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CANCER PREVENTION RESEARCH ORIGINAL ARTICLE 자궁경부암세포의 Epidermal Growth Factor Receptor Kinase 에대한해조류 - 공생미생물유래물질의활성억제효과 부경대학교자연과학대학 1 미생물학과, 2 화학과 조미정 1 ㆍ손병화 2 ㆍ김군도 1 Inhibitory Activity of Compounds Originated from Marine Algae-Symbiotic Microorganisms on Epidermal Growth Factor Receptor Kinase in HeLa Human Cervix Carcinoma Cells Mi Jeong Jo 1, Byeng Wha Son 2 and Gun-Do Kim 1 Departments of 1 Microbiology, 2 Chemistry, College of Natural Sciences, Pukyong National University, Busan 608-737, Korea Binding of ligand such as epidermal growth factor on epidermal growth factor receptor (EGFR), a member of the receptor tyrosine kinases (RTK) protein, leads to the receptor heterodimerization, phosphorylation and activation the loops in downstream. Development of the specific or broad spectrum of inhibitor for phosphorylation of EGFR is worth for cancer therapy because the EGFR plays a role as regulator in cellular processes such as proliferation, differentiation and cell survival. In this study, the effects of several compounds originated from marine algae-symbiotic microorganisms on the activity of EGFR kinase in HeLa human cervical cancer cells were investigated. The results shown the purified compounds inhibited the expression and phosphorylation of EGFR and/or EGF-related downstream molecule such as extracellular signal-regulated kinase (ERK) 1/2 in HeLa cells. It has finally decreased the growth of human cervix carcinoma cells. The results suggested that the compounds may have a therapeutic potential as inhibitors for EGFR to treat EGFR mediated diseases. (Cancer Prev Res 16, 102-109, 2011) Key Words: Receptor tyrosine kinase (RTK), Marine algae, Symbiotic microorganism, ERK1/2, HeLa 서 Epidermal growth factor receptor (EGFR) 는세포의표면에존재하는수용체 (trans-membrane growth factor receptor) 중의하나로, epidermal growth factor (EGF) 와강하게결합함으로써활성화되는 170 kda의단백질이다. 1,2) 또한, EG- FR은 type 1 receptor kinase 혹은 ErbB (HER) receptor family 책임저자 : 김군도, 608-737, 부산시남구대연 3 동 599-1 번지부경대학교자연과학대학미생물학과 Tel: 051-629-5618, Fax: 051-629-5619 E-mail: gundokim@pknu.ac.kr 접수일 :2011 년 4 월 1 일, 1 차수정일 :2011 년 4 월 5 일, 2 차수정일 :2011 년 4 월 11 일, 게재승인일 :2011 년 4 월 13 일 론 중하나로, cytoplasmic domain에 tyrosine kinase를가지고있어 ligand가결합하여이를활성화시키면 kinase의인산화로인해 signaling cascade가유도된다. 3,4) EGFR은폐, 위, 두경부암등많은종류의암에서과다발현되며, 지나치게활성화된 EGFR signaling은다양한악성종양을유도한다. 5) 이는 EGFR이다양한 signaling pathway 를통해세포의성장, 세포주기및분화를조절한다는것을의미한다. 6) EGF 가암세포의표면에있는 Correspondence to:gun-do Kim Department of Microbiology, College of Natural Sciences, Pukyung National University, 599-1, Daeyeon 3-dong, Nam-gu, Busan 608-737, Korea Tel: +82-51-629-5618, Fax: +82-51-629-5619 E-mail: gundokim@pknu.ac.kr 102

조미정외 2 인 : 해조류 - 공생미생물유래물질의 EGFR Kinase 활성억제 103 EGFR에결합하면 EGFR family의 hetero-dimerization 또는 homo-dimerization이일어나게되며, EGFR에존재하는 PTK domain의 autophosphoylation을유발하여그하위에존재하는세포내 phospholipase-cγ, PI3K/AKT, MAPK, ERK1/2를활성화시키고, 궁극적으로 DNA의합성과세포의증식을유도한다. 7) 따라서 EGFR의작용과 EGFR과관련된하위분자들과의상호작용을이해한다는것은항암치료에있어중요한작용점의한부분이될수있다. 지난몇십년동안 EGFR을작용점으로하는항암치료가연구되었으며, 특히단일클론의항체나 tyrosine kinase inhibitor는수용체의활성을억제하는약물로개발되었다. EGFR을억제하는단일클론항체로개발된 Cetuximab은전이성대장암이나두경부암을치료하는데있어화학요법과함께사용되고있으며, tyrosine kinase inhibitor인 Gefitinib (Iressa R ) 과 Erlotinib은 EGFR의 signaling cascade를억제하며, 비소세포폐암, 췌장암의치료제로사용되고있다. 본연구는지구의 70% 를구성하는바다에존재하는다양한해양생물들로부터 EGFR의 kinase 활성을억제하는신규항암활성물질의발굴에초점을두고있으며, 해양천연물의잠재력은이미많은연구자들에의해언급되어그연구가진행되고있다. 해양생물은종다양성의수준이방대하고높은염의농도, 고압의환경에서백만년이상을견디며살고있으며이러한생명체로부터의신규작용물질의발굴및분리는새로운치료제로서의효용가치가높을것으로인식되고있다. 해양생물과해양생물의이차대사산물이가지는약리학적잠재력또한그범위가매우광범위하다. 어떤생리활성대사산물의경우동물혹은식물에서직접생산되는것이아닌공생미생물에의해생산되기도하는데, 이에따라연구자들은생리활성천연물자원으로써미생물을이용하여많은연구를진행하였다. 해양미생물의산업적응용사례로는호염성해양미생물로부터의항생제, 색소, 바이오폴리머생산, 내한성미생물의경우세제용효소의개발, 빙핵활성단백질생산, 내한성유전자를이용한인터페론안정화등다양한방면에서이용되고있다. 8) 특히해양환경에서유래한균류의경우일반미생물과다르게특이한구조를나타내며, 큰잠재력을가지고다양한이차대사산물을생성함에따라그가치가더욱높아졌으며 9,10) 지금까지보고된생리활성천연물의약 25% 가균류로부터분리된이차대사산물로알려져있다. 11) 해양미생물로부터생리활성물질을생산하는해양미생물균주를개발하기위해해양미생물을이용한 anti-oxidant, tyrosine kinase 억제및 anti-bacterial 활성등을조사하여다양한생리활성해양미생물균주들이개발되었다. 12 14) 따라서본연구에서는해양거대조류의공생미생물에서분리한단일화합물을이용, in vitro상에서의 EGFR kinase 활성억제효과분석및우리나라여성암중 22.3% 를차지하는자궁경부암세포로서세포의표면에 EGFR 을많이발현하는 HeLa 세포를대상으로 EGFR kinase와그하위분자 ERK1/2의 kinase 활성억제효과를확인함으로써암세포의성장억제효과를가지는새로운물질을발굴하고자하였다. 재료및방법 1. 해조류채집및공생미생물분리 해양의거대조류 ( 홍조류, 갈조류, 녹조류 ) 는통영시욕지도와여수시거문도연안에서채집, 멸균한봉지에담아실험실로운반한후 20 o C에서보관하면서공생미생물을분리하였다. Petri dish에여지를깔고채집한해조류를얹어멸균해수를가하여세척한후 27 29 o C에서 2 4주동안배양, 현미경하에서자낭과로부터자낭포자를멸균침을이용하여채취하고계대배양하여공생미생물균주를분리하였다. 숙주재료를무균하에서 YPG agar 12 14) 평판배지상에서배양한후, 현미경하에서순수균사 (hyphae) 를채취하거나, 배지상의균사를계대배양하여표면의공생균주를분리하였다. 무균상태에서숙주재료의표면을 3차증류수와 70% 에탄올로세척한후, 해부용메스 (scalpel) 로균사조직의내부를노출시킨다음내부조직을채취하여 YPG agar 평판배지상에서배양한후, 현미경하에서순수균사 (hyphae) 를채취하거나, 배지상의균사를계대배양하여내면공생균주를분리하였다. 분리한공생균주는 18s rrna를이용하여균을동정하였다 (SolGent, Daejeon, Korea) (Similarity 99%). 2. 미생물배양및유효물질의분리 분리한균주를각각 10 ml의 YPM 배지 (0.2% yeast extract, 0.2% peptone, 0.4% mannitol, 100% seawater) 에서 27 29 o C로 2주동안배양한후, 배양액과같은양의 EtOAc-MeOH (1 : 1) 을가하여추출한다음, 여과하여얻은추출액의유기용매를유거하고남은수용액을 HP-20 column에주입하고, 증류수로세척하여탈염처리한후, MeOH 및 EtOAc 순으로순차적으로용출, 이분획들을대상으로 EGFR 활성도를조사, 분획을다시선별하여 silica gel column chromatography [CH 2 Cl 2 -MeOH (20 : 1)] 에이어, HPLC [YMC ODS-A, 10 250 mm) (MeOH)] 로분리

104 Cancer Prevention Research Vol. 16, No. 2, 2011 정제, HREIMS 및 13 C NMR data로부터분자조성을확인하며 3종류의단일물질을분리하였다. 3. In vitro kinase assay 1) 시약및기기 : Tris-HCl, MgCl 2, MnCl 2, DTT, Tween-20, HEPES, NaCl, EDTA, BSA, substrate (Poly Glu : Tyr, 4 : 1), ATP 등은 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, MO, USA) 의제품들을사용하였고, Streptavidin Donor, P-Tyr- 100 Acceptor bead, Fusion alpha-microplate analyzer는 Perkin Elmer사 (Shelton, CT, USA) 의제품을사용하였다. 2) Epidermal growth factor receptor (EGFR) kinase assay: 해조류공생미생물유래각화합물들의 EGFR kinase 활성억제효과는 Perkin Elmer사의 Alpha Screen R system을응용하여측정하였다. Assay는 384 well plate (Greiner Bio-One, Monroe, NC, USA) 를사용하여전체 reaction vol. 25μl에서이루어졌고, 분리정제된 EGFR 효소는 Sigma-Aldrich사로부터구입하였다. 추출물 1μl, ATP ( 최종농도 100 mm) 가함유된 kinase buffer 4μl, EGFR 효소 5μl를넣고, 15분동안상온에서반응시킨후기질 (Poly Glu : Tyr, 4 : 1) 5μl를넣고 1시간동안상온에서반응시켰다. 여기에 donor와 acceptor bead 혼합물 (1 : 1 ratio) 을 10μl 넣은다음, 빛을차단한상태로상온에서 1 시간동안추가반응시킨후, 효소의활성억제효과를측정하였다. 해조류공생미생물에서분리한화합물은먼저최종농도 50μg/ml에서활성억제효과를 1차검색하여활성시료를선정한다음, 최종농도 10μg/ml에서 2차검색을진행하여억제효과를나타내는시료를대상으로 IC 50 값을조사하였다. Kinase assay buffer는 50 mm Tris-HCl (ph 7.5), 5 mm MgCl 2, 5 mm MnCl 2, 2 mm DTT, 0.01% Tween-20의조건으로조제하였고, Capture buffer (2.5 concentrated) 는 62.5 mm HEPES (ph 7.4), 250 mm NaCl, 100 mm EDTA, 0.25% BSA의조건으로조제하였다. 기질 (Poly Glu : Tyr, 4 : 1) 은 ATP가함유된 kinase assay buffer로희석하였고, Streptavidin donor와 P-Tyr-100 acceptor bead는최종농도가각각 20μg/ml이되도록 capture buffer로희석해서조제하였다. 4. 세포배양 실험에사용한자궁경부암 HeLa 세포는 American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA) 에서구입하였으며세포의배양을위해 DMEM (HyClone Laboratories, Logan, UT, USA), 10% heat-inactivated fetal bovine serum (HyClone Laboratories) 및 100 U/ml Penicillin and 100 μg/ ml Streptomycin (PAA Laboratories GmbH, PA, Austria) 이포 함된배지를이용, 37 o C, 5% CO 2 incubator에서배양하였다. 5. 세포의성장및 Cell viability 확인 세포의성장과 Cell viability를확인하기위해 HeLa 세포를배지 100μl에 1 10 4 세포로 96-well cell culture plate (SPL Lifesciences, Gyeonggi, Korea) 의각 well에분주하였다. 그리고화합물을다양한농도로처리한후, 24시간동안배양하였다. 24시간의배양후 EZ-Cytox Cell viability assay solution WST-1 R (Daeil Lab Service, Jong-No, Korea) 을각 well에넣고 37 o C, 5% CO 2 incubator에서 3시간동안반응시킨다음 ELISA reader (Molecular Devices, Silicon Valley, CA, USA) 를이용하여 460 nm의파장에서흡광도를측정하였다. 세포의성장상태는현미경을사용하여확인하였다. 6. Western blot analysis HeLa 세포에각화합물을 40분동안선처리하고 epidermal growth factor (EGF) 를 10분동안처리한후, cold PBS를이용하여세포를세척하고회수하였다. 회수한세포에 cold lysis buffer [50 mm Tris-HCl (ph 7.5), 150 mm NaCl, 1 mm DTT, 0.5% NP-40, 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS and proteinase inhibitors (PMSF, EDTA, aprotinin, leupeptin, prostatin A)] (Intron biotechnology, Gyeonggi, Korea) 를첨가하여 30분간 ice에서반응시킨후 14,000 rpm으로 20분간원심분리하여그상층액을취하였다. 상층액의단백질농도는 Protein quantification kit (CBB solution R ) (Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA) 를이용해서측정하였으며 BSA를이용하여 standard curve를설정하였다. 각각의단백질 sample은 Laemmli buffer와섞어 4분간끓였으며, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 로분리하였다. 분리된단백질을함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (PALL Life Science, MI, USA) 으로 electro-transfer 시킨후 5% skim milk를포함하는 PBST buffer (135 mm NaCl, 2.7 mm KCl, 4.3 mm NaPO 4, 1.4 mm KH 2 PO 4, 0.5% Tween-20) 에담가상온에서 2시간반응시켜비특이적인단백질들에대한 blocking을실시하였다. 그다음 PBST buffer로 15분정도세척한후, 1차항체 (EGF receptor, phospho-egf receptor (Tyr1068), phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2) (Thr202/Tyr204)) (Cell Signaling Technology Inc., Beverly, MA, USA) 를처리하여 4 o C에서 overnight 반응시킨다. 그후 PBST buffer로세척하고처리된 1차항체에적절한 2차항체 (Horseradish peroxidase-coupled anti-rabbit or mouse IgG) (Cell Signaling

조미정외 2 인 : 해조류 - 공생미생물유래물질의 EGFR Kinase 활성억제 105 Table 1. Inhibitory activity of the compounds isolated from marine algae-symbiotic microorganisms by in vitro EGFR kinase assay Sample No. Chemical formula % Inhibition (50μg/ml) % Inhibition (10μg/ml) Host marine algae Microorganism 018 C 9H 10O 5 87.78 91.42 Hypnea saidana Phoma herbarum 019 C 8H 8O 4 96.89 94.03 Hypnea saidana Phoma herbarum 030 C 7H 8O 4 88.03 86.43 Ishige okamurai Aspergillus sp. Fig. 1. IC 50 values of in vitro EGFR kinase activity against the compounds. Technology Inc.) 를상온에서 1시간반응시킨다. 그리고다시 PBST buffer로세척, enhanced chemiluminescent (ECL) detection solutions (Pierce, Rockford, IL, USA) 을처리한다음 X-ray film에감광시켜특정단백질의발현양상을비교분석하였다. 결과및고찰본연구는자궁암세포주인 HeLa 세포를대상으로해조류공생미생물에서분리한 3종류의서로다른단일물질들이 HeLa 세포의세포막에존재하는 EGFR kinase의인산화를저해하는활성을가지고있는지? 만약활성을가지고있는물질이있다면이를분리하여물질의구조 를분석하고자하였다. 또한이물질이 EGFR kinase의인산화를저해하는활성을가지고있다면 EGFR 신호체계에관여하는하위분자들의인산화혹은활성도에도영향을미치는지? 이러한 EGFR kinase와하위분자들의인산화저해효과가궁극적으로는자궁암세포인 HeLa 세포의성장에영향을주는지를분석하고자하였다. Epidermal growth factor (EGF) 는 EGFR에결합, 수용체에존재하는 kinase의인산화를유도하여궁극적으로는세포의생장, 증식및분화를조절하는중요한 polypeptide 이다. 15) EGFR은상피세포및상피세포암의생장을결정하는중요한수용체로, 이러한 EGF 수용체의과다한인산화는다양한암을유발하게된다. 16) EGFR은특히몇몇암세포에서과다발현되기때문에암치료에있어 target

106 Cancer Prevention Research Vol. 16, No. 2, 2011 Fig. 2. Morphological changes and growth inhibition induced by three compounds. Compare to the control cells treated with only EGF, the HeLa cells were treated with each compound (10μg/ml, 24 h) and EGF (100 ng/ml, 10 min). 이되어이용된다. Epidermal growth factor receptor (HER1) tyrosine kinase는수용체의활성억제를통한항암치료및항암제의 target으로알려졌다. 17) 현재가장널리알려진 receptor tyrosine kinase inhibitor로서는수용체의활성을억제하는 Iressa, 18) Cetuximab과같은단일항체 17) 등이밝혀졌다. Iressa는악성종양에서돌연변이단백질에선택적으로작용하는 EGFR inhibitor이며 Cetuximab은암세포표면의단백질에특이적으로결합하여 lysosome에의한분해를유도한다. 17,19) 본연구에서사용한해조류공생미생물의추출물중 018와 019는홍조류인 Hypnea saidana ( 사이다가시우무 ) 를숙주로이용하는 Phoma herbarum에서추출한것이며, 030 의경우는갈조류인 Ishige okamurai ( 패 ) 를숙주로갖는 Aspergillus sp. 에서추출한것이다. 이들물질의숙주해조류, 분자식을 EGFR kinase 활성억제도와함께 Table 1에나타내었다. HeLa 세포에대한 3종류의서로다른단일추출물이가지는 EGF receptor kinase 활성의억제효과를확인하기위하여 in vitro assay인 Alpha Screen R system을이용하였다. 이 assay는 human EGF receptor의 cytoplasmic 부분에서유래된 kinase domain의활성을측정하는것으로이 kinase domain은기질특이성을가지고있다. 각각의추출물농도를 50μg/ml로처리하여활성도비교실 험을실시한결과, 추출물 3종류모두 85% 이상의억제효과를나타내었으며, 그중 019 물질이 95% 이상의가장높은 EGFR의인산화활성억제효과를나타냈다. 이결과를바탕으로동일한방법으로각각의추출물을 10 μg/ml의농도로낮추어활성도를비교한결과, 3종류의물질들이모두 85% 이상의 EGFR 인산화활성을억제하는효과를나타내었다 (Table 1). 10μg/ml의농도에서이 kinase domain의활성을저해하는것을확인한후이들각각물질들의 IC 50 값을구하고자 3종류의물질들을다양한농도로처리하여 in vitro assay를실시하였다. 그결과각물질의 EGFR 인산화활성억제에대한 IC 50 값은 2.6 ppm, 0.6 ppm 그리고 2.8 ppm의값으로나타났으며, 019 물질이가장낮은 IC 50 의값을나타내었다 (Fig. 1). 이들물질들이 in vitro상에서 EGF receptor의 kinase 활성을억제하였기에, 이물질들을세포에처리하면 EGF receptor를매개로하는신호전달체계에영향을줄수있을것이라생각되어 3종류의물질들을세포에각각처리하였다. 물질을처리한세포를확인한결과, EGF의신호를유도하기위하여 EGF만처리한세포에비해추출물을함께처리한세포의수가훨씬더감소하였음을확인할수있었으며, 이는추출물이 EGFR의 kinase의활성도를억제함으로서이와연관된하위분자들의신호체계에

조미정외 2 인 : 해조류 - 공생미생물유래물질의 EGFR Kinase 활성억제 107 영향을주어 HeLa 세포의성장을억제하였다고생각할수있다 (Fig. 2). EGFR은 ligand binding domain과 kinase domain으로구성되어있다. 20) EGF와같은 ligand가 ligand binding domain에부착하면수용체는활성화되고, kinase domain에존재하는각각의아미노산잔기에인산화와같은생화학적변화가일어난다. 21) 특히 tyrosine 1,068 잔기의인산화는 EGF에의해강하게반응하여 mitogenic (Ras/Raf/MEK/ ERK) signaling pathway를유도한다. 22) 이러한연구결과를바탕으로 HeLa 세포에 EGF만을처리한후단백질을추출하여 western blot을통해 EGF의 EGFR kinase의활성유무를조사하였다. Western blot 결과에서보는바와같이활성화된 EGFR (phospho-egfr) 의단백질발현량이 EGF 를처리된세포에서더증가하는것을확인할수있었고, 비인산화된 EGFR은세포표면에있는 EGFR의전체양을나타낸다 (Fig. 3). 따라서세포에동일한양의수용체가존재할지라도, EGFR의인산화는 EGF의처리유무에의존적으로나타난다고할수있다. Tyrphostin AG 1,478은여러가지 tyrosine kinase inhibitor 중특히 EGFR (ErbB1) 에잘작용한다고알려진억제제로서주로 EGFR antagonist로사용되어왔었으며, in vivo상에서 EGFR의활성을억제시킬수있는물질로서 in vitro 와 in vivo상에서암세포의증식을억제하는기능을가진다는것이밝혀져있다. 23 25) 이러한연구결과를바탕으로 HeLa 세포에해조류공생미생물에서분리한 3종류의추출물과 AG 1478을각각처리하여 EGFR과 EGFR의 downstream에있는 ERK1/2의인산화발현량을 western blot을통해비교확인하였다. ERK1/2는 Thr202/Tyr204 잔기의인산화를통해활성화되는단백질로 growth factor에의해활성화되어세포의증식및분화를조절하는단백질이다. 26) Western blot 결과에서는각각의추출물과 AG 1,478이 EGFR의인산화를억제하고, EGFR의 downstream에존재하는단백질 ERK1/2의인산화를억제하는것을확인할수있었다 (Fig. 4). AG 1,478과마찬가지로 018, 019, 030은 EGFR의인산화에는강한억제효과를나타내었으나, ERK1/2의인산화에는상대적으로영향을주지않았다. 반면, 018의경우 ERK1/2의인산화를가장강하게억제하는보아, 018은 EGFR의인산화에도강한억제효과를나타내며무엇인가다른경로를통해서 ERK1/2의인산화를억제한다고생각할수있다. 이들 3종류의해조류공생미생물유래의단일추출물은 AG 1,478과같이 EGFR kinase 및 EGFR의 downstream 에존재하는단백질의인산화활성을억제하는효과를가진다고할수있으며 FACS analysis 및 EGFR 이하의 downstream signaling pathway를보다더탐색해봄으로써 Tyrphostin AG 1,478을대체할수새로운억제제로서의활용가능성및 Iressa R 를대체할수있는새로운해양생물유래의항암활성물질로서의개발가능성을결정할수있으리라사료된다. 결 론 Fig. 3. Activation of EGFR kinase induced by EGF. In order to examine the effect of EGF on the activation of EGFR kinase, the HeLa cells were treated with various concentrations of EGF (0, 10, 50, and 100 ng/ml) for 10 min. The expressed levels of phospho-egfr were detected by Western blot analysis. EGFR kinase의활성억제효과를바탕으로, 본연구에서는해조류공생미생물 2종을선별, 이들미생물로부터 3종류의단일물질을분리, 이물질들을이용하여자궁경부암세포주인 HeLa 세포에서의 EGFR kinase 활성및 Fig. 4. The inhibitory effects of the compounds and Tyrphostin AG 1478 on EGFR kinase signaling cascades. The HeLa cells were pre-incubated with 10μg/ml of each compound and Tyrphostin AG 1,478 (100 and 200 nm) for 40 min and then stimulated with 100 ng/ml EGF for 10 min. The expression of the phosphorylated EGFR and EGFR-related downstream molecule ERK1/2 were detected by Western blot analysis with the phospho-specific antibodies against EGFR and ERK1/2.

108 Cancer Prevention Research Vol. 16, No. 2, 2011 EGFR의 downstream에존재하는단백질의인산화활성을억제하는 EGFR targeted 억제제를발굴하고자하였다. 해조류에서분리한해양공생미생물에서단일물질을추출, EGFR kinase 활성억제효과를 in vitro assay를이용하여분석하였다. 3종류의물질, 018, 019 그리고 030 중추출물 019가가장낮은농도의 IC 50 값을나타낸것으로보아 EGFR kinase 활성억제효과가가장높았다. HeLa 세포를대상으로 3종류의추출물을각각 40분동안처리하고 EGF로 10분동안 EGFR kinase의활성화를유도한후 Western blot을행한결과, 이들추출물들이 phospho-egfr의발현을억제하는것을확인하였다. 또한 tyrosine kinase inhibitor로알려진 Tyrphostin AG 1,478과비교실험한결과, EGFR kinase 활성및 EGFR의 downstream에존재하는단백질 phospho-erk1/2의활성또한억제함을관찰하였다. 이러한활성억제효과는이들물질을 24시간지속적으로처리하였을때세포수의확연한감소와함께세포의증식억제효과를유도하였다. 이와같은결과들은해조류의공생미생물에서분리한 3 종류의단일추출물에대한 EGFR targeted 항암활성물질로서의개발가능성을제시하고있다. 감사의글 이논문은 2008년도정부 ( 교육과학기술부 ) 의재원으로한국연구재단의지원을받아수행된연구 (KRF-2008-314-F00048) 임. 참고문헌 1) Casalini P, Iorio MV, Galmozzi E, Mnard S. Role of HER receptors family in development and differentiation. J Cell Physiol 200, 343-350, 2004. 2) Ranson M. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors. Br J Cancer 90, 2250-2255, 2004. 3) Hamid O. Emerging treatment in oncology: focus on tyrosine kinase (erbb) receptor inhibitors. J Am Pharm Assoc 44, 52-58, 2004. 4) Grunwald V, Hidalgo M. The epidermal growth factor receptor: a new target for anticancer therapy. Curr Probl Cancer 26, 109-164, 2002. 5) Salomon DS, Brandt R, Ciardiello F, Normanno N. Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies. Crit Rev Oncol Haematol 19, 183-232, 1995. 6) Chen WS, Lazar CS, Poenie M, Tsien RY, Gill GN, Rosenfeld MG. Requirement for intrinsic protein tyrosine kinase in the immediate and late actions of the EGF receptor. Nature 328, 820-823, 1987. 7) Zhe XF, Liu ZC, Xie BF, Li ZM, Feng GK, Yang D, Zeng YX. EGFR tyrosine kianse inhibitor AG1478 inhibits cell proliferation and arrests cell cycle in nasopharygeal carcinoma cells. Cancer Lett 169, 27-32, 2001. 8) 이유경, 이정현, 이홍금. 미생물유전체연구현황. 미생물과산업 27, 33-39, 2001. 9) Tao LY, Zang JY, Liang YJ, Chen LM, Zheng LS, Wang F, Mi YJ, She ZG, To KK, Lin YC, Fu LW. Anticancer effect and structure-activity analysis of marine products isolated from metabolites of mangrove fungi in the South China Sea. Mar Drugs 8, 1094-1105, 2010. 10) Almeidal AP, Dethoup T, Singburaudom N, Lima R, Vasconcelos MH, Pinto M, Kijjoa A. The in vitro anticancer activity of the crude extract of the sponge-associated fungus Eurotium cristatum and its secondary metabolites. J Nat Pharm 1, 25-29, 2010. 11) Henkel T, Brunne RM, Muller H, Reichel F. Statistical investigation into the structural complementarity of natural products and synthetic compounds. Angew Chem Int Ed 38, 643-647, 1999. 12) Choi JS, Lee WK, Son BW, Kim DS, Choi, HD, Choi JS, Jung JH, Im KS, Choi WC. Screening on radical scavenging activity of marine microalgae. Korean J Pharmacogn 31, 252-255, 2000. 13)Li X, Li Y, Nam KW, Kim DS, Choi HD, Son BW. Screening of radical scavenging activity from the marinederived fungus. Korean J Pharmacogn 33, 219-223, 2002. 14) Li X, Li Y, Jeong JH, Lee KT, Choi HD, Son BW. Screening of tyrosinase inhibiting activity from the marine-derived fungus. Korean J Pharmacogn 34, 138-141, 2003. 15) Carpenter G, Cohen S. Epidermal growth factor. J Biol Chem 265, 7709-7712, 1990. 16)Herbst RS. Review of epidermal growth factor receptor biology. Int J Radiat Oncol Biol Phys 59, 21-26, 2004. 17) Oliveira S, Schiffelers RM, van der Veeken J, van der Meel R, Vongpromek R, van Bergen En Henegouwen PM, Storm G, Roovers RC. Downregulation of EGFR by a novel multivalent nanobody-liposome platform. J Control Release 145, 165-175, 2010. 18) Moulder SL, Yakes FM, Muthuswamy SK, Bianco R, Simpson JF, Arteaga CL. Epidermal growth factor receptor (HER1) tyrosine kinase inhibitor ZD1839 (Iressa) inhibits HER2/neu (erbb2)-overexpressing breast cancer cells in vitro and in vivo. Cancer Res 61, 8887-8895, 2001. 19) Sweeney C, Carraway KL 3rd. Negative regulation of ErbB family receptor tyrosine kinases. Br J Cancer 90, 289-293, 2004. 20) Maihle NJ, Baron AT, Barrette BA, Boardman CH, Christensen TA, Cora EM, Faupel-Badger JM, Greenwood T, Juneja SC, Lafky JM, Lee H, Reiter JL, Podratz KC. EGF/ErbB receptor family in ovarian cancer. Cancer Treat Res 107, 247-258, 2002.

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