특별기고 Technologies for vaccine design using non-whole pathogen strategy 송재민 성신여자대학교 글로벌의과학과 E-mail: jmsong@sungshin.ac.kr 감염질환을 조절하는데 있어 백신을 활용하는 것이 의료, (1) Natural protein 경제성 측면에서 가장 합리적이라는데 이견이 없다. 고전 고전적으로 단백질 기반의 백신은 병원체가 가지고 있 적, 일반적 백신은 병원체를 불활화(inactivation)시켜 독성 는 항원단백질 그 자체를 사용하였다. 초기의 HBV 백신은 과 증식력을 없앤 비병원성 균주를 백신으로 사용하는 것이 HBV에 만성 감염된 보균자의 혈장에 존재하는 HBV의 표면 다. 불활화 백신은 병원체를 효과적으로 배양할 수 있고 항 항원 단백질인 HBsAg를 분리 정제하여 사용하였다. HBsAg 원성에 변이가 적은 불활화 방법이 갖춰있을 때 제작하고 활 는 약 22nm 크기의 지질단백질이며 방어면역력을 유도하는 용할 수 있다. 하지만 많은 병원체들이 그렇지 못하다. 병원 에피토프를 갖고 있다. 이러한 HBsAg 단백질을 분리하고 성이 강해 배양에 특수시설이 필요하거나, 경제적 생산에 적 혹시 모를 바이러스와 다른 인자들의 활성을 억제하기 위해 합한 숙주시스템을 갖추지 못한 경우가 많다. 따라서 전체 2-3회 불활화 과정을 거친 후 백신으로 사용되었으며 충분 병원체를 백신으로 활용하지 않는 비-전병원체(non-whole 한 면역원성을 유도할 수 있었다. pathogen) 기반의 백신개발에 관한 연구가 활발히 이뤄지 고 있다. 대표적으로 항원단백질을 분리, 정제하여 백신으로 활용하는 재조합 단백질 기반의 백신이 있으며 그 외에 펩타 이드, 탄수화물, 핵산을 기반으로 한 다양한 형태의 백신디 자인이 이뤄지고 있다. 본 원고에서는 어떠한 기술이 이러한 비-전병원체 기반 백신개발에 활용되는지 살펴보고, 그 활 용 전망을 논의하고자 한다. Protein based vaccine design 1 분 자 세 포 생 물 학 뉴 스 레 터 (2) Chemical and genetic inactivation 세균백신 중 백일해 백신은 과거 whole-cell 형태로 사용 되던 것이 최근에는 항원단백질을 여러 개 제형화한 형태의 acellular pertussis (ap) 백신으로 사용하고 있다. 이때 사 용되는 항원은 통상 백일해 독소(Pertussis toxoid)는 반드 시 함유되며 그 외 다른 항원단백질을 혼합하여 제조한다. 백일해 독소는 백일해 배양액 상에서 얻을 수 있으며 포르 말린이나 글루타알데하이드 같은 화학물질을 이용하여 불활 화(chemical inactivation) 한다. 이렇게 불화화된 독소는
톡소이드 (toxoid) 라고불리며, 백일해독소 (P) 는파상풍독소 (T; Clostridium tetani), 디프테리아독소 (D; Corynebacterium diphtheria) 와함께혼합하여 DTP 또는 acellular pertussis 백신와혼합하여 DTaP 형태로사용한다. 화학적방법으로독소를톡소이드로전환하면그과정중에일부항원성에변화가발생하기도하며, 드물게독성이부활할가능성도있다. 따라서유전자수준에서독성요소에돌연변이를주어근본적으로독성을제거하는유전자불활화 (genetic inactivation) 방법이개발되었다. 앞에서살펴본백일해독소에이러한방법이적용되었다. 백일해독소가독성을얻기위해서필요한효소활성을낮춘유전자를사용하여독소를유전적으로불활화하였으며 (1), 추가로화학적방법을사용하는이중불활화방법을활용하기도한다. 이와같은유전적불활화방법을이용하여불화화시킨 C. diphtheriae 의톡소이드 CRM197은다른항원과결합하여결합백신 (conjugated vaccine) 의형태로만드는데활용되고있다 (2). (3) Recombinant protein 재조합 DNA 기술을이용하여최초로생산된백신은 HBV 백신이다. HBsAg 유전자를빵의효모균를활용하여발현시킨후바이러스단백질간의자가조립특성을이용하여바이러스와형태적으로매우유사한바이러스유사입자 (VLPs; Virus Like Particles) 를만들고, 이를 aluminum salt를보조제로첨가하여백신으로사용하였다. 이러함 particle 기반의백신은단순항원단백질에비해일반적으로면역원성이높고항체생성능력이뛰어나다. 이와같은특성을이용하여 human papillomavirus (HPV) 백신은바이러스의 L1 단백질을세포에서발현시킨후마찬가지로자가조립을통한 VLP 형성을유도하여효과적인중화항체를형성할수있음이입증되었고, 이를바탕으로한백신이라이센스를얻어시판중에있다. 여러개의항원 (multiepitope vaccine antigen) 또는하나의항원을여러개연결하는퓨전단백질전략도재조합 DNA 기술을활용한대표적인백신디자인전략중하나다. Streptococcus pneumoniae에존재하는 2개의서로다른 표면단백질을결합하여만든재조합단백질백신은현재임상시험중에있다 (3). 유사하게재조합 N. meningitidis serogroup B (MenB) 백신은 5개의항원중 4개의항원을융합단백질형태로발현하여백신을제작하고현재임상시험중에있다 (4,5). 여러개의항원이아닌다른목적의단백질을융합하는경우도있다. 미생물의 heat-shock protein 에의해 CD8 + CTL response 가유도된다는결과를응용하여, HPV-16 E7 항원단백질과 M. bovis BCG hsp65 단백질을융합시켜접종을할경우 CD8 + CTL 반응이촉진되어 HPV E7 + tumor cells 의성장을현저하게억제하는결과를얻을수있었으며이또한임상시험이진행중에있다 (6). Peptide based vaccine design (1) B cell epitope 중화항체를형성하는 B cell epitope는항원내에서 6-20 여개의아미노산이선형형태를이루고있다. 말라리아의항원단백질인 Plasmodium falciparum circumsporozoite 단백질은 4개의아미노산이반복된서열로구성된 B cell epitope가존재하며선형자체로약한면역반응을유도할수있으나 (7), 때로는입체구조속에서정확하게인식이된다. 따라서선형형태인 B cell epitope의면역원성을높이기위해여러가지전략들이시도되고있다. 일부 peptide의경우적절한조건에서크고작은망상구조 (aggregation) 를유도할수있으며이를통해더높은면역반응을유도함이알려졌다. 일예로 Aβ 단백질을 fibril 단백질과 in vivo 에서적절히반응시킨후이것을 Alzheimer disease (AD) 에대한백신으로사용하고자하였다. 현재동물 AD 모델에서그효능을입증하였으나 (8) 임상초기단계에서부작용이나타나현재개선이진행중이다. B cell epitope의면역력을높이기위해융합기술 (Fusion technology) 이널리사용되고있다. 대표적인융합파트너로사용되는것이 HBsAg와 Hepatitis B core antigen을들수있다. B cell epitope는이들융합파트너의 N, C 말단또는단백질내부중에면역반응을가장잘유도할수있는위치에자리한다. circumsporozoite 웹진 12 월 2013 2
특별기고 peptide 와 HBsAg 간의융합단백질은말라리아를대상으로한몇안되는백신후보물질중하나이다 (9). 항원단백질로부터유래한 B cell epitope와다른 epitope를융합하는전략도사용되고있다. 16개아미노산으로구성된 cholesterol ester transfer protein (CETP) 을 14개의아미노산으로구성된파상풍톡소이드 (tetanus toxoid) 의 T cell epitope 와결합시켜랫트에주입한결과, 고콜레스테롤식이에대해 aortic lesions 의감소결과를나타냈으며, 인간에있어서도항-CETP 항체가형성되는것을확인한연구결과가있다. Conjugation technology는일반적으로 polysaccharide antigenic vaccine을제작할때활용되지만, peptide based vaccine 개발에도사용된사례가있으며, 임신예방백신의경우가그예이다. Human chorionic gonadotropin (hcg) 또는 luteinizing hormone releasing hormone (LH-RH) 를타겟으로하여이들을파상풍톡소이드에결합한후실험동물에서면역반응을측정한결과, 파상풍톡소이드를결합하지않았을때나타나지않았던면역반응이유도되는것을확인한바있다 (10). 또한 conjugation technology는암을대상으로한치료백신개발에서사용된예가있으며암특이적인항원으로알려진 MUC-1을대표적인 fusion partner 로알려진 KLH 에결합하여 non small cell lung carcinoma 에서항암작용을확인하였다 (11). (2) Mimotope Mimotope는 epitope 구조와유사성이매우높은물질로일반적으로재조합단백질또는합성방법으로면역반응을충분히유도하는백신을제작할수없을때시도하는방법이다. 다양한고분자물질이가능하지만일반적으로 peptide 형태를취하고있으며, 많은경우 phage display 기술을이용하여제작한다. 반응성이높은 mimotope를찾기위해서는먼저다양하게제작된 peptide library가필요하고이로부터반응성이높은형태를골라내는스크리닝단계를거치게된다. 대표적인예로 Lewis-Y carbohydrate (LeY) 는항암특이적항원으로알려져있으나 (neolactoseries carbohydrate) 백신으로사용할수있을만큼충분한양을분리해내거나합성하기어려운단점을갖고있다. LeY에서유래 한 multiple antigenic mimotope 를제작하고, 마우스에접 종하여면역반응을살펴본결과, LeY 특이적인항체가형성 되는것을확인하였으며암 - 실험동물실험에서암의크기와 발달을억제하는것을확인할수있었다 (12). Carbohydrate and polysaccharide based vaccine design 다수의박테리아가가지고있는 outer polysaccharide capsule 과 lipopolysaccharide (LPS) 의성분은항체가인 식하는주요타깃이된다. 일반적으로 natural capsular polysaccharide 는 monosaccharide 의수백개반복으로구 성되어있으며, 세균배양중에이것들을분리하여백신으 로활용할수있다. Polysaccharide 에의해유도된항체는 bacteriolysis 또는 opsonization 을유도할수있으며 Hib (monovalent), N. meningitides (quadrivalent), and S. pneumoniae (tridecavalent) 백신이시판중이다. 이러한 Polysaccharide 기반의백신은일반적으로 T ecll independent antigen 으로작용하기때문에면역기관의발달이 완전히성숙되지못한 2 세미만의영유아에게는효과가떨어 진다는단점이있으며, 성인에있어서도백신메모리형성이 이뤄지지않는다는문제가있다. 이를극복하기위해 Conjugated polysaccharide 백신전략이활용되고있다. 이는 carrier 단백질을활용함으로써 Polysaccharide TI antigen 을 T cell dependent antigen 으로전환하는효과를갖고 있으며동시에메모리형성도가능하다. Hib bacteria 는 single serotype 을갖고있으며 carrier 단백질 (TT, diphtheria toxoid, CRM197, outer membrane protein complex from N. meningitidis) 을활용한여러가지백신이시 판중에있다. 폐렴구균은약 90 여가지혈청형이존재하며서로다 른 capsular polysaccharide 구조를가지고있다. 이중전 체소아폐렴의 60~75% 를차지하는 7 종의혈청형에대한 heptavalent conjugate vaccine 이개발되어개발도상국중 심으로사용중에있으며현재는 13 종의혈청형에대한 tridecavalent conjugate vaccine 이 2010 년허가를받아시판 3 분자세포생물학뉴스레터
중에있다. 침습성뇌수막염 (Invasive meningococcal disease) 백신또한 diphtheria toxoid를 carrier protein 으로사용한 5가백신 (quadrivalent meningococcal conjugate vaccine; A, B, C, W135, Y) 형태로미국과캐나다에서사용중이며최근에는 mutant diphtheria toxin (CRM197) 을 carrier protein로사용하여성인과 2세이상의어린이에게좋은결과를보여주고있다. nucleic acid-based vaccine design 백신항원의유전자정보를함유하고있는 DNA 를백신으로사용하고자하는시도는 1990년대에시작되었다. 초기의전략은아무런 formulation 없는 DNA 자체 (Naked DNA) 를근육주사를통해접종하고백신항원을발현시키는것으로이는마치바이러스가감염된후바이러스유전자가발현되는과정과유사하다고할수있다. 인플루엔자, HIV, 말라리아에대한 DNA 백신임상실험이진행되었으나 1세대 DNA 백신은충분한면역반응을이끌어내지는못하고, 가능성만확인하였다. 최근에는효과적인전달및발현수준을높인기능성추가 DNA(facilitated DNA) 가사용되고있다. hepatitis B vaccine에사용된 gold microparticle 기술은 DNA 표면을나노사이즈의금입자로코팅한후파우더형태로건조하여비주사장치를이용진피부위로접종함으로써효과적인면역반응을유도할수있다. DNA의세포내도 입을증가시키기위해 cationic lipid, liposermine 등을사용하여세포의지질이중층을통과할수있도록디자인하고있다. 더불어 DNA와함께혼합하여효능을높이고자하는시도도이뤄지고있다. Unmethylated CpG dinucleotide는박테리아유전자에서는흔히나타나지만고등생물에서는잘나타나지않으므로선천면역반응을유도하는효과를기대할수있다. 이를활용하여 DNA 백신에일종의면역보조제형태로 Unmethylated CpG dinucleotide를혼합하여사용한결과 B 세포의증식과항체생성이증가되는것을확인하였다 (13). 항원의발현양을증가시키기위한다양한기술적접근이시도되고있다. 특히 viral vector를이용한항원전달기술집중적으로이뤄지고있으며 DNA vaccine delivery 로서 fowlpox 또는 canarypox virus가연구되고있다. 이러한 poxvirus 들은 mammalian cell에감염이가능하고항원으로사용되는단백질합성이가능하지만 infectious virus 의형성은불가능한 single round of self-limiting infection 형태를취하고있다. 이러한예로 HIV 백신으로 DNA prime (phis-hiv-b), recombinant fowlpox virus (rfpv-hiv-b) boost 전략이개발되었다 (14,15) 박테리아를 DNA 전달체로사용하고자하는연구도진행되고있다. S. flexneri의성장에필수적인 asd gene을제거를통해영양요구성균주로전환된돌연변이균주를이용하여시겔라박테리아유전자전달시스템이개발되었다 (16). 표 1. 백신디자인에활용되는다양한기술별인체백신의예시 Technology (Type of vaccine) Pathogen status Attenuation Poliovirus cell culture passage Measles virus Mumps virus Varicella-zoster virus (VZV) Host range Smallpox (vaccinia virus) Rotavirus Reassorted genomes Rotavirus Influenza virus Rubella virus Temperature-selected Influenza virus Respiratory syncytial virus (RSV) 웹진 12 월 2013 4
특별기고 Technology (Type of vaccine) Pathogen status Recombinant virus or viral vector Engineered genome Herpes simplex virus (HSV) HIV using vaccinia virus Recombinant viral vector HIV using adenovirus Ebola, cytomegalovirus (CMV) using alphavirus Bacteria Classic bacteria Tuberculosis (Bacille-Calmette-Guérin [BCG]) Typhoid fever (Salmonella typhi) Recombinant bacteria Cholera (Vibrio cholerae) S. typhi V. cholerae Recombinant bacterial vector Shigella flexneri Streptococcus gordonii Listeria monocytogenes BCG Protein based Natural Hepatitis B virus (HBV) Pertusis Tetanus (Clostridium tetani) Chemically inactivated Diphtheria (C. diphtheriae) Pertusis Genetically inactivated Pertussis Lyme disease (Borrelia burgdorferi) Cholera Human papillomavirus Recombinant polypeptide Human immunodeficiency virus (HIV) HSV Pneumococcal (Streptococcus pneumoniae) Neisseria meningitidis serogroup B Peptide-based Alzheimer disease B-cell epitope Malaria Hypercholesterolemia Fertility Mimetopes Cancer Preclinical HIV Carbohydrate-and polysaccharide-based Haemophilus influenza type b (Hib) Polysaccharide Meningococcal (N. meningitidis) Pneumococcal Hib Polysaccharide conjugate Pneumococcal Meningococcal (N. meningitidis) Group B strep (Streptococcus agalactiae) Nucleic acid-based DNA-naked Influenza HBV Facilitated DNA HIV Influenza Preclinical 5 분자세포생물학뉴스레터
시겔라박테리아는장에감염되어점막면역반응을유도하고동시에항원단백질발현까지가능하며지속적인증식이불가능하고또경구백신형태로개발이가능하여다양한활용가능성을갖고있다. 이상에서논의한다양한형태의백신은표1 에정리하였다. Adjuvant 제형 (Formulation) 은백신항원에면역보조제 (Adjuvant) 와접종방법을포함하여최종백신에더가까운형태를말한다. 면역보조제는면역반응을증가하기위해항원에첨가되는첨가물로서목적에따라체액성, 세포성면역반응의촉진을유도하도록디자인된다. 체내에서적절한세포, 조직에백신항원이적절하게도달할수있도록최적의접종방법을선택하는것과함께다양한면역보조제가활용되고있다. 고전적으로 70년넘게사용된면역보조제는 Aluminum salts (hydroxide or phosphate) 로서최근 10년간 10억명이상의인구가사용한것으로추산된다. 기본적인원리는백신항원과 Aluminum salts 간에이온결합이형성되어항원간에 macromolecule 형성이이뤄져 B cell receptor 가쉽게인식하고 B 세포활성화및항체형성에도움을주는것으로이해된다 (17). 반면 T cell 관련된면역반응에는크게관여하지않아 cell mediated immunity 에는별도움이되지않는다. HBV, 백일해백신등에활용이되고있으나그외다른백신에폭넓게사용되지는못하고있다. 따라서신규면역보조제를개발하기위한연구가활발히이뤄지고있으나기본적으로면역보조제의경우높은독성을나타내는경우가많아면역증강작용과부작용간의합리적인균형을잡는것이신규면역보조제발굴에있어중요한요소라고할수있다. 최근유럽에서승인을받은면역보조제 MF59(oil-inwater emulsion) 은 inactivated split-virion influenza vaccine 에적용하여그효과와안정성이입증된바있어 1997년부터인플루엔자백신에사용이허가되었다 (18). 현재개발중인면역보조제중 MF59과유사한형태의스쿠알랜기반의 AS03 또한 2009H1N1 백신에서그효능이입증되었다 (19, 20). AS04는 MPL (deacylated monophosphoryl lipid A plus aluminum) 계열의면역보조제로서효모발현 HBV 백신과함께혼합하여항체형성을돕는역할을한다 (21). 유럽을포함최근미국에서는 AS04의사용이 HBV, HPV에대하여허용되었다 (22). 최근몇가지박테리아유래독소를면역보조제로개발중이다. Cholera toxin (CT) 은몇안되는점막면역보조제로개발중에있으며 (23), 작동기작은독소의 A 부위와 5량체 B 부위가여러세포의 GM1 ganglioside 상호작용함으로써효과를나타낸다. LT (heat-labile toxin) 도비강, 경구, 질, 항문등다양한점막경로를통해면역증강효과를갖고있으나, LT, CT 면역보조제모두아직부작용에서자유롭지는못하다. CT는경구투여후설사를유발한사례가있으며, LT는인플루엔자바이로소좀백신과함께경구투여로사용한후심각한부작용이관찰된바있다. 따라서이들독성을조절하고면역증강효과를유지하는기술이신규면역보조제발굴에중요한요소가될것이다. Conclusion 새로운백신을디자인하고개발하려는시도가지속되고있으며, 지속되어야한다. 이전에개발된적이없는병원체를대상으로함은물론이고, 과거에개발이되어사용중에있으나개선이필요한것들도해당된다. 그형태는고전적인생백신, 사백신의형태를포함하여, 다양한 vector, recombinant DNA, Protein 기술들이활용될수있을것이다. 또최근다양한오믹스 (omics) 기술과시퀀싱 (sequencing) 기술을발전으로병원체의유전자기능에대한이해가높아지며생백신개발에대한다양한전략이마련될수있을것이며, 병원체의특이적생활사를이용하여항원전달체로활용할수있는기회도늘어날것이다. 면역보조제는팬대믹과같이유사시항원을절약하여더많은사람을대상으로백신을접종할수있는있는좋은전략이될수있으나, 독성의문제를해결해야할숙제가있다. 이번글에서집중적으로다루지않았지만, 백신을효과적으로전달할수있는전달방법에관한개발도백신디자인에있어중요한이슈중하나가될것이다. 웹진 12 월 2013 6
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