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ORIGINAL ARTICLE Korean J Clin Lab Sci. 2016, 48(1):1-7 htt://dx.doi.org/10.15324/kjcls.2016.48.1.1 ISSN 1738-3544 eissn 2288-1662 Korean J Clin Lab Sci. Vol. 48, No. 1, Mar. 2016 1 Antioxidative Effect of Chelidonium majus Extract on Cultured NIH3T3 Fibroblasts Injured by Cadmium Chloride of Toxicant Tae-Yoon Kim 1 and Seung-Joo Jekal 2 Deartments of 1 Physical Theray, 2 Clinical Laboratory Science, Wonkwang Health Science University, Iksan 54538, Korea 독성물질인염화카드뮴으로손상된배양 NIH3T3 섬유모세포에대한애기똥풀추출물의항산화효과 김태윤 1, 제갈승주 2 원광보건대학교 1 물리치료학과, 2 임상병리학과 The aim of this study was to evaluate the cytotoxicity of cadmium chloride (CdCl 2), toxicant, and the rotective effect of Chelidonium majus (CM) extract on CdCl 2-induced cytotoxicity in cultured NIH3T3 fibroblasts. Cell viability, the effect of butylated hydroxytoluene (BHT) against CdCl 2, and the antioxidative effects including DPPH-free radical scavenging activity, sueroxide anion-radical scavenging activity (SSA), and lactate dehydrogenase (LDH) activity were assessed. CdCl 2 caused a significant dose-deendent decrease in cell viability, and XTT 50 value was determined at 38.7 um of CdCl 2. It was determined as highly-toxic by Borenfreund and Puerner' toxic criteria. BHT of antioxidant significantly increased cell viability severely damaged by CdCl 2-induced cytotoxicity in these cultures. In the rotective effect of CM extract on CdCl 2-induced cytotoxicity, CM extract significantly increased cell viability, DPPH-free radical scavenging activity, SSA and inhibitory activity of LDH. From these results, it is suggested that oxidative stress is involved in the cytotoxicity of CdCl 2, and CM extract showed rotective efficacy on CdCl 2-induced cytotoxicity via antioxidative effects. Conclusively, natural resources like CM extract may be a utative antioxidative agent for the detoxification or diminution of toxicity correlated with oxidative stress. Keywords: Cytotoxicity, Antioxidative effect, Oxidative stress, Natural resources Corresonding author: Seung-Joo Jekal Deartment of Clinical Laboratory Science, Wonkwang Health Science University, 514 Iksan-daero, Iksan 54538, Korea Tel: 82-63-840-1215 Fax: 82-63-840-1219 E-mail: sjjei@wu.ac.kr This is an Oen Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (htt://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which ermits unrestricted non-commercial use, distribution, and reroduction in any medium, rovided the original work is roerly cited. Coyright 2016 The Korean Society for Clinical Laboratory Science. All rights reserved. Received: February 1, 2016 Revised 1 st : February 25, 2016 Revised 2 nd : February 29, 2016 Acceted: March 3, 2016 서론카드뮴은은백색의중금속류일종으로크롬과같이자연계에서는산소나염소, 황과결합하여다양한화합물을형성하고있다 [1]. 카드뮴은돌연변이원이면서도독성이강하기때문에이따이-이따이병 (itai-itai disease) 으로도잘알려져있다. 그이유로는 1968년일본도마야현에있는미쯔이제련공장의폐광석에서흘러나온카 드뮴에노출된주민들에서이의독성으로인해골다공증을비롯한전신통증, 골연화증폐암및신장기능장애와같은후유증을일으켰던대표적인사례가있었는데특히뼈나근육의통증을호소함으로서붙여진이름이다 [2]. 카드뮴의인체내축적은대부분먹이사슬에의하여이루어지며일부는피부접촉을통해피부병변유발은물론, 그밖에도화석원료나쓰레기소각시에분진에의한공기오염에의해서호흡기를통하여흡입되기도한다 [3]. 공기중 0.1 mg/m 3

2 Tae-Yoon Kim and Seung-Joo Jekal. Antioxidative Effect of Chelidonium majus Extract on Cadmium Chloride 의카드뮴농도에장기간노출된경우폐병을비롯한신장병및골다공증과같은질환의위험율이높아진다고한다. 따라서미국의경우 EPA 에서는공장에서물이나토양, 공기중으로방출되는카드뮴양을엄격히제한함으로서국민건강에기여하고있다 [4]. 카드뮴의독성이강함에도불구하고이의중독시아직까지독성기전은물론, 효과적인치료약제의개발이미흡한상태에있다 [5]. 최근, 카드뮴을비롯한몇몇독성이강한크롬이나수은과같은중금속류는이들이붕괴될때자유라디칼 (free radicals) 을생성한다고알려지면서이의독성에산화적손상 (oxidative stress) 이관여하고있다는것이제시된바있다 [6]. 카드뮴의독성에관한한연구에서항산화제의일종인 vitamin E가카드뮴의독성을방어하였다는연구결과가보고됨에따라카드뮴의독성과산화적손상간의관련성이제시되었다 [7]. 따라서, 카드뮴독성에의한치료적접근을항산화측면에서시도할려는연구가이루어지고있다 [1]. 한편, 천연물의성분분석에대한연구에서한약재를비롯한약용식물의성분중에는항산화를비롯한항염, 항암및항균과같은인체에유효한생리활성물질이다량함유되어있다고보고되고있다 [8]. 이들성분중에는 flavonoid와같은페놀화합물 (henolic comound) 을비롯하여 anthocyanin 과같은배당체들과같은다양한물질들이알려져있다 [9]. 식물중애기똥풀 (Chelidonium majus, CM) 은양비귀과 (Paaveraceae) 에속하는초본식물로서우리나라전국각지의햇볕이따스한양지바른곳이나산기슭의나무주변등과같이약간시원하고그늘진곳에서자생하고있다. 흔히 CM은백굴체라고도널리알려져있으며대개여름과가을에꽃을비롯한잎이나줄기를채취하여햇빛이직접들지않은서늘한곳에서말린다음이를약재로사용한다. CM은오래전부터해독이나이뇨는물론위궤양이나창종과같은염증성병변치료에자주사용되어왔으며그밖에도완선이나수종, 황달과같은질환등에도유효한효능이있는것으로알려져있다 [10]. CM에서는 almitic acid를비롯한 stigmasterol 이나 taraxerol 성분들이분리정제되었으며, 그밖에도 berbenine 이나 malic acid, olyhenol, flavonoid 와같은성분들이함유되어있다고밝혀져있다 [11]. 특히, olyhenol 이나 flavonoid와같은페놀성분들은이의분자구조에다른물질과의결합력이강한수산기 (-OH) 를한개이상가지고있어항산화나항독등에뛰어난효능이있다고알려져있다 [12]. 근래세포배양기술이발전함에따라배양세포를이용하여병변의모델제작은물론, 병인의기전규명및치료적접근을위한최적의도구로자리잡고있다 [4]. 특히, 결합조직의구성성분하나인섬유모세포는비만세포나형질세포와함께조직의세포성분을이루고있으며, 특히콜라겐을생성함으로서피부의찰과상이나화상 과같은피부병변이나또는뼈의인대나힘줄손상과같은외상으로인한병변의경우이의회복을위하여중요한역할을담당하고있다 [13]. 본연구는천연소재를이용한병변의치료물질에대한탐색이나발굴을위한목적의일환으로독성물질인염화카드뮴 (CdCl 2) 의독성분석과함께이에대한 CM 추출물의영향을항산화측면에서조사하기위하여배양 NIH3T3 섬유모세포를재료로시험관내분석을시행하였다. 재료및방법 1. 실험재료 NIH3T3 섬유모세포는 American Tye Culture Collection (ATCC) 에서분양받아사용하였다. 2. 약제제조본실험에사용한시약으로는 cadmium chloride (CdCl 2) 를비롯한 butylayed hydroxytoluene (BHT), 1,1-dihenyl-2-icrylhydrazyl (DPPH), ethanol, hoshate buffered saline (PBS), fetal bovine serum (FBS), minimum essential medium (MEM), xanthine, nitroblue tetrazolium (NBT), hydrogen eroxide (H 2O 2) 및 XTT는 Sigma사 (Sigma Chemical Comany, St. Louis, MO, USA) 에서, LDH CytoTox detection kit는 Takara사 (Takara Biochemical Comany, Kangnam, Korea) 에서각각구입하였다. CdCl 2 의제조는 FBS가없는배양액을사용하여최종농도가각각 30 um, 50 um, 100 um 및 150 um의저장액을만들어냉암소에보관한후실험직전필요한양을배양액에직접첨가하여사용하거나또는필요농도로희석하여사용하였다. XTT (2,3-bis-[2-methoxy-4-nitro-5-sulfohenyl]-2Htetrazolium-5-caboxanilide, disodium salt) 는실험전날 PBS를이용하여 50 ug/ml의저장액을제조한후사용하였다. 3. 애기똥풀 (Chelidonium majus, CM) 추출 CM은 7월경전라북도익산시야산부근에서채취하여시에위치하고있는대학부설생명자원과학연구소에서확인동정후사용하였다. 채집한전초는세척한후통풍이잘되고서늘한곳에서말린다음일정길이로잘라냉암소에보관하여시료로사용하였다. 시료추출을위해시료 73.8 g을파쇄한다음시료의 3배정도의증류수와함께 1,000 ml의환저플라스크에넣고 2시간동안가열하였다. 위의과정을 5회반복하여추출한액을여과후 3,000 rm에서 30분동안원침시켰으며, 원침후진공농축기에서농축감압시

Korean J Clin Lab Sci. Vol. 48, No. 1, Mar. 2016 3 켜 4.3 g의시료를얻었다. 이때수율은 5.8% 로나타났다. 4. 세포배양세포배양은 Rim 등 [8] 의방법에의하여배양용기로부터효소해리술에의하여세포를분리하였다. 분리된세포들은일정시간동안원침후 10% FBS가함유된 MEM 배양액에넣어 1 10 5 cells/well 의밀도로조절한후 96 well late에삽주하였다. 삽주된세포들은 36 o C, 5% CO 2 로조절된항온기내에서 72시간동안배양하였다. 5. CdCl 2 처리 CdCl 2 가 25 45 um까지의농도별로각각포함된배양액에서 NIH3T3 섬유모세포를 72시간동안배양한후세포생존율을대조군과비교조사하였다. 6. BHT의항산화능측정항산화제의일종인 BHT의항산화능의조사를위하여활성산소의하나인과산화수소 (H 2O 2) 20 um을배양세포에처리하기 2시간전에 BHT가각각 20 50 um의농도로포함된배양액에서세포를처리한후세포생존율을대조군과비교조사하였다. 7. CdCl 2 에대한 BHT의영향 XTT 50 값의 CdCl 2 를배양세포에처리하기 2시간전에 BHT가각각 30 um과 50 um의농도로포함된배양액에서세포를배양한다음세포생존율을양성대조군인 CdCl 2 의처리군과비교조사하였다. 36 o C로조절된항온기에서 4시간동안배양하였다. 배양완료후 DMSO를넣고일정시간정치한다음 varioskan flash ELISA reader (Thermofisher Scientific Comany, Vantaa, Finland) 로 450 nm에서흡광도를측정하였다. XTT 50 값의산출은회귀직선식에의하여산정하였다. 10. DPPH- 자유라디칼소거능측정 DPPH-자유라디칼소거능 (DPPH-free radical scavenging activity) 의측정은 Blois [16] 의방법에의하여메탄올에녹인시료에 0.3 mm DPPH 메탄올용액 100 ul를넣고실온에서 30분간처리하였다. 처리완료후 varioskan flash ELISA reader (Thermofisher Scientific Comany, Finland) 로 517 nm에서흡광도를측정하였다. 전자공여능은시료첨가군과시료무첨가군간의차이를시료무첨가군에의한백분율로나타냈으며, BHT의활성을비교군으로하여조사하였다. 11. Sueroxide anion-radical 소거능측정 Sueroxide anion-radical 소거능의측정은 nitroblue tetrazolium (NBT) 환원방법에따라, 각시료용액 0.1 ml와 0.1 M otassium hoshate buffer (H 7.5) 0.4 ml에 0.4 mm xanthine과 0.24 mm NBT를가하여 37 o C에서 20분동안반응시켰다. 반응이완료된후 1 N HCl 1 ml를가하여반응을정지시켜반응액중에생성된 sueroxide anion radical 양을 varioskan flash ELISA reader (Thermofisher Scientific Comany, Finland) 로 560 nm에서흡광도를측정하였다. 소거능측정은시료첨가군과무첨가군의흡광도감수율을백분율로나타냈다. 8. 애기똥풀 (CM) 추출물처리 CdCl 2 에대한 CM 추출물의영향을조사하기위하여배양 NIH3T3 섬유모세포에 CdCl 2 XTT 50 값을처리하기 2시간전에 60 ug/ml와 80 ug/ml의추출물농도에서세포를처리한다음세포생존율을양성대조군인 CdCl 2 의처리군과비교조사하였다. CM 추출물분석농도는 Jung 등 [14] 에의한 CM 추출물의항산화능 (DPPH-free radical 소거능, xanthine oxidse 저해능 ) 분석농도인 0.05 mg/ml-2.0 mg/ml의범위를근거로하여이에가장근접농도인 0.06 mg/ml와 0.08 mg/ml를선정하여분석하였다. 9. 세포생존율분석세포생존율의분석은 Borenfreund 와 Puerner [15] 의방법에따랐다. 즉, 배양세포에농도별로약제나추출물을일정시간처리한후실험당일제조한 50 ug/ml XTT를 well당 100 ul씩넣고 12. LDH (lactate dehydrogenase) 활성측정 LDH 활성조사를위하여배양세포에약제나추출물을농도별로처리한다음 250 g에서 15분동안원침시켰다. 원침완료후 50 ul의상등액을취한다음 LDH CyTox detection kit의반응용액 (0.05 U/mL) 50 um를넣은다음실온에서 30분동안반응시켰다. 반응완료후 490 nm에서 varioskan flash ELISA reader (Thermofisher Scientific Comany, Finland) 로흡광도를측정하였으며 LDH 활성은대조군에대한백분율로표시하였다. 13. 통계처리자료분석은 Windows SPSS 프로그램버전 18.0 (SPSS Inc., Chicago, USA) 에의하여행하였으며군간차이값의비교를위하여 ANOVA 를실시하였고사후검정은 Scheffe test에의하였다.

4 Tae-Yoon Kim and Seung-Joo Jekal. Antioxidative Effect of Chelidonium majus Extract on Cadmium Chloride 결과 1. CdCl 2 의독성효과 CdCl 2 의독성조사를위하여배양 NIH3T3 섬유모세포에 25 45 um 농도의 CdCl 2 각각을배양세포에 72시간동안처리한결과, CdCl 2 는농도처리에따라세포생존율을유의하게감소시켰으며 (<), 이때 XTT 50 값은 38.7 um의농도에서나타났다 (Table 1). 2. BHT의항산화능측정 20 um의 H 2O 2 만을처리에서는세포생존율이대조군인 100% (0.163±0.02) 에비하여 39.9% (0.065±0.01) 로나타난반면, 20 um 농도의 BHT의처리에서는 46.0% (0.075±0.01) 로 H 2O 2 만의처리에비하여약간의증가를보였다. 또한, 30 um과 50 um의처리에서는세포생존율이각각 61.3% (0.100±0.01) 와 74.8% (0.122±0.02) 로나타나 H 2O 2 만의처리에비하여모두유의한세포생존율의증가를보였다 (<) (Table 2). 3. CdCl 2 에대한 BHT의영향 CdCl 2 의세포독성과산화적손상간의상호관계를알아보기위하여 XTT 50 값의 CdCl 2 를배양세포에처리하기전에항산화제인 BHT 30 um과 50 um의농도를세포에각각처리하였다. 그결과 CdCl 2 만을처리한경우세포생존율은대조군인 100% (0.175± 0.02) 에비하여 37.1% (0.065±0.01) 로나타난반면, 30 um과 50 um 농도의 BHT의처리에서는각각 59.4% (0.104±0.02) 와 64.0% (0.112±0.02) 로나타나이는 CdCl 2 만의처리에비하여모두유의하게증가하였다 (<) (Table 3). 4. CdCl 2 의독성에대한애기똥풀 (CM) 추출물의영향 CdCl 2 의세포독성에대한 CM 추출물의영향을조사하기위하여 XTT 50 값의 CdCl 2 를배양 NIH3T3 섬유모세포에처리하기전에 60 ug/ml와 80 ug/ml의 CM 추출물을전처리한결과, CdCl 2 만의처리에서는세포생존율이대조군인 100% (0.187±0.01) 에비하여 41.2% (0.077±0.01) 로나타난데비하여 60 ug/ml CM 추출물처리에서는 56.1% (0.105±0.01) 로나타나 CdCl 2 만의처리에비하여유의한증가를나타냈다 (<). 한편, 80 ug/ml 추출물처리에서는세포생존율이 84.5% (0.158±0.02) 로나타남으로서 CdCl 2 만의처리에비하여유의한증가를나타냈다 (<) (Table 4). 5. DPPH- 자유라디칼소거능측정 DPPH-자유라디칼소거능 (DPPH-free radical scavenging activity) 을측정하기위하여 60 ug/ml와 80 ug/ml 농도의 CM 추출물시료를분석한결과 60 ug/ml 추출물시료의처리에서는소거능이 28.5% 로이는대조군에비하여유의한증가를나타냈다 (<). 또한, 80 ug/ml 추출물처리에서는 50% 로나타나이역시대조군에비하여유의한증가를보였다 (<). 특히, 80 Table 1. The cytotoxicity of CdCl 2 on cultured NIH3T3 fibroblasts by XTT assay Concentrations of CdCl 2 (um) Control* 0.196±0.05 100 25 0.128±0.01 65.3 35 0.113±0.05 57.7 45 0.072±0.02 36.7 38.7 (XTT 50) 0.098±0.04 50.0 *> > > Table 3. The effect of BHT on the cytotoxicity induced by CdCl 2 in cultured NIH3T3 fibroblasts Concentrations of BHT (um) Control* 0.175±0.02 100 CdCl 2 (XTT 50) 0.065±0.01 37.1 30 0.104±0.02 59.4 50 0.112±0.02 64.0 *> > Table 2. The antioxidative effect of BHT on hydrogen eroxide (H 2O 2) Concentrations of BHT (um) Control* 0.163±0.02 100 20 um H 2O 2 0.065±0.01 39.9 20 0.075±0.01 46.0 30 0.100±0.01 61.3 50 0.122±0.02 74.8 *> > Table 4. The rotective effect of Chelidonium majus (CM) extract on CdCl 2-induced cytotoxicity in cultured NIH3T3 fibroblasts Control* 0.187±0.01 100 CdCl 2 (XTT 50) 0.077±0.01 41.2 60 0.105±0.01 56.1 80 0.158±0.02 84.5 *> > >

Korean J Clin Lab Sci. Vol. 48, No. 1, Mar. 2016 5 ug/ml의추출물시료에서소거능은비교군으로사용한 50 um BHT 활성값인 68.7% 의 50% 이상인것으로나타났다 (Table 5). 6. Sueroxide anion-radical 소거능측정 CM 추출물시료 60 ug/ml와 80 ug/ml에대한 sueroxide anion-radical 소거능에있어서 60 ug/ml 처리에서는대조군에비하여 30.9% (<) 의소거능을나타냈으며, 80 ug/ml에서는 48.0% (<) 의소거능을나타냈다. 특히, 80 ug/ml의추출물시료처리에서는비교군인 50 um BHT 소거능값인 70.4% (<) 의 65% 이상의높은값을나타냈다 (Table 6). 7. LDH 활성측정 CdCl 2 에대한 CM 추출물의 LDH (lactate dehydrogenase) 활성에대한영향을조사하기위하여 60 ug/ml와 80 ug/ml 농도의추출물을분석한결과 XTT 50 값의 CdCl 2 의 LDH 활성은대조군에비하여 136.2% 로높게나타났다. 이에비하여 60 ug/ml 추출물처리에서는 113.8% 로나타나 CdCl 2 만의처리에비하여유의한활성감소를보였다 (<). 또한, 80 ug/ml 추출물처리에서는 105.7% 로나타나이역시 CdCl 2 만의처리에비하여유의한활성감소를보였다 (<) (Table 7). Table 5. DPPH-free radical scavenging activity of Chelidonium majus (CM) extract determined at a wavelength of 517 nm Table 6. Sueroxide anion-radical scavenging activity of Chelidonium majus (CM) extract determined at a wavelength of 560 nm DPPH-free radical scavenging activity (517 nm) Control* 0.214±0.02 0 50 um BHT 0.067±0.01 68.7 60 0.153±0.01 28.5 80 0.138±0.01 35.5 Sueroxide anion-radical scavenging activity (560 nm) Mean±SD (% of control) > >* 고찰 염화카드뮴 (CdCl 2) 의독성분석에있어서배양 NIH3T3 섬유모세포에 25 45 um 농도의 CdCl 2 를각각 72시간동안처리한결과, 대조군에비하여세포생존율을유의하게감소시킴으로서 (<), 세포독성을나타냈다. 본실험에서처럼 CdCl 2 에의한세포생존율의감소는 CdCl 2 가배양 NIH3T3 섬유모세포에세포독성이있음을말해주고있으며, 이같은독성은 CdCl 2 의 XTT 50 값이 100 um 이하인 38.7 um로나타남으로서 Borenfreund 와 Puerner [15] 에의한독성판정기준에의하여고독성 (highly-toxic) 인것으로나타났다. 이들에의한독성판정기준을보면 XTT 50 값이나 MTT 50 값이 100 um 이하인경우를고독성 (highly-toxic) 으로판정하였고, 100 1,000 um인경우는중간독성 (mid-toxic) 으로, 1,000 2,000 um 인경우는저독성 (low-toxic) 으로, 또한 2,000 um 이상인경우를무독성 (non-toxic) 인것으로각각판정하였다. 본연구결과는 Jung 등 [7] 에의한배양 NIH3T3 섬유모세포에대한카드뮴독성에대한보고나, Son 등 [5] 에의한배양섬유모세포에대한카드뮴의독성보고와도일치하였다. 본연구결과에서와같이배양 NIH3T3 섬유모세포에대한 CdCl 2 의독성효과에대한현상은 CdCl 2 에의한세포내 DNA의가교결합이나 RNA와같은핵산물질의합성저해와같은가능성도배제할수는없겠지만 [17], 그보다는 CdCl 2 의독성이자유라디칼과관련이있어그결과이의산화적손상으로인해세포생존율의감소를초래하였을가능성이클것으로생각된다 [5]. 따라서, 본연구에서는 CdCl 2 와산화적손상간에대하여조사하였다. 한편, 본연구에서활성산소의일종인 H 2O 2 에대한 BHT의항산화능을분석한결과, 30 um과 50 um 농도의 BHT의처리는 20 um H 2O 2 만의처리에비하여모두유의한세포생존율의증가를보여높은항산화능을나타냈다 (<). BHT는 tocoherol이나 ascorbic acid와같이강력한항산화제의일종으로서산화방지와세포노화를막아준다고알려져있다 [18]. 위에서말한바와같이, 본연구에서는 CdCl 2 의독성과산화적손상간의관련성조사를위하여 CdCl 2 에대한항산화제의일종인 Table 7. LDH activity of Chelidonium majus (CM) extract on CdCl 2-induced cytotoxicity determined at a wavelength of 490 nm LDH activity (490 nm) Mean±SD (% of control) Control* 0.152±0.02 0 50 um BHT 0.045±0.01 70.4 60 0.105±0.02 30.9 80 0.079±0.01 48.0 > >* Control* 0.174±0.04 100 CdCl 2 (XTT 50) 0.237±0.06 136.2 60 0.198±0.03 113.8 80 0.184±0.01 105.7 >*

6 Tae-Yoon Kim and Seung-Joo Jekal. Antioxidative Effect of Chelidonium majus Extract on Cadmium Chloride BHT의영향을분석하였다. 그결과 30 um과 50 um 농도의 BHT를전처리한결과 CdCl 2 만의처리에비하여처리농도모두에서유의한세포생존율의증가를보였다 (<). 위의결과에서처럼항산화제인 BHT에의한 CdCl 2 의독성방어는 CdCl 2 의독성이산화적손상과관련되어있음을증명하고있으며, 이는 Son 등 [5] 의연구에서항산화제인 vitamin E가 CdCl 2 독성을감소하였다는보고와도일치하였다. 한편, CdCl 2 의독성에대한 CM 추출물의영향분석을위하여 60 ug/ml와 80 ug/ml의 CM 추출물농도를배양세포에전처리하였다. 그결과, CdCl 2 만의처리에비하여추출물처리농도모두에서유의한세포생존율의증가를나타냈다 (<). 이같은결과는 CM 추출물이 CdCl 2 의세포독성을방어했음을말해주고있으며, 이는또한 Son 등 [10] 에의한 CM 추출물이강독성의유기수은의세포독성을방어하였다는연구결과와도상통하였다. 본결과에서와같이 CdCl 2 에대한 CM 추출물의방어효과는 Koizumi 와 Waalkes [17] 의보고에서와같이카드뮴에대한 CM 추출물의항독작용이나또는세포내 DNA나 RNA와같은핵산물질의합성저해에대한방어효과와같은일부원인도있겠지만, 그보다는 CM 추출물의항산화작용이 CdCl 2 의산화적손상을방어한결과로생각된다. 따라서본연구에서는 CM 추출물에대한항산화능을조사하기위하여 DPPH- 자유라디칼소거능을비롯한 sueroxide anion-radical scavenging activity (SSA) 및 lactate dehydrogenase (LDH) 활성을조사하였다. 그결과 CM 추출물은항산화분석모두에서유효한효과가있는것으로나타났으며, 특히 80 ug/ml CM 추출물시료처리에서는 DPPH-자유라디칼소거능과 SSA에있어서비교군인 BHT 활성의 50 65% 이상의활성을보여 BHT와같은항산화능을나타냈다. 또한, 본연구의분석결과중 CM 추출물은유의한 LDH 활성억제능을보임으로서자유라디칼의막지질과산화에대한방어능을증명하였다. 따라서, 본연구에서행한항산화능에대한분석은 CM 추출물이자유라디칼제거를위한소거능을가지고있음을말해주고있으며이같은효능은추출물성분중에 olyhenol, flavonoid와같은강력한항산화성분들에의한것으로생각된다 [11]. 특히, olyhenol 이나 flavonoid 와같은페놀화합물은항산화능이나항염, 항독과같은유효한약리활성을가지고있음은이미잘알려져있다 [19]. 따라서, CM 추출물과같은천연성분을대상으로항산화에대한생리활성의분석은산화적손상과연관된다양한측면에서지속적으로연구가이루어져야할것으로생각된다. 요약 본연구는배양 NIH3T3 섬유모세포를재료로독성물질인염화카드뮴 (CdCl 2) 의세포독성과이에대한애기똥풀 (Chelidonium majus, CM) 추출물의방어효과를조사하기위하여세포생존율 (cell viability) 을비롯한 CdCl 2 에대한 BHT의영향및 DPPH-자유라디칼소거능, sueroxide anion-radical scavenging activity (SSA), lactate dehydrogenase (LDH) 활성과같은항산화효과를분석하였다. 그결과 CdCl 2 는농도의존적으로배양 NIH3T3 섬유모세포의생존율을유의하게감소하였으며, XTT 50 값이 38.7 um로나타나 Borenfreund와 Puerner의독성판정기준에따라고독성 (highly-toxic) 인것으로나타났다. 또한, 항산화제인 BHT는 CdCl 2 의독성으로인하여심하게손상된세포생존율을유의하게증가시켰다. 한편, CdCl 2 의세포독성에대한 CM 추출물의방어효과에서, CM 추출물은 CdCl 2 에의하여감소된세포생존율을유의하게증가시켰으며, 또한 DPPH-자유라디칼소거능을비롯한 SSA 및 LDH 활성억제와같은항산화능을나타냈다. 이상의결과에서 CdCl 2 의독성에산화적손상이관여하고있으며, CM 추출물은항산화효과에의하여 CdCl 2 의세포독성에대한방어효과를나타냈다. 결론적으로, CM 추출물과같은천연소재는산화적손상과관련된독성의제독내지는저감을위한항산화물질로서의개발적가치가있다고사료된다. Acknowledgements: None Funding: None Conflict of interest: None References 1. Jung JY, Oh SK, Park SH, Yoon MY, Yu YW, Rim YS, et al. Antioxidative effect of Ajuga multiflora BUNGE extract on chrominum trioxide, dermatitis inducer in cultured NIH3T3 fibroblasts. J Invest Cosmetol. 2014;10:21-26. 2. Waalkes MP, Poirier LA. In vitro cadmium-dna interaction: Cooerativity of binding and cometitive antagonism by calcium, magnesium and zinc. Toxicol Al Pharmacol. 1984;75: 539-546. 3. Nomiyama K. Recent rogress and ersective in cadmium health effects studies. Sci Total Environ. 1980;14:199-232. 4. Park ST, Choi MK, Lee KC, Cho KH, Jeon BH, Woo WH. Study on the effect of vitamin E on methylmercury in cultured sinal motor neurons. Kor J Oriental Med Pathol. 2000;14:7-10. 5. Son YW, Rim YS, Yu YW, Jung IJ. Effect of ersimmon leaves extract on the cytotoxicity induced by cadmium of hair dye comonent. J Invest Cosmetol. 2012;8:9-15. 6. Kim MS, Seo YM, Park ST. Antioxidative effect of kaemferol

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