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Polymer(Korea), Vol. 42, No. 2, pp. 280-287 (2018) https://doi.org/10.7317/pk.2018.42.2.280 ISSN 0379-153X(Print) ISSN 2234-8077(Online) 골재생을위한이종골이함유된온도감응형하이드로젤 김진 천서영 * 국민석 ** 이창문 *** 이기영 ****, 전남대학교헬스케어의공학연구소, * 전남대학교신화학소재공학과, ** 전남대학교치의학전문대학원구강악안면외과학교실, *** 전남대학교의공학과, **** 전남대학교화학공학부 (2017 년 8 월 25 일접수, 2017 년 9 월 27 일수정, 2017 년 9 월 29 일채택 ) Thermo-Responsive Hydrogels Containing Xenogenic Graft Materials for Bone Regeneration Jin Kim, Seo Young Cheon*, Min Suk Kook**, Chang Moon Lee***, and Ki Young Lee****, Research Center for Healthcare-Biomedical Engineering, Chonnam National University, Yeosu 59626, Korea *Department of Advanced Chemicals and Engineering, Chonnam National University, Gwangju 61186, Korea **Department of Oral and Maxillofacial Surgery, School of Dentistry, Chonnam National University, Gwangju 61186, Korea ***Department of Biomedical Engineering, Chonnam National University, Yeosu 59626, Korea ****Faculty of Chemical Engineering, Chonnam National University, Gwangju 61186, Korea (Received August 25, 2017; Revised September 27, 2017; Accepted September 29, 2017) 초록 : 골재생을유도하기위해주사가가능한메틸셀룰로스 (methylcellulose, MC) 와잔탄검 (xanthan gum, XT) 으로구성된온도감응형하이드로젤을제조하였다. 본연구에서는생체내에서골결손재생을향상시키기위해골이식재 (BGM) 가포함된하이드로젤을연구하였다. BGM 이함유된 MC-XT 수용액은생리학적온도에서졸 - 젤전이를보였다. 두개골결손동물모델연구에서, BGM 을함유한하이드로젤은무처치그룹및하이드로젤만처리한그룹과비교하였을때뼈재생을상당히개선시켰다. Micro-CT 및조직학적결과에서볼수있듯이, BGM 을포함한하이드로젤에서는치료 4 주후에새로형성된골조직이분명하게관찰되었다. 결론적으로 BGM 을함유한온도감응형 MC-XT 하이드로젤은생체내에골결손재생을위한유용한주사물질임을확인하였다. Abstract: Thermo-responsive hydrogels consisted of methylcellulose (MC) and xanthan gum (XT) could be used as an injectable reparing material to regenerate bone defect. In this study, the hydrogel containing xenogenic bone graft materials (BGM) was investigated for enhancement of bone defect regeneration in vivo. MC-XT aqueous solution containing BGM exhibited sol-to-gel transition at physiological temperature. In a cranial defect animal model studies, the hydrogel containing BGM improved the bone regeneration significantly in comparision with the untreated group and the hydrogel only group. As shown in the result of micro-ct and immunohistochemical staining, newly formed bone tissues were clearly observed at 4 weeks post-treatment in the hydrogel containing BGM group. The results indicate that the thermoresponsive MC-XT hydrogel containing BGM was an useful injectable material for bone defect regeneration in vivo. Keywords: xenogenic bone graft material, methylcellulose, thermo-responsive, sol-gel, bone regeneration. 서 골이식은각종골재건술 (reconstructive orthopedic surgery) 및치과용임플란트시술에매우다양한분야에서광범위하게이용범위가늘어가고있는추세이다. 가장이상적인골이식재로자가골은채취시부가적인수술이필요하며, 채취부위의통증, 골채취량의제한등의문제점을가지고있어 론 To whom correspondence should be addressed. kilee@chonnam.ac.kr, 0000-0001-9169-2660 2018 The Polymer Society of Korea. All rights reserved. 자가골을대체할수있는동종골, 이종골및합성골이식재에대한연구가활발히이루어지고있다. 1 이종골은소나돼지등의다른종의동물에서골을채취한후동결건조, 탈회동결건조, 그리고방사선조사및열멸균등을거쳐골전도능력을기대하는골이식재 (BGM, xenogenic bone graft materials) 이다. 이러한골이색재를손쉽게사용하기위해지지체, 스캐폴더, 하이드로젤에적용시켜활용되고있다. 그러나사용부위에따라물성과형태조절이자유롭지않은한계점을가지고있다. 최근, 졸 (sol)- 젤 (gel) 전이거동을보이는온도감응형창상피복재가제품화되고있다. 제네웰의 Guardix-SG 와 CG-Bio 의 Mediclore 제품으로 poloxamer 에 280

골재생을위한이종골이함유된온도감응형하이드로젤 281 알지네이트를첨가시킨것과 poloxamer 에젤라틴과키토산을첨가시킨졸의형태로유착방지제에활용되고있다. 온도감응형소재는스마트한생체재료로다양한응용분야에서활용할수있다. 유동성액체인졸상태에서체내로주입하면고형젤을형성하는온도감응성젤은복잡하고불규칙적형태의 3 차원적공간에기능적이고심미적인조직재생을위해주입형적용이가능하다. 2 졸 - 젤전이가일어나는고분자로 poly(n-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) 기반공중합체와 poly(ethylene glycol)(peg) 기반블록공중합체로나눌수있다. 3,4 하지만, 우수한온도감응성및광범위한응용성에도불구하고비분해성과세포독성이라는본질적인문제로인해생체재료로활용에제한이있다. 천연고분자인알지네이트, 셀롤로오스, 히알루론산, 덱스트란등은생체적합성과생분해성이뛰어나지만온도감응성의고분자로전환하기위해 dihydrazide, carbohydrazide, butanediol digly-cidylether 등의다양한가교결합제를사용하고있다. 5.6 그러나 methylcellulose(mc) 의경우염의농도, 분자량그리고고분자의농도에따라수초내에상전이가되는졸 - 젤고분자로사용이가능하다. 7 의약품에다양하게활용되고있는 MC 는약물의담지체및스캐폴더등생체내활용가능한소재로쓰이고있다. 특히, 섬유아세포에부착및증식성, 세포적합성이높은소재이며골형성세포 MC-3T3 에처리했을때골형성에도움을주는연구결과가있다. 8,9 Xanthan gum(xg) 은 cellulose 와같이박테리아발효에의해생산되는생체적합성과생분해성이가능한음이온다당으로낮은온도에서는규칙적이고단단한이중나선스트랜스구조와고온에서는무질서하고유연한코일구조의두가지의다른형태성질을가진다. MC 와 XT 의혼합은전단감소및낮은점도의특성을보완해주어주사가가능한하이드로젤이형성되어의료용소재로많은연구가되어있다. 이러한특성을적용하여 BGM 을적용시킨주사가가능한하이드로젤을개발하고자한다. 이전연구에서 MC 조성온도감응성유착방지제를개발했었으며독성이없고한달이상유착방지막의역할을하는것을관찰하였다. 10 본연구에서는골재건및재생을유도할때사용되는 BGM 을온도감응의성질을가진 MC/XT 조성에첨가시켜 BGM 이함유된수용액 ( 졸 ) 을제조후, 골손상부위에처리하여골재생률을확인하고골재생의료소재로활용가능성을평가하고자한다. 실 시약및재료. Methylcellulose(MC, 4000CP), xanthan gum(xt, 800-1200CP), alkaline phosphatase yellow (pnpp), Na 2 HPO 4 는 Simga사 (St. Louis, MO, USA) 에서구입하여사용하였다. 실험에사용한이종골은 Mega-Oss Bovine(Megagen, Korea) 을사용하였다. MC3T3-E1 세포주 험 는한국세포주은행에서구입하여사용하였다. 배양하기위한 Dulbeco s modified eagle s medium(dmem) 과 trypsinethylene diaminetetra acetic acid(edta) 는 Gibco laboratories (Grand Island, NY, USA) 에서구입하였으며, fetal bovine serum(fbs) 은 hyclone laboratories(logan, UT, USA) 에서, ninety-six well tissue culture plates 및 tissue culture dish 는 Nunc Inc.(North Aurora Road, IL, USA) 에서각각구입하였다. 그외모든시약은 1 급또는특급을사용하였다. 이종골함유젤제조. 이전연구의방법을활용하여 MC/ XT 조성온도감응형하이드로젤을제조하였다. 10 MC 와 XT 을증류수에 4:1 비율로용해시키고 0.1 M Na 2 HPO 4 을첨가하여 50 o C 에서 4 시간동안교반하였다. 교반한용액에 0.1% 의 EDTA 와 1% 의 BGM 을첨가하여다시 50 o C 에서 4 시간동안교반하였다. MC/XT-BGM 수용액 ( 졸 ) 을 4~8 o C 의저온에서 24 시간교반한후, 제조한졸의안정화를위하여제조후 4 시간동안 4 o C 에서방치하였다. 제조된 MC/XT- BGM 혼합조성물을 25 o C 와 37 o C 온도로유지되는항온수조에서분사하여온도가 37 o C 일때 gelation 되는것을육안으로확인하였다. MC/XT 조성졸의열 - 전이거동은온도를 25 o C 에서 40 o C 로점차증가시키면서광투과율 (light transmittance) 을 UV-vis spectrophotometer 로측정하였다. 각온도지점에서졸은데이터를측정하기전에최소 10 분간배양후, 350 nm 에서측정하였다. FTIR 분석. 이종골함유조성물의화학구조의변화를살펴보기위하여적외선분광광도계 (FTIR spectroscopy, Shimadzu- IR Prestige-21, Japan) 를이용하여분석하였다. BGM, MC/ XT 그리고 MC/XT-BGM 하이드로젤을각각동결건조하였다. KBr pellet 을만들어시편을제조하였으며, 시료와 KBr 을무게비 1:100 으로잘혼합하여 pellet 을제조하고 60 o C 에서 12 시간동안감압건조를이용하여수분을제거한후 4000~500 cm -1 영역에서측정하였다. 표면형태평가 (SEM). 각시료의표면형태를관찰하기위해시료를준비하였다. 실험에사용한 BGM, BGM 이첨가되지않은 MC/XT 그리고 MC/XT-BGM 하이드로젤내부에존재하는 BGM 을관찰하기위해졸상태의시료를 6 well petri dish 에 casting 후 37 o C 에서하이드로젤상태의시료를초저온냉동고 (-80 o C) 에서한시간방치후동결건조하였다. 동결건조된시료는 automatic coater(sputter Coater 108auto, Cressington Scientific Instruments Inc.) 를이용하여 Au-Pd 로 60 초동안진공코팅한후에 scanning electron microscope (SEM, JSM-5400A, JEOL, Japan) 를이용하여 15 kv 에서형태를관찰하였다. 원자력현미경 (Atomic Force Microscopy, AFM) 분석. 각시료의가시적표면분석을위하여졸상태의시료를 6 well petri dish 에 casting 후 37 o C 에서하이드로젤상태의시료를초저온냉동고 (-80 o C) 에서한시간방치후동결건조하였다. Polymer(Korea), Vol. 42, No. 2, 2018

282 김진 천서영 국민석 이창문 이기영 각시료를 2cm 2cm로절단하여준비한후표면에 3곳의동일한면적 (30 μm 30 μm) 을설정하여 AFM(XE-100, Park systems Corp., Santa Clara, CA, USA) 을이용하여표면형태 (surface morphology), 표면고도 (R z : Max. roughness profile height), 표면거칠기 (RMS: root mean square) 를관찰하였다. XRD 분석. X선회절분석은분말형시편의방사선회절패턴을분석하여고체의결정구조를조사하는방법이다. BGM 과동결건조된 MC/XT 및 MC/XT-BGM 시료를 10 mm 15 mm로절단한후 X-ray diffractograms은 wide angle X- ray diffractometer(waxd; Rigaku Dmac 2000 V)(Rigaku, Tokyo, Japan) 의 Cu KR방사선을이용하여 40 kv, 30 ma 조건에서 2θ=5-40 o 의범위로측정하였다. 세포독성평가. 의료기기관련세포독성측정방법은 ISO 10993에제시된방법으로평가하였다. 세포생존율측정은 MTT assay 법으로측정하였다. 동결건조후얻은 MC/XT와 MC/XT-BMG 시료각 1% 를세포배양액 (DMEMGibco) 으로 25 o C 이하에서 24시간이상교반하여용출액을제조하였다. 96 well plate에각 well당 MC3T3-E1 세포 5 10 4 cells/well 을분주하고 MC/XT와 MC/XT-BMG 용출액을함유한 DMEM 배양액으로갈아준후 24시간동안 37 o C, 5% CO 2 조건에서배양하였다. Well 당 20 μl의 MTT 용액을첨가하여 37 o C, 5% CO 2 조건에서 4시간동안반응시킨후, 배양액을버리고 DMSO 100 μl씩넣어 formazan을용해한후, ELISA 측정기 (ELX 808, Biotek Instruments, Vermont, USA) 를이용하여 570 nm에서측정하였다. ALP활성평가. 24 well plate에 MC3T3-E1 cells을 2 10 3 cell/ml이되도록분주한후 10% FBS가첨가된 DMEM 배지에서 37 o C, 5% CO 2 조건에서배양하였다. 24시간배양후분화유도배지 (50 μg/ml ascorbic acid, 10 mm β- glycerophosphate, 10 7 M dexamethasone 포함된 DMEM) 로교환하여 24시간배양한다음시료를처리하였다. 0.2 g/ml 농도의시료를처리하여배양한후 2, 7일뒤배양한 MC3T3- E1 cells을 PBS로 2회세척하고 1회냉동 / 해동 (freezing/ thawing) cycle 후 200 µl 0.1% Triton X-100를첨가하여완벽하게용해시켰다. 총 50 µl의세포용해물을 96 well plate 로옮기고, 150 µl pnpp를실온에서각 well에첨가하였다. ELISA reader로 405 nm의파장에서흡광도 (t =0) 를측정한후다시 30분후흡광도 (t =30) 를측정하였다. 30분후측정한흡광도값에서 0분에측정한흡광도값을뺀값을사용하였다. Bicinchoninic acid(bca) protein assay kit (Pierce, USA) 를사용하여전체단백질량과 ALP 농도를결정하여 ALP activity 값을계산하였다. 석회화결절형성측정. MC3T3-E1 cells을 6 well plate에각 well당 1 10 5 개씩분주하고, 분화유도배지 (50 μg/ml ascorbic acid, 10 mm β-glycerophosphate, 10 7 M dexamethasone이포함된 DMEM) 에각 0.2 g/ml 농도의시료를 첨가하여각 well 에투여하였다. 2 일마다시료를포함한새배지로교환하면서배양하였다. 배양후배지를제거하고 PBS 로가볍게세척한후 70% ethanol 을가하고 4 o C 에서 1 시간동안고정하였다. 세포를증류수로세척하고 40 mm alizarin red solution(ph 4.2)(Sigma-Aldrich) 으로실온에서 10 분간염색하였다. 비특이적인염색을줄이기위해증류수로 5 번세척한후 PBS 를가하고 15 분방치하였다. PBS 를제거한후 10%(w/v) cetylpyridinium chloride(sigma-aldrich) 를첨가한 10 mm sodium phosphate(ph 7.0) 용액을각 well 에첨가하고실온에서 15 분간반응시켜서얻은 alizarin red 추출액을 96-well plate 로옮기고 562 nm 에서흡광도를측정하였다. 동물실험. 본연구는전남대학교동물윤리위원회 (CNU- IACUC) 로부터과학성과윤리성에대한심사를거쳐승인 ( 승인번호 : CNU-YB-2016-40) 받아수행하였다. 실험에사용된 SD 랫 (10 주령, 수컷 ) 은 ( 주 ) 오리엔트바이오 (Korea) 로부터구입하였다. 물과사료를자유급식하도록하였다. 모든동물실험은 12 시간의조명주기 (08:00~20:00) 로 specified pathogen-free(spf) 상태에서온도 22±1 o C, 상대습도 50± 5% 의조건으로관리되는전남대학교청정실험동물센터 (CNU- Laboratory Animal Resources Center) 에서사육하였다. 본연구에서모든전신마취는 zoletil(30 mg/kg), rumpun(10 mg/kg) 을혼합하고근육주사하였다. 마취제주입후, 랫의두부에시야확보와무균적수술환경을위하여전기면도기를이용하여절개부위의털을제모하였다. Povidon-iodine 용액과 70% ethyl alcohol 으로살균하고수술부위를격리하였다. 2% lidocaine 으로국소마취한후랫의두개골의시상봉합선을따라정중부에절개를가하고골막기자를이용하여골막을거상하고박리하였다. 준비된 MC/XT-BGM 졸을처치할수있도록두개골을충분히노출시켰다. Trephine bur( 내경 5 mm) 를이용하여두개골시상봉합선에각 1 개의원형의홈을파서 MC/XT-BGM 졸시료를주입후 1 차로골막을봉합하고 2 차로표피를봉합하였다. 육안적관찰과 micro CT(Quantume GX Uct, Perkin Elmer, USA) 로촬영하였다. 마이크로 CT 촬영. 실험당일과 4 주후에 micro CT(Perkin Elmer) 를이용하여실험부위를촬영하였다. CT 촬영시관전압은 90 kv, 관전류는 88 μa 이었으며 1mm 알루미늄필터를사용하였고카메라화소크기는 12.56 μm 였다. 촬영시간은 2 분이소요되었다. CT-Vol 분석프로그램을이용하여분석하였다. 골결손부위의 3 차원적재건및분석에는 ASBMR 에기준하여분석하였다. 조직학적평가. 골결손부위의 4 주를경과한후실험동물은보건복지부고시제 88-9 호의실험동물관리지침서등에관한기준에명시된향정신성약의과잉투여에의한방법에따라 ethyl ether 를이용하여조직검사용실험동물을안락사시켰다. 희생시킨랫의두개관을절제하고절제해낸조직을 폴리머, 제 42 권제 2 호, 2018 년

골재생을위한이종골이함유된온도감응형하이드로젤 283 Figure 1. Temperature dependent changes of MC/XT-BGM sol-togel image. The sol state at 25 o C; the gel state at 37 o C. 10% formalin 에고정한후 5% nitric acid 에넣어탈회시킨후파라핀포매하였다. 이블록을 3μm 두께로결손부의중앙부에서관상면으로절단하여블록당 4 장의슬라이드를제작하였다. 이를 hematoxylin-eosin(h-e) 염색법으로염색하고, 광학현미경으로관찰하였다. 통계처리. 모든실험결과는평균값 (mean) 과표준편차 (standard deviation, SD) 로표시하였다. 대조군과실험군사이의통계학적유의성검정은 Student s t-test 로비교하였으며 p 가 0.05 이하인것과 0.01 이하인것만유의한것으로하였다. 결과및토론 이종골함유젤제조. 골재건시술시사용되는골이식재는 250-800 nm 크기이며골분말을결절부분에채워주는방식으로활용되고있다. 또한골이식재가점착력을가질수있도록환자의혈액이나혈소판응축액을넣어충분히적셔사용하도록되어있다. 본연구에서는골이식재의손쉬운활용을위해골이식재인 BGM 이함유된 MC/XT 수용액을제조하였다. 연구에사용된 MC/XT 수용액은생체내에주입했을때 1 일에서 7 일이경과되었을때졸 - 젤의팽윤이일어나며 2 주가경과되면부피가감소하고 30 일이되면분해되는것을이전연구를통해관찰하였다. 10 MC 와 XG 은 cellulose backbone 을가지고있으며 XG 의강한수분저장력 (strong water binding capacity) 은조성비율에따라 in vitro 와 in vivo 에서분해율과팽윤율에밀접한관계를나타낸연구결과가있다. 9 본연구에서제조한이종골함유졸 - 젤은 25 o C 에서는수용액상태로유지되다가 37 o C 에서하이드로젤상태로전환 Figure 2. FTIR spectra of the BGM (a); MC/XT gel (b); MC/XT- BGM gel (c) after freezing dry. 되는주사형온도감응형골이식재이다. Figure 1 은온도에따른 MC/XT-BGM 하이드로젤에졸 - 젤전이를나타낸는그래프이다. FTIR 분석. 실험에사용된우골에서단백질을제거한이종골이식재 BGM 은 3000-3570 cm -1 부근에서 OH stretching 흡수밴드를관찰하였다. 특히, 940~1120, 560~603 cm -1 에서 orthophosphate(po 4 ) 를관찰했다. 합성골에비해결정화도가낮은이종골의이식재는 1110 cm -1 영역에서 HPO 4 의비화학양론적은 hydroxyapatite 구조를관찰할수있었다. 11 Figure 2(b) 의분석결과 MC 와 XT 조성하이드로젤에서 3500 cm -1 부근에서 hydroxyl(-oh), 1000 cm -1 부근에서 ester(-coo-) 의존재를확인하였다. BGM 을함유시킨 MC/XT 하이드로젤에서각각의고유피크 BGM 의 OH stretching, orthophosphate (PO 4 ), HPO 4 와 MC/XT 젤의 hydroxyl(-oh), ester(-coo-) 흡수밴드를관찰할수있었다 (Figure 2(c)). 표면형태평가. 실험에사용된 BGM 과 MC/XT 및 MC/ XT-BGM 하이드로젤을동결건조하여표면을관찰하였다. BGM 의다공성미세구조를관찰할수있었다 (Figure 3(a)). 12 MC/XT 조성시료는얇은층이겹겹이쌓여있는것을관찰하였다. BGM 이첨가된 MC/XT 시료에서는 BGM 의입자가 MC/XT 조성하이드로젤내에잘혼합되어있는것을확인할수있었다 (Figure 3(c)). 원자력현미경분석. 표면의거칠기를확인하기위한분석법으로 MC/XT-BGM 하이드로젤의표면형태를관찰하기위해, AFM 을이용하여표면의형태, 표면고도, 표면거칠 Polymer(Korea), Vol. 42, No. 2, 2018

김 진 천서영 국민석 이창문 이기영 284 Figure 3. SEM images of the BGM (a); MC/XT gel (b); MC/XT-BGM gel (c) after freezing dry. Figure 4. AFM images of the BGM (a); MC/XT gel (b); MC/XT-BGM gel (c) after freezing dry. Table 1. The Morphological Characteristics of RZ and RMS Using AFM Measurement Samples Rz (nm) RMS (μm) BGM 774±32.5 54.05±5.3 MC/XT 537±12.26 8.445±2.3 MC/XT-BGM 413.6±9.78 33.26±1.2 Rz: Max. roughness profile height. RMS: Root mean square. 기를 분석하였다(Figure 4). 그 결과, 표면의 형태는 분말형 태의 BGM이 첨가됨에 따라 거칠기가 높아지는 것을 관찰 하였다. 표면고도는 BGM 774 nm, MC/XT은 537 nm이며 MC/XT-BGM 하이드로젤의 경우 413.6 nm의 값을 확인할 수 있었다. 표면거칠기(RMS)는 BGM 54.05 μm, MC/XT 하 이드로젤은 8.445 μm이며 MC/XT-BGM 하이드로젤의 경우 33.26 μm의 값을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 BGM의 나노에서 마이크로의 불균일한 크기의 입자가 표면 고도의 값을 높였고, MC/XT 조성의 수용액에 첨가시켜 제조한 MC/ XT-BGM 하이드로젤 표면 거칠기의 증가는 BGM이 수용액 젤 내에 함유되어 있음을 알 수 있었다(Table 1). XRD 분석. XRD 피크의 너비가 넓을수록 저결정성(low crystallinity)이며 좁을수록 고결정성(high crystallinity)을 나 타낸다. 소의 뼈에서 합성된 BGM의 XRD 회절피크는 hydroxyapatite 주 피크인 2θ값 (002), (211), (112), (300)에 폴리머, 제42권 제2호, 2018년 Figure 5. XRD patterns of the BGM (a); MC/XT gel (b); MC/XTBGM gel (c) after freezing dry. 서 주로 나타났다. BGM은 hydroxyapatite의 구성으로 높은 결정화도를 나타냈으며 높고 좁은 회절피크를 확인할 수 있 었다. MC/XT-BGM 하이드로젤 조성의 시료에서도 hydroxyapatite의 주 피크를 확인할 수 있었다(Figure 5).13

골재생을위한이종골이함유된온도감응형하이드로젤 285 Figure 6. Cell viability in vitro in the presence of MC/XT and MC/ XT-BGM solutions of different concentrations. 세포독성평가. 세포생존율측정은 MTT assay법으로측정하였다. 독성평가결과모든그룹에서 80% 가넘는세포생존율을확인할수있었다 (Figure 6). Aprilia 등의연구에서 xenograft, hydroxyapatite 그리고 hydroxyapatite-chitosan을처리한 osteoblastic cell line에서세포증식률을실험한결과고분자가결합된 hydroxyapatite-chitosan 그룹에서세포증식률이높게나타났다. 또한 hydroxyapatite는세포증식을증가시킬수있다는연구보고가있다. 14,15 ALP활성평가. 일반적인골조직에서는파골세포에의한골흡수과정과조골세포에의한새로운골의형성을위한무기질화과정중골형성에관여하는효소인 alkaline phosphatase(alp) 가활성화되면서무기질화 (mineralization) 과정이끊임없이반복적으로일어난다. 16 MC/XT-BGM 젤은시중에판매되고있는 lyoplant(bovin collagen) 막을처리한그룹보다더높은 ALP 활성값을확인하였다 (Figure 7). BGM은골전구세포들과신생혈관이수용부로부터이식재로침투해국소적인골형성을한다. 또한 MC는세포에서부착및증식성, 세포적합성이높아 hydroxypropyl methylcellulose(hpmc), carboxyl metylcellulose (CMC) 등이생체내에활용되고있다. 17,18 세포와접착력및세포에영양분이되는 MC/XT 젤은무기질화과정에영향을주는것을관찰하였다. 세포이종골이함유된 MC/XT- BGM 시료에서 2일에는 5.1±0.5(nmol/min/mg), 7일후에는 6.65±0.2(nmol/min/mg) 의값을확인하였다. 이결과는하이드로젤내에함유된 BGM이골모세포표현형 (phenotype) 발현을향상시키는데영향을주는것을알수있었다. 콜라겐또한골을형성하는세포에기능을가진활성물질임을확인할수있었다. 하지만, 콜라겐과 hydroxyapatite을혼합한연구에서콜라겐만처리한그룹보다 hydroxyapatite을함유 Figure 7. Analysis of alkaline phosphatase activity of cells on MC/ XT and MC/XT-BGM solutions. *p<0.01, **p<0.05 as compared with control and experiment. 시킨콜라겐처리그룹이 3 배이상 ALP 활성이높은것이보고되었다. 19,20 석회화결절형성측정. 석회화결절형성은조골세포의후기분화단계의 biomarker 로서 alizarin red S(ARS) 염색법을이용하여확인할수있으며, alizarin 은무기질화된세포기질의칼슘을염색하므로석회화결절을형성한정도와염색정도가비례한다. type I 콜라겐구조를가진 lyoplant 보다이종골이함유된 MC/XT BGM 그룹에서더높은석회화현상이관찰되었다 (Figure 8). MC/XT 조성의유기소재에서 BGM 은골재생결절의핵생성속도를가속화시킨다. 21 골재생을위한 Becker 등의연구에서 type I 콜라겐으로코팅된티타늄합금을처리한골아세포 (osteoblastic) 의증식의연구에서도콜라겐의종류에따라 osteoblastic 세포에세포부착과증식에영향을주지않는다는연구보고가발표되었다. 22 Micro-CT 평가. MC/XT BGM 하이드로젤을골결손부에처치후수술당일날과 4 주후 Micro-CT 로분석하였다. MC/ Polymer(Korea), Vol. 42, No. 2, 2018

286 김 진 천서영 국민석 이창문 이기영 Figure 10. Histologic observation of the MC/XT gel in rat calvarial defects: photograph of control group at 4 weeks (10 ) (a); photograph of MC/XT gel implanted group at 4 weeks (10 ) (b); photograph of MC/XT-BGM gel implanted group at 4 weeks (10 ) (c); NB: new bone; OB: old bone; CT (connective tissue), Arrow: wound edge. Figure 8. Effects of MC/XT and MC/XT-BGM solutions on bone mineralization in 3T3-E1 osteoblasts-like cell. *p<0.01, **p<0.05 as compared with control and experiment. XT-BGM 하이드로젤을 처치한 그룹에서의 BGM이 유동적 이지 않고 잘 고정되어 있는 것을 확인하였다(Figure 9(c)). 특히 세포 부착성과 세포 증식에 영향을 주는 MC가 골 결 손부에 잘 부착되어 있는 것을 관찰할 수 있었다.9 골 이식 재를 첨가하지 않은 군에서는 골 결손부를 확인할 수 있었 다(Figure 9(a), 9(b)). 체적 표현(volume rendering) 결과 골 이식재가 첨가되지 않은 그룹의 골 부피(bone volume)는 18.86±5.86 %이고, 이식재 함유 그룹에서는 61.46±13.53% 값이 산출되었다. Figure 9. Micro-CT evaluation of bone regeneration in the rat calvarial defects implanted with the non-treatment (a); MC/XT gel (b); MC/ XT-BGM gel (c) at 0 and 4 weeks post-implantation. Cross-sectional views of reconstructed images. 폴리머, 제42권 제2호, 2018년

골재생을위한이종골이함유된온도감응형하이드로젤 287 조직학적평가. 4 주후에대조군과실험군의조직학적평가를관찰하였다. 결손부의대부분은만성염증세포의침윤및혈관의증식이관찰되었다. 하지만, 아무것도처리하지않은대조군 Figure 10(a) 에서골이식재의지지를받지못한결손부는상부연조직형성이미비하며외관성오목한형태가관찰되었다. MC/XT 하이드로젤을처리한그룹에서도결손부의변연에대부분성긴결합조직이형성되었으며오목한형태를확인할수있었다 (Figure 10(b)). MC/XT-BGM 하이드로젤을처리한그룹에서는다른그룹과는확연하게결손부변연부에대부분결합조직및이식재를확인할수있었다 (Figure 10(c)). 또한 BGM 주변에골모세포들이관찰되었다. 골유도재생술때쓰이는차폐막의기능으로생체적합성, 세포차단성, 창상고정력, 그리고재생공간의유지능력이있어야한다. 23-25 MC/XT-BGM 하이드로젤은생체적합성, 재생공간의유지능력을가지고있는것을확인하였다. 또한 BGM 이골재생을증가시키는것을알수있었다. 온도감응형 MC/ XT 하이드로젤에 BGM 의다양한함유량에따른골재생연구가추가적으로필요할것으로사료된다. 결 본연구에서는골재생을유도하기위해 BGM 이함유된주사가가능한메틸셀룰로스 (methylcellulose, MC) 와잔탄검 (xanthan gum, XT) 으로구성된온도감응형하이드로젤을제조하였다. BGM 이함유된 MC/XT 수용액은 37 o C 에서젤로전이되는것을관찰하였고 BGM 은 MC/XT 하이드로젤에안정적으로분산되어있는것을확인하다. 특히, 조골세포를이용한실험에서 BGM 함유하이드로젤군이골형성에관여하는 alkaline phosphatase(alp) 활성도를증가시켰다. 석회화또한 BGM 함유하이드로젤군이더높은것을관찰하였다. 랫을이용한동물실험에서골이식재가담지된온도감응형하이드로젤에활용평가결과골재생관련의료용소재로활용가능함을확인할수있었으나예상보다는골형성량이부족함을관찰할수있었다. BGM 의함량에따른골재생연구가추가적으로필요로하며골결손부위와처치되는부위에따라다양한농도조절이가능하며손쉽게사용할수있어골재생및골결손부에폭넓게사용할수있을것으로기대된다. 감사의글 : 이논문은 2015 년도정부 ( 교육부 ) 의재원으로한국연구재단의지원을받아수행된기초연구사업임 (No. 2015H1C1A1035894), 2016 년도정부 ( 교육부 ) 의재원으로한국연구재단의지원을받아수행된기초연구사업임 (No. 2016R1A6A3A11935439). 론 참고문헌 1. D. L. Hoexter. J. Oral Implantol., 28, 290 (2002). 2. T. N. Vo, A. K. Ekenseair, F. K. Kasper, and A. G. Mikos, Biomacromolecules, 15, 132 (2014). 3. R. Namgung and W. J. Kim, Biomater. Res., 14, 86 (2010). 4. L. Klouda and A. G. Mikos, Eur. J. Pharm. Biopharm., 68, 34 (2008). 5. K. P. Vercruysse, D. M. Marecak, J. F. Marecek, and G. D. Prestwich, J. Bioconjug. Chem., 8, 686 (1997). 6. P. A. Ramires and E. Milella, J. Mater. Sci. Mater. Med., 13, 119 (2002). L. Lin, Macromolecules, 35, 5990 (2002). 7. S. Khan, M. Ul-Islam, M. W. Ullah, M. Ikram, F. Subhan, Y. Kim, J. H. Jang, S. Yoon, and J. K. Park, RCS Adv., 103, 84565 (2015). 8. Z. Liu and P. Yao, Carbohydr. Polym., 132, 490 (2015). 9. J. Kim, S. Y. Cheon, D. I. Shin, C. M. Lee, and K. Y. Lee, Polym. Korea, 41, 318 (2017). 10. S. E. Stabenfeldt, A. J. García, and M. C. LaPlaca, J Biomed. Mater. Res. A, 77, 718 (2006). 11. J. S. Cho, H. S. Kim, S. H. Um, and S. H. Rhee, J. Biomed. Mater. Res. B: Appl. Biomater., 101, 855 (2013). 12. F. D. P. D Desterro, M. S. Sader, G. D. D. A. Soares, and G. M. V. Jr, Braz. Dent. J., 25, 282 (2014). 13. A. Kasaj, B. Willershausen, C. Reichert, B. Röhrig, R. Smeets, and M. Schmidt, J. Oral Sci., 50, 279 (2008). 14. E. W. Bachtiar, B. M. Bachtiar, B. Abas, N. A. Harsas, N. F Sadaqah, and R. Aprilia, Dent. J., 43, 176 (2010). 15. H. J. Koo, E. H. Sohn, and S. C. Kang, Korean J. Plant Res., 26, 658 (2013). 16. X. Bourges, P. Weiss, G. Daculsi, and G. Legeay, Adv. Colloid Interface Sci., 299, 228 (2002). 17. C. H Chen, C. C. Tsai, W. Chen, F. L. Mi, H. F. Liang, S. C. Chen, and H. W. Sung, Biomacromolecules, 7, 736 (2006). 18. S. C. Rodrigues, C. Salgado, A. Sahu, M. P. Garcia, M. H. Fernandes, and F. Monteiro, J. Biomed. Mater. Res. A, 101A, 1080 (2013). 19. Y. Chen, Z. Huang, X. Li, S. Li, Z. Zhou, Y. Zhang, Q. L. Feng, and B. Yu, J. Nanomater., 2012, Article ID 401084 (2012). 20. S. W. Tsai, F. Y. Hsu, and P. L. Chen, Acta Biomater., 4, 1332 (2008). 21. O. Petrauskaite, P. D. S. Gomes, M. H. Fernandes, G. Juodzbalys, A. Stumbras, J. Maminskas, J. Liesiene, and M. Cicciù, Biomed. Res. Int., 2013, Article ID 452750 (2013). 22. D. Becker, U. Geißler, U. Hempel, S. Bierbaum, D. Scharnweber, H. Worch, and K. W. Wenzel1, J. Biomed. Mater. Res., 59, 516 (2001). 23. N. Donos, L. Kostopoulos, and T. Karring, Clin. Oral Impl. Res., 13, 175 (2002). 24. V. A. Thomas, D. L. Cochran, J. S. Hermann, R. K. Schenk, and D. Buser, Clin. Oral Impl. Res., 12, 260 (2001). Polymer(Korea), Vol. 42, No. 2, 2018