백질에대한 MAb의제조는진단기술, 백신연구및바이러스성발병기전연구의발전을위해중요하다. 발명의요약본발명은인간메타뉴모바이러스바이러스 (HMPV) F-단백질항원에특이적으로결합하는항체또는이의절편의개발을기준으로한다. 한구현예에서, 단리된인간항체는인간메타뉴모바이러스 (HMPV) 융합당단백질 (F-단백질) 에특이적으로결합하는것으로개시된다. 한측면에서, F-단백질은 SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34 및 SEQ ID NO:36에서설명하는바와같은아미노산서열로이루어지는군에서선택된다. 관련측면에서, 항체는 HMPV 유전자군 A1, A2, B1 및 B2를중화시킨다. 또다른측면에서, 항체는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28에서설명하는바와같은 HCDR3 아미노산서열을포함한다. 또다른구현예에서, 중화항체를확인하는방법은융합단백질 (F-단백질) 의재조합, 미숙및성숙형태에대한항체의패널을생성하고, 경쟁분석에의해 F-단백질의각형태에대한항체의결합을비교하고, F-단백질의각형태에대한패널에서의각항체에대한 K d 를측정하고, K d 가 F-단백질의성숙형태보다 F-단백질의재조합 또는미숙형태에대해 10배이상으로더높은패널에서의하나이상의항체를확인하고, 확인된하나이상의항체의중화효능을측정하는것을포함하여개시되며, 여기서중화항체는비중화항체보다 F-단백질의성숙형태에대해더낮은결합상수를갖는다. 관련측면에서, 상기방법은미세중화분석에의해확인된하나이상의항체를분석하는것을포함한다. 한구현예에서, HMPV를중화시키는항체를대상에게투여하는것을포함하는, 대상에서의호흡기상태 ( 인간메타뉴모바이러스 (HMPV) 감염에의해야기되는 ) 의치료방법이개시된다. <15> <16> <17> <18> 또다른구현예에서, 백신은인간메타뉴모바이러스 (HMPV) 융합당단백질 (F-단백질) 에특이적으로결합하는하나이상의인간항체를포함하여개시된다. 관련측면에서, 백신은 HMPV 유전자군 A1, A2, B1 및 B2를중화시킨다. 한구현예에서, 항체 /F-단백질복합체를형성시키는조건하에대상으로부터의시료를 HMPV 융합당단백질 (F- 단백질 ) 에특이적으로결합하는인간항체에접촉시키고, 시료를항체와반응하는시약에접촉시키고, 시약과항체의반응을검출 ( 여기서시약-항체반응의검출은대상내 MHPV 감염이존재함을나타냄 ) 하는것을포함하는, 메타뉴모바이러스 (HMPV) 감염을진단하는방법이개시된다. 관련측면에서, 상기대상은인간이다. 또다른관련측면에서, 상기시약은 HMPV F-단백질에특이적으로결합하는인간항체에대한항체유도성이다. 또다른구현예에서, 하나이상의항체및하나이상의 HMPV F-단백질사이에복합체를형성시키는조건하에하나이상의 HMPV 융합당단백질 (F-단백질) 에특이적으로결합하는하나이상의인간항체를생물학적시료에접촉시키기위한장치, 비복합항체를제거하는하나이상의시약, 항체를인지하는하나이상의시약, 항체및시약의사용에대한절차를제공하는사용설명서, 및하나이상의항체, 시약및사용설명서를수납하는용기를포함하는, 시료중인간메타뉴모바이러스 (HMPV) 의존재를측정하기위한진단키트가개시된다. 하기에설명한바와같은다른측면을포함하는구현예로서, 전술한구현예의다양한조합이본발명에의해숙고된다. - 6 -
<29> <30> <31> <32> 발명의상세한설명본조성물및방법을기재하기전, 상기발명이기재된특정조성물, 방법및실험적조건에제한되지않아, 그로서조성물, 방법및조건이다양할수있음이이해될것이다. 또한본발명의범주가첨부된청구항에서만제한되기때문에, 본원에사용된용어는특정구현예만을기재하는목적을위한것으로이해되며, 제한하는것으로의도되지는않는다. 본명세서및첨부된청구항에서사용된바와같이, 별도로명백하게지시하지않는한단수형은복수형을포함한다. 따라서, 예를들어 " 방법 " 은본개시를읽는당업자에게명백한하나이상의방법, 및 / 또는본원에기재된유형의단계등을포함한다. 별도로정의하지않는한, 본원에사용된모든기술적및과학적용어는본발명이속한당업계의통상적인기술중하나로써흔히이해되는바와동일한의미를갖는다. 본원에기재된것과유사또는동등한임의방법및물질이본발명의수단또는시험에서사용될수있으나, 본보기가되는방법및물질이이제기재된다. " 단일-사슬항원-결합-단백질 " 은 V L 서열의카르복실말단을 V H 서열의아미노말단에연결시키는펩티드에의해 면역글로불린중쇄가변부아미노산서열 (V H ) 에매어진면역글로불린경쇄가변부아미노산서열 (V L ) 으로이루 어지는폴리펩티드를나타낸다. <33> <34> <35> <36> <37> <38> <39> <40> <41> <42> " 단일-사슬항원-결합-단백질-코딩유전자 " 는단일-사슬항원-결합-단백질을코딩하는재조합유전자를나타낸다. " 폴리펩티드및펩티드 " 는인접한잔기의카르복시기및알파-아미노사이의펩티드결합에의해서로연결된아미노산잔기의선형연속물을나타낸다. " 단백질 " 은폴리펩티드의경우에서와같이서로연결된약 50개초과의아미노산선형연속물을나타낸다. " 면역글로불린생성물 " 은면역글로불린중쇄의적어도면역학적으로활성인부분을함유하는폴리펩티드, 단백질또는다중결합단백질을나타내며, 따라서항원과특이적으로결합할수있다. 대표적인면역글로불린생성물은면역글로불린중쇄, 면역글로불린분자, 실질적으로손상되지않은면역글로불린분자, 파라토프를함유하는면역글로불린의임의부분이며, Fab 절편, Fab' 절편, Fab2' 절편및 Fv 절편으로서당업계에공지되는이들부분을포함한다. " 면역글로불린분자 " 는공유결합으로함께연결된면역글로불린중쇄및면역글로불린경쇄의면역학적활성부분을함유하며항원에특이적으로결합할수있는다중결합단백질을나타낸다. "Fab 절편 " 은공유결합으로함께연결된면역글로불린중쇄및면역글로불린경쇄의면역학적활성부분을함유하는면역글로불린분자의일부분으로이루어지며항원에특이적으로결합할수있는다중결합단백질을나타낸다. 전형적으로 Fab 절편은, 당업계에잘공지된방법을사용하여실질적으로손상되지않은면역글로불린분자를파파인으로단백질분해적으로소화시켜제조된다. 그러나, Fab 절편은또한당업계에잘공지된방법을사용하여면역글로불린중쇄및면역글로불린경쇄의원하는부분을적합한숙주세포에서발현시켜제조될수있다. "Fv 절편 " 은공유결합으로함께연결된면역글로불린중쇄가변부및면역글로불린경쇄가변부의면역학적활성부분으로이루어지며항원에특이적으로결합할수있는다중결합단백질을나타낸다. 전형적으로 Fv 절편은, 당업계에잘공지된방법을사용하여면역글로불린중쇄가변부및면역글로불린경쇄가변부의원하는부분을적합한숙주세포에서발현시켜제조된다. " 면역글로불린상과 (superfamily) 분자 " 는면역글로불린또는면역글로불린관련영역과매우유사한아미노산잔기서열및영역크기를갖는분자를나타낸다. 유사점의중요성은컴퓨터프로그램예컨대 [Dayhoff 등, Meth Enzymol. 91: 524~545 (1983)] 에의해기재된정렬프로그램 (Align program) 을사용하여통계적으로측정된다. 3 미만의전형적인정렬점수는시험한분자가면역글로불린유전자상과의일원이라는것을나타낸다. " 에피토프 " 는면역글로불린생성물에의해특이적으로인지되는분자의일부분을나타낸다. 이는또한결정기또는항원성결정기로서나타내어진다. " 중화시킨다 " 는것은항체가바이러스의감염력또는독소분자의독성을억제할수있는경우의항체의활성을 - 7 -
나타낸다. <43> <44> <45> <46> <47> <48> " 유전자군 " 은동일또는유사한단백질을코딩하는, 밀접하게연관된유전자의집합으로서포함되는바이러스균주 (strain) 를나타낸다. HRSV 및 AMPV와같이, HMPV는음성가닥 RNA로이루어지는약 13 킬로베이스의게놈을함유하는외피바이러스이다. 조직은, 예견된개방리딩프레임에서나타난게놈의약 95% 를갖는, 빽빽한조직이다. 3' 에서 5' 방향에서하기의순서로발생하는 8개의유전자가있는것으로생각된다 : 뉴클레오캡시드 RNA 결합-단백질유전자 ((N): 예를들어 GenBank Accession Nos. DQ841210; DQ841209; DQ841208; DQ841207; DQ834376); 뉴클레오캡시드인단백질유전자 ((P): 예를들어 GenBank Accession Nos. DQ112319; DQ112318; DQ112317; DQ112316; DQ112315; DQ112314); 비글리코실화기질단백질유전자 ((M): 예를들어 GenBank Accession Nos. DQ439961; DQ439960; DQ439959; DQ439958; DQ439957); 융합당단백질유전자 ((F): 예를들어 SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:36을포함하나이에제한되지는않음 ); 전사연장인자유전자 ((M2-1): 예를들어 GenBank Accession Nos. AAS22126; AAS22086; AAS22118; AAS22110; AAS22102); 소 (small) 소수성표면단백질유전자 ((SH): 예를들어 GenBank Accession No. AAS22088; AAS22128; AA22120; AAS22112; AAS22104); 주요결합단백질유전자 ((G): 예를들어 GenBank Accession Nos. AAS22129; AAS22121; AAS22113; AAS22105; AAS22097); 및주요중합효소서브유닛유전자 ((L): 예를들어 GenBank Accession Nos. AY550173; AY550172; AY550171; AY550170; AY550169). HRSV의경우에서와같이 M2 유전자서열내 2번째중복개방리딩프레임에서생기는, 9번째단백질, RNA 합성조절인자 ((M2-2): 예를들어 GenBank Accession Nos. AAS22095; AAS22103; AAS22111; AAS22119; AAS22127) 가예측된다 (van den Hoogen 등, Nat Med (2001) 7:719~724). 유형 II 당단백질일것으로예측되는 SH 분자는또한, 이의아미노말단에위치한소수성신호고정서열을통해바이러스외피에삽입된다. 넓은지리적및시간적분포로단리된많은 HMPV로부터의 F-, G-, SH-, N-, P-, M-, M-2- 및 L- 유전자중하나이상의부분적또는완전서열의계통발생학적조사가수행되어왔다 (Bastien 등, J Clin Microbiol (2004) 42:3532~3537; Biacchesi 등, Virol (2003) 315:1~9; Ishiguro 등, J Clin Microbiol (2004) 42:3406~3414). 이들분석에서의데이터집합은항상, HRSV의단리물에대한분류와유사한두 HMPV 유전적직계 (A 및 B로칭함 ) 를확인시킨다. A 및 B군내의 HMPV 유전자서열은추가적으로, 군당 2개의클레이드 (A1 및 A2, 및 B1 및 B2로나타냄 ) 로나누어진다. 이들 4개의 HMPV 아형이동일한지리적영역내에서동시에순환할수있고, 각아형의관련부분이한시즌에서다음까지다양할수있음이명백하다. A군또는 B군에할당된 HMPV 단리물사이의예측되는아미노산서열을비교하는경우, G- 및 SH-단백질은낮은아미노산동일성 ( 각각 33% 및 58% 동일성 ) 을갖는다. 반대로, 다른 HMPV 유전자생성물은매우보존된다 ; F-단백질 94~95% 아미노산동일성 ; N-단백질 95~96% 동일성 ; P-단백질 85% 동일성 ; M-단백질 97% 동일성 ; M2-1 95~96% 동일성 ; M2-2-단백질 89~90% 동일성 ; 및 L-단백질 94% 동일성. F 및비-외피바이러스성단백질에대한보다보존된서열의 HMPV 군과 G- 및 SH-단백질에서의더큰다양성사이의이러한명백한패턴은, 일반적으로 HRSV에서의동등한분석으로나타나는것을반영한다. 예외는 M2-2 단백질인데, 이는 HRSV 균주사이에서보다 HMPV 균주사이에서더현저히보존된다. 또한, 아미노산수준에서, HMPV의 F-단백질은 HRSV F-단백질사이에서보다계통발생학적군사이에서 6% 덜발산성인것으로보인다. 한구현예에서, 매우면역성이며코튼랫트에서중화항체를유도한, 고체형태의 HMPV F 단백질 (FΔTM) 을생성시키기위한포유류단백질발현방법이개시된다. 이러한구성은조합파지디스플레이라이브러리로부터완전한인간 MAb를선택하는데사용된다. 한측면에서, 이러한접근은 HMPV-감염세포에결합하는수많은인간 Fab를단리하는데효과적이다. 또다른측면에서, FΔTM 단백질은원형 F 단백질상에존재하는중화에피토프를유지한다. 개별적 HMPV 균주와특정하게는 3개외피당단백질인코딩유전자사이의유전적다양성의정도는, 감염된숙주에서의항원적다양성에대한직접적영향을갖는다. HRSV와유사하게, HMPV의 F-단백질에대한항체반응이계통발생학적 A군및 B군사이에서교차보호성및교차반응성인반면, G-단백질에대한면역반응은군특이적인경향을가지며일반적으로교차클레이드중화및보호를제공할수없는것으로보인다. 이론에속박되지않고, HMPV 단리물의계통발생학적연구로부터, A군및 B군바이러스단리물이또한별개의항원성집단화를나타내며유전적다양성으로서대부분의항원적다양성이 G- 및 SH-단백질에서발생할수있다고결론내리는것이합리적이다. 인간에서, 파라믹소바이러스 (HMPV를포함 ) 에의한재감염은이것이유전적으로상동하는바이러스라하더라도 - 8 -
일생에걸쳐발생한다. 따라서이러한환경하에서 HMPV에서의유전적및항원적다양성의가장중요한결과를의미있게결정 ( 한유전적군의바이러스가비상동균주보다는상동균주에의한감염에대해더큰면역학적보호를유도하는지아닌지 ) 하기가어렵다. 그러나, HMPV 아집단사이및내에서의 G-단백질의높은정도의불일치는 G-단백질에대한한정된교차중화및교차보호항체반응에기여하지않을것으로보이므로, 불변 F-단백질은 HMPV 중화항체에대한주요작동목표로서관계된다. <49> <50> <51> <52> 한구현예에서, 인간메타뉴모바이러스 (HMPV) 융합당단백질 (F-단백질) 에특이적으로결합하는단리항체가개시된다. 한측면에서, F-단백질은 SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34 및 SEQ ID NO:36에서설명하는바와같은아미노산서열로이루어지는군에서선택된다. 관련측면에서, 항체는 HMPV 유전자군 A1, A2, B1 및 B2를중화시킨다. 항원적다양성은병원체에대한전술적장점을제공한다. HMPV의계통발생학적군사이에서 G-단백질에대해관찰된서열다양성은, HRSV의 G-단백질에서의유사한변화에대해가정된바와같이상기현상이면역학적압박에대한진화적반응임을제시하는분자의세포외적부분에주로국한된다. 상기특성은한 HMPV 아집단의 G-단백질에대한항체가다른아집단에속한바이러스를교차중화시키는확률을감소시킬것으로보인다. 이와합하여, 이들인자는 HMPV 감염의항체예방에서표적이되도록 G-단백질이흡입성분자가되게한다. 이는 F-단백질에대한경우는아닌것으로보인다. F-단백질은 HMPV 단리물에대해매우보존되며, 어쩌면 G-단백질에서보다이분자중아미노산치환에적용되는더큰기능적및구조적억제를반영하는, 시간이지남에따라항원이소폭으로변화하는약간의징후가있다. HRSV를참고하자면, F-단백질은교차-균주중화및보호항체에대한주요표적이다. 따라서, HMPV의 F- 단백질은항체예방에대해서, 및또한후보백신의성분으로서매우바람직한표적을나타낸다. F-단백질은초기에불활성단량체성전구체 F 0 으로서합성되는데, 상기단백질은디설파이드결합을통해공유결 합으로연결된두서브유닛 (F 1 및 F 2 ) 으로분해된다. F 1 -F 2 분자중 4 개는 F 1 서브유닛을통해반응하여, 성 숙한바이러스스파이크를형성한다. <53> 한구현예에서, 본발명은 HMPV 의 F- 단백질에대한중화항체를확인하는방법을개시하는데, 이는융합단백질 (F- 단백질 ) 의재조합, 미숙및성숙형태에대한항체의패널을생성하고, 경쟁분석에의해 F- 단백질의각형 태에대한항체의결합을비교하고, F- 단백질의각형태에대한패널에서의각항체에대한 K d 를측정하고, K d 가 F-단백질의성숙형태보다 F-단백질의재조합또는미숙형태에대해 10배이상으로더높은패널에서의하나이상의항체를확인하고, 확인된것으로서하나이상의항체의중화효능을측정하는것을포함하며, 여기서중화항체는비중화항체보다 F-단백질의성숙형태에대해더낮은결합상수를갖는다. 관련측면에서, F- 단백질은올리고머형태이다. <54> <55> <56> <57> " 올리고머 " 는반복성공유또는비공유결합에서의적은수 ( 전형적으로 2 내지약 10) 의구성상유닛을함유하는분자로이루어지는임의의물질또는물질형태를나타낸다 ; 상기유닛은한종류이상의것일수있다. 기능적단백질복합체를포함하는기능적폴리펩티드를제조하기위한본발명의방법의유용함은, 기능적항체의제조에의해본원에예시된다. 용어 " 항체 " 는항원의에피토프에특이적으로결합할수있는폴리펩티드또는단백질복합체를나타내도록본원에서광범위하게사용된다. 일반적으로, 항체는중쇄가변부영역및경쇄가변부영역, 특히과가변부의회합에의해형성되는하나이상의항원결합영역을함유한다. 필라멘트성박테리오파지의표면상에발현되는항체분자절편의라이브러리의구성, 및항원에대한결합에의한파지항체의선택은연구및임상적적용을위한새로운도구를생성시키기위한강력한수단으로인식되어왔다. 그러나이기술은고체상의존적인선택방법을위해충분량으로활용가능한, 정제된항원에특이적인파지항체를생성시키는데주로사용되어왔다. 생화학적및기능적분석에서의이러한파지항체의유효성은다양하고 ; 전형적으로상기방법은이의효용을결정하는데사용된다. 전형적으로, 관심있는많은항원은매우다량으로는순수형태로활용가능하지않다. 이는연구및임상적적용을위한상기물질의결합에서의파지항체의효용을제한할수있다. 또한, 이러한적용에서의파지항체의효용은단리된파지항체의특이성을보증하기위한정제방법및항원의순도에대해정비례적이다. 원형세포표면구조에결합하는인간단클론항체는치료적및진단적방법에있어서다양한적용을갖는것으로기대된다. 파지항체디스플레이기술의중요한연장은, 불균질한혼합물에존재하는세포의부분모집단의표면상에발현되는항원에대한특이적항체의직접적선택을위한전략이다. 이러한항체는단일 - 9 -
한매우다양한디스플레이라이브러리에서유래할수있다 ( 예를들어본원에참고문헌으로포함되는미국특 허제 6,265,150 호참조 ). <58> <59> <60> <61> <62> 디스플레이라이브러리 ( 즉박테리오파지, 특히필라멘트성파지및특히파지 M13, Fd 및 F1로부터의 ) 는, 융합단백질을형성하는이들파지중 giii 또는 gviii에디스플레이될폴리펩티드를인코딩하는, 삽입라이브러리를포함한다. 예를들어 Dower, WO 91/19818; Devlin, WO 91/18989; MacCafferty, WO 92/01047 ( 유전자 III); Huse, WO 92/06204; Kang, WO 92/18619 ( 유전자 VIII) 를참조한다. 이러한융합단백질은통상파지피막단백질을제외한분비단백질로부터의신호서열, 디스플레이될폴리펩티드, 및유전자 III 또는유전자 VIII 단백질또는이의절편을포함한다. 외인성코딩서열은, 다른삽입위치가가능하지만종종유전자 III 또는유전자 VIII의 N-말단에서또는근처에서삽입된다. 일부필라멘트성파지벡터는유전자 III 또는유전자 VIII의 2차카피가제조되도록설계된다. 이러한벡터에서, 외인성서열은두카피중하나에만삽입된다. 다른카피의발현은, 파지입자에혼입된융합단백질의일부분을효과적으로희석시키며, 파지성장에유해한폴리펩티드에대한선택을감소시키는데있어서유리할수있다. 또다른변이에서, 외인성폴리펩티드서열은파지피막단백질및파지패키징서열을인코딩하나복제는할수없는파지미드벡터에클로닝된다. 파지미드는보조파지로의감염에의해세포에트랜스펙션되고패키징된다. 파지미드시스템의사용은또한피막단백질, 및보조파지로부터발현된피막단백질의야생형카피를갖는디스플레이된폴리펩티드로부터형성된융합단백질을희석시키는효과를갖는다. 예를들어 Garrard, WO 92/09690를참조한다. 수동적방법으로폴리펩티드를디스플레이하는데진핵생물성바이러스가사용될수있다. 포자는또한디스플레이패키지로서사용될수있다. 이러한경우, 폴리펩티드는포자의외부표면으로부터디스플레이된다. 예를들어, B. 서브틸리스 (B. subtilis) 의포자가적합한것으로보고된다. 이들포자의피막단백질의서열은당업계에공지되어있다. 또한, 디스플레이패키지로서세포가사용될수있다. 디스플레이될폴리펩티드는세포표면상에발현되는세포단백질을인코딩하는유전자에삽입된다. 박테리아세포에는살모넬라티피무리움 (Salmonella typhimurium), 바실러스서브틸리스 (Bacillus subtilis), 슈도모나스아에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 비브리오콜레라에 (Vibrio cholerae), 클렙시엘라뉴모니아 (Klebsiella pneumonia), 나이세리아고노레아 (Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아메닝기티디스 (Neisseria meningitidis), 박테로이드노도수스 (Bacteroides nodosus), 모락셀라보비스 (Moraxella bovis) 및대장균 (Escherichia coli) 이포함되나이에제한되지는않는다. 외부표면단백질의상세사항은당업계에잘공지되어있다 ( 예를들어 Ladner, 등, 미국특허제 5,571,698 호를참조 ). 예를들어, 대장균 (E. coli) 의 lamb 단백질이적합하다. 항체사슬은단일또는이중사슬형태에서디스플레이될수있다. 단일사슬항체라이브러리는항체의중 쇄또는경쇄단독또는이의가변영역을포함할수있다. 그러나보다전형적으로, 단일-사슬항체라이 브러리의일원은단일인접단백질내펩티드스페이서에의해분리되는중쇄및경쇄가변영역의융합으로부 터형성된다. 예를들어 Ladner, 등, WO 88/06630; McCafferty, 등, WO 92/01047을참조한다. 이중사 슬항체는중쇄및경쇄, 또는이의결합절편의비공유적회합에의해형성된다. 이중사슬항체는또한 두단일사슬항체의회합에의해형성될수있는데, 각각의단일사슬항체는중쇄가변영역, 링커및경쇄 가변영역을포함한다. 디아바디로서공지된이러한항체에서, 한단일사슬항체의중쇄는다른항체의경 쇄에결합하고 ( 이의반대또한동일함 ), 따라서두동일한항원결합위치를형성한다. 따라서, 파지를디 스플레이하는단일사슬항체는, 디아바디로서의두단일사슬항체의회합에의해디아바디를형성할수있다. 항체라이브러리의다양성은천연공급원예컨대면역화또는비면역화된 B 세포의비-클론집단으로부터항체 인코딩서열을수득하는것에서생길수있다. 대안적또는추가적으로, 디스플레이벡터에도입전또는 이후핵산인코딩항체사슬의인공적돌연변이생성에의해다양성이도입될수있다. 이러한돌연변이생 성은 PCR 중에일어나거나, 또는 PCR 전또는이후에유도될수있다. 임의로는스페이서쪽에위치한디스플레이될항체사슬을인코딩하는핵산은, 표준재조합 DNA 기술에의해상 기토의된바와같이파지의게놈에삽입된다 ( 일반적으로, 본원에참고문헌으로포함되는 Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). 핵산은궁극적으로는항체사슬로서발현된다 ( 스페이서또는기본틀잔기를가지거 나또는갖지않음 ). 파지, 박테리아및포자벡터에서, 항체사슬은복제가능한패키지의외부표면단백 질의전부또는일부에융합된다. 크기를갖는다. 라이브러리는종종약 10 3, 10 4, 10 6, 10 7, 10 8, 또는보다많은일원의 - 10 -
<63> <64> <65> <66> <67> <68> <69> 용어 " 폴리뉴클레오티드 " 또는 " 뉴클레오티드서열 " 또는 " 핵산분자 " 는, 인산디에스테르결합에의해함께연결되는둘이상의데옥시리보뉴클레오티드또는리보뉴클레오티드의서열을의미하도록본원에서광범위하게사용된다. 그로서, 상기용어는 RNA 및 DNA ( 유전자또는이의부분일수있음 ), cdna, 합성폴리데옥시리보핵산서열등을포함하고, 단일가닥또는이중가닥뿐아니라 DNA/RNA 하이브리드일수있다. 또한, 본원에서사용되는바와같은용어는, 세포뿐아니라합성폴리뉴클레오티드로부터단리될수있으며, 예를들어화학적합성또는효소적방법 [ 예컨대중합효소연쇄반응 (PCR)] 에의해제조될수있는, 자연적으로발생하는핵산분자를포함한다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드를포함하는뉴클레오티드는자연적으로발생하는데옥시리보뉴클레오티드예컨대 2' 데옥시리보오스에연결된아데닌, 시토신, 구아닌또는티민, 또는리보뉴클레오티드예컨대리보오스에연결된아데닌, 시토신, 구아닌또는우라실이다. 그러나, 용도에따라폴리뉴클레오티드는또한뉴클레오티드유사체 ( 자연적으로발생하지않는합성뉴클레오티드, 또는개질된자연적으로발생하는뉴클레오티드를포함함 ) 를함유할수있다. 뉴클레오티드유사체는이러한뉴클레오티드유사체를함유하는폴리뉴클레오티드로서, 당업계에잘공지되어있으며시판된다 ( 예를들어 Ambion, Inc. 사제 ; Austin TX). 폴리뉴클레오티드의뉴클레오티드를연결하는공유결합은일반적으로인산디에스테르결합이다. 그러나폴리뉴클레오티드가사용될목적에따라공유결합은또한임의의많은다른결합일수있는데, 티오디에스테르결합, 포스포로티오에이트결합, 펩티드성결합또는합성폴리뉴클레오티드가제조되도록뉴클레오티드를연결하는데유용한것으로서당업계에공지된임의의다른결합이포함된다. 자연적으로발생하는뉴클레오티드및인산디에스테르결합을포함하는폴리뉴클레오티드는화학적으로합성될수있거나, 또는주형으로서적절한폴리뉴클레오티드를사용하는재조합 DNA 방법을사용하여제조될수있다. 비교하여, 뉴클레오티드유사체, 또는인산디에스테르결합이외의공유결합을포함하는폴리뉴클레오티드는일반적으로화학적으로합성되지만, T7 중합효소와같은효소가특정유형의뉴클레오티드유사체를폴리뉴클레오티드에혼입시킬수있으므로, 이러한폴리뉴클레오티드를적절한주형으로부터재조합적으로제조하는데상기효소가사용될수있다. 용어 " 재조합핵산분자 " 는인간조절에의해조작되는폴리뉴클레오티드를나타내도록본원에서사용된다. 재조합핵산분자는, 생성물이자연에서의세포에서발견되지않도록하는방법으로연결되는둘이상의뉴클레오티드서열을함유할수있다. 특히, 둘이상의뉴클레오티드서열은작동적으로연결될수있고, 예를들어융합폴리펩티드를인코딩할수있거나, 또는인코딩뉴클레오티드서열및조절요소를포함할수있다. 재조합핵산분자는또한, 자연적으로발생하는폴리뉴클레오티드를기초로할수있으나, 이와상이하도록, 예를들어제한엔도뉴클레아제인지위치또는접합위치, 프로모터, 복제의 DNA 기원등의폴리뉴클레오티드에서통상발견되는제 1 코돈또는관심서열을폴리뉴클레오티드에도입시킨것과같은하나이상의뉴클레오티드변경물을갖도록조작될수있다. 본원에서사용되는바와같이, 표현 " 작동적으로연결된 " 은둘이상의분자가서로에대해위치하여이들이단일유닛으로행동하고, 하나또는둘모두의분자또는이의조합에기인하는기능에영향을미치는것을의미한다. 예를들어, 폴리펩티드를인코딩하는폴리뉴클레오티드는전사적또는번역적조절요소에작동적으로연결될수있는데, 이경우상기요소는세포내에서정상적으로회합된, 폴리뉴클레오티드서열에영향을미치는조절요소에서와유사한방법으로폴리뉴클레오티드상에이의조절효과를부여한다. 본발명의폴리뉴클레오티드는또한제 1 클로닝위치및제 2 클로닝위치쪽에위치할수있어, 따라서 2차폴리뉴클레오티드에쉽게삽입되거나연결될수있는카세트를제공한다. 이렇게위치하는제 1 및제 2 클로닝위치는동일또는상이할수있고, 하나또는둘모두는독립적으로다수의클로닝위치중하나, 즉다중클로닝위치일수있다. 본발명의벡터는또한벡터상에원하는특징을부여하는하나이상의추가적인뉴클레오티드서열 ( 예를들어벡터의조작을촉진하는서열을포함 ) 을함유할수있다. 그로서, 벡터는예를들어하나이상의클로닝위치, 예를들어비상동성폴리뉴클레오티드가벡터에삽입되고제 1 프로모터와 작동적으로연결될수있도록위치된, 다중클로닝위치일수있는클로닝위치를함유할수있다. 상기벡터는또한원핵생물의복제기원 (ori), 예를들어대장균의 ori 또는코스미드의 ori를함유할수있어, 따라서 DNA증폭을위한원핵생물숙주세포내에서운반될수있는벡터를제공한다. 이중사슬항체디스플레이라이브러리는상기토의된디스플레이라이브러리의종류를나타낸다. 이러한라이브러리의제조는당업계에잘공지되어있다. 예를들어이중사슬항체파지디스플레이라이브러리에서는, 단일사슬라이브러리에서의경우와같이한항체사슬이파지피막단백질에융합된다. 파트너항체 - 11 -
사슬은제 1 항체사슬과복합되나, 파지피막단백질과직접적으로연결되지는않는다. 중쇄또는경쇄는피막단백질에융합된사슬이될수있다. 피막단백질에융합되지않는어느사슬이파트너사슬이다. 이배열은전형적으로한항체사슬유전자를인코딩하는핵산조각을파지디스플레이벡터의 giii 또는 gviii에혼입시켜신호서열, 항체사슬및파지피막단백질을포함하는융합단백질을형성시킴으로써획득될수있다. 파트너항체사슬을인코딩하는핵산조각은제 1 항체사슬을인코딩하는핵산조각과동일한벡터에삽입될수있다. 임의로는, 중쇄및경쇄는동일한프로모터에연결된동일한디스플레이벡터에삽입되고다시스트론성메세지로서전사될수있다. 대안적으로는, 파트너항체사슬을인코딩하는핵산은개별벡터 ( 파지벡터일수도아닐수도있음 ) 에삽입될수있다. 이러한경우, 두벡터는동일한세포에서발현된다 (WO 92/20791 참조 ). 파트너사슬을인코딩하는서열이삽입되어파트너사슬이신호서열과연결되나, 파지피막단백질에융합되지는않는다. 둘모두의항체사슬은발현되고, 이들이모이는세포의주변세포질로보내지고파지입자에혼입된다. <70> 디스플레이벡터는, 삽입서열로부터발현된중쇄및경쇄가변부와함께프레임내에중쇄및경쇄불변부또는이의절편이발현되도록설계될수있다. 전형적으로, 불변부는자연적으로발생하는인간불변부이고 ; 소수의보존치환이용인될수있다. Fab 절편에서중쇄불변부는통상 C H 1 부위, 및임의로는경첩부중 일부또는전부를포함하며, 경쇄불변부는손상되지않은경쇄불변부예컨대 C κ 또는 C λ 이다. 불변부동 형의선택은, 보체의존성세포독성이궁극적으로필요한지아닌지에대해어느정도의존한다. 예를들어, 인간동형 IgG1 및 IgG4가이러한세포독성을지지하는반면 IgG2 및 IgG3은그렇지않다. 대안적으로는, 디스플레이벡터는비인간불변부를제공할수있다. 전형적으로이러한상황에서는, 항체사슬의오직가변부만이그후디스플레이벡터로부터서브클로닝되며, 삽입된항체서열을갖는프레임내발현벡터에의해인간불변부가제공된다. <71> <72> 항체인코딩서열은인간의림프세포로부터수득될수있다 ( 하기실시예참조 ). 본발명의방법을실행하기에유용한폴리뉴클레오티드는관심있는항체를제조하는세포로부터단리될수있는데, 예를들어면역화된대상또는특정항원에노출된개인으로부터의 B 세포를폴리뉴클레오티드합성의잘공지된방법을사용하여새로이 (de novo) 합성할수있거나, 또는재조합적으로제조할수있다. 한측면에서, 본발명의항체라이브러리는상이한성인공여자 ( 여기서공여자는이들의일생에서 1회이상 HMPV에노출되었거나또는 HMPV에의해감염되었음 ) 의골수림프구로부터제조된다. 또다른측면에서, 면역화된인간림프구는엡스테인-바 (Epstein-Barr) 바이러스로의감염으로불사화되어, 단클론항체분비배양물을생성시킬수있다. 재배열된면역글로불린유전자는게놈 DNA 또는 mrna로부터클로닝될수있다. mrna로부터클로닝되는경우, mrna는세포로부터추출되고역전사효소및폴리 dt 올리고뉴클레오티드프라이머를사용하여 cdna가제조된다. 이러한서열을인코딩하는항체를클로닝하기위한프라이머는당업계에잘공지되어있다. <73> 항체절편의목록은증폭된 V H 및 V L 서열을여러방식으로함께조합시킴으로써구성된다. 경쇄및중쇄는 상이한벡터에삽입될수있고, 벡터는체외또는체내에서조합된다. 대안적으로는, 경쇄및중쇄는동일한벡터에순차적으로클론될수있거나, 또는 PCR에의해함께결합된후벡터에삽입될수있다. 중쇄의목록은또한단일경쇄와조합될수있거나또는그반대로도동일하다. <74> <75> 전형적으로, 중쇄및경쇄항체사슬을인코딩하는조각은중쇄및경쇄의개별적인집단으로부터서브클로닝되어, 각각의벡터에서의집단으로부터중쇄및경쇄쌍의무작위한회합을야기한다. 따라서, 개질된벡터는전형적으로는자연적으로발생하는항체에서는발견되지않는중쇄및경쇄가변부의조합을함유한다. 이들조합의일부는전형적으로선택과정에서살아남으며, 또한다클론라이브러리에존재한다. 중쇄및경쇄인코딩서열의클로닝집단을위한방법및일부예가되는벡터는 Huse, WO 92/06204에기재된다. H C 폴리펩티드를인코딩하는서열의다양한집단은 M13IX30에클로닝되고, L C 폴리펩티드를인코 딩하는서열은 M13IX11에클로닝된다. 집단은 M13IX30에서의 XhoI-SeeI 또는 StuI 제한효소위치사이, 및 M13IX11에서의 SacI-XbaI 또는 EcoRV 위치사이에삽입된다 ( 각각 Huse의도 1A 및 B). 둘모두의벡터는 H C 및 L C 인코딩서열및이의연관된벡터서열을함께결합시키기위한두쌍의 M13uI-HindIII 제한효소위치를함유한다 (Huse의도 1A 및 B). 두쌍은클로닝위치에대칭적으로향하여, 발현될서열을함유하는벡터단백질만이단일벡터에정확하기결합된다. <76> 항체사슬을필라멘트성파지에클로닝하기위한방법및다른예가되는벡터가본원에참고문헌으로포함되 는미국특허제 6,794,132 호에기재된다. 일반적으로, 본발명의벡터는원형화된벡터이거나또는선형 - 12 -
벡터 ( 제 1 말단및제 2 말단을갖는 ) 일수있다. 본발명의선형벡터는하나또는두말단모두에서하나이상의클로닝위치를가질수있어, 따라서벡터를원형화시키거나제 2 폴리뉴클레오티드 ( 제 2 벡터일수있으며, 본발명의벡터와동일또는상이함 ) 에벡터를연결시키기위한수단을제공한다. 클로닝위치는제한엔도뉴클레아제인지위치 ( 또는이의분할생성물 ), 재조합효소위치또는이러한위치의조합을포함할수있다. <77> <78> <79> <80> <81> <82> <83> 벡터는또한하나이상의발현조절요소, 예를들어전사적조절요소, 추가적번역요소등을함유할수있다. 한구현예에서, 벡터는프로모터인코딩서열에작동적으로연결된개시자 ATG 코돈을함유하여, 폴리펩티드인코딩폴리뉴클레오티드가개시 ATG 코돈에인접하게작동적으로연결될수있다. 따라서, 벡터는또한하나이상의비상동폴리뉴클레오티드가 ATG 코돈에대해작동적으로연결되도록위치하는클로닝위치를함유할수있다. 본발명의벡터는또한제 1 프로모터에작동적으로연결되는제 1 폴리펩티드를인코딩하는뉴클레오티드서열을함유할수있으며, 여기서인코딩하는뉴클레오티드서열은하나이상의클로닝위치 ( 예를들어 ATG 코돈의근처및상류, ATG 코돈의근처및하류, 및 / 또는인코딩된폴리펩티드의 C-말단또는근처를포함 ) 를함유하도록개질된다. 이러한벡터는, 제 1 폴리펩티드를인코딩하는뉴클레오티드서열의치환, 또는인코딩된폴리펩티드의 C-말단또는 N-말단근처의작동적연결에의해, 제 2 폴리펩티드를인코딩하는뉴클레오티드서열을그에삽입시키기위한편리한수단을제공하여, 제 1 및제 2 폴리펩티드를포함하는융합단백질이발현될수있다. 항체제조를위한재조합발현시스템을사용하는가장유용한측면중하나는, 항체가분자공학에의해용이하게맞추어질수있다는것이다. 이는항체절편및단일사슬분자의제조뿐아니라전체길이항체의조작을가능하게한다. 예를들어, 기능적재조합-항체절편의가장자리범위예컨대 Fab, Fv, 단일사슬및단일영역항체가제조될수있다. 이는개별적영역이유전자수준에서 " 절단및접합 " 되게하는면역글로불린사슬의영역구조에의해촉진된다. 인간화단일클론항체를인코딩하는폴리뉴클레오티드는, 예를들어마우스상보성결정부위를인코딩하는뉴클레오티드서열을마우스면역글로불린유전자의중쇄및경쇄가변쇄로부터인간가변영역유전자에옮긴후쥐과등가물의기본틀부위에서인간잔기를치환시킴으로써수득될수있다. 쥐과면역글로불린가변영역을클로닝하기위한일반적인기술은당업계에공지되어있다. 본발명의방법은또한조합적면역글로불린라이브러리로부터단리된인간항체절편을인코딩하는폴리뉴클레오티드를사용하여실행될수있다. 인간면역글로불린파지라이브러리를제조하는데유용한클로닝및발현벡터는, 예를들어 Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA) 에서수득될수있다. 인간단클론항체를인코딩하는폴리뉴클레오티드는또한, 예를들어항원적챌린지에반응하는특이적인간항체가제조되도록설계된유전자삽입마우스로부터수득될수있다. 상기기술에서, 인간중쇄및경쇄부위의요소는내인중쇄및경쇄부위의표적된분열물을함유하는배아줄기세포주에서유래한마우스의주에도입된다. 유전자삽입마우스는인간항원에특이적인인간항체를합성할수있고, 상기마우스를인간항체분비하이브리도마를제조하는데사용할수있으며, 이로부터본발명의방법을실행하기에유용한폴리뉴클레오티드를수득할수있다. 유전자삽입마우스에서인간항체를수득하기위한방법은당업계에공지되어있다. 또한폴리뉴클레오티드는항체의항원결합절편을인코딩하는것일수있다. 예를들어 Fv, Fab, Fab', Fc 및 F(ab')2 절편을포함하는항원결합항체절편은당업계에잘공지되어있으며, 원래항체의단백질분해적 가수분해에의해확인되었다. 예를들어, 항체절편은통상적인방법으로써전체항체의펩신또는파파인소화에의해수득될수있다. 항체의펩신으로의효소적분할에의해제조된항체절편은 F(ab')2로나타내는 5S 절편을생성한다. 상기절편은티올환원제, 및임의로는디설파이드결합의분할로부터야기된설프하이드릴기에대한차단기를사용하여추가적으로분할되어, 3.5S Fab' 1가절편이제조될수있다. 대안적으로는, 펩신을사용한효소적분할은두 1가 Fab' 절편및 Fc 절편을직접적으로제조해낸다 ( 예를들어, 본원에참고문헌으로포함되는 Goldenberg, 미국특허제 4,036,945 호및미국특허제 4,331,647 호를참조 ). 또다른형태의항체절편은단일상보성-결정부위 (CDR) 를코딩하는펩티드이다. CDR 펩티드는관심있는항체의 CDR을인코딩하는폴리뉴클레오티드를구성함으로써, 예를들어중합효소연쇄반응을사용하여항체제조세포의 RNA로부터가변부를합성시킴으로써 ( 예를들어, 본원에참고문헌으로포함되는 Larrick 등, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106, 1991 를참조 ) 수득될수있다. 이러한항체절편을인코딩하는폴리뉴클레오티드 ( 예를들어중쇄가변부및경쇄가변부와접합하는상기절편및펩티드링 - 13 -
커의서브유닛을포함 ) 는화학적합성법, 또는파지디스플레이를포함하며전체길이중쇄및경쇄를인코딩하는폴리뉴클레오티드로시작하는일상적인재조합 DNA 방법을사용함으로써제조될수있으며, 상기기재된바와같이수득될수있다. 한측면에서, 본발명의항체는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, 또는 SEQ ID NO:28에서설명하는바와같은 HCDR3 아미노산서열을포함한다. <84> <85> <86> <87> 한구현예에서, 다중결합단백질은면역글로불린중쇄부분및면역글로불린경쇄부분으로이루어지는 Fab 절편이다. 면역글로불린중쇄및경쇄는서로회합하며, 예비선택또는예비결정된항원에대해특이적인항원결합위치를갖는입체형태를갖는것으로추측된다. Fab 절편상의항원결합위치는면역글로불린분자상의항원결합위치와유사한결합친화력또는결합력을갖는다. 본발명을실행하기에유용한유전자는면역글로불린생성물, 면역글로불린분자, Fab 절편및 Fv 절편에함유된폴리펩티드를코딩하는유전자를포함한다. 이들은면역글로불린중쇄및경쇄가변부를코딩하는유전자를포함한다. 전형적으로, 예비선택된항원에결합할수있는면역글로불린의면역글로불린중쇄가변부및면역글로불린경쇄가변부를코딩하는유전자가사용된다. 이들유전자는포유류, 한측면에서는인간 ( 활성을필요로하는것에대한항원적리간드 ( 항원 ), 즉예비선택된항원으로면역화된 ) 에서수득된세포에서단리된다. 통상적으로면역화를실행할수있고, 비인간동물에서의항체역가를모니터링하여, 필요한친화력또는결합력에상응하는, 필요한면역화단계를결정할수있다. 부분면역화된비인간동물은전형적으로오직한면역화만을부여받고, 세포는반응이검출된직후에그로부터수집된다. 전체면역화된비인간동물은, 보통 2 내지 3주간격에서항원을숙주비인간동물에 1 회이상반복주사하여획득되는최고점역가를나타낸다. V H 및 V L 폴리펩티드를코딩하는유전자는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM을만들어내는세포에서유래할수 있다. 어있다. 면역글로불린가변부유전자를클로닝할수있는, 게놈 DNA 의절편제조방법은당업계에잘공지되 <88> 본원에서사용되는바와같이, 용어 " 특이적으로회합함 " 또는 " 특이적으로반응함 " 또는 " 특이적으로결합함 " 은복합체를형성하는둘이상의폴리펩티드가생리적조건하에상대적으로안정적이라는것을나타낸다. 다양한반응에대한참고중본원에서사용되는용어는, 예를들어기능적단백질복합체가형성되도록반응하는제 1 폴리펩티드서브유닛및제 2 폴리펩티드서브유닛의반응뿐아니라항체및이의항원의반응을포함 한다. 특이적인반응은, 약 1 x 10-6 M 이상, 일반적으로약 1 x 10-7 M 이상, 통상약 1 x 10-8 M 이상, 및특히약 1 x 10-9 M 이상, 또는 1 x 10-10 M 이상의해리상수로특징지어질수있다. 특이적인반응은일반적으로생리학적조건 ( 예를들어척추동물또는무척추동물일수있는살아있는대상의세포또는아세포성구획에서발생하는조건뿐아니라, 생물의세포또는조직을유지하는데사용되는것과같은세포배양액에서발생하는조건을포함 ) 하에서안정적이다. 두분자가특이적으로반응하는지를측정하기위한방법은잘공지되며, 예를들어평형투석, 표면플라스몬공명, 겔이동분석등이포함된다. <89> 한측면에서, 체내에서도출되는항체는체외항체친화력이강화되도록발달될수있다. 예를들어 CDR 워킹 (walking) 이사용될수있는데, 여기서항체중쇄및경쇄의개별또는다중 CDR 부위는중복 PCR 및 NNK 도핑전략을사용하는포화돌연변이생성에의해순차적으로무작위화된다. 이러한방식으로생성된 Fab 항체서열변이의라이브러리는, 최고친화력 Fab 클론의회수를보증하기위해엄격하고경쟁적인패닝환경을사용하여, 파지표면상에디스플레이되고관심있는항원 ( 예를들어 HMPV의 F-단백질 ) 에대해재선택된다. 이후당업계에공지된접근법 ( 예를들어평형투석, 표면플라스몬공명, 겔이동분석등을포함하나이에제한되지는않음 ) 으로친화력을측정할수있다. 이러한방법을사용하여 K d 값을 10, 100 또는 1000배강 화시킬수있다. <90> 한구현예에서, HMPV F-단백질에대해제기된항체패널은다양한형태의 F-단백질항원에대한항체의중화특성을측정하는데사용된다. 이론에속박되지않으면서개념상으로, F-단백질은다중항원성및면역성형태로발생할수있다. 다양한형태중하나이상에공통적인항원적결정기에서유래하는중복교차반응성의일부부분을가질것으로보이는, 각각의미숙및성숙형태의 F-단백질이자연적감염동안숙주면역시스템에존재할것으로보이며상이한항체프로필이도출될수있는것이합리적이다. - 14 -
<91> <92> 관련측면에서, HMPV-특이적항체패널의항원결합특성은, 다양한시스템 ( 바쿨로바이러스 (baculovirus) 시스템을포함하나이에제한되지는않음 ) 에서발현될수있는 HMPV F-단백질의재조합융합에대한스크리닝에의해회수된중화항체를포함하여검사된다. 추가적인관련측면에서, 다양한공급원 ( 파지항체라이브러리를포함하나이에제한되지는않음 ) 에서수득된다른비중화 Fab가패널을포함할수있다. 비중화항체는적절한숙주세포 ( 예를들어 CHO 세포 ) 에서발현된정제재조합 HMPV F-단백질에대해선택될수있다. 한측면에서, 항체는체외중화활성을나타낸다. 예를들어, 상기선택분석을수행한후 HRSV에대한항체 ( 즉 RSV19) 를사용하는경쟁연구는 RSV19 항체에의해확인되는것이외의에티토프에결합한비중화항체를나타낸다. 보다두드러지게는, 중화항체는비중화항체보다재조합 HRSV F-단백질에대해약 1000회덜양호하게결합하였다 (K d = 6 nm). 그러나, 바이러 스스파이크에조립된 F-단백질에대한항체결합에선행되어야하는메카니즘을통해체외에서중화된 RSV19 바이러스로의효능 (4 nm에서 50% 플라크감소 ) 은, 이러한성숙상태에서의 F-단백질에대한이의전체결합상수가재조합단백질에대한것보다 1000배더높다는것을제시한다. 실로 RSV19는, 비중화항체패널보다 HRSV 감염세포표면에대해더욱효과적으로결합하는데, 여기서단백질은출아하는비리온 (virion) 의외피에혼입될성숙한올리고머성구조로배열되는것으로보인다. 다시금이론에속박되지않고, 이들데이터는이러한특정중화항체가 F-단백질의미숙형태보다성숙형태에보다양호하게결합하면서비중화항체로는반대의결합패턴이나타난다는가설을지지한다. <93> 한구현예에서, 본발명의 HMPV F- 특이적 Fab 는 V H 및 V L 유전자조각의다양한용도를나타낸다. 한측면에 서, 항체가변항체유전자조각은무작위선택된성인 B 세포의목록에서흔하지않다. 예를들어, 하나이상의중화클론은별개의경쇄, 그러나사실상동일한중쇄를이용한다. 이론에속박되지않고, 이는이러한클론에대해, 중쇄가 FΔTM 결합에대한주요결정기를조정한다는것을제시한다. 또다른측면에서, 체외에서가장높은중화활성은뉴클레오티드및아미노산수준에서별개의 V H 및 J H 조각을이용하는데, 여기 서 Fab 는상이한공여자로부터유래할수있다. 치이다. 관련측면에서, HCDR3 루프는중대한결정기항원결합위 <94> <95> <96> 본발명의방법을수행하는데유용한폴리뉴클레오티드는관심있는항체를제조하는세포로부터단리될수있는데, 예를들어면역화된대상또는특정항원에노출된개인에서의 B 세포가폴리뉴클레오티드합성의잘공지된방법을사용하여새로이합성될수있고, 예를들어가변중쇄및가변경쇄를인코딩하는폴리뉴클레오티드의조합적라이브러리의스크리닝에의해수득되거나또는재조합적으로제조될수있다. 예를들어키메릭, 인간화, CDR-이식, 단일사슬및 2기능성항체를인코딩하는폴리뉴클레오티드를제조하기위한이들방법및다른방법은, 당업자에게공지되어있다. 본발명의항체또는이의절편은또한, HMPV 복제를하향조절또는억제하는이들의능력에대해당업자에게공지된기술을사용하여분석될수있다 ( 예를들어본원에참고문헌으로포함되는미국특허제 6,818,216 참조 ). 예를들어, HMPV 복제는플라크분석에의해분석될수있다. 본발명의항체또는이의절편은또한, HMPV 폴리펩티드의발현을하향조절또는억제하는이들의능력에대해분석될수있다. 당업자에게공지된기술 (ELISA, 웨스턴블럿분석, 노던블럿분석및 RT-PCR이포함되나이에제한되지는않음 ) 이 HMPV 폴리펩티드의발현을직접적또는간접적으로측정하는데사용될수있다. 또한, 본발명의항체또는이의절편은합포체의형성을방지하는이들의능력에대해분석될수있다. 본발명의항체또는이의절편은, 인간에게사용되기전에원하는치료적또는예방적활성에대해체외, 이후체내에서시험된다. 예를들어, 본발명의조성물또는특정항체의투여를나타내는지여부를측정하는데사용될수있는체외분석은, 대상조직세포를배양액에서성장시키고, 본발명의항체또는조성물에노출시키거나또는이를별도로투여하고, 조직시료에대한이러한본발명의항체또는조성물의영향을관찰하는체외세포배양분석을포함한다. 다양한구현예에서, HMPV 감염에포함된세포유형의대표적세포 ( 예를들어 LLC-MK2 세포 ) 로체외분석을실행하여본발명의항체또는조성물이 HMPV에대해원하는영향을갖는지측정할수있다. 한측면에서, 본발명의항체또는조성물은또한, 인간에게투여되기전에체외분석및동물모델시스템에서시험된다. 특정구현예에서, 본발명의항체또는이의절편, 또는본발명의조성물 을코튼랫트에 10 5 pfu의 HMPV로챌린지하여투여하고, 4일이상후에랫트를희생시키고 HMPV 역가및항- HMPV 항체혈청역가를측정한다. 또한상기구현예에따라, 희생된랫트의조직 ( 예를들어폐조직 ) 을조직학적변화에대해검사할수있다. - 15 -
<97> <98> <99> <100> <101> 본발명에따라, 인간대상으로의임상시험이본발명의항체또는이의절편의예방적및 / 또는치료적효과를설명하기위해수행될필요는없다. 항체또는이의절편을사용하는체외및동물모델연구는인간에대해추론될수있고, 상기항체또는항체절편의예방적및 / 또는치료적유용성을설명하기에충분하다. 치료요법에서의사용을위한본발명의항체또는조성물은랫트, 마우스, 소, 원숭이및토끼를포함하나이에제한되지는않는적합한동물모델시스템에서이의독성에대해시험될수있다. 항체또는조성물의독성의체내시험에대해서는, 당업계에공지된임의의동물모델시스템이사용될수있다. 바이러스감염을치료또는예방하는것에서의효능은, 바이러스의복제를억제하고, 숙주안에서스스로정착하는바이러스를방지하거나또는전파를억제하고, HMPV 감염의발생을감소시키거나, 또는 HMPV 감염과연관된하나이상의증상을개선또는완화시키도록본발명의항체또는조성물의능력을검출함으로써설명될수있다. 예를들어바이러스수치의감소, 하나이상의증상의개선, HMPV 감염의지속성감소, 또는본발명의항체또는조성물의투여후사망률및 / 또는이환율에서의감소가있다면, 상기치료가치료적인것으로간주된다. 또한, 면역특이적으로하나이상의 HMPV 항원에결합하는하나이상의항체또는이의절편의투여후면역반응에서의증가가있다면, 상기치료가치료적인것으로간주된다. 본발명의항체에대한적합한표지가하기에제공된다. 적합한효소표지의예에는말레이트디하이드로게나아제, 스타필로코칼뉴클레아제, 델타-5-스테로이드이소머라아제, 이스트-알코올디하이드로게나아제, 알파- 글리세롤포스페이트디하이드로게나아제, 트리오스포스페이트이소머라아제, 퍼옥시다아제, 알칼린포스파타제, 아스파라기나아제, 글루코오스옥시다아제, 베타-갈락토시다아제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라아제, 글루코오스-6-포스페이트디하이드로게나아제, 글루코아밀라아제및아세닐콜린에스테라아제가포함된다. 적합한방사성동위원소표지의예에는 3 H, 111 In, 125 I, 131 I, 32 P, 35 S, 14 C, 51 Cr, 57 To, 58 Co, 59 Fe, 75 Se, 152 Eu, 90 Y, 67 Cu, 217 Ci, 211 At, 212 Pb, 47 SC, 109 Pd 등이포함된다. <102> <103> <104> <105> <106> <107> <108> <109> 적합한비방사성동위원소표지의예에는 157 Gd, 55 Mn, 162 Dy, 52 Tr 및 56 Fe가포함된다. 적합한형광표지의예에는 152 Eu 표지, 플루오레세인표지, 이소티오시아네이트표지, 로다민표지, 피코에리트린표지, 피코시아닌표지, 알로피코시아닌표지, o-프탈데히드표지및플루오레스카민표지가포함된다. 적합한독소표지의예에는디프테리아독소, 리신및콜레라독소가포함된다. 화학발광표지의예에는관강내표지, 이성관강내표지, 방향족아크리디늄에스테르표지, 이미다졸표지, 아크리디늄염표지, 옥살레이트에스테르표지, 루시페린표지, 루시페라아제표지및아에쿠오린표지가포함된다. 핵자기공명조영제의예에는중금속핵예컨대 Gd, Mn 및철이포함된다. 상기기재한표지를항체에연결하기위한전형적인기술에는, 당업계에공지된글루타르알데히드, 페리오데이트, 디말레이미드, m-말레이미도벤질-n-하이드록시 -숙시니미드에스테르의사용이포함된다. 한구현예에서, 메타뉴모바이러스 (HMPV) 감염을진단하는방법이개시되는데, 이는항체 /F-단백질복합체가형성되게하는조건하에 HMPV 융합당단백질 (F-단백질) 에특이적으로결합하는인간항체를대상으로부터의시료에접촉시키고, 시료를항체 /F-단백질복합체와반응하는시약에접촉시키고 ; 시약과항체의반응을검출하는것을포함하며, 여기서시약-항체반응의검출은대상에서의 HMPV 감염의존재를나타낸다. 한측면에서, 항체 /F-단백질복합체형성은항체-항원반응을나타낸다. 또다른측면에서, 시약반응에는 HMPV F-단백질에특이적으로결합하는인간항체를인지하는항체의결합이포함되나이에제한되지는않는다. 또한시약반응에는항체에공유결합또는비공유결합적으로결합하는부분을인지하는리간드가포함된다. 예를들어항체는비오틴부분으로표지될수있고, 시약은스트렙타비딘을포함한다. 이러한목적에유용한다른리간드는당업계에공지되어있으며, 상기약술한바와같은표지를포함한다. 또다른구현예에서, 하나이상의항체및하나이상의 HMPV F-단백질사이에복합체를형성시키는조건하에하나이상의 HMPV 융합당단백질 (F-단백질) 에특이적으로결합하는하나이상의인간항체를생물학적시료에접촉시키기위한장치, 비복합항체를제거하는하나이상의시약, 항체를인지하는하나이상의시약, 항체및시약의사용에대한절차를제공하는사용설명서, 및하나이상의항체, 시약및사용설명서를수납하는용기를포함하는키트가개시된다. 한측면에서, 장치는심지, 면봉, 다공성매질 ( 예를들어비즈, 겔 ), 모세 - 16 -
관튜브, 실린지, 피펫등을포함할수있으나이에제한되지는않는다. 치를통해삼출되는이동상으로서역할하는고정상을포함할수있다. 관련측면에서장치는, 이러한장 <110> <111> <112> <113> <114> <115> <116> <117> <118> <119> <120> <121> <122> 한측면에서, 진단키트의상이한일원은사용될실제적인진단방법에의존한다. 상기기재한진단키트의가능한일원에추가하여, 키트는양성참고시료, 음성참고시료, 희석제, 세척액및 완충액을적절한것으로서함유할수있다. 한측면에서, 진단은면역진단법예컨대효소면역측정법 (ELISA), 방사선면역측정법 (RIA) 또는면역형광측정 법 (IFA) 을포함할수있다. ELISA에대해, 표지로서폴리펩티드에연결되는, 전형적으로사용되는효소는양고추냉이과산화효소 (horseradish peroxidase), 알칼린포스파타아제등을포함한다. 이들각각의효소는색형성시약또는시 약 ( 기질 ) 예컨대각각하이드로겐퍼옥사이드및 o-페닐렌디아민 ; 및 p-니트로페닐포스페이트와함께사용된 다. 대안적으로는, 폴리펩티드에연결되는비오틴은양고추냉이과산화효소와같은신호수단에스스로연 결되는아비딘과함께면역반응물의존재를나타내도록표지로서이용될수있다. 한측면에서, 생물학적유체및조직에존재하는경우 F-단백질은본발명의방법에의해검출될수있다. 검출가능한양의항원을함유하는임의의표본이사용될수있다. 시료는소변, 타액, 뇌척수액, 혈액, 혈 청등과같은액체, 또는조직, 대변등과같은고체또는반고체, 또는대안적으로는조직학적진단에서흔히 사용되는것과같은고체조직일수있다. 한측면에서, 시료는혈청을포함하는혈액이다. 관련측면 에서, 표본은인간혈액또는혈청시료이다. 항체및항원의특정농도, 인큐베이션의온도및시간뿐아니라다른분석조건은시료중항원의농도, 시료 의성질등과같은인자에따라다양할수있다. 당업자는일상적실험의이용에의한각각의측정에대해 작용및최적분석조건을결정할수있을것이다. 전형적으로, 시간기간은분석을수행하기전잘공지된 방법에의해주어진반응조건에대해예비결정된다. 생물학적분석조건하에서, 유지시간기간은통상분내지시간, 예컨대 30분내지 2시간내지하룻밤이지만, 이러한시간기간은다양할것이다. 다른단계예컨대세척, 교반, 진탕, 여과또는항원의예비분석추출 등이, 특정상황에대해요구되거나또는필요할수있는것으로서분석에물론첨가될수있다. 형성된복 합체는본원에기재된수단에의해이후검출될수있다. 상기언급한모든진단법은당업계에잘공지되어있으며, 당업계의통상의지식중하나로, 사용될진단법에 관련된진단키트에대해유용한일원을용이하게선택할것이다. 본발명의조성물은살아있는대상 ( 예를들어가축또는애완동물일수있거나, 또는사람일수있는척추동물 또는다른포유류 ) 에대한투여에적합한형태로제형화될수있다. 예를들어적합한형태는인코딩된항 체, 또는이의항원결합절편을포함하는조성물일수있고, 상기조성물은 HMPV에노출된개인과같은대상의 수동적면역화에유용할수있다. 그로서, 본발명은 HMPV에의해야기또는악화된호흡기감염과같은병 리학적상태를개선하기에유용한약제를제공한다. 한구현예에서, 수동적면역화는 HMPV에대해백신을주사하는경우직면하게되는자연적인면역반응의변화 에의존하는것보다는, 일관된보호적농도에서항-바이러스성항체를대상에게전달되게한다. 관련측면 에서, 상이한특이성의소수의상이한항체를동시에단일투여하는것은, 몇몇바이러스성호흡기병원체에의 한감염으로부터대상을보호한다. 한구현예에서, 인간메타뉴모바이러스 (HMPV) 융합당단백질 (F-단백질) 에특이적으로결합하는하나이상의 인간항체를포함하는백신이개시된다. 한측면에서, 백신은보강제를추가적으로포함할수있다. 이러한보강제는물론수의학또는인간의약에 책임있는허가기관에의해백신으로의사용이승인된보강제여야한다. 개별적인항체또는항체를함유하는백신제제는진단적또는치료적사용을위한조성물에혼입될수있다. 형태는진단적또는치료적적용및투여의의도된양태에의존한다. 조성물은또한원하는제형에 따라, 동물또는인간투여를위한약학조성물을제형화하는데흔히사용되는운반체로서정의되는, 약학적으 로허용가능하고비독성인담체또는희석제를포함할수있다. 희석제는조합물의생물학적활성에영향을주지않도록선택된다. 이러한희석제의예는증류수, 생리적포스페이트-완충식염수, 링거액, 덱스트로오 - 17 -
스용액및행크액이다. 추가적으로, 약학조성물또는제형은또한다른담체, 보강제또는비독성, 비치료적, 비면역성안정화제등을포함할수있다. Remington's Pharmaceutical Science (15판, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980) 를참조한다. 체내사용을위해의도된조성물은통상멸균적이다. 모투여 (parental administration) 용조성물은멸균적이고, 실질적으로등장이며, GMP 조건하에제조된다. <123> <124> <125> <126> 제형은항체로치료가필요한포유류 ( 인간을포함함 ) 에게, 덩어리로서의정맥투여, 또는장시간에걸친지속적주입과같은공지된방법에따라, 근육내, 복막내, 뇌척수액내, 피하, 관절내, 윤활막내, 경막내, 경구, 국소또는흡입경로에의해투여된다. 한구현예에서, 상기제형은정맥투여에의해포유류에게투여된다. 이러한목적을위해, 제형은예를들어실린지를사용하거나또는 IV 선을통해주입될수있다. 항체의적절한투약량 (" 치료적으로효과적인양 ") 은, 예를들어치료할상태, 상태의중증도및과정, 예방적또는치료적목적을위해투여되는지의여부, 예전의치료요법, 환자의임상적기록및항체에대한반응, 사용하는항체의유형및참석하는의사의판단에의존한다. 항체는 1회로또는연속치료에걸쳐적합하게투여되고, 진단으로부터나아가임의시간에의해환자에게투여될수있다. 항체는유일한치료로서, 또는다른약물과함께, 또는의문의상태를치료하는데유용한치료요법으로서투여될수있다. 일반적제안으로서, 투여된항체의치료적유효량은하나이상의투여여부에의해, 환자체중의약 0.1 내지약 50 mg/kg 범위에있으며, 예를들어매일투여된사용항체의전형적인범위는약 0.3 내지약 20 mg/kg, 및 / 또는약 0.3 내지약 15 mg/kg이다. 그러나, 다른투약요법이유용할수있다. 이러한치료요법의진행은통상적인기술에의해용이하게모니터링된다. 하기의실시예는, 제한하지않고본발명의범주를설명하도록의도된다. <127> <128> <129> <130> <131> <132> 실시예재료및방법포유류세포에서의 HMPV F 외영역 (ectodomain) 발현. 제안된명명법에따라 TN/92-4, 원형유전자군 A2 균주로지정된병원성임상단리물 (van den Hoogen 등, Nat Med (2001) 7:719~724) 로부터전체길이 F 서열을증폭시키기위해 RT-PCR을사용하였다. 전체 TN/92-4 F 서열은, 포유류 trna 바이어스를위한차선의코돈사용이교체되도록시판공급원 (Aptgen) 에의해서열-최적화되어, 이로써 2차 mrna 구조가개선되고 AT-풍부부위가제거되어 mrna 안정성이증가한다. 이후막관통 (TM) 영역이없는 HMPV F 외영역구조를인코딩하는발현벡터를생성시켰다 (pcdna3.1-fδtm). F 유전자의최적화된전체길이 cdna를프라이머 5'-GGAGGTACCATGAGCTGGAAG-3' 및 5'-G AAGCGGCCGCTGCCCTTCTC-3' 로 PCR 증폭시켰고, PCR 생성물을제한효소처리하고벡터 pcdna3.1/myc-his B (Invitrogen사제) 의 KpnI/NotI 위치 ( 프라이머서열에서밑줄그어진제한위치 ) 로연결시켰다. pcdna3.1-fδtm 재조합플라스미드는 293-F 세포현탁물 (Freestyle 293 Expression System, Invitrogen사제 ) 에트랜스펙션되었다. 트랜스펙션후 96시간째에, 세포를실온에서 100 x g에서 5분동안원심분리하고상층액을채취하였다. 정제전에, 0.2μm 필터를통해상층액을여과시켰다. 6xHis-표지 F 외영역의정제. UNICORN 4.12 소프트웨어 (GE Healthcare사제 ) 에의해제어되는 AKTA FPLC 시스템으로단백질정제를수행하였다. 예비패킹된 HisTrap Ni-Sepharose 컬럼 (GE Healthcare사제 ) 를사용하여, 고정화금속이온크로마토그래피에의해 His-표지 F 외영역 FΔTM을정제하였다. 정제전에 ph, 염및이미다졸농도를조정하기위해, 농축된결합완충저장액으로시료를희석하였다. 단백질을 5.9 ml/ 분의로딩유속을갖는 5 ml HisTrap 컬럼에로딩하였고, 결합완충액은 20 mm 인산나트륨, 0.5 M NaCl, 30 mm 이미다졸을함유하였다 (ph 7.4). 관련없는단백질을 8% 용리완충액의 4 컬럼부피를사용하여용리단계 1에서용리하고, His-표지 F 단백질을 25% 용리완충액의 4 컬럼부피로용리단계 2에서용리하였다. 용리완충액은 20 mm 인산나트륨, 0.5 M NaCl, 500 mm 이미다졸을함유하였다 (ph 7.4). 정제된단백질을농축시키고, 30,000 및 100,000 분자량차단을갖는 Amicon Ultra centrifugal filter (MWCO, Millipore사제 ) 를통해, PBS (Invitrogen사제) 에대해투석시켰다. 항체파지디스플레이라이브러리의구성및선택. - 18 -
<133> 항체 Fab 면역글로불린 G1 (IgG1) (K 및또는 X 사슬 ) 파지디스플레이라이브러리를, 문헌 [Barbas 등, Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89:10164~10168, Williamson 등, Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90:4141~4145] 에 기재된바와같이 12명의공여자의골수조직으로부터클로닝하였다. 라이브러리는 3 x 10 3 내지 5 x 10 7 일원의크기로분류되었다. 문헌 [Barbas 등 (1992)] 에기재된바와같은바이오패닝방법을사용하여, 효소면역측정법 (ELISA) 웰에결합한재조합 HMPV F 단백질에대해개별적으로라이브러리를선택하였다. 패닝의 4 또는 5번째라운드에서회수한선택파지를가용성 Fab 발현시스템으로전환시키고 (Barbas 등 (1992)), 재조합 HMPV F 단백질선택항원과의반응성에대해개별적으로클론을시험하였다. 선택된 HMPV F 단백질- 반응성 Fab 클론을면역-친화성크로마토그래피로정제하였다 (Williamson 등 (1993)). HMPV-반응성항체 Fab 클론의경쇄및중쇄가변부서열을, 문헌 [Williamson 등 (1993)] 에기재된바와같이측정하였다. 또는 V L 부위서열을, 접합분석프로그램을사용하여, 최근요약된인간 Ig 유전자의업데이트된명명법 (Giudicelli 등, Nucleic Acid Res (2006) 34:D781~784, Ruiz 등, Nucleic Acids Res (2000) 28:219~221) 으로결과를보고하는국제 ImMunoGeneTics 데이터베이스 (France, Centre Informatique National de L'Enseignment Superieur, Montpellier에의해주최 ) 로분석하였다. 수동조사로모든 V H 및 V L 지정을검토및확증하였다. 접합부위에서의돌연변이를수동으로확증하고, 남은부위에서의돌연변이를수동으로기록하고표로만들었다. V H <134> <135> <136> <137> 면역형광분석. LLC-MK2 세포배양액단일층을 1의 MOI에서 HMPV로감염시켰다. 감염시키고 34시간후, 세포를 10% 완충된포르말린으로고정시키고, PBS-T로세척한후 PBS-T/ 밀크중 Fab 또는항-HMPV 혈청 (1:500으로희석 ) 으로, 1시간동안 37 에서인큐베이션하였다. PBS-T로세척한후, PBS-T/ 밀크중 1:1000으로희석된 AlexaFluor586-컨쥬게이션된염소항-기니아피그 Ig 또는 AlexaFluor568-컨쥬게이션된마우스항-Fab 항체 (Molecular Probes사제 ) 로 1시간동안 37 에서세포를염색하였다. 세포단일층을 Nikon Diaphot 위상차현미경으로검사하고, Nikon D100 디지털카메라로이미지를수집하였다. Adobe Photoshop 및 Illustrator 로, 이미지의디지털조정또는재생없이이미지를잘라내고그림을구성시켰다. 체외중화분석. HMPV-중화역가를, 문헌 [Williams 등, J Virol (2005) 79:10944~10951] 에기재된바와같이, 하기의수정사항을갖는플라크감소분석에의해측정하였다. 희석하지않는것에서부터시작하여연속 4배희석시킨 Fab 현탁액을, 24웰플레이트에서웰당 50 플라크가수득되도록희석된 HMPV의작업용저장액 (working stoc k) 과함께인큐베이션하였다. 1시간동안 37 에서회전시키면서, Fab 및바이러스혼합물을인큐베이션하였다이후 Fab/ 바이러스혼합물을 24웰배양플레이트에서 LLC-MK2 단일층상에 3중으로플레이팅하고, 실온에서 1시간동안흡수되게하였다. 이후웰에, 트립신으로보충된 OptiMEM 중 0.755 메틸셀룰로오스를깔고, 4일동안 CO 2 배양기에서 37 에서인큐베이션하였다. 문헌 [Williamson 등 (2005)] 에기재된바와같 이, 단일층을헹구고포르말린고정시키고, 기니아피그항 -HMPV 혈청및퍼옥시다아제 - 표지염소항 - 기니아피그 Ig 로염색하였다. 플라크수를세고, 60% 플라크감소역가를계산하였다. HMPV 양성인간혈청을양성 대조군으로사용하였다. <138> <139> 표면플라스몬공명. BIAcore 2000에서표면플라스몬공명을사용하여 HMPV F-특이적 MAb와 HMPV F 단백질의반응을수행하였다. 정제된재조합 HMPV F 또는 RSV F 단백질을, ph 4.5인 10 mm 소듐아세테이트에서 30μg/ml로희석하고, 목표 RU 밀도 1200을갖는 CM5 센서칩 (BIAcore Life Sciences사제 ) 의덱스트란기질에대한아민커플링에의해 45 μl/ml에서공유결합적으로고정화시켰다. 미반응한활성에스테르기를 1M 에탄올아민으로차단하였다. 참조물로사용하기위해, 단백질을함유하지않는빈표면을동일한고정조건하에제조하였다. 정제된 HMPV F 항체및 RSV-특이적 MAb ( 팔리비주맙 ) 을, HBS/Tween-20 완충액 (BIAcore Life Sciences사제 ) 중 5 내지 500 nm 범위의상이한농도에서, 세포표면을참조하도록 RSV F 단백질, 고정화 HMPV F 단백질에걸쳐주입하였다. 30μl/ 분의유속에서 180초동안항체결합을측정하고, 추가로 360초동안해리를모니터링하였다. 50 mm HCl을 100μl/ 분에서 30초동안파동시켜센서칩으로부터잔류결합항체를제거하였다. BIAevaluation 소프트웨어를사용하여, 1:1 랭뮤어결합모델에맞도록구형으로결합곡선을배열시켜 K a, K d 및 KD 를측정하였다. - 19 -
<140> <141> 체내감염및 Fab 처리. 상업적사육업체 (Harlan, Indianapolis, IN) 로부터 5~6주령의코튼랫트를구입하여, 표준식이및물을자유로이공급하고, 미세분리기케이지에두었다. 바이러스또는 Fab 접종전에동물을이소푸란흡입으로마취시켰다. 사용된바이러스균주는, 제안된명명법에따라 hmpv 균주 TN/92-49, 유전자군 A2 바이러스로지정된병원성임상단리물 (van den Hoogen 등 (2004)) 이었다. 이러한바이러스저장액은 LLC-MK2 세포단일 층배양액중플라크역가에의해 3.5 x 10 6 pfu/ml의역가를갖도록결정되었다. 5-1군의코튼랫트에, 0 일째에 100μl의부피중 3.5 x 10 5 pfu로비강내로접종하였다. 감염후 3일째에 Fab의용액을비강내로주입하였다. 무관하게유사제조된 Fab 지정 B12를 1 또는 4 mg/kg 체중에서사용하였다. HMPV F-특이적 DSλ7을 0.06, 0.25, 1 또는 4 mg/kg 체중에서사용하였다. 낮은농도로인해 225μl 부피로주어진 B12 4 mg/kg 용량을제외하고, 모든 Fab 농도를 100μl의동일부피로조정하였다. 감염후 4일째 (Fab 투여후 24시간 ), 동물을 CO 2 질식및방혈시켜희생시켰다. 비강및폐조직을별도로수합하고, 각동물에대해개별적으로칭량하고, 즉시균질화시켰다. 폐를얼음냉각유리균질화기에서분쇄하고, 비갑개 (nasal turbinate) 를 3 ml의얼음냉각행크염평형용액중냉각된자기막자사발과막자에서멸균모래로연마하였다. 조직호모제네이트를 4 에서 10분동안 300 x g에서원심분리하고, 상층액을수집하고, 동결바이알에분취하고, 액체질소에서순간동결시켰다. 반데르빌트동물실험윤리위원회 (The Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee) 가상기연구를승인하였다. <142> <143> 통계적분석. 대조군사이의바이러스성역가를크루스탈-왈리스시험 (Krustal-Wallis test) 으로비교하였다. 각각의 HMPV F-특이적 Fab DSλ7-처리군에서의바이러스성역가를, 윌콕슨순위합시험 (Wilcoxon rank sum test) 을사용하여조합대조군에서의바이러스수치와비교하였다. 선형회귀를사용하여용량-반응분석을검사하 였다. 용량이 2-4, 2-2, 2 0 및 2 2 mg/kg이고, 조직바이러스역가가비-가우시안분포의영향이최소화되도록 log-변환되었기때문에, 용량은 log 2 변환되었다. 플라크가검출되지않은바이러스성분석에, log 10 -변환 전 5 PFU/g의검출한계에서역가가할당되었다. 단지 4개의거리를둔용량수준만으로, 데이터에대한유 연한곡선에적합한모델이과대적합할수있었음이추론되었기때문에, 이모델에서선은데이터에 적합하였다. <144> <145> <146> 파지라이브러리패닝에의한 HMPV F-특이적단클론 Fab 절편의회수. 12명의공여자의골수조직으로부터제조된파지항체 Fab 디스플레이라이브러리를, ELISA 웰에결합한재조합 HMPV F 단백질에대해개별적으로선택하였다. 파지패닝의 4 또는 5번째라운드후존재하는 20 또는 30개항체 Fab 클론을, 선택된항원에대한반응성에대해 ELISA로평가하였다. 12명공여자라이브러리중 5개로부터항원-특이적클론을단리하였다. 특이적 Fab의 Fab 경쇄및중쇄 DNA 서열의분석으로, 별개의서열을갖는 14개의상이한클론을확인하였다 ( 표 1). 분자의막관통부분이제거된, 친화성정제된 F-단백질 (ΔTM) 에대한 HMPV에대해선택실험을수행하였다 (John Williams, Vanderbilt University에의해제공됨 ). 선택실험은표 1에나타낸바와같이중쇄서열분석으로측정된것으로서, 14개의상이한 HMPV-반응성항체패널을야기하였다. 표 1. ELISA에의해재조합 hmpv F 단백질과특이적으로반응하는재조합인간항체 Fab의중쇄 (A) 및경쇄 (B) 가변부아미노산서열. - 20 -
<147> (A) <148> - 21 -
<149> (B) <150> <151> <152> <153> * 체외중화활성을갖는 Fab 클론을굵은글씨로나타내었다. 이들실험에서, 6개파지항체중오직하나만이단일패닝후 HMPV-특이적항체를얻는데실패하였다. 가 용성 Fab 절편으로서, 표 1에나타낸각각의항체는 ELISA 포맷에서재조합 F-단백질과양성적으로반응하나, 대조군항원과는그렇지않은것으로나타났다. 이들의반응성을추가적으로조사하기위해, ELISA-양성 Fab 항체를면역조직화학분석에서 HMPV-감염 LLC-MK2 세포에대해평가하였다. ELISA 스크리닝에의해특이적으로결합한 HMPV F-단백질인 14개 Fab 클론으로부 터세균성상층액을시험하였다. 시험한 14개 Fab 항체중, 2개를제외하고모두 HMPV-감염세포에대해특 이적결합을나타내었다 ( 도 2A,B). 몇몇 Fab는체외에서중화활성을나타내었고, 세균성상층액에서정제 되었다. 이들정제된 Fab는또한 HMPV-감염된세포에결합하였다 ( 도 2C,D). F-특이적 Fab는, F 단백질 의예상된위치측정과일치하는막-분포패턴에서합포체및단일감염세포모두를검출하였다. 형광의 - 22 -
패턴은, 다클론혈청으로의 HMPV-감염세포염색, 또는 HMPV F 단독을인코딩하는 cdna로트랜스펙션된세포로이미나타낸것과유사하였다. 면역형광에의해 HMPV를검출한 Fab 클론의체외중화능력을추가적으로시험하였다. <154> <155> HMPV-특이적 Fab의기능성을측정하기위해, 미세중화플라크분석을이용하였다. 처음으로, 가용성 F-단백질반응성 Fab 클론을함유하는미정제세균성상층액을스크리닝하였다. 플라크수를 60% 감소시키는데필요한세균성상층액의희석을각각의경우에기록하였다. 높은 HMPV 중화역가를갖는 HIV-1 및인간혈청을인지하는재조합 Fab를각각음성및양성대조군으로서상기실험에포함시켰다. 이들실험은, HMPV의 A2 균주에대해 HMPV 중화활성을갖는 4개의개별적 Fab 클론, DSλ1, DSλ6, DSλ7 및 ACN044를나타내었다. 각각의이들항체를, 비-중화 HMPV F-단백질특이적항체 Hanκ9 및 Fab b12와함께친화성크로마토그래피로써정제하였고, HMPV 중화실험을반복하였다. 이들실험의결과를표 2에나타내었다. 표 2. 정제된 F-단백질특이적재조합인간항체 Fab에의한 HMPV (A2 균주 ) 의중화. <156> <157> <158> 상기데이터는, Fab 클론 DSλ1, DSλ6, DSλ7 및 ACN044가체외에서합리적인효능 (1.1 내지 3.2μg/ml) 으로 HMPV의 A2 균주를중화시키는것을나타내었다. 그후, Fab 패널이또한 A2 이외의 HMPV의균주를중화시킬수있는지여부를측정하였다 ( 표 3). A2가임상에서우세한 HMPV 유전자군으로생각되었지만, 다른유전자군, 및특히 B2가또한흔히생각될수있다. 표 3. 4개의모든공지된유전자군으로부터 HMPV 균주에대해선택된인간 Fab의중화활성 (60% 플라크감소 ). <159> <160> <161> <162> 상기데이터는, 선택된모든항체가 HMPV A2 유전자군을중화시키지만, 오직 DSλ7 Fab 클론만이 A1 또는 B1 유전자군에대해임의의중화활성을나타낸다는것을확증하였다. 이들데이터는항체중화 A2 바이러스의 A2 유전자군선호적선택의재조합 F-단백질대표물에대한선택에의해항체가회수된다는것을제시한다. 이러한유형의유전자군-특이적중화에는상이한 HMPV 유전자군과연관된 F-단백질사이의높은아미노산동일성이예측하지못하게주어지고, 항체를중화시키는반응에의해가해지는선택적압력이파라믹소비리데과에서의외피단백질이종성을구체화시키는데중요한역할을할수있다는논의에무게가더해진다. 하기는 SEQ ID NO:30 (A1); SEQ ID NO:32 (A2); SEQ ID NO:34 (B1) 및 SEQ ID NO:36 (B2) 에의해예시되는바와같은, 획득한임상시료에서생각되는것으로서 4개의 HMPV 유전자군내, 및이를넘은 F-단백질서열의포괄적인비교이다 ( 표 4). 표 4. 유전자군내, 및사이에서의전체길이인간메타뉴모바이러스 F 유전자의뉴클레오티드및아미노산동일성의비교. - 23 -
<163> <164> <165> HMPV FΔTM-특이적 Fab는많은 VH 유전자조각을이용하였다 ( 표 5). 표 5. 재조합 HMPV F 단백질과특이적으로반응하는재조합인간항체 Fab의중쇄및경쇄가변부조각사용. 굵은글씨는체외중화활성을갖는 Fab 클론을나타냄. 별개의공여자라이브러리에서유래한클론 : 모두 "AC" 로지정 ; 모두 "DS" 로지정 ; Han01 및 Han05; Han02; Han09; 및 Han10: LL01. <166> <167> 성인무작위순환 B 세포목록에서가장흔히사용되는 V H 조각임에도불구하고 (Brezinchek 등, J Immunol (1995) 155: 190-202, Corbett 등, J MoI Biol (1997) 270:587-597, Weitkamp 등, J Immunol (2003) 171 :4580-4688), VH3-23은오직하나의클론에만존재하였다. 5% 미만의무작위순환 B 세포에의해이용되는 V H 1-03은, 네개클론에의해사용되었다. V H 4-59는세개클론에서이용되었는데, 두개는한공여자로부터클론적으로관계된것으로보였고, 한개는개별적인공여자로부터관계된것으로보였다. 바이러스중화활성을갖는네개의 Fab 클론중, 단일공여자로부터의두개 (DSλ1 및 DSλ6) 는매우유사한 V H 조각및동일한 HCDR3 부위 ( 표 1) 를갖지만, 별개의경쇄를가졌다. 최고중화능력을갖는두개의클론 (ACN044 및 DSλ7) 은뉴클레오티드및아미노산수준에서별개인 V H, J H 및경쇄를포함하지만, 매우유사한 HCDR3 루프를가졌다 ( 표 1). 체세포돌연변이의분석은, 대부분의 Fab 클론이우세한기본틀돌연변이로매우돌연변이되었음을나타내었다 ( 표 6A 및 6B). <168> 표 6. (A) 중쇄 Fab 클론의 V- 부위에서의대체및침묵돌연변이. (B) 경쇄 Fab 클론의 V- 부위에서의대체 및침묵돌연변이의수. 굵은글씨는체외중화활성을갖는 Fab 클론을나타냄. 별개의공여자라이브 - 24 -
러리에서유래한클론 : 모두 "AC" 로지정 ; 모두 "DS" 로지정 ; Han01 및 Han05; Han02, Han09 및 Han10; LL01. <169> (A) <170> <171> (B) <172> <173> <174> 그러나, 돌연변이의수및중화활성사이에는명백한상관관계가없었다. SPR 연구가, 예상한바와같이 HMPV-특이적 Fab가높은친화력으로 HMPV FΔTM에결합한다는것을나타내는반면, RSV F-특이적 MAb 팔리비주맙은그렇지않았다. 500 nm 내지 5 NM 범위농도에서의항-HMPV Fab DSλ7 의결합곡선은 HMPV FΔTM에대한특이적결합의패턴을나타내었다 ( 도 3). 반대로, 도 3은팔리비주맙이 100 nm 농도에서조차도 HMPVFΔTM에결합하지않았다는것을나타낸다. RSV-FΔTM에대한팔리비주맙의결합능력을시험하였고, 이는강한, 특이적결합을나타내었으며, HMPVFΔTM에대한결합결여를보이는것은특이성의결과이고항체의품질에관련되지는않았다. HMPVFΔTM에대한인간 Fab DSλ7의친화력은 K a = 3.54 x 105 (1/ms), K d = 3.48 x 10-5 (1/s) 및 K D = 9.84 x 10-10 (M) 로, 높았다. 이들값은강한, 특이적인항체-항원결합을제시한다. 결합하는 Fab DSλ7은 HMPVFΔTM에대한특이적결합을나타내었으나, RSV FΔTM 단백질에대한검출가능한친화력은가지지않았다 ( 도 3). <175> 햄스터, 기니아피그, 코튼랫트및 9회근친교배된마우스균주에, 마취하에 HMPV 10 5 pfu를비강내로접종하였다. 감염후 4일째동물을희생시켜, 플라크적정 (titration) 으로비강및폐조직에서의 HMPV 역가를측정하였다. 어떠한동물도파라믹소바이러스감염의설치류모델에서흔한호흡기증상을나타내지 않았다. 마우스에서의 RSV 감염연구는, 마우스가오직 10 8 pfu 의매우높은접종으로만움츠리고주름진 모피와같은증상을보인다는것을나타내었다. 비강조직내에존재하는바이러스의양은 4.6 x 10 2 pfu/g - 25 -
조직 (C3H 마우스 ) 내지 10 5 pfu/g 조직초과 ( 햄스터 ) 의범위였다 ( 도 4, 위 ). 따라서모든동물은비갑개에서의 HMPV 복제에대해반-증식허용적이었다. 폐역가의측정으로꽤상이한결과를수득하였다 ( 도 4, 아래 ). 폐조직에서복제하는 HMPV의양은검출가능한값미만 (< 5 pfu/g; 기니아피그및 SJL 마우스 ) 내지평균 1.8 x 10 5 pfu/g ( 코튼랫트 ) 의범위였다. <176> 이들데이터는, 시험한설치류중코튼랫트가 HMPV 감염에대해가장고도로증식허용적임을나타내었다. 따라서, HMPV 10 5 pfu로동물을비강내로감염시키고이들을감염후 2, 4, 6, 8, 10 또는 14일째에희생시킴으로써, 코튼랫트에서의 HMPV 복제의운동학을측정하였다. 도 5에서나타내는바와같이, HMPV 복제는 2 일에 5.6 x 10 4 pfu/g의평균역가에서비갑개에서최고였고, 4일후감소하였고, 6일후비갑개에서검출되지 않았다. 폐조직에서의 HMPV의복제는감염후 4일째 1.8 x 10 5 pfu/g의평균역가에서최고였고, 6일후폐에서바이러스가검출되지않음으로써빠르게감소하였다. 이는인간에서의 HMPV 쉐딩의지속에대한데이터와유사하다 (Ebihara 등, J Clin Microbiol (2004) 42: 126~132; van den Hoogen 등, J Infect Dis (2003) 188: 1571~1577; Williams 등, J Infect Dis (2006) 193:387~395). <177> <178> <179> 다음으로, 감염후 4일째수합한감염및비감염동물의병리적표본을검사하였다. HMPV-감염동물의비강상피는가벼운상피하림프성침윤을나타내었다. 가장주목할만한발견은감염된동물의폐에서였다 ( 도 6B,D). HMPV-감염코튼랫트의폐는기관지주위림프형질세포침윤및기관지점막하의부종성비후를나타내었다. 또한, 단핵성세포침윤및부종으로인한폐포사이질의가벼운확장확산이있었다. 탈피된상피세포, 호중구, 대식세포및무정형조직파편이기관지관내강에서보였다. 폐병변의분포는다발성이었고, 위치적으로광범위하였다. 비감염된동물의폐는정상이었다 ( 도 6A,C). 임의동물에서의뇌, 심장, 흉선, 폐, 비장또는간의단면에서병리학적변화는나타나지않았다. 비감염된동물로부터의폐를포함하는조직단면은, 항-HMPV 혈청과반응성을나타내지않았다 ( 도 7A). HMPV-감염코튼랫트으로부터의뇌, 심장, 흉선, 비장및간의면역염색된단면은음성이었다. HMPV 항원은호흡기상피세포의관강내표면에서, HMPV-감염코튼랫트로부터의단면에서오직호흡기상피조직에서만검출되었다 ( 도 7B). 형태적으로정상및퇴화된상피세포모두에서의세기관지에대한비강조직으로부터의호흡기상피세포에서 HMPV 항원염색이나타났으며, 이는호흡기상피에서의바이러스복제를나타낸다. 탈피된상피세포및대식세포모두를포함하는관강내세포조직파편은 HMPV 항원에대해양성으로염색되었다. CD3에대한면역조직화학은 T 세포의실질적인유입을나타내었고, 이는바이러스정화에관계된세포면역성을제시한다. 조직병리학및면역조직화학데이터모두는, 호흡기도이외의조직에서 HMPV를확인하는데실패했던인간및영장목연구를반영하였다. 보호적면역성및항체반응을측정하기위해, 코튼랫트중두군에비강내로수크로오스 ( 모의 ) 또는수크로 오스정제된 HMPV 10 5 pfu를접종하였다. 두군모두에, 21일후수크로오스정제된 HMPV 10 5 pfu를비강내로챌린지하였다. 4일후코튼랫트를희생시키고, 비강및폐조직에서의바이러스역가를측정하였다. 예전에감염된동물은적당하나큰, 비강역가의감소를나타내었고, 폐에서높은정도의보호를나타내었다 ( 도 8, 좌측 ). 예전에감염된랫트 6마리중 4마리는폐에서바이러스의검출가능한역가를내지않았다. 이들동물에서의바이러스복제의부재는, 면역조직화학으로확증되었다. 예전에감염된동물은또한평균 1:174 (1:117~1:256 범위 ) 로, 큰혈청중화항체역가를가졌다 ( 도 8, 우측 ). <180> <181> 이들데이터는코튼랫트가병리가세기관지염과일치하는, 비강및폐에서의 HMPV 복제에대해증식허용인것으로증명되었음을나타낸다. 또한, HMPV 감염은코튼랫트에서보호면역성을유도한다. 따라서코튼랫트는확고하고다루기쉬운, HMPV 감염의동물모델을제공한다. 체내에서 HMPV-특이적 Fab의기능성을측정하기위해, 코튼랫트중 7개군 (6 내지 7마리동물 / 군, 총 43마리동물 ) 을선택하였다. 4개군에, Fab DSλ를0.06 mg/kg, 0.25 mg/kg, 1 mg/kg, 및 4 mg/kg에서비강내로투여하였다. 대조군으로서 2개군에, Fab b12 ( 비중화항체 ) 를각각 4 mg/kg 및 1 mg/kg에서비강내로투 여하였다. 다음날, 동물에수크로오스정제된 HMPV 10 5 pfu 를비강내로접종하였다. 4 일후, 동물을 희생시키고, 비강및폐조직에서의바이러스역가를측정하였다. 각각의시험및대조군동물의집합을, HMPV 만을부여받은동물군과비교하였다. 결과를표 7 에나타내었다. - 26 -
공개특허 10-2009-0088871 <182> 표 7. HMPV 감염 코튼 랫트에서 인간 Fab DSλ7의 투여에 의한 바이러스 수치의 감소. <183> <184> 폐 조직에 대한 표에서 볼 수 있듯이, DSλ7을 부여받은 랫트는 시험한 모든 농도에서 B12와 비교하여 감소된 바이러스성 역가를 나타내었고, 역가는 특히 DSλ7의 최고 농도에서, 일반적으로 비강 조직에서 낮았다. 이 들 데이터는 상기 보호 면역성 및 항체 반응 데이터와 잘 상호 연관된다 (즉, 도 8). <185> 비강 및 폐에서 HMPV 복제에 대해 증식 허용인 동물에서 나타나는 이들 데이터는, 체내 중화 모델에 사용될 수 있으며 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득되는 Fab 클론 (예를 들어 DSλ7)이 이들 동물의 폐에서 바이러스 수 치를 감소시킬 수 있음을 나타낸다. <186> 또 다른 집합의 실험에서, 코튼 랫트는 HMPV로 비강 내로 감염되고, HMPV 복제가 최고가 되기 전 4일에 비강 내 로 Fab가 투여되었다 (Williamson 등, J Virol (2005) 79: 10944~10951). 에 수합하고, 비강 및 폐 바이러스 역가를 측정하였다. 해 단지 적당하게만 감소하였다 (도 9A). 동물을 희생시키고, 조직을 4일 비갑개에서의 바이러스 역가는 Fab DSλ7 처리에 의 대조군 (p=0.025) 사이의 바이러스 역가에는 큰 차이가 있었는데, 4 미처리 대조군이 두 Fab B12-처리 대조군보다 꽤 높은 기하학적 평균 비강 역가를 갖는다 (1.9 x 10 PFU/g, 4 4 HMPV; 1.2 x 10 PFU/g, B12 4 mg/kg; 1.7 x 10 PFU/g, B12 1 mg/kg). 조합된 대조군에 대한 DSλ7-처리 3 군, 및 4 mg/kg DSλ7 용량만이 비강 바이러스 역가에서의 큰 감소와 연관되었다 (4.9 x 10 PFU/g 대 1.8 10 PFU/g, p=0.0005) (도 9A). 4 용량 및 반응 사이에 통계적으로 큰 관계가 있었다 (p=0.0002): 용량의 매 4배 - 27 -
에대해, 예상되는바이러스수치는약 -0.20 log 10 -PFU/g (-0.29, -0.11 의 95% CI) 감소하였다 ( 도 10A). <187> DSλ7 은폐에서감소하는바이러스역가에서매우효과적이었다 ( 도 9B). 대조군 (Fab B12 로처리또는미 처리된 ) 은 9.6 x 10 3 PFU/g의평균폐바이러스역가를가졌다. 세대조군사이에서폐바이러스역가는상이하지않았다 (p=0.38). 각각의 DSλ7-처리군은대조군보다낮은폐바이러스역가를가졌다 ( 대조군과비교하여각각의군에대해 p<0.0002). DSλ7-처리동물의폐에서의평균바이러스역가는 1.1 x 10 2 (0.06 mg/kg 용량 ) 내지 6.2 x 10 0 PFU/g (4 mg/kg 용량 ) 범위였다. DSλ7 4 mg/kg 군에서의 7마리동물중오직 1마리만이폐에서검출가능한바이러스를가졌다. 이는대조군과비교하여 4 mg/kg 처리된코튼랫트에서 1500배를초과하는감소를나타냈다. 높은용량이낮은폐바이러스역가를야기시킨다는증거가있었다 (p=0.013; 4배용량 [-0.62, -0.10의 95% CI] 당기울기 -0.36 log 10 -PFU/g) ( 도 10B). 그러나, 상기결과는 4 mg/kg 용량에의한것이었다. 0.06, 0.25 및 1.0 mg/kg 용량사이에폐바이러스역가가상이하다는것을제시하는증거는없었다 (p=0.37). 용량의 log 2 -변환없이선형회귀분석을또한수행하였고, 비강및폐조직모두에대한바이러스역가에서의감소는여전히컸다 ( 둘모두에대해 p<0.0001; 폐에대해 -0.62 Log 10 -PFU/g [-0.82, -0.43의 95% CI] 이고, 비갑개에대해 -0.14 log 10 -PFU/g [-0.20, -0.09의 95% CI] 임 ). <188> 본발명이상기실시예에대해기재되었지만, 수정및변형이본발명의취지및범주안에포함되는것으로이 해될것이다. 따라서, 본발명은하기의청구항에의해서만제한된다. <19> <20> <21> <22> <23> <24> <25> <26> <27> 도면의간단한설명도 1은 HMPV FΔTM 단백질에대해 Fab 생성파지디스플레이로염색된 HMPV-감염 LLC-MK2 세포단일층의면역형광상을나타낸다. 염소항-인간 Fab로 2차검출을수행한다. 좌측패널, 10x 배율. 우측패널, 2Ox 배율 ( 두합포체가나타남 ). 도 2는인간항-HMPV F Fab 및 AlexaFluor568-염소항인간 IgG로염색된 HMPV-감염 LLC-MK2 세포단일층의광학현미경및면역형광상을나타낸다. (A), (B). Fab ACN044. (C), (D). Fab DSλ7. 2OX 배율. 도 3은 DSλ7 Fab의표면플라스몬공명분석을나타낸다. (A). 고정화 HMPV FΔTM 단백질에대한 DSλ7의감소하는농도의회합 / 해리곡선. 팔리비주맙 (RSV F-특이적 MAb) 을무관대조군으로서사용하였다. (B). 고정화 HMPV FΔTM 단백질및 RSV FΔTM 단백질에대한, 100 nm 농도에서의 DSλ7의회합 / 해리곡선. 도 4는시험한동물주및종으로부터의감염후 4일째의 HMPV 쉐드의비강역가 ( 위 ), 및시험한동물주및종으로부터의감염후 4일째의 HMPV 쉐드의폐역가 ( 아래 ) 를도해로설명한다. (A) 기니아피그 ; (B) C3H 마우스 ; (C) CBA 마우스 ; (D) C57BI/10 마우스 ; (E) SJL 마우스 ; (F) BALB/c 마우스 ; (G) 129 마우스 ; (H) AKR 마우스 ; (I) DBA/1 마우스 ; (J) DBA/2 마우스 ; (K) 시리안골든햄스터 ; 및 (L) 코튼랫트. 도 5는코튼랫트에서의 HMPV 쉐딩의운동학을도해로설명한다. 동물은비강내로감염되었고감염후 2, 4, 6, 8, 10 및 14일째에희생되었다. 폐쇄된원 = 비강, 개방된원 = 폐. 도 6은코튼랫트폐에서의 HMPV 감염의조직병리학을나타낸다. (A): 낮은출력에서, 대조군폐는정상기도를가지며세포간침윤이없다 (H&E x35). (B): HMPV-감염폐의사이질이단핵세포에의해확장된다 (H&E x25). (C): 비감염폐의높은배율은세포간침윤또는세기관지주위염증을나타낸다 (H&E x62.5). (D): HMPV-감염폐의높은배율은상피의과분비성변화및세기관지주위단핵세포침윤을나타낸다 (H&E xl25). 도 7은코튼랫트폐에서의 HMPV의면역조직화학을나타낸다. (A): 최소배경으로, 대조군폐는 HMPV 항원에대해음성이다 (x250). (B): HMPV-감염폐. HMPV 항원이섬모세포의관강내표면에서불연속패턴 ( 화살표 ) 으로검출된다. 관내강 (L) 에서의혼합염증성세포를주목한다 (x250). 도 8은 1차접종후 21일째챌린지한후의 HMPV-감염동물의이전모의감염된비강및폐 HMPV 역가 ( 좌측 ), 및 1차접종후 21일째챌린지한후의 HMPV-감염동물의이전모의감염된혈청 HMPV-중화항체역가 ( 우측 ) 를도해로설명한다. 도 9는 HMPV의비강 (A) 및폐 (B) 역가를나타낸다. 군은실시예부분에정의된바와같다. 조직바이러스역가는통계적분석을위해 log(10)-변환되었다. 윌콕슨 (Wilcoxon) 순위합시험을사용하여군사이 - 28 -
를비교하였다. 수평바는기하학적평균을나타내고 ; 점선은검출한계를나타낸다 (5 PFU/g). <28> 도 10은 DSλ7의용량반응관계를나타낸다. (A) HMPV의비강역가. (B) HMPV의폐역가. 군은본문에정의된바와같다. 실시예부분에기재된바와같이, Fab DSλ7 및 log(10)-변환된바이러스성역가사이의용량반응관계를검사하는데선형회귀를사용하였다. 점선은검출한계를나타낸다 (5 PFU/g). 도면 도면 1 도면 2-29 -
도면 3-30 -
도면 4 도면 5-31 -
도면 6 도면 7-32 -
도면 8-33 -
도면 9-34 -
도면 10 서열목록 <110> THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE WILLIAMSON, Anthony R. CHEN, Zhifeng SANNA, Pietro Paolo BURTON, Dennis R. CROWE, James WILLIAMS, John V. <120> HUMAN ANTIBODIES NEUTRALIZING HUMAN METAPNEUMOVIRUS <130> SCRIP1810-2WO - 35 -
<150> US 60/918,030 <151> 2007-03-13 <150> US 60/849,626 <151> 2006-10-04 <160> 64 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 372 <212> DNA <400> 1 atggcccagg tgaaactgct cgagtcgggc ccaggactgg tgaagccttc ggagaccctg 60 tccctcacct gcactgtctc tggtggctcc atcagtagtt attactggac ctggattcga 120 cagcccccag ggaagggact ggagtggatt ggatactcgt accccagtgt gagcaccaag 180 tacaacccct ccctcaagag tcgagtctcc atctcaacag acacgtccaa gagccagttc 240 tccctgaagc tgacttctgt gaccgctgcg gacacggccg tttattactg tgcgcgagga 300 gcagtgcgag ctagtggact ccatgacgct tatgacatct ggggccaagg gacactggtc 360 accgtctctt ca 372 <210> 2 <211> 129 <212> PRT <400> 2 Ala Cys Asn Val His Met Ala Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Pro 1 5 10 15 Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser - 36 -