Bilirubin 측정법 (page928) 혈청내빌리루빈은 van den Berg 및 snapper에의해처음으로증명 alcohol이첨가된 Ehrlich's diazo reagent와반응하는 bilirubin을발견. bilirubin이촉진제첨가없이도디아조시약과반응하면직접빌리루빈이라고하고메탄올과카페인같은반응촉진제를사용하는것을간접빌리루빈이라한다. 촉진제를사용하여측정된빌리루빈이총빌리루빈이되고총빌리루빈농도에서촉진제를사용하지않고측정된직접빌리루빈농도를뺀것이간접빌리루빈의농도이다. 1. 검체 bilirubin은빛과열에매우민감하여노출시파괴되며, 직사광선에노출시시간당 30~50% 씩감소할수있다차광상태로분리보관시실온에서약2시간, 4 o C에서 4일안정하다. 용혈된검체는낮게측정된다. 2. 측정법의종류 1) Diazo 법 : 반응촉진제및반응이일어나는 ph 조건의차이에방법이변형 산성아조빌리루빈법 (ph1.2) Malloy-Evelyn method : 반응촉진제로 methanol을이용 검체에 methanol과 diazo reagent(diazotied sulfanilic acid) 를 ph1.2에서반응시켜생성된자색의아조빌리루빈을파장 560nm에서흡광도를측정한다. 많이쓰는검사법이며알코올이용혈이나혼탁에영향받기쉽다. 알카리아조빌리루빈법 (ph13.0) a. Jendrassik-Grof method : 반응촉진제로카페인-안식향산나트륨을이용 검체에 caffein-benzoate와 diazo reagent를 ph6.5에서반응시킨후발색물질을알칼리타타르산염을첨가하여 ph13.0으로알카리화시킨후생성된푸른색발색물질을파장600nm에서흡광도를측정한다. 많이사용하는검사법이며 Malloy-Evelyn 법보다낮은빌리루빈농도를민감하고정밀하게검사할수있다. b. Michaelsson method : 반응촉진제로 dyphylline과 sod. acetate를이용 검체에 dyphylline과 sod. acetate를 ph6.5에서반응시킨후알칼리성 Fehling액을첨가하여 ph13.0으로알카리화시킨후생성된푸른색발색물질을파장600nm에서흡광도를측정한다. - 1 -
2) 분광광도법 : bilirubinometer method - bilirubin 자체의색을직접분광광도계로측정하며신생아빌리루빈측정에주로이용 - 혈청내의 Total bilirubin은자체적으로 455nm파장의노란색을띠므로직접분광광도계에의해측정되나 oxyhemoglobin의 (HbO 2) 간섭을받는다. oxyhemoglobin은 575nm에서만측정되므로 455nm값에서측정한 bilirubin값에서 575nm에서측정한 oxyhemoglobin값을빼면정확한 Total bilirubin을얻게된다. bichromatic photometer를사용해야정확하게측정할수있다. - bichromatic photometer일지라도 carotenoid도역시 455nm 발색을보이게되므로생후 3 개월까지는측정시영향을받지않으나그이후에는영향으로사용할수없다. - 이방법은시약이필요없고소량의피부천자혈액으로검사가가능하므로신생아들의황달검사시에유용하다. 3) 효소법 : Bilirubin oxidase method - Bilirubin oxidase는빌리루빈을산화해서 biliverdin과물로변환하는반응을촉매하는효소이며효소반응은파장 405nm 및 460nm에서녹색의 biliverdin이산화하여무색으로되어흡광도가감소하는것을측정한다. - 최근에개발되었으며 Hb의방해를받지않으므로표준방법으로이용될수있으나활용되지않는다. 4) Dry film technology - 투명한 polyester film 에시약을부착시켜측정한다. - 건식화학검사는쉬우나시약값이비싸다. 예 ) Kodak Ektachem 5) 반사분광법 : 신생아의피부에서직접측정 6) HPLC method( 고성능액체크로마토그래피법 ): High Performance Liquid Chromatography - photoirradiation 후생성되는빌리루빈이성질체정량시유용하며연구목적으로이용 7) 소변내빌리루빈 - 소변과직접반응하는 2,4-dichloroaniline diazonium salt 를부착시킨 dipstick 을이용한다. - 2 -
2. Malloy-Evelyn 법검사 (Total bilirubin 측정 ) A. 시약 1) sulfanilic acid (26.2 mmol/l in 0.702 mol/l HCl) 60 ml conc HCl에 5.0g의 sulfanilic acid를넣어증류수로희석하여 1L로만든다. 실온에서 6개월까지안정 2) sodium nitrite stock solution(2.9 mol/l) 20g의 sodium nitrite(nano 2) 를증류수에녹여 100 ml로만든다. 갈색병에넣어 4 o C에보관. 수주후노란색의 nitrite에의해변색되면사용할수없다. 3) working sodium nitrite solution(290 mmol/l) stock sodium nitrite solution을증류수로 10배희석하여만든다. 불안정하므로사용당일에만들어검사한다. 4) diazo blank 60mL의 conc HCl을증류수로희석하여 1L로만든다. 실온보관시 1년간유효하다. 5) diazo reagent 10mL의 sulfanilic acid 시약에 0.3 ml의 working sodium nitrite solution을넣고잘섞는다. 이시약은불안정하고제조후수시간내에사용해야한다. 6) methanol(absolute) 99.5% 이상의순도시약사용 7) serum-based standard( 표준액 ) bilirubin 농도가 3~5 mg/dl 정도가적당하다. 8) serum-based controls( 정도관리물질 ) 2가지 level(low, medium, high) 의농도이상이필요. B. 술식 1) 희석검체 : 1.9mL 증류수 + 0.1mL(100uL) 혈청 => 20배로희석 2) standard, serum-based controls => 1:20 배로희석 검체 (test), Control 표준액 (std.) Test( 검체 ) Blank( 맹검 ) STD.( 표준 ) Blank( 맹검 ) Methanol 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL Diazo reag. 100uL - 100uL - Diazo blank - 100uL - 100uL 희석혈청,std,cont 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 잘섞은후실온에 10분방치후 560nm에서증류수를대조로흡광도측정 Test 및 Blank 시험관들의흡광도를측정하여맹검으로교정한검체, 표준액, control 의교정한흡광도를얻는다. - 3 -
3. Malloy-Evelyn 법검사 (Direct bilirubin 측정 ) A. 시약 : total bilirubin 측정시약과동일 B. 술식 1) 희석검체 : 1.9mL 증류수 + 0.1mL(100uL) 혈청 => 20 배로희석 2) calibrating standard, serum-based controls => 1:20 배로희석 검체 (test), Control 표준액 (std.) D( 검체 ) B( 맹검 ) D( 표준 ) B( 맹검 ) 증류수 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL Diazo reag. 100uL - 100uL - Diazo blank - 100uL - 100uL 희석혈청,std,cont 0.4mL 0.4mL 0.4mL 0.4mL 넣는순간시간을측정하고검체간의가격은 30초로맞추어넣고잘섞는다. 정확히 1분후에 D 및 B 시험관들의흡광도를측정하여맹검으로교정한검체, 표준액, control 의교정한흡광도를얻는다. C. 계산 (t OD- t blk OD) Test conc. = x std conc. (std OD - std blk OD) D. 주의점 1) 반드시술식대로검사하여야혼탁이생기지않고정확하게검사할수있다. 2) 용혈된검체는 bilirubin 치가낮게측정되므로검사하지않는다. 3) 빛에민감하므로채혈후 2시간이내에검사실시한다. 4. Urine Urobilinogen 측정요를통해서하루에 4mg정도의 urobilinogen이배설되는데, 담관폐쇄같은때는감소하고, 용혈성빈혈때는증가한다. 간실질에손상이생기는간염의경우엔간세포가 sinusoid의혈액중에서 urobilinogen을잡아들여이것은 bile 속에배설하는기능이저하되므로문맥에서흡수된 urobilinogen은그대로대순환으로많이빠져나간다. 따라서요에서배설되는양이많아진다. 측정법 : Wallace-Diamond test (Ehlich-Aldehyde 반응 ) : Urobilinogen 과 para-dimethylaminobenzaldehyde(p-dmaba) 가반응하여진분홍 (pink) 의 정색반응 - 4 -
Urobilinogen 은공기중에노출되면쉽게산화되어 urobilin 이됨으로요가신선할때 (4 시간내 ) 검사를끝낸다. 1 원리 : urobilinogen + p-diethylaminobenzaldehyde(p-dmaba) 복합체 (pink) 2 결과는 Ehlich Unit(EU) 로표기하고 1 EU는 1mg의 urobilinogen으로정색되는양에해당된다. 정상치는 0.1~1.0EU 또는 0.5~4.0EU/day urobilinogen은정상적으로 0.2~1.0mg/dL(±, trace) 정도소변으로설된다. 만일검출되지않으면장관폐쇄로인한폐쇄성황달을의심해야한다. 5. Urine Bilirubin 측정 (coupling 반응 ) 1 원리 : 빌리루빈이의 Diazonium 복합체와강산성조건하에결합하여 azo 색소를형성 빌리루빈 + Diazonium ----------- azo 색소 (pink to violet, 강산성 ) 2 결과 : 정상 : Negative False positive : Stool contamination( 대변오염 ) False negative : 25mg% 이상의비타민씨, 0.1mg% 이상의아질산염 Type of Jaundice Urine Bilirubin Urine Urobilinogen Normal( 정상 ) negative trace 1.0Eu/dL Hepatocellular jaundice( 간세포성황달 ) 증가증가 Obstructive jaundice( 폐쇄성황달 ) 증가 negative Hemolytic jaundice( 용혈성황달 ) negative 증가 - 5 -
6. Diazo method 비교 측정법 Malloy-Evelyn 법 Jendrassik-Grof 법 Michaelsson 법 원 리 총빌리루빈 Methanol +Diazo시약 + Bilirubin Azobilirubin (30-60분) (acid, reddish-purple) Bilirubin + Diazo시약 + Fehlingll + caffein-benzoate + Ascorbic acid Azobilirubin (alkali, blue) Bilirubin + Diazo시약 (10분) + dyphyllin(6분 ) + Ascorbic acid + Fehling II( 즉시첨가 ) Azobilirubin (blue) 직접 물 + Diazo 시약 + Bilirubin Bilirubin + Diazo 시약 + FehlingII Bilirubin + Diazo 시약 (10 분 ) + 빌리 Azobilirubin (5-10 분 ) + Ascorbic acid Ascorbic acid +Fehling 루빈 (reddish-purple) Azobilirubin(blue) Azobilirubin (blue) (1) Diazo 시약 (1) Diazo 시약 (1) Diazo 시약 A 시약 : Sulfanilic acid + HCl (2) Fehling ll A 시약 : B 시약 = 10 : 0.25mL ( 실온 6 개월안정 ) NaOH + Sodium tartrate ( 제조후 30 분이내사용 ) B 시약 :Sodium nitrite(nano 2) 정색시약 (2) Fehling ll ( 갈색병 4 o C 에 1 개월안정 ) (3) Caffein-benzoate NaOH + Sodium tartrate A 시약 : B 시약 = 10 : 0.3mL Sodium benzoate+sod.acetate 정색시약 ( 제조후즉시사용, ( 방부제, ph 조절제 ) (3) Dyphylline + sodium acetate 시약 수시간안정 ) 반응촉진제 혼탁방지제 (2) Diazo blank 지방분해시약 지방분해시약 HCl + DW (1 년실온보관 ) (4) Ascorbic acid 4% (4) Ascorbic acid 4% (3) Methanol (absolute) diazo 반응정지제 Diazo 반응정지제 지방분해시약 hemolysis 에의한 T.Bil. 치의 hemolysis 에의한 T. Bili. 치의 Total Bil. 측정시발색시약 저하를감소시키는효과 저하를감소시키는효과 Indirect bilirubin 과 albumin 을 해리 반응명 van den Bergh 반응 = Diazo 반응 반응색 Reddish-purple (ph 1.2) Blue (ph 13.0) Blue(pH 13.0) 파장 540~560nm 600nm 600nm Hb 에의한간섭효과가크다 낮은 bilirubin 측정 (1) Jendrassik-Grof 법은자동분석기에많이사용한다. (2) lcterus Index( 황달지수 ) : 중크롬산칼륨농도 0.01% 가황달지수 1 Unit 에해당 - 혈청중의황달정도 ( 황색도 ) 를나타내는방법 : Bilirubin 농도계측 비고 - 혈청을 Meulengracht 관에채취하여기준액과같은색조로될때까지생리적식염수로 희석한희석배수가황달지수임.( 모일렌그라흐트법 ) - 표준액 : 0.01% Potassium dichromate ( 중크롬산칼륨 : K 2Cr 2O 7) - 정상치 : 3-8 Unit - 6 -