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국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 유상호세종대학교식품공학과 1. 서론 1.1 서론 급속한경제발전과서구화된식생활에따른고지방, 고칼로리식품의섭취로국민의건강관리에적신호가켜졌다. 이에따라, 인간에게이로운다양한생리활성을가진천연식물이기능성소재로서개발되고있으며이에대한투자도활발히이루어지고있다. 복분자 (Rubus corenus Miquel) 는장미과 (Rosaceae) 에속하는산딸기의일종으로우리나라를비롯한동아시아권에서오랫동안질병치료와예방목적으로사용되어왔다. 복분자내존재하는 phytophenolics 의일종인 anthocyanin 은항암, 항염, 항산화활성등이있는것으로보고되고있으나빛, 열에대한노출, ph변화등에상당히민감하여그저장안정성에문제가있어천연색소로서의개발잠재력이큼에도불구하고현실적으로산업적이용이어려운실정이다. 따라서, 다양한 glycosylated anthocyanin 구조확보를통한화학적, 물리적안정성간의상관관계를밝혀내는것은 anthocyanin 색소체의산업적응용을위한기초연구결과를확보하는데있어반드시수행되어야하는과제이다. 본연구에서는식품차원의연구분야의일환으로서국내자생하는복분자내색소체의분리, 정제및대량생산을통하여항산화활성능을평가하고, 다양한물리적처리조건하에서의구조적안정성탐색을실시하며화학적구조안정성증진방안을도출하여기능성식품소재의이용에대한기초자료를제공하고자한다. 225 유상호.indd 225 2010-04-16 오후 5:16:58

1.2 연구범위 복분자일반성분및유효성분분석 - 유리당, 유기산및유리아미노산분석 - 복분자내색소체의정성, 정량및구조동정 복분자내색소체의안정성관찰및안정성향상증진방안의강구 - 빛, 열등물리적조건변화에따른색소체안정성관찰 - Copigments 존재하의복분자내색소체안정성관찰 복분자내색소체의항산화활성평가 - 빛, 열등물리적조건변화에따른색소체항산화활성평가 1.3 연구기간 2008 년 12 월 1 일 2009 년 11 월 30 일 (1 년 ) 2. 분석방법 2.1 복분자시료전처리 복분자 200g + DW 1L 4 C 에서 24 시간용출 100 mesh 체를이용한과실제거 감압여과 용출액 1. 유리당분석 2. 유기산분석 3. 유리아미노산분석 C18 Sep-pak cartridge를이용한색소체정제 (Pre-purification step) Speed vacuum dryer로농축후색소체정량및분석 1. 색소체정량 2. 색소체 LC/MS 분석 그림 1 Preparation of bokbunja extract for analysis of major components. 226 유상호.indd 226 2010-04-16 오후 5:16:58

2.2 복분자유리당분석복분자시료를 0.45-µm syringe filter로여과시킨후표 1과같은조건에서 HPLC 에주입하여분석하였다. 표준물질은 fructose, glucose, galactose, arabinose, fucose, rhamnose, xylose(sigma-aldrich Chemical Co. M, USA) 를사용하였고각각에대한검량곡선을작성하여정량하였다. 표 1 Instrumentation and operating condition for HPAEC analysis of free sugars Instrument Dionex HPAEC system(dx 600, DINEX, Corp., Sunnyvale, CA, USA) Column Carbopac PA-1 column (4Φ 250 mm, DINEX) Eluent A 15 mm sodium hydroxide Eluent B 500 mm sodium hydroxide Detector Dionex ED50 electrochemical detector Injection vol. 10 µl Time (min) %B 0 0 Gradient 35 100 45 0 Flow rate 1 ml/min 2.3 복분자유기산분석 복분자시료를 0.45-µm syringe filter로여과시킨후표 2와같은조건에서 HPLC 에주입하여분석하였다. 표준물질은 oxalic acid, citric acid, formic acid, lactic acid, succinic acid, tartaric acid, malic acid (Sigma-Aldrich Chemical Co. M, USA) 를사용하였고각각에대한검량곡선을작성하여정량하였다. 표 2 Instrumentation and operating condition for HPAEC analysis of free organic acids Instrument Dionex HPAEC system (DX 600, DINEX, Corp., Sunnyvale, CA, USA) Column IonPac ICE-AS6 column (9Φ 250 mm, DINEX) Eluent 0.4 mm heptafluorobutyric acid Supressor 5 mm tetrabutylammonium hydroxide Injection vol. 20 µl Gradient Isocratic Flow rate 1.0 ml/min 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 227 유상호.indd 227 2010-04-16 오후 5:16:58

2.4 복분자유리아미노산분석 유리아미노산 PA(-phthalic dicarboxaldehyde) 유도체화방법 PA(-phthalic dicarboxaldehyde) 시약제조 PA Methanol 2-mercaptoethanol 0.4M sodium borate (ph 9.5) 10 mg 0.25 ml 10 µl 2.2 ml 0.45µm membrane filter 로여과 시료 5µL + PA 시약 5µL 0.1M sodium acetate(ph 7) 40µL 첨가 HPLC 에시료주입 그림 2 HPLC analysis procedure of free amino acids by PA (-phthalic dicarboxaldehyde) method. 유리아미노산 HPLC 분석그림 2의방법으로유도체화복분자시료를 0.45-µm membrane filter로여과시킨후표 3과같은조건에서 HPLC 에주입하여분석하였다. 표준물질은 21L-Amino acids puls Glycine(Sigma-Aldrich Chemical Co. M, USA) 을사용하였고검량곡선을작성하여정량하였다. 228 유상호.indd 228 2010-04-16 오후 5:16:59

표 3 Instrumentation and operating condition for HPLC analysis of free amino acids Instrument Dionex HPAEC system (DX 600, DINEX, Corp., Sunnyvale, CA, USA) Column Nova-pak C18 column (Waters Corp., Milford, MA, USA) Eluent A Potassium phosphate buffer (60 mm; ph 6.65) Eluent B Eluent A: methanol: 2-propanol: acetonitrile = 46:18:18:18 Injection vol. 20 μl Detection UVD 170U (338 nm, DINEX, USA) Time (min) %B 0 10 0.5 10 Gradient 2.5 10 15 45 27 100 28 10 30 10 Flow rate 1 ml/min 2.5 복분자색소체정제 극성이다른용매를이용한복분자내 anthocyanin 추출 파우더형태의건조된복분자 200g + 극성이다른용매 1L 4 C에서 1시간용출 100mesh 체를이용한과실제거 감압여과 C18 Sep-pak cartridge 를이용한색소체정제 (Pre-purification step) Speed vacuum dryer 로농축후색소체정량및분석 그림 3 Extraction procedure of colorant with different polarity solvents in bokbunja. 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 229 유상호.indd 229 2010-04-16 오후 5:16:59

C18 Sep-pak cartridge 를이용한복분자색소체정제 Methanol 10mL 로 cartridge 활성화 증류수 (DW) 10mL 로 cartridge 세정 복분자용출액 10mL 통과 0.01% HCI 10mL 로불순물제거 0.01% HCI 을함유한 methanol 5mL 로용출 Speed vacuum dryer 로농축후색소체정제및분석 그림 4 Separation procedure of bokbunja colorant by C18 Sep-pak cartridge (Waters, Milford, MA, USA). Recycling preparative HPLC 를이용한복분자내색소체정제 그림 3 과같은방법으로추출한복분자시료를표 4 와같은조건에서 HPLC 에주입하여다시정 제하였다. 표 4 Instrumentation and operating condition for HPLC analysis of bokbunja colorants Instrument Recycling preparative HPLC system (LC-9104, JAI, Japan) Column DS-AP (JAI, Japan) Eluent 0.1% TFA in DW : Acetonitrile = 83 : 17 (v/v) Gradient Isocratic Detector JAI UVD detector (520nm) Injection vol. 5 ml Flow (ml/min) 5 ml/min 2.6 복분자내색소체정량 HPLC 를이용한복분자내색소체정량 그림 3 의방법으로각각의극성이다른용매를이용하여추출한복분자색소체시료를 0.45-μm membrane filter 로여과시킨후표 5 와같은조건에서 HPLC 에주입하여분석하였다. 230 유상호.indd 230 2010-04-16 오후 5:17:00

표 5 Instrumentation and operating condition for HPLC analysis of bokbunja colorants Instrument Summit Dionex HPLC system (DINEX, USA) Column Xterra TM (4.6 cm 250 mm, Waters, Ireland) Eluent A 0.1% Trifluoroacetic acid (TFA) Eluent B Acetonitrile : 0.1% TFA in H 2 = 1 : 1 (v/v) UV detector UVD 170U (DINEX, USA) Detection range 520 nm Injection vol. 20 μl Time (min) % B 0 20 Gradient 10 24 50 40 65 20 75 20 Flow rate 0.8 ml/min 2.7 복분자내색소체 LC/MS 분석 Recycling preparative HPLC 를이용하여각각정제분리된파우더형태의 anthocyanins 를 DW 에희 석하여 0.45 μm membrane filter 로여과시킨후표 6 과같은조건에서 LC/MS 에주입하여분석하 였다. 표 6 Instrumentation and operating condition for HPLC analysis of bokbunja colorants Instrument Agilent 1100 series LC/MSD (Agilent Tech, Palo Alto, CA, USA) Column Xterra TM (4.6 cm 250 mm, Waters, Ireland) Eluent A 0.1% Trifluoroacetic acid (TFA) Eluent B Acetonitrile : 0.1% TFA in H 2 = 1 : 1 (v/v) Detection UVD, Agilent technologies, USA (520 nm) Injection vol. 10 μl Time (min) Flow (ml/min) %B 0 0.6 20 Gradient 5 0.6 24 50 0.6 40 65 0.6 20 75 0.6 20 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 231 유상호.indd 231 2010-04-16 오후 5:17:00

2.8 HPTLC 방법을이용한 anthocyanins 의구성당분석 정제된 anthocyanin 의산 가수분해 정제된파우더형태의색소체를 DW 에희석 위의희석액 1mL + 4M TFA 1mL 를 Reactivial 에서 mixing Vacuum pump 로 degassing 한후 30 분동안상온에방치 Heating block 에서 121 C 에서 2 시간반응 상온에서 cooling 후 speed vacuum dryer 를이용 TFA 제거 파우더형태의시료를 DW 0.5mL 에희석하여사용 그림 5 Acid hydrolysis procedure of the purified anthocyanins. 산 가수분해물을이용한 HPTLC 분석그림 5의방법으로산 가수분해시킨복분자시료는다시희석하여그림 6의단계로분석하였다. 표준물질로는 fructose, glucose, galactose, xylose, rhamnose(sigma-aldrich chemical Co. M, USA) 를사용하였다. 232 유상호.indd 232 2010-04-16 오후 5:17:00

Si 5000 HPTLC 플레이트 (10 20cm, Merck, Germany) 를 110 C 오븐에서 1 시간동안활성화함 산 가수분해물 3µL를일정한간격을두고 Si 5000 HPTLC 플레이트에로딩후상온에서 10분건조전개용매 : n-propanol : water : triethylamine : 30% NH3 (80 : 20 : 0.2 : 4, v/v/v/v) TLC chamber에서전개용매로로딩한 Si 5000 HPTLC 플레이트를전개후상온에서 1시간방치발색시약 : N-(1-naphyl) ethyleneamine : sulfuric acid : methanol (0.3 : 5 : 95, v/v/v) 발색시약을도포한후 121 C 오븐에서 10분간발색 그림 6 HPTLC procedure of the purified anthocyanins. 2.9 복분자색소체의안정성관찰및안정성향상증진방안의연구빛에대한안정성실험 1) Sample preparation 복분자색소체용액 : 복분자에서정제한각각의 anthocyanin 을 0.01% HCl에녹여최종농도를 0.01mM 로제조하였다. 대조구용액 : 표준물질인 cyanidin chloride(extrasynthèse, Genay France) 와 Cyanidin-3- -glucoside 를 0.01% HCl에녹여최종농도를 0.01mM 로제조하였다. 2) 빛에대한안정성측정을위해색소의파괴정도를분석하였다. 복분자색소체용액과대조구용액을암실에서형광, 자외선조건에보관하면서 2, 6, 12, 24, 48, 72, 120, 168 시간마다 UV/VIS scanning spectrophotometer(du 730, Beckman Coulter, Inc., USA) 를이용하여 520nm 에서흡광도를측정하였다. 열에대한안정성실험 1) Sample preparation 복분자색소체용액 : 복분자에서정제한각각의 anthocyanin 을 0.01% HCl에녹여최종농도를 0.01mM 로제조하였다. 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 233 유상호.indd 233 2010-04-16 오후 5:17:00

대조구용액 : 표준물질인 cyanidin chloride(extrasynthèse, Genay France) 와 Cyanidin-3--glucoside 를 0.01% HCl 에녹여최종농도를 0.01mM 로제조하였다. 2) 열에대한안정성측정을위해색소의파괴정도를분석하였다. 복분자색소체용액과대조구용액을 4 C, 25 C, 80 C 조건에서보관하면서 2, 6, 12, 24, 48, 72, 120, 168 시간마다 UV/VIS scanning spectrophotometer(du 730, Beckman Coulter, Inc., USA) 를이용하여 520nm 에서흡광도를측정하였다. 3) 빛에의한영향을제거하기위하여빛이없는암소조건하에실험을진행하였다. 2.10 저장기간에따른복분자색소체의항산화능관찰 1) Sample preparation 복분자색소체용액 : 복분자에서정제한각각의 anthocyanin 을 0.01% HCl에녹여최종농도를 0.01mM 로제조하였다. 대조구용액 : 표준물질인 cyanidin chloride(extrasynthèse, Genay France) 와 Cyanidin-3--glucoside 를 0.01% HCl에녹여최종농도를 0.01mM 로제조하였다. 2) 다양한빛의조건과저장온도조건을달리하여각각의항산화능을측정하기위해 DPPH(α, α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) radical 을이용한항산화활성을측정하였다. 복분자색소체용액과대조구용액을 2, 6, 12, 24, 48, 72, 120, 168 시간마다 UV/VIS scanning spectrophotometer(du 730, Beckman Coulter, Inc., USA) 를이용하여 517nm 에서흡광도를측정하였다. 물리적처리조건에따른 anthocyanin 용액 0.1mL + DPPH 용액 2.9mL 암실에서 30 분간반응 517nm 에서흡광도측정 측정방법 : (Control 의흡광도 - 시료의흡광도 ) 100 그림 7 The procedure of DPPH radical scavenging Assay. 234 유상호.indd 234 2010-04-16 오후 5:17:01

3. 결과및고찰 3.1 복분자유리당분석 복분자추출액의유리당성분을 HPLC로분석한결과는그림 8~9, 표 7과같다. 복분자의유리당으로는 glucose와 fructose가검출되었다. 복분자의유리당주성분으로나타난 glucose와 fructose의각각유리당함량은 glucose 387.5±3.5mg/100g, fructose 521.5±7.9mg/100g 범위이고, fructose 의검출된양이 glucose 보다많았다. 45.0 nc 1 30.0 2 20.0 10.0 3 4 5 6 7 0.0-10.0 min 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 그림 8 HPAEC separation profile of free sugar standards. 1. fucose, 2. rhamnose, 3. arabinose, 4. galactose, 5. glucose, 6. xylose, 7. fructose. 50.0 nc 40.0 30.0 20.0 10.0 5 7-2.0 min 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 그림 9 HPAEC separation profile of free sugar of bokbunja water extract. 5. glucose, 7. fructose. 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 235 유상호.indd 235 2010-04-16 오후 5:17:01

표 7 Released amount of free sugars in water extract of bokbunja Name Average STDEV mg/100 g Glucose 387.5 3.5 387.5±3.5 Fructose 521.5 7.9 521.5±7.9 3.2 복분자유기산분석 복분자추출액의유기산성분을 HPLC로분석한결과는그림 10, 그림 11, 표 10과같다. 복분자의유기산으로는 oxalic acid와 citric acid가검출되었다. 복분자의유기산주성분으로나타난 oxalic acid와 citric acid의각각유기산함량은 oxalic acid 154.7±0.3mg/100g, citric acid 1818.7± 8mg/100g 범위이고, citric acid의양이 oxalic acid의검출량보다월등히많았다. 본연구에서 tartaric acid를내부표준물질로첨가하여 spiking 분석을한결과, 그림 11 에서보이는피크 1과 3 사이의미지의피크는 tartaric acid가아닌것으로판단되었다. 10.0 #14 [modified by user, 1peak manually assigned] µs 8.0 1 6.0 2 3 4 5 4.0 2.0 6 7-1.0 min 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 그림 10 HPAEC separation profile of organic acid standards. 1. oxalic acid, 2. tartaric acid, 3. citric acid, 4. malic acid, 5. formic acid, 6. lactic acid, 7. succinic acid. 236 유상호.indd 236 2010-04-16 오후 5:17:01

25.0 µs 20.0 3 15.0 10.0 5.0 1 0.0-5.0 min 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 그림 11 HPAEC separation profile of oragnic acids of bokbunja water extract. 1. oxalic acid, 3. citric acid. 표 10 Released amount of free organic acids in water extract of bokbunja Name Average STDEV mg/100 g xalic acid 154.7 0.3 154.7±0.3 Citric acid 1818.7 8 1818.7±8 3.3 복분자유리아미노산분석 복분자시료의유리아미노산을 HPLC 로분석한결과는그림 12, 그림 13, 표 11 과같다. 확인된 16종의유리아미노산중 threonine 이 32.2±1.6mg/100g, GABA가 20.1±3.4mg/100g, serine 이 20.0± 1.5mg/100g 의함량순으로높게나타나아미노산주성분으로확인되었다. 특히, 분석결과복분자시료안에 GABA의함량이상당량검출되었는데, GABA는중추신경계의억제성신경전달물질로작용하며, 혈압상승억제, 신경안정효과가있는것으로알려져있다. 그외에검출된유리아미노산성분중 arginine, leucine, phenylalanine 등은모두쓴맛을내는성분으로보고되었고, serine, glycine, alanine 은단맛을내고, methionine 은쓴맛과단맛을동시에내는아미노산성분이다. 복분자의색소체와폴리페놀류와더불어기능성소재로서의이용가능성을제시할수있을것으로판단된다. 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 237 유상호.indd 237 2010-04-16 오후 5:17:02

200 mau WML : 338 nm 150 100 12 50 1 2 3 4 5 6 78 9 10 11 14 15 13 16-2 min 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 그림 12 HPLC separation profile of free amino acid standards. 1. Aspartic acid (Asp), 2. Glutamic acid (Glu), 3. Asparagine (Asn), 4. Serine (Ser), 5. Histidine + Glycine (His+Gln), 6. Arginine (Arg), 7. Glycine (Gly), 8. Alanine (Ala), 9. Threonine (Thr), 10. Gama amino butyric acid (GABA), 11. Metionine (Met), 12. Tryptophan + Valnine (Trp+Val), 13. Phenylalanine (Phe), 14. Isoleucine (Ile), 15. Leucine (Leu), 16. Lysine (Lys). 200 mau WML : 338 nm 150 100 50 3 4 5 2 6 7 8 1 11 12 131415 16-2 min 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 그림 13 HPLC separation profile of free amino acid of bokbunja extract. 1. Asn, 2. Glu, 3. Asn, 4. Ser, 5. His+Gln, 6. Arg, 7. Gly, 8. Ala, 9. Thr, 10. GABA, 11. Met, 12. Trp+Val, 13. Phe, 14. Ile, 15. Leu, 16. Lys. 9 10 238 유상호.indd 238 2010-04-16 오후 5:17:02

표 11 Released amount of free amino acids in water extract of bokbunja mg/100 g, fresh weight basis Average STDEV 1 Asp 0.8 0.2 2 Glu 4.5 0.5 3 Asn 11.1 1.2 4 Ser 20.0 1.5 5 His+Gln 26.9 1.6 6 Arg 7.8 0.1 7 Gly 1.7 0.3 8 Ala 2.5 0.3 9 Thr 32.2 1.6 10 GABA 20.1 3.4 11 Met 0.3 0.0 12 Trp+Val 1.3 0.3 13 Phe 0.4 0.2 14 Ile 1.1 0.2 15 Leu 1.9 0.2 16 Lys 1.3 0.0 3.4 복분자내색소체정제 Recycling preparative HPLC 를이용한복분자색소체정제복분자내색소체정제결과 Peak 1, 2, 3, 4는각각전체양의 20, 12.4, 66.9, 0.7% 에해당되는양을가지고있으며 Recycling preparative HPLC 를이용하여각각의피크를고순도로정제하였다. 정제한 anthocyanins 는 Speed vacuum dryer를이용하여유기용매를제거후, 동결건조를통하여분말형태로제조하였다. 분말형태로제조된 anthocyanins 를이용하여 LC/MS, HPTLC 분석을실시하였다. 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 239 유상호.indd 239 2010-04-16 오후 5:17:02

800 mau WML : 520 nm 625 3 500 1 375 250 125 2-20 min 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 그림 14 HPLC separation profile of bokbunja colorants at 517 nm. 1. cyanidin-3--xylosylrutinoside, 2. cyanidin-3--sambubioside, 3. cyanidin-3--rutinoside, 4. pelargonidin-3--rutinoside. 4 3.5 복분자색소체정량추출용매별복분자색소체정량극성이다른용매로추출한복분자내색소체를 HPLC 로정량한결과는그림 15~19, 표 12~16 과같다. 0.01% HCl-acidified 100% MeH 을이용한추출에서 1.21g/100g 의 anthocyanin이추출되었다. 또한, 산성조건 (0.01% HCl) 에서 cyanidin 유래 anthocyanins는비교적비극성용매추출에서용출이잘된다고판단되며, pelargonidn-3--rutinoside 는극성용매추출에서비교적용출이잘된다고판단되고이는 anthocyanin 의 core structure 에따라다른패턴의 optimal extraction polarity 를갖는경향이있는것으로판단된다. 240 유상호.indd 240 2010-04-16 오후 5:17:02

mg/100g 800 700 600 500 400 300 200 100 0.01% HCI-MeH MeH 0.01% HCI-EtH EtH 0 0 20 40 60 80 100 The concentration of alcohols (%) in water 그림 15 Extraction yield comparison of cyanidin-3--xylosylrutinoside with different polarity solvents. 표 12 The extraction yield of cyanidin-3--xylosylrutinoside with different polarity solvents Solv. Yield (mg/100g of dried fruit) Conc. 0.01% HCl-MeH MeH 0.01% HCl-EtH EtH 0% 106.7+0.3 54.8+11.5 106.7+0.3 54.8+11.5 20% 334.8+1.5 310.1+4.2 133.5+1.2 102.4+6. 40% 244+3.9 220+2.5 97.5+0.7 338.4+1 60% 235.2+3.7 146+2.6 171.4+3.5 189.7+1.9 80% 178.7+3.4 258.2+5.4 253.3+15.6 236.2+27 100% 358.7+1.5 297.9+27.7 46.7+1.8 302+7.8 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 241 유상호.indd 241 2010-04-16 오후 5:17:03

mg/100g 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 0.01% HCI-MeH MeH 0.01% HCI-EtH EtH The concentration of alcohols and acidified alcohols (%) in water 그림 16 Extraction yield comparison of cyanidin-3--sambubioside with different polarity solvents. 표 13 The extraction yield of cyanidin-3--sambubioside with different polarity solvents Solv. Yield (mg/100g of dried fruit) Conc. 0.01% HCl-MeH MeH 0.01% HCl-EtH EtH 0% 11.1+0.1 5.8+1.1 11.1+0.1 5.8+1.1 20% 51.7+2.3 49.2+0.4 20.3+0.1 44+1.5 40% 51.5+2.4 49.5+1.1 21.4+0.7 52.8+3.6 60% 55.3+0.7 38+0.1 17.8+0.7 46.8+0.9 80% 45.2+0.4 64.7+2.9 87+2.1 80.7+2.6 100% 83.7+1.11 77.3+4.2 46.7+1.7 38.7+2.6 242 유상호.indd 242 2010-04-16 오후 5:17:03

mg/100g 800 700 600 500 400 300 200 100 0.01% HCI-MeH MeH 0.01% HCI-EtH EtH 0 0 20 40 60 80 100 The concentration of alcohols and acidified alcohols(%) in water 그림 17 Extraction yield comparison of cyanidin-3--rutinoside with different polarity solvents. 표 14 The extraction yield of cyanidin-3--rutinoside with different polarity solvents Solv. Yield (mg/100g of dried fruit) Conc. 0.01% HCl-MeH MeH 0.01% HCl-EtH EtH 0% 72.8+0.8 49.4+12.3 72.8+0.8 49.4+12.3 20% 568.7+7.4 444.1+9 219+2.5 395.9+14.6 40% 539.8+4.4 550.4+7 225+0.6 552.6+1.1 60% 621.8+11.9 437.7+4.2 385.4+3.8 511.1+14.7 80% 546.2+3.5 644.8+3.9 562.8+10.1 650.7+3.9 100% 765.1+6.2 685.2+34.5 61+3.1 106.3+2.8 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 243 유상호.indd 243 2010-04-16 오후 5:17:03

mg/100g 20 15 10 0.01% HCI-MeH MeH 0.01% HCI-EtH EtH 5 0 0 20 40 60 80 100 The concentration of alcohols and acidified alcohols (%) in water 그림 18 Extraction yield comparison of pelargonidin-3--rutinoside with different polarity solvents. 표 15 The extraction yield of pelargonidin-3--rutinoside with different polarity solvents Solv. Yield (mg/100g of dried fruit) Conc. 0.01% HCl-MeH MeH 0.01% HCl-EtH EtH 0% 7.1+0.1 5.8+1.1 11.1+0.1 5.8+1.1 20% 4.6+0.1 4+0.3 1.9+0.2 3.8+0.1 40% 3.6+0.6 3.58+0.3 1.3+0.1 3.8+0.6 60% 3.7+0.5 2.5+0.1 2.1+0.2 4+0.2 80% 3+0.5 3.8+0.8 4.3+0.3 5.2+0.9 100% 5.4+0.3 4.8+0.6 0.7+0.1 1.3+0.1 244 유상호.indd 244 2010-04-16 오후 5:17:03

mg/100g 1400 1200 1000 800 600 0.01% HCI-MeH MeH 0.01% HCI-EtH EtH 400 200 0 0 20 40 60 80 100 The concentration of alcohols acidified alcohols (%) in water 그림 19 Extraction yield comparison of total anthocyanins with different polarity solvents. 표 16 The extraction yield of total anthocyanins with different polarity solvents Solv. Yield (mg/100g of dried fruit) Conc. 0.01% HCl-MeH MeH 0.01% HCl-EtH EtH 0% 197.7±0.3 115.8±0.04 197.7±0.7 115.8±0.04 20% 959.8±1.5 807.3±2.3 374.7±7.3 546.2±0.1 40% 838.9±3.9 823.4±2.4 345.2±4.1 947.5±0.6 60% 916±3.66 624.2±0.67 576.8±7.8 751.5±0.53 80% 773.2±3.3 971.5±0.4 907.3±3.5 972.8±0.45 100% 1212.9±1.4 1065.1±1.1 155±6.2 448.3±0.3 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 245 유상호.indd 245 2010-04-16 오후 5:17:04

3.6 복분자색소체 LC/MS 분석 Relative Intensity (%) 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 200 727.3 727.3 287.3 727.3 400 600 800 A B C 1,000 Mass per charge ratio (M/Z) 그림 20 ESI mass spectra of bokbunja anthocyanin peak-1 after purification. The MS fragmentor voltages are (A) 75, (B) 125, and (C) 180 ev. H H CH 3 H H H H H H H H H Xylosylrutinoside H H H H H Cyanidin 그림 21 Fragmentaion mechanism of cyanidin-3--xylosylrutinoside. 246 유상호.indd 246 2010-04-16 오후 5:17:04

Relative Intensity (%) 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 200 581.4 581.4 287.3 400 600 800 A B C 1,000 Mass per charge ratio (M/Z) 그림 22 ESI mass spectra of bokbunja anthocyanin peak-2 after purification. The MS fragmentor voltages are (A) 75, (B) 125, and (C) 180 ev. H H H H H H H H H H H Sambubioside H H H H H Cyanidin 그림 23 Fragmentaion mechanism of cyanidin-3--sambubioside. 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 247 유상호.indd 247 2010-04-16 오후 5:17:05

Relative Intensity (%) 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 200 595.2 595.2 287.3 287.3 400 600 800 A B C 1,000 Mass per charge ratio (M/Z) 그림 24 ESI mass spectra of bokbunja anthocyanin peak-3 after purification. The MS fragmentor voltages are (A) 75, (B) 125, and (C) 180 ev. H H H H CH 3 H H H H H H Rutinoside H H H H H Cyanidin 그림 25 Fragmentaion mechanism of cyanidin-3--rutinoside. 248 유상호.indd 248 2010-04-16 오후 5:17:05

Relative Intensity (%) 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 200 579.4 271.2 579.4 271.2 400 600 800 A B C 1,000 Mass per charge ratio (M/Z) 그림 26 ESI mass spectra of bokbunja anthocyanin peak-4 after purification. The MS fragmentor voltages are (A) 75, (B) 125, and (C) 180 ev. H H H CH 3 H H H H H H Rutinoside H H H H Pelargonidin 그림 27 Fragmentaion mechanism of pelargonidin-3--rutinoside. 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 249 유상호.indd 249 2010-04-16 오후 5:17:06

정제된복분자내색소체 LC/MS 결과 4개색소체의 mass-to-charge ratio(m/z) 는 727, 581, 595, 579 로나타났으며, 이는각각 cyanidin-3--xylosylrutinoside, cyanidin-3--sambubioside, cyanidin-3- -rutinoside, pelargonidin-3--rutinoside 로확인되었다. fragmentor voltage값이커져감이따라 anthocyanin 을구성하는당잔기가잘려나가면서비배당체인 cyanidin(m/z= 287), pelargonidin(m/ z= 271) 이생성됨을확인하였고당과당사이의결합이 core structure 와당의결합보다더단단하게결합되어있음을확인할수있었다. 3.7 복분자내 anthocyanin 의구성당분석 HPTLC 분석결과 Peak-1(cyanidin-3--xylosylrutinoside) 은 cyanidin 구조에 glucose, xylose, rhamnose 가, peak-2(cyanidin-3--sambubioside) 는 cyanidin 구조에 glucose, xylose 가, peak-3(cyanidin- 3--rutinoside) 은 cyanidin 구조에 glucose, rhamnose가, peak-4(pelargonidin-3--rutinoside) 는 pelargonidin 구조에 glucose, rhamnose 가결합되어있는형태인것을확인하였다. Rhamnose Fructose Xylose Glucose Galactose 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 그림 28 Sugar composition analysis of the purified colorants by HPTLC. Lane 1, 10, Monosaccharides standard; 2, 4, 6, 8, Purified fraction of peak 1, 2, 3 and 4; 3, 5, 7, 9, Acid hydrolyzate of peak 1, 2, 3 and 4 respectively. 250 유상호.indd 250 2010-04-16 오후 5:17:06

3.8 복분자색소체의안정성관찰및안정성향상증진방안의연구빛에대한안정성실험 1) 암실암실조건에서 cyanidin 은저장 2시간내에색소파괴가 67.1% 진행되었다. 당이결합되지않은비배당체인 cyanidin 의색소안정성은좋지않은반면, 당이결합된배당체인 cyanidin-3--glucoside, cyanidin-3--sambubioside, cyanidin-3--rutinoside, cyanidin-3--xylrosylrutinoside 는저장 7일째에도색소잔존율이각각 89.5, 93.7, 93.9, 94.7% 이상으로유지되어당의결합으로색소체의안정성이증진되는것으로보였다. 반면결합된당의개수가증가함에따라색소체의안정성이증가하는경향을보였으나본실험조건에서는명확하게판단하기어려웠다. 1.2 1.0 abs (at 520 nm) 0.8 0.6 0.4 cyanidin cyanidin-3--glucoside cyanidin-3--sambubioside cyanidin-3--rutinoside cyanidin-3--xylrosylrutinoside 0.2 0.0 02 6 12 24 48 72 120 168 Storage Time (hr) 그림 29 Light effect on color degradation of anthocyanins under the dark during storage. 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 251 유상호.indd 251 2010-04-16 오후 5:17:06

2) 형광형광조건에서 cyanidin 은저장 2시간내에색소파괴율이 70.1% 진행되었고저장 7일째에는색소의 99.7% 가파괴되어색소잔존율이 0.3% 에불과하였다. 이는암소조건에서보다색소의파괴가더많이이루어진결과이다. 당이 1개결합된 cyanidin-3--glucoside 의경우에는저장 7일이후색소잔존율이 81.7% 이었고, 당이 2개결합된 cyanidin-3--sambubioside 와 cyanidin-3--rutinoside 의경우에는저장 7일째색소잔존율이각각 91.9% 와 91.4%, 당이 3개결합된 cyanidin-3-xylrosylrutinoside 의경우에는저장 7일째에색소잔존율이 94.8% 으로배당체간에도당의결합수가증가함에따라색소안정성이더우수하였다. 1.2 1.0 0.8 abs (at 520 nm) 0.6 0.4 0.2 cyanidin cyanidin-3--glucoside cyanidin-3--sambubioside cyanidin-3--rutinoside cyanidin-3--xylrosylrutinoside 0.0 02 6 12 24 48 72 120 168 Storage Time (hr) 그림 30 Light effect on color degradation of anthocyanins under the fluorescent light during storage. 252 유상호.indd 252 2010-04-16 오후 5:17:07

3) UV UV 조건에서 cyanidin 은저장 2시간내에색소파괴율이 77.3% 진행되었고저장 48시간째에는색소파괴율이 98.6% 진행되어색소잔존율이 1.4% 에불과했다. 암소조건에서 cyanidin 의경우저장 48시간째색소잔존율이 10.17% 였고, 형광조건에서는 6.12% 였었던것에비해 UV 조건에서는 1.4% 로 UV조건이색소체의안정성에가장부정적인영향을미치는것으로나타났다. Cyanidin-3- -glucoside, cyanidin-3--sambubioside, cyanidin-3--rutinoside, cyanidin-3--xylrosylrutinoside 는저장 7일째에색소잔존율이각각 52.9, 65.8, 67.7, 77.6% 이었고배당체간당의결합수가증가할수록안정함이증가하였지만, 암소조건과형광조건에비해 UV 조건일때색소잔존율이현저히낮았다. 비배당체와배당체사이의안정성상관관계를살펴보면당이결합된배당체가더욱더안정함을알수있었으며, 배당체간에도당의결합수가증가함에따라더욱안정함을알수있었다. 빛에대한안정성은암실조건이가장효과적인것으로나타났다. 1.2 1.0 0.8 cyanidin cyanidin-3--glucoside cyanidin-3--sambubioside cyanidin-3--rutinoside cyanidin-3--xylrosylrutinoside abs (at 520 nm) 0.6 0.4 0.2 0.0 02 6 12 24 48 72 120 168 Storage Time (hr) 그림 31 Light effect of color degradation of anthocyanins under the UV light during storage. 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 253 유상호.indd 253 2010-04-16 오후 5:17:07

열에대한안정성 1) 4 C 4 저장의경우, cyanidin에서는저장 2시간만에색소가 54.13% 파괴되지만, cyanidin-3-glucoside, cyanidin-3--sambubioside, cyanidin-3--rutinoside, cyanidin-3--xylrosylrutinoside 의배당체들은저장 7일째에도각각 94.3, 93.9, 94.0, 95.1% 색소잔존율을보여주었다. 4 에서의색소안정성은비배당체보다배당체가더욱더안정하였고, 배당체들간의유의적차이는발견되지않았다. 특히배당체구조는 7일째에도색소안정성이매우우수한것으로판단되어 7일이후저장기간동안의안정성평가수행이필요하다고판단되었다. 1.2 1.0 abs (at 520 nm) 0.8 0.6 0.4 cyanidin cyanidin-3--glucoside cyanidin-3--sambubioside cyanidin-3--rutinoside cyanidin-3--xylrosylrutinoside 0.2 0.0 02 6 12 24 48 72 120 168 Storage Time (hr) 그림 32 Thermal effect on color degradation of anthocyanins at 4 C during storage. 254 유상호.indd 254 2010-04-16 오후 5:17:07

2) 25 C 25 저장의경우, cyanidin 은저장 2시간만에색소파괴율이 67% 진행되어, 4 에서보다색소파괴가더많이진행되었다. Cyanidin-3--glucoside 는저장 48시간이후부터색소파괴율이증가하여저장 7일째에는색소잔존율이 79% 로떨어진반면, cyanidin-3--sambubioside, cyanidin-3-rutinoside, cyanidin-3--xylrosylrutinoside 의경우에는반응 7일째에도색소잔존율이각각 95.1, 95.9, 94.5% 수준으로유지되었다. 결합된당의개수가 2개이상인배당체가당이 1개결합된배당체보다색안정성에있어온도에의한영향을덜받는것으로나타났다. cyanidin-3--rutinoside, cyanidin-3--xylrosylrutinoside 의경우, 4 와 25 에따른색소잔존율의차이를보이지않았지만, cyanidin 과 cyanidin-3--glucoside 의경우에는 25 보다 4 보관조건이색소안정성에더유리하였다. 1.2 1.0 abs (at 520 nm) 0.8 0.6 0.4 cyanidin cyanidin-3--glucoside cyanidin-3--sambubioside cyanidin-3--rutinoside cyanidin-3--xylrosylrutinoside 0.2 0.0 02 6 12 24 48 72 120 168 Storage Time (hr) 그림 33 Thermal effect on color degradation of anthocyanins at 25 C during storage. 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 255 유상호.indd 255 2010-04-16 오후 5:17:07

3) 80 C 80 저장조건에서 cyanidin 은저장 2시간만에색소파괴율이 89% 진행되었고, 다른온도조건에서보다가장색소안정성이떨어졌다. 저장 6시간이후는적색색소가거의소실되어육안으로도거의색을확인할수없었다. Cyanidin-3--glucoside, cyanidin-3--sambubioside, cyanidin-3-rutinoside 는저장 6시간경과후까지색소잔존율이 50% 이상되었고, 12시간까지는색이소량존재하다가, 저장 24시간이전에적색의색소가소실되었다. 반면결합된당의개수가가장많은 cyanidin-3--xylrosylrutinoside 는저장 24시간까지색소잔존율이 40.8% 수준으로시험구중가장색소안정성이우수하였고, 48시간까지육안으로색을확인할수있었다. 하지만, 저장기간 7 일이전에색소체의적색의색소가거의소실되었다. 1.2 1.0 0.8 abs (at 520 nm) 0.6 0.4 0.2 cyanidin cyanidin-3--glucoside cyanidin-3--sambubioside cyanidin-3--rutinoside cyanidin-3--xylrosylrutinoside 0.0-0.2 02 6 12 24 48 72 120 168 Storage Time (hr) 그림 34 Thermal effect on color degradation of anthocyanins at 80 C during storage. Copigments 존재하의복분자색소체안정성관찰빛과열의물리적조건을달리하여색소체안정성평가를실시한결과, 복분자내색소체는빛이차단된암소조건에서색소안정성이우수하였고배당체들간에도당의결합이많을수록색소안정성에대한저장온도의영향을덜받았다. 4, 25 조건일때, 당의결합이많을수록, 안정성이우수하였다. 색소체의안정성을향상시킬수있는방안으로 copigments 존재하에서색소체의안정성평가를암소보관, 25 조건에서실시하였다. 256 유상호.indd 256 2010-04-16 오후 5:17:08

1) Ascorbic acid Cyanidin 은 ascorbic acid의첨가에상관없이급속한색소파괴율을보였고, 당이결합된배당체경우에도 ascorbic acid에의한 copigmentation 효과는나타나지않은것으로판단된다 ( 표 17). 하지만배당체에서도당의결합수가증가할수록 ascorbic acid의상호작용에의한파괴에상대적으로안정한것으로나타났다. 2) Ferulic acid Ferulic acid에의한영향을살펴보면, 배당체의경우색소안정성을유지하는것으로나타났지만, 더욱정확한경향을살펴보기위해서는저장 7일이후에대한측정이필요한것으로판단된다 ( 표 18). 저장 7일간의결과로써는 cyanidin-3--xylrosylrutinoside 에서 cyanidin-3--xylrosylrutinoside 와 ferulic acid의몰비율이 1:2 일때, 안정화를증진시킬수있을것으로판단되지만, cyanidin-3-glucoside 는 ferulic acid와의몰비율이 1:2 일때, 오히려색소안정성이떨어지는결과를보였다. 3) Rosemarinic acid Rosemarinic acid에의한영향을살펴보면, cyanidin-3--sambubioside 와 rosemarinic acid의몰비율이 1:1 일때넣지않은대조구보다 2.5% 증가하였으며, cyanidin-3--xylrosylrutinoside에서는 rosemarinic acid와의몰비율이 1:1 일때 1.8%, 1:2 일때 5.1% 증가하여색소체안정성증진이가능할것으로판단된다 ( 표 19). 반면, cyanidin-3--glucoside 는 rosemarinic acid와의몰비율이 1:2 일때, 색소체의안정성이오히려떨어지는결과를보였다. 4) Tannic acid 색소체안정을위해첨가한 copigments 중에서 tannic acid가복분자색소체의안정성에가장효과적인것으로판단된다 ( 표 20). 특히배당체중에서상대적으로가장안정성이떨어지는 cyanidin-3- -glucoside 의경우 tannic acid를 1:1 의몰비율로첨가할경우저장 7일이경과한후에도 97.2% 이상의색소잔존율을보였다. 또한 cyanidin-3--sambubioside 에서도저장 7일째에 95.8% 이상의색소잔존율을보였으며, cyanidin-3--xylrosylrutinoside 는몰비율 1:1 에서 2.9%, 1:2 에서는 8.5% 색소안정성이증가하였으며, 저장 7일후에도색소잔존율이각각 96.9, 96.8% 이상이었다. 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 257 유상호.indd 257 2010-04-16 오후 5:17:08

표 17 Copigmentation effect on color degradation of anthocyanins during storage with ascorbic acid (25, under the dark) Cyanidin-3-xylrosylrutinoside Cyanidin Cyanidin-3--glucoside Cyanidin-3--sambubioside Cyanidin-3--rutinoside (M/M) (1:1) (1:2) (1:1) (1:2) (1:1) (1:2) (1:1) (1:2) (1:1) (1:2) Storage Time Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev 0 1.051 0.002 1.021 0.010 0.937 0.005 0.921 0.007 0.838 0.007 0.839 0.002 0.834 0.003 0.836 0.005 0.754 0.008 0.759 0.005 2 0.347 0.009 0.312 0.012 0.914 0.006 0.923 0.002 0.841 0.002 0.837 0.004 0.825 0.005 0.827 0.007 0.751 0.005 0.769 0.007 6 0.211 0.012 0.188 0.006 0.918 0.003 0.906 0.005 0.835 0.002 0.828 0.008 0.818 0.002 0.825 0.007 0.746 0.006 0.759 0.007 12 0.141 0.009 0.139 0.004 0.914 0.006 0.900 0.003 0.828 0.005 0.847 0.008 0.806 0.005 0.803 0.002 0.736 0.005 0.731 0.002 24 0.137 0.003 0.129 0.004 0.875 0.007 0.871 0.002 0.818 0.006 0.813 0.002 0.798 0.005 0.799 0.003 0.709 0.005 0.721 0.003 48 0.107 0.007 0.109 0.007 0.806 0.006 0.749 0.006 0.772 0.008 0.763 0.006 0.778 0.013 0.760 0.006 0.735 0.005 0.716 0.006 72 0.105 0.004 0.093 0.003 0.775 0.005 0.662 0.010 0.746 0.004 0.732 0.009 0.748 0.007 0.729 0.008 0.719 0.007 0.654 0.008 120 0.091 0.009 0.085 0.005 0.629 0.006 0.525 0.003 0.683 0.009 0.656 0.007 0.672 0.006 0.677 0.011 0.647 0.006 0.608 0.011 168 0.068 0.003 0.054 0.004 0.591 0.009 0.453 0.009 0.654 0.008 0.627 0.031 0.595 0.004 0.604 0.003 0.595 0.006 0.551 0.003 258 유상호.indd 258 2010-04-16 오후 5:17:08

표 18 Copigmentation effect on color degradation of anthocyanins during storage with ferulic acid (25, under the dark) Cyanidin-3-xylrosylrutinoside Cyanidin Cyanidin-3--glucoside Cyanidin-3--sambubioside Cyanidin-3--rutinoside (M/M) (1:1) (1:2) (1:1) (1:2) (1:1) (1:2) (1:1) (1:2) (1:1) (1:2) Storage Time Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev 0 1.047 0.007 1.018 0.007 0.933 0.007 0.901 0.003 0.841 0.004 0.834 0.011 0.839 0.002 0.840 0.012 0.735 0.002 0.770 0.012 2 0.342 0.011 0.341 0.008 0.918 0.005 0.886 0.007 0.829 0.006 0.832 0.003 0.839 0.009 0.842 0.008 0.735 0.009 0.772 0.008 6 0.193 0.004 0.208 0.006 0.920 0.001 0.886 0.005 0.826 0.006 0.835 0.005 0.831 0.014 0.835 0.002 0.733 0.007 0.773 0.002 12 0.134 0.004 0.165 0.008 0.915 0.005 0.900 0.001 0.816 0.006 0.829 0.004 0.825 0.004 0.832 0.008 0.718 0.004 0.758 0.003 24 0.059 0.008 0.135 0.003 0.908 0.012 0.913 0.002 0.810 0.006 0.825 0.003 0.820 0.006 0.828 0.009 0.716 0.006 0.757 0.009 48 0.083 0.012 0.093 0.005 0.893 0.002 0.860 0.002 0.802 0.003 0.806 0.004 0.825 0.008 0.824 0.009 0.695 0.006 0.740 0.004 72 0.068 0.004 0.070 0.001 0.884 0.001 0.816 0.006 0.798 0.010 0.806 0.004 0.816 0.002 0.819 0.004 0.681 0.002 0.736 0.004 120 0.067 0.003 0.049 0.002 0.889 0.007 0.773 0.009 0.804 0.006 0.811 0.002 0.805 0.003 0.819 0.018 0.691 0.003 0.726 0.010 168 0.064 0.004 0.033 0.001 0.890 0.007 0.755 0.003 0.806 0.004 0.807 0.004 0.807 0.004 0.805 0.006 0.683 0.006 0.722 0.006 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 259 유상호.indd 259 2010-04-16 오후 5:17:09

표 19 Copigmentation effect on color degradation of anthocyanins during storage with rosemarinic acid (25, under the dark) Cyanidin-3-xylrosylrutinoside Cyanidin Cyanidin-3--glucoside Cyanidin-3--sambubioside Cyanidin-3--rutinoside (M/M) (1:1) (1:2) (1:1) (1:2) (1:1) (1:2) (1:1) (1:2) (1:1) (1:2) Storage Time Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev 0 1.035 0.005 1.04 0.003 0.937 0.004 0.891 0.008 0.845 0.006 0.834 0.005 0.842 0.01 0.845 0.009 0.767 0.01 0.791 0.009 2 0.35 0.006 0.373 0.007 0.926 0.004 0.926 0.057 0.838 0.006 0.844 0.002 0.841 0.007 0.84 0.006 0.769 0.007 0.781 0.006 6 0.193 0.005 0.226 0.009 0.92 0.009 0.877 0.004 0.841 0.002 0.832 0.001 0.84 0.002 0.842 0.007 0.762 0.007 0.778 0.007 12 0.166 0.003 0.181 0.002 0.92 0.006 0.866 0.003 0.834 0.001 0.828 0.007 0.829 0.002 0.832 0.007 0.765 0.002 0.768 0.007 24 0.134 0.006 0.145 0.008 0.918 0.006 0.867 0.002 0.826 0.004 0.823 0.002 0.832 0.011 0.829 0.003 0.761 0.002 0.767 0.003 48 0.088 0.007 0.093 0.007 0.914 0.009 0.842 0.004 0.821 0.002 0.803 0.002 0.824 0.008 0.828 0.003 0.756 0.003 0.763 0.003 72 0.078 0.003 0.087 0.006 0.906 0.004 0.812 0.008 0.815 0.003 0.808 0.003 0.818 0.008 0.826 0.003 0.75 0.008 0.758 0.003 120 0.072 0.006 0.084 0.004 0.91 0.005 0.78 0.01 0.813 0.002 0.814 0.009 0.816 0.003 0.817 0.002 0.749 0.003 0.753 0.002 168 0.068 0.003 0.074 0.008 0.899 0.002 0.758 0.007 0.818 0.004 0.813 0.002 0.814 0.002 0.816 0.002 0.743 0.003 0.742 0.002 260 유상호.indd 260 2010-04-16 오후 5:17:09

3.9 저장기간에따른복분자색소체의항산화능관찰빛에대한항산화능평가 1) 암실암실조건에서색소체의 DPPH 라디칼소거능활성을측정하였다. 초기의 DPPH 라디칼소거능활성측정값을 100 으로볼때, 7일째의 cyanidin, cyanidin-3--glucoside, cyanidin-3--sambubioside, cyanidin-3--rutinoside, cyanidin-3--xylrosylrutinoside 의자유라디칼소거능 (%) 이각각 87.6%, 87.7%, 92.2%, 92.3%, 91.2% 이었다. 이는암소조건이색소안정성에긍정적인영향을미친앞선결과와제한적이긴하지만대체로일치하는결과이다. 특히, cyanidin 의경우저장 2시간경과후에색소파괴율이 67.1% 진행된것에비해, 이때항산화활성값은 94.38% 으로여전히높게나타난점이주목할만하다. 30 25 Inhibition (%) 20 15 cyanidin cyanidin-3--glucoside cyanidin-3--sambubioside cyanidin-3--rutinoside cyanidin-3--xylrosylrutinoside 10 02 6 12 24 48 72 120 168 Storage Time (hr) 그림 35 Change in the antioxidant activity of anthocyanins under the dark during storage. 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 261 유상호.indd 261 2010-04-16 오후 5:17:09

2) 형광형광조건에서색소체의 DPPH 라디칼소거능활성을측정하였다. 초기의 DPPH 라디칼소거능활성측정값을 100 으로볼때, 7일째의 cyanidin, cyanidin-3--glucoside, cyanidin-3--sambubioside, cyanidin-3--rutinoside, cyanidin-3--xylrosylrutinoside 의자유라디칼소거능 (%) 이각각 82.4%, 84.0%, 92.5%, 87.7%, 92.0% 로당이 2개이상결합된 cyanidin-3--sambubioside, cyanidin-3-rutinoside, cyanidin-3--xylrosylrutinoside 의항산화활성값이높게나타났다. 색소체안정성에서빛의조건과배당체에결합된당의개수에따라색소체안정성이좌우된것과는달리색소체의항산화능평가에서는암소조건과형광조건에따른배당체들간의항산화능차이가나타나지않았다. 35 30 cyanidin cyanidin-3--glucoside cyanidin-3--sambubioside cyanidin-3--rutinoside cyanidin-3--xylrosylrutinoside Inhibition (%) 25 20 15 10 02 6 12 24 48 72 120 168 Storage Time (hr) 그림 36 Change in the antioxidant activity of anthocyanins under the fluorescent light during storage. 262 유상호.indd 262 2010-04-16 오후 5:17:09

3) UV UV 조건에서색소체의 DPPH 라디칼소거능활성을측정하였다. 초기의 DPPH 라디칼소거능활성측정값을 100 으로볼때, 7일째의 cyanidin, cyanidin-3--glucoside, cyanidin-3--sambubioside, cyanidin-3--rutinoside, cyanidin-3--xylrosylrutinoside 의자유라디칼소거능 (%) 이각각 69.8%, 71.9%, 84.5%, 84.8%, 84.7% 로빛의조건중 UV 조건이색소체의항산화능을가장떨어뜨리는것으로나타났다. 또한 cyanidin-3--sambubioside, cyanidin-3--rutinoside, cyanidin-3-xylrosylrutinoside 의항산화활성값이다른시험구에비해비교적높게나타났으나이들배당체들간의차이는없었다. UV 조건의색소안정성평가에서는결합된당의개수에따른배당체들간의차이가크게나타났으나, 항산화능력평가에서는배당체들간의항산화능력이크게차이를보이지않았다. 30 28 26 24 cyanidin cyanidin-3--glucoside cyanidin-3--sambubioside cyanidin-3--rutinoside cyanidin-3--xylrosylrutinoside Inhibition (%) 22 20 18 16 14 12 10 02 6 12 24 48 72 120 168 Storage Time (hr) 그림 37 Change in the antioxidant activity of anthocyanins under the UV light during storage. 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 263 유상호.indd 263 2010-04-16 오후 5:17:10

열에대한항산화능평가 1) 4 C 저장 4 조건에서색소체의 DPPH 라디칼소거능활성을측정하였다. 초기의 DPPH 라디칼소거능활성측정값을 100으로볼때, 7일째의 cyanidin, cyanidin-3--glucoside, cyanidin-3-sambubioside, cyanidin-3--rutinoside, cyanidin-3--xylrosylrutinoside 의자유라디칼소거능 (%) 이각각 83.9%, 87.3%, 94.3%, 96.0%, 91.7% 로저장온도 4 조건에서는저장기간 7일까지도항산화활성값이크게떨어지지않았으며, 비배당체 cyanidin 과당이 1개결합된 cyanidin-3--glucoside 보다당이 2개이상결합된 cyanidin-3--sambubioside, cyanidin-3--rutinoside, cyanidin-3-xylrosylrutinoside 가우수하였고, 특히 cyanidin-3--rutinoside 의항산화활성값이가장우수하였다. 28 26 24 22 Inhibition (%) 20 18 16 14 12 cyanidin cyanidin-3--glucoside cyanidin-3--sambubioside cyanidin-3--rutinoside cyanidin-3--xylrosylrutinoside 10 02 6 12 24 48 72 120 168 Storage Time (hr) 그림 38 Change in the antioxidant activity of anthocyanins at 4 during storage. 264 유상호.indd 264 2010-04-16 오후 5:17:10

표 20 Copigmentation effect on color degradation of anthocyanins during storage with tannic acid (25, under the dark) Cyanidin-3-xylrosylrutinoside Cyanidin Cyanidin-3--glucoside Cyanidin-3--sambubioside Cyanidin-3--rutinoside (M/M) (1:1) (1:2) (1:1) (1:2) (1:1) (1:2) (1:1) (1:2) (1:1) (1:2) Storage Time Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev Abs stdev 0 1.04 0.005 1.035 0.013 0.927 0.006 0.906 0.006 0.842 0.002 0.839 0.002 0.841 0.002 0.845 0.002 0.774 0.005 0.813 0.011 2 0.385 0.007 0.42 0.008 0.924 0.005 0.895 0.009 0.835 0.006 0.836 0.004 0.835 0.003 0.842 0.005 0.772 0.003 0.807 0.005 6 0.241 0.006 0.264 0.008 0.92 0.002 0.894 0.011 0.831 0.002 0.833 0.002 0.832 0.01 0.835 0.004 0.781 0.002 0.804 0.004 12 0.188 0.005 0.219 0.006 0.916 0.006 0.894 0.004 0.825 0.012 0.831 0.002 0.826 0.005 0.832 0.002 0.769 0.005 0.797 0.004 24 0.159 0.008 0.167 0.003 0.912 0.003 0.885 0.005 0.826 0.003 0.822 0.004 0.819 0.004 0.824 0.003 0.765 0.004 0.788 0.003 48 0.111 0.01 0.121 0.01 0.892 0.001 0.871 0.002 0.81 0.006 0.809 0.003 0.809 0.008 0.826 0.006 0.743 0.006 0.783 0.006 72 0.096 0.006 0.101 0.01 0.889 0.011 0.876 0.005 0.813 0.002 0.804 0.001 0.805 0.007 0.815 0.008 0.741 0.007 0.791 0.009 120 0.085 0.004 0.076 0.004 0.886 0.005 0.888 0.006 0.82 0.004 0.813 0.011 0.806 0.009 0.807 0.003 0.748 0.004 0.791 0.003 168 0.054 0.002 0.056 0.004 0.892 0.01 0.879 0.005 0.807 0.006 0.809 0.008 0.804 0.005 0.806 0.009 0.75 0.005 0.787 0.012 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 265 유상호.indd 265 2010-04-16 오후 5:17:10

2) 25 C 저장 25 조건에서색소체의 DPPH 라디칼소거능활성을측정하였다. 초기의 DPPH 라디칼소거능활성측정값을 100 으로볼때, 7일째의 cyanidin, cyanidin-3--glucoside, cyanidin-3-sambubioside, cyanidin-3--rutinoside, cyanidin-3--xylrosylrutinoside 의자유라디칼소거능 (%) 이각각 6.90%, 79.2%, 95.1%, 94.4%, 94.5% 로나타났다. 4 저장조건과달리 cyanidin 의항산화활성값이저장 5일이후급격히감소하여저장 7일이후에는 6.90% 로크게감소하였고, cyanidin-3- -sambubioside, cyanidin-3--rutinoside, cyanidin-3--xylrosylrutinoside 의경우에는저장 7일까지 94.4~95.1% 의항산화능을유지하였고배당체들간의차이는없었다. 따라서비배당체인 cyanidin 과당이 1개결합된 cyanidin-3--glucoside 의경우 4 저장온도가 25 보다항산화활성값의유지에유리하고, 당이 2개이상결합된배당체부터는 25 에서도 4 조건과동일한항산화활성값을유지할수있다. 이는당의결합수가증가할수록온도에더안정하여강한항산화활성을보였다고판단할수있다. 30 25 Inhibition (%) 20 15 cyanidin cyanidin-3--glucoside cyanidin-3--sambubioside cyanidin-3--rutinoside cyanidin-3--xylrosylrutinoside 10 02 6 12 24 48 72 120 168 Storage Time (hr) 그림 39 Change in the antioxidant activity of anthocyanins at 25 during storage. 266 유상호.indd 266 2010-04-16 오후 5:17:11

3) 80 C 저장온도 80 조건에서색소체의 DPPH 라디칼소거능활성을측정하였다. 초기의 DPPH 라디칼소거능활성측정값을 100으로볼때, 7일째의 cyanidin, cyanidin-3--glucoside, cyanidin- 3--sambubioside, cyanidin-3--rutinoside, cyanidin-3--xylrosylrutinoside 의자유라디칼소거능 (%) 이각각 56.8%, 53.0%, 70.7%, 71.0%, 73.9% 로나타났다. 80 저장조건에서는 Cyanidin-3-xylrosylrutinoside 를제외한모든시험구에서 6시간이후항산화활성이급격히감소하였고, 12시간이경과한후 cyanidin, cyanidin-3--glucoside, cyanidin-3--sambubioside, cyanidin-3--rutinoside 의항산화활성값이각각 71.7%, 64.7%, 80.9%, 81.1% 로급격히떨어졌다. 반면당이 3개결합된 cyanidin-3--xylrosylrutinoside 의경우는급격한감소보다는저장기간에따라꾸준히감소하여저장기간 7일째의 cyanidin-3--xylrosylrutinoside 항산화활성값은 73.9% 로모든시험구중가장높은항산화활성을유지하고있었지만 80 의높은온도조건은 4 와 25 에비해색소체의항산화활성에부정적인영향이컸다. 하지만 80 조건에서안정성평가에서저장기간 7일째색소체의적색이모두소실된것과는달리항산화활성평가에서는같은기간에항산화활성이 53.0~73.9% 유지되었다. 4 와 25 의조건에서는색소체의항산화활성이온도의영향을받지않았고비배당체보다는배당체의항산화활성이높았으며, 특히 2개이상의당이결합된배당체들간에는온도에따른항산화활성의차이가없었다. 30 25 cyanidin cyanidin-3--glucoside cyanidin-3--sambubioside cyanidin-3--rutinoside cyanidin-3--xylrosylrutinoside Inhibition (%) 20 15 10 02 6 12 24 48 72 120 168 Storage Time (hr) 그림 40 Change in the antioxidant activity of anthocyanins at 80 during storage. 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 267 유상호.indd 267 2010-04-16 오후 5:17:11

4. 결론 본연구에서는국내에서자생하는복분자추출액의유리당, 유기산, 유리아미노산의일반성분분석및복분자내색소체의정성, 정량및구조분석을실시하였다. 또한빛과열의물리적조건을달리하고 copigments 첨가에따른복분자내정제된색소체의안정성과항산화활성을평가하였다. 복분자의유리당주성분으로나타난 glucose 와 fructose 의함량은각각 387.5±3.5mg/100 g, 521.5±7.9mg/100g 이었고, 유기산주성분으로나타난 oxalic acid와 citric acid의함량은각각 154.7±0.3mg/100g, 1818.7±8.0mg/100g 이었다. 확인된 16종의유리아미노산중 threonine 이 32.21± 1.6mg/100g, GABA가 20.1±3.4mg/100g, serine 이 20.0±1.5mg/100g 의함량순으로높게나타나아미노산주성분으로확인되었다. 복분자내색소체를 HPLC 를이용하여 4개의 peak로분리한후 Recycling preparative HPLC 를이용각각의피크를고순도로정제한것을 LC/MS, HPTLC 분석을이용하여각각의 peak에대한동정과구조분석을실시한결과, cyanidin 구조에 glucose, xylose, rhamnose 가결합된 cyanidin- 3--xylosylrutinoside 를, cyanidin 구조에 glucose, xylose가결합된 cyanidin-3--sambubioside 를, cyanidin 구조에 glucose, rhamnose 가결합된 cyanidin-3--rutinoside 를, pelargonidin 구조에 glucose, rhamnose 가결합된 pelargonidin-3--rutinoside 를확인하였다. 최적의추출조건을구하기위해극성이다른용매로추출한복분자내색소체를 HPLC 로정량한결과 cyanidin-3--xylosylrutinoside, cyanidin-3--sambubioside, cyanidin-3--rutinoside 는모두 0.01% HCl-acidified 100% MeH 추출조건에서최대수율을보인반면, pelargonidin-3-rutinoside 는수율이현저히낮았다. 이는 anthocyanin 의 core structure 에따라다른패턴의 optimal extraction polarity 를갖는경향때문이라판단된다. 빛과열에대한안정성평가결과, 비배당체보다당이결합된배당체가빛과온도조건모두에서더안정한결과를보였고, 또한배당체들간에도당의결합수가증가함에따라안정성이증가한다는사실을확인하였다. 25, 암소조건에서 copigments 첨가에의한색소체안정성평가결과, tannic acid의첨가가색소체안정에가장효과적인것으로나타났다. 하지만색소체와 copigment 의몰비율 1:1 과 1:2 의조건에따른색소체안정성에는뚜렷한차이를보이지않았다. 빛과열에대한색소체의 DPPH 라디칼소거능활성을측정한결과에서도, 비배당체인 cyanidin 보다당이결합된배당체가항산화활성능이우수하였고 4, 암실조건에서높은항산화활성을보였다. 특이한점으로는, 안정성평가에서당의결합수에따라색소체의안정성이증가하는경향을보이지않았다는점이다. 즉, 당이 3개결합된배당체가당이 2개결합된배당체보다항산화활성이크지않았다. 각각의빛과온도조건에서당이 2개이상결합된배당체들간에는항산화능의차이가크게없었다. 또한 80 조건에서저장 7일째에모든색소체의적색이소실된것과 268 유상호.indd 268 2010-04-16 오후 5:17:11

달리, 항산화활성능은저장 7 일째에도 53.0~73.9% 활성을유지하였다. 참고문헌 Kim SH, Joo MH, Yoo SH. 2009. Structural identification and antioxidant properties of major anthocyanin extracted from omija (Schizandra chinensis) Fruit. J. Food Sci. 74: 134 140. Pantelidis GE, Vasilakakis M, Manganaris GA, Diamantidis Gr. 2007. Antioxidant capacity, phenol, anthocyanin and ascorbic acid contents in raspberries, blackberries, red currants, gooseberries and Cornelian cherries. Food Chem. 102: 777-783. Lee KW, Kim YJ, Lee HJ, Lee CY. 2003. Cocoa has more phenolic phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and red wine. J. Agric. Food Chem. 51: 7292-7295. Wojdylo A, szmianski J, Czemerys R. 2007. Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs. Food Chem. 105: 940-949. Schwarz M, Picazo-Bacete JJ, Winterhalter P, Hermosin-Gutierrez I. 2005. Effect of copigments and grape cultivar on the color of red wines fermented after the addition of copigments. J. Agric. Food Chem. 53: 8372 8381. Nakatani N, Kikuzaki H, Hikida J, hba M, Inami, Tamura I. 1995. Acylated anthocyanins from fruits of Sambucus canadensis. Phytochem. 38: 755-757. 국내자생베리류유래항산화능 phytophenolics 의화학적구조적안정성관찰및안정성향상방안탐색 269 유상호.indd 269 2010-04-16 오후 5:17:11

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