객담항산균도말양성환자에서비결핵항산균과의감별을위한결핵균중합효소연쇄반응검사의유용성 울산대학교의과대학서울아산병원호흡기내과이재승, 지현숙 1, 홍상범, 오연목, 임채만, 이상도, 고윤석, 김우성, 김동순, 김원동, 심태선 Clinical Utility of Polymerase Chain Reaction for the Differentiation of Nontuberculous Mycobacteria in Patients with Acid-fast Bacilli Smear-positive Specimens Jae Seung Lee, M.D., Hyun Shuk Ji, M.D. 1, Sang Bum Hong, M.D., Yeon-Mok Oh, M.D., Chae-Man Lim, M.D., Sang Do Lee, M.D., Younsuck Koh, M.D., Woo Sung Kim, M.D., Dong Soon Kim, M.D., Won Dong Kim, M.D., Tae Sun Shim, M.D. Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Department of Internal Medicine, Department of Diagnostic Laboratory Medicine 1, University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center, Seoul, Korea Background : In Korea, polymerase chain reaction (PCR) test for M. tuberculosis has been used for the diagnosis of acid-fast bacilli (AFB) smear-negative tuberculosis in order to increase diagnostic sensitivity. However, there have been no data dealing with the clinical utility of PCR in AFB smear-positive patients to differentiate between M. tuberculosis and nontuberculous mycobacteria. Method : We retrospectively analyzed the PCR test results which have been performed in patients who had AFB smear-positive sputum but had ambiguous clinical manifestations of active tuberculosis. PCR test was done using AMPLICOR â M. tuberculosis kit. The sensitivity, specificity, and positive and negative predictive values of the PCR test were calculated based on culture and final clinical diagnosis result. Results : Fifty-six consecutive patients (62 PCR tests) were included in the study. Active tuberculosis was diagnosed in 23 patients (41.0%), while 9 patients had NTM infection (16.0%). The sensitivity, specificity, positive- and negative-predictive value of PCR test were 88.8%, 86.8%, 76.1% and 94.3%, respectively, according to the culture result. In comparison, they were 91.3%, 100%, 100%, 94.3%, respectively, according to the final clinical diagnosis. All 15 patients with NTM isolates, including 6 patients who had other lung diseases but expectorated NTM isolate, were negative for PCR test. Conclusion : Even though tuberculosis is still prevalent in Korea, PCR test is useful to differentiate between M. tuberculosis and NTM in patients with AFB-smear positive sputum but with ambiguous clinical manifestations of active tuberculosis. (Tuberc Respir Dis 2005; 58: 452-458) Key words : AFB smear-positive, Mycobacterium tuberculosis, Nontuberculous mycobacterium (NTM), Polymerase chain reaction (PCR) 서 결핵은결핵균이신체장기에침범하여다양한소견을나타내는감염성질환으로가장확실한진단방법은임상검체에서결핵균을검출하는것이다. 우리 론 Address for correspondence : Tae Sun Shim Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Department of Internal Medicine, University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center, 388-1 Pungnap-dong, Songpa-gu, Seoul 138-600, Korea Phone : 82-2-3010-3892 Fax : 82-2-3010-6968 E-mail : shimts@amc.seoul.kr Received : Jan. 17. 2005 Accepted : Mar. 15. 2005 나라결핵환자의진단기준은임상검체에서결핵균이분리배양된경우또는도말검사에서항산균이증명된경우중하나만충족하여도결핵환자로진단하고세균학적검사에서결핵균을증명하지못할경우에한하여임상적, 방사선학적또는조직학적으로결핵에합당한증상이나소견이있어서진료의사가결핵치료를시행하기로결정한경우에는의사환자로진단하게된다 1. 객담도말검사는시행이간단하고저렴하며, 결과가빠르고전염성을평가하는데가장중요한검사법이나민감도와특이도가낮은단점이있다. 배양검사는소수의균도검출하여동정할수있어가장확실한 452
Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 58. No. 5, May. 2005 진단법이며약제감수성검사를시행할수있다는장점이있지만시간이오래걸려진단이지연되는단점이있다. 최근결핵균중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, 이하 PCR) 검사가이러한도말검사와배양검사의단점을보완하여민감하고신속하게결핵균검출및동정을위하여많이사용되고있다 2. 미국식품의약청은항산균도말양성객담검체에서결핵의확진을위하여두가지상업화된 PCR 검사법인 AMPLICOR M. tuberculosis test (Roche Diagnostic Systems, Branchburg, NJ) 와 MTD (Gen-Probe, San Diego, CA) 를공인하였다. 이두가지 PCR 검사는항산균도말양성객담에서배양양성을기준으로민감도가각각 96%, 95% 이고특이도는두방법모두 100% 로조사되었다 3. 당시항산균도말음성객담에서는민감도가 53/48% 로낮아상기검사법이추천되지않았으나, 1999년에임상적으로폐결핵의가능성이높은환자의경우항산균도말음성객담에서도 MTD 검사법의사용이추가로공인되었다 4. 미국과달리국내의경우결핵의유병률과발생률이높고비결핵항산균폐질환의빈도가낮아객담에서항산균도말양성일경우대부분결핵으로간주하여왔으며, 균배양후에도결핵균과비결핵항산균을구별하고있는검사실은매우소수인실정이다 5. 따라서 PCR 검사는주로항산균도말음성환자에서결핵이의심될경우진단의민감도를높이기위하여실시되어왔다 6. 그러나국내에서도비결핵항산균증이증가하고있으며 7 최근한연구에서항산균도말양성, 배양양성검체의 10.3% 가비결핵항산균임이보고되기도하였다 8. 따라서국내에서도항산균도말양성폐결핵으로진단받은환자의일부가비결핵항산균폐질환일수있어이의신속감별이중요하리라판단된다. 그러나객담도말양성환자에서결핵균과비결핵항산균의감별을위한 PCR 검사의유용성에대한국내연구는없었다. 이에저자들은객담도말양성이지만임상적으로결핵이불확실한경우에 PCR 검사가비결핵항산균과의신속감별에유용한지여부를알아보기위하여본연구를수행하였다. 대상및방법 1. 대상본연구는 2002년 10월부터 2003년 10월까지서울아산병원에서항산균객담도말검사상양성이었으나비결핵항산균과의감별을위하여결핵균 PCR 검사가시행된 56명의환자를대상으로후향적으로의무기록을분석하였다. 2. 방법 1) 객담항산균도말, 배양및동정검사약 5ml의아침첫객담을 50ml 튜브에받는것을원칙으로하였으며, 검사실에보내어진검체는 N-acetyl- L-cystein 과 1.5% NaOH로처리한후멸균증류수와섞어 15분간원심분리하여침사액 0.lml를슬라이드에도말하여형광염색으로선별검사한후양성인검체에한하여 Kinyoun법으로재검하여최종보고하였다. 도말검사결과의보고는미국질병예방통제국의기준을따랐으며고배율 300시야에서항산균이관찰되지않으면음성, 300 시야에서항산균이 1-2개관찰되면 trace, 100 시야에서항산균이 1-9개관찰되면 1+, 10 시야에서항산균이 1-9개관찰되면 2+, 한시야에서항산균이 1-9개관찰되면 3+, 그리고한시야에서항산균이 10개이상관찰되면 4+ 로보고하였다 9. 도말양성인검체는배지에접종후나머지를 1.5ml eppendorf 튜브에넣어 4 에보관하였다가이후 PCR 이의뢰되면사용하였다. 배양은 3% Ogawa배지에접종하여 35 에서최대 8주간관찰하였다. 균배양후결핵균과비결핵항산균의감별은 AccuProbe 검사 (Gen-Probe Inc., San Diego, USA) 를이용하였고, 일부비결핵항산균은 rpob 유전자의 PCR-RFLP 방법으로균동정을시행하였다 10. 2) 결핵균 PCR 검사항산균도말양성이확인되어보관되었던검체중임상상이애매하여결핵균 PCR이의뢰된검체만을대상으로하였다. PCR 검사는제조회사의방법에따 453
JS Lee, et al.: PCR for tuberculosis in AFB smear-positive specimens 랐다. 간략히요약하면 N-acetyl-L-cystein과 NaOH 로처리한검체에 lysis reagent를넣고 60 에서 45분간배양한다음 neutralized reagent를동량넣고전처리한검체 50ul를 mast mix 50ul와섞어 AMPLI COR M. tuberculosis test (Roche Diagnostic System, Branchburg, NJ) 기에서증폭하여그산물을 450nm 에서 OD값을측정하여 0.35 이상을양성으로하였다. 한명에서 2번이상의 PCR을시행한경우에는한번이라도양성이나온경우 PCR 검사양성으로판정하였다. 4) 통계분석통계분석은 Window 용 SPSS 프로그램 (SPSS 11.0, SPSS Inc, Chicago, Illinoi, USA) 을이용하여시행하였다. 모든통계값은평균 ± 표준편차로표기하였으며, 각군사이의통계값비교는교차분석-카이제곱검정을이용하였다. P-value 가 0.05 이하인경우를통계적으로유의한경우로간주하였다. PCR 검사의유용성평가를위해배양양성및최종진단을기준으로민감도, 특이도, 양성예측도및음성예측도를계산하였다. 3) 임상진단결핵은세균학적또는임상적으로진단되었고비결핵항산균폐감염증은미국흉부학회의기준으로정의하였다 11. 임상적결핵진단은임상적또는방사선학적으로결핵에합당한증상이나소견이항결핵제치료후호전된경우로정의하였다. 대상환자의흉부엑스선소견을기준으로결핵의가능성을고, 중, 저로구분하고각군에서의결과를비교하였다 (Table 1) 12. 결과 1. 대상환자의임상적특성연구대상환자는 56명으로항산균도말검체를대상으로한 PCR 검사는모두 62회시행되었다. 1회시행한환자 51명, 2회 4명, 3회시행한환자가 1명이었다. 나이는 22세에서 83세까지로평균 58.7세였으며, 남자가 29명, 여자가 27명이었다. Table 1. Radiologic definition of pretest probability for pulmonary tuberculosis 13 Pretest probability High Intermediate Low Radiologic features Upper lobe, patchy airspace infiltrates interpreted as active Cavitary disease Diffuse miliary pattern Middle or lower lobe abnormalities Upper lobe abnormalities of indeterminate activity Diffuse (non-miliary) abnormalities Normal or near-normal chest radiographs Multifocal, calcified nodules consistent with healed tuberculosis Table 2. Final clinical diagnosis of 56 patients Diagnosis No. of patients (%) Active tuberculosis 23 (41.0) NTM infection 9(16.0) Lung cancer 8(14.2) Inactive tuberculosis 4( 7.1) Pneumonia 4( 7.1) Bronchiectasis 2( 3.5) Miscellaneous* 6(10.7) * Pulmonary edema (1), usual interstitial pneumonia (1), nocardiosis (1), brochiolitis (1), empyema (1), pancreas cancer without definite lung abnormality (1) 454
Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 58. No. 5, May. 2005 56명의최종진단은활동성폐결핵 23명 (41.0%), 비결핵항산균폐감염증 9명 (16.0%), 폐암 8명 (14.2%), 폐렴 4명 (7.1%), 비활동성폐결핵 4명 (7.1%), 기관지확장증 2명 (3.5%) 등이포함되었다 (Table 2). 활동성폐결핵의진단은결핵균배양양성 18명, 임상적으로진단된경우가 5명이었다. 항산균도말양성객담에서비결핵항산균이배양된환자는 15명이었으며, 이중에서 9명 (16%) 은미국흉부학회의비결핵항산균폐감염증의진단기준을만족하였다. 비결핵항산균폐감염증으로진단된환자의원인균주는 Mycobacterium avium complex 가 5명, Mycobacterium abscessus 2 명, Mycobacterium fortuitum complex 1명, Mycob acterium kansasii 1명의순이었다. 흉부엑스선소견상활동성폐결핵의가능성을분류한결과 (Table 1), 높은군이 17명 (30.4%), 중등도군이 33명 (58.9%), 낮은군이 6명 (10.7%) 이었다. 흉부엑스선상결핵의가능성이높고, 항산균도말양성임에도불구하고 PCR 검사를시행한가장큰이유는항결핵제투여에도호전을보이지않거나치료후균음전이된후추적객담도말검사에서다시도말양성객담이나온경우이었다. 흉부엑스선소견상활동성폐결핵의가능성이높은군에속한 17명중결핵 12명, 비결핵항산균폐감염증 5명이었다. 증등도군에속한 33명중결핵 11명, 비결핵항산균폐감염증 4명, 기타질환 18명이었다. 낮은군 6명은모두기타질환자이었다. 이상의결과흉부엑스선소견으로활동성폐결 핵과비결핵항산균폐감염증과의구별을할수는없었다. 2. PCR 결과 56명의환자중 21명 (37.5%) 에서 PCR 검사상결핵균이검출되었다. PCR을 2회시행한환자 4명중 2명은 2회모두음성, 1명은모두양성이었고, 나머지 1명은 1회는음성, 1회는양성이었다. 3회시행한 1명에서 1회는양성, 2회는음성이었다. PCR을 2-3회시행한 5명중 2회모두음성인 2명은모두비결핵항산균이동정되었고나머지 3명은해당검체또는다른검체에서결핵균이배양되어균양성결핵으로진단되었다. 도말결과에따른양성률은각각 trace 31.5% (5/16), 1+ 35.0% (7/20), 2+ 41.6% (5/12), 3+ 25% (1/4), 4+ 75.0% (3/4) 이었다. PCR 양성 21명모두최종폐결핵으로진단되었으며 16명은결핵균배양양성이었고 5명은임상적으로폐결핵이진단되었다. PCR 음성 35명중 2명에서배양양성폐결핵이진단되었고 33명모두결핵이아닌것으로진단되었다 (Table 3). 비결핵항산균이배양된 15명모두 PCR 음성이었다. 결핵균배양양성을기준으로 PCR 검사의민감도, 특이도, 양성예측도, 음성예측도는각각 88.8%, 86.8%, 76.1%, 94.3% 이며, 최종임상진단을기준으로는각각 91.3%, 100%, 100%, 94.3% 이었다 (Table 4). Table 3. Reults of PCR for tuberculosis according to the culture results and final clinical diagnosis Pulmonary tuberculosis Culture (+) Culture (-) Other diseases PCR (+) 16 5 0 PCR (-) 2 0 33 Table 4. Performance of PCR for tuberculosis in AFB smear-positive patients according to culture results and final clinical diagnosis Culture-based (%) Final clinical diagnosis-based (%) Sensitivity 88.8 91.3 Specificity 86.8 100 Positive predictive value 76.1 100 Negative predictive value 94.3 94.3 455
JS Lee, et al.: PCR for tuberculosis in AFB smear-positive specimens 고찰본연구결과국내에서도항산균도말양성검체를대상으로한 PCR 검사는결핵균과비결핵항산균을신속히구분하는데유용함을알수있었다. 그러나이는임상적으로결핵의가능성이높지않은환자만을대상으로한연구이고특이도가높은상업화된 PCR 검사법을이용한결과이므로이결과를일반적으로적용하기보다는해당지역의결핵및비결핵항산균폐감염증의비율, PCR 검사방법, 임상적으로결핵의가능성정도등을고려하여적용하는것이필요할것으로생각된다. 1995년에우리나라의폐결핵유병률은인구 10만명당균양성폐결핵환자가 219명이었고, 1992년부터 1994 년까지의균양성결핵발생률이인구 10만명당 81명으로미국의 6.4명에비하여매우높은수준이다 13. 따라서국내에서는기침, 가래, 발열등의호흡기증상으로입원을하는환자의경우임상적으로결핵의가능성이높지않은경우에도객담항산균검사를시행하는경우가많고, 도말양성이면결핵으로진단하고항결핵제치료를시행하는것이일반적이었다. 이는국내에서폐결핵에비하여비결핵항산균폐질환의빈도가매우낮았기때문이다. 대한결핵및호흡기학회의진단기준에도항산균도말양성이폐결핵의진단기준으로제시되고있다 1. 그러나항산균도말검사는결핵균과비결핵항산균을구별할수없으므로결핵의유병률이낮거나비결핵항산균동정률및감염증이많은지역에서는위양성의가능성이높다. 미국등상대적으로비결핵항산균폐질환의빈도가높은지역에서는항산균도말양성객담의 30-50% 까지비결핵항산균이분리되고있다 14. 실제로 James 등은미국의워싱톤대학병원에서시행된 9,604개의도말검사중양성검체에서결핵진단의위양성률은 50% 로높아선별검사로서제한점이있음을보고하였다 15. Paul 등은형광염색법도결핵균은민감도가 63%, 비결핵항산균은 56% 로차이를보이지않음을보여주었다 16. 최근국내에서도비결핵항산균의분리율및비결핵항산균질환의증가가보고되고있다. 한보고에의하면항산균도말양성, 배양양성균주의 10.3% 가 비결핵항산균이라는보고가있었고 8, 다른연구에서도 12.2% 가비결핵항산균이라는보고가있었다 ( 투고 ). 그러나아직도국내에서도말양성의약 90% 는결핵균으로추정되므로임상적으로도결핵이의심된다면항결핵치료를시작하고이후균배양결과를확인하는것이순서일것으로생각된다. 그러나임상적으로결핵의가능성이높지않은상황이라면결핵균 PCR 을시행하여음성의결과가나오면비결핵항산균이거나또는결핵균이외의다른가능성들을고려할수있겠다. 추후비결핵항산균동정률의증가에따라적절한결핵및비결핵항산균증의진단지침의변경이필요할것으로생각된다. PCR법은크게상업화된검사와개개실험실에서제작한 in-house법으로구분할수있다. In-house PCR은개개실험실마다검사기법이다양하고오염에의한위양성의가능성이있다. 실제로각실험실마다다양한결과를보여주어 17 이러한 PCR 결과를모두동일하게판단해서는안된다. 반면에상업화된 PCR법은 in-house PCR법에비하여오염의위험이적고, 정량적이며, 특이도가높다. 본연구에서는미국식품의약청에서공인한상업화된검사두가지중한가지인 AMPLICOR M. tuberculosis test를사용하였다 3. 즉이검사는, 특히도말양성의경우, 특이도가 100% 에이르고민감도도 95-96% 이므로임상적으로결핵의가능성이낮더라도 PCR양성이면결핵임을진단할수있고, PCR 음성이라면 PCR 반응억제제가있지않는한대부분결핵균이아니라고할수있다. 즉항산균도말양성이면서 PCR 음성이면대부분비결핵항산균의가능성을고려하여야한다. 미국질병예방통제국의지침에의하면객담항산균도말양성에서결핵균핵산증폭검사가양성일경우폐결핵으로진단할수있으며만일핵산증폭검사가음성일경우에는 PCR 억제물질이있는지확인하고이후에도다시음성으로나오면비결핵항산균에의한폐감염으로진단하라고권고하고있다 4. 본연구에서는항산균도말양성검체가결핵균을포함하고있는지를확인하기위하여상업화된결핵균 PCR 검사를이용하였다. 최근분자생물학적방법의발달에따라객담과같은임상검체를대상으로결핵 456
Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 58. No. 5, May. 2005 균및비결핵항산균의구분뿐만이아니라비결핵항산균동정및일부결핵균약제감수성까지도확인할수있는방법들이개발되고있다 18,19. 기존의 PCR 검사는결핵균의밴드만확인할수있는데비하여결핵균과비결핵항산균을동시에검출할수있는 duplex PCR을이용하면결핵균또는비결핵항산균각각의존재여부를뚜렷하게확인할수있다 10. 그러나아직이러한검사법들은직접임상검체를대상으로한연구결과가부족한상태이고비용이많이드는단점이있다. 그러므로이러한검사법들의임상에서의확실한유용성및경제성이밝혀지기까지는기존에상업화되어있는민감도및특이도가높은결핵균 PCR법을사용하는것이유용할것으로생각된다. 본연구에서중요한점은도말양성으로확인된검체만을대상으로 PCR을시행하였다는점이다. 도말양성폐결핵환자이더라도배출하는모든객담에항산균이포함되어있는것은아니다. 따라서도말양성인환자에서다시객담을배출하여 PCR을시행하면도말음성인검체에서검사가시행될가능성이있다. 이경우 PCR 결과의올바른해석은불가능하다. 유등의결과에서보듯이항산균도말양성폐결핵환자라도도말양성이확인되지않은검체를이용한결핵균 PCR의민감도는 78.7% 에불과하였다 20. 본연구에서는도말양성인모든검체는 4 냉장고에보관하였다가 PCR 검사가의뢰되면 PCR에사용하였다. 도말양성검체를보관하기어렵다면 PCR을위하여다시객담을채취한후반드시항산균염색을시행하여양성임을확인하고 PCR을시행하여야할것이다. 본연구에서는모든도말양성환자를대상으로하지않고임상적으로결핵이불확실한환자만을대상으로시행하였다. 후향적연구이었기때문에 결핵이불확실한환자 의기준은담당의사의임상적인판단에의하였다. 흉부엑스선으로결핵과비결핵항산균폐감염증을구분할수있는지확인하기위하여흉부엑스선소견에따라결핵의가능성을고, 중, 저로구분하여비교하였으나흉부엑스선도결핵과비결핵항산균폐감염증을감별하는데도움이되지못함을알수있었다. 이러한모호성에도불구하고최종진단을기준으로한결핵균 PCR의민감도, 특이도, 양성예측 도및음성예측도는각각 91.3%, 100%, 100%, 94.3% 로우수한결과를보여주었다. 이는 PCR이도말양성이면서결핵의가능성이모호한환자에서양균의감별에우수한검사임을확인할수있었다. 최근의추세와같이비결핵항산균폐감염증이지속적으로증가하고결핵이감소한다면미래에는항산균도말양성인모든검체를대상으로 PCR을시행하여결핵균과비결핵항산균을구분하여야할가능성도있다. 이상의결과를종합하면임상적으로결핵의가능성이높지않은항산균도말양성객담환자에서도말양성검체를대상으로한결핵균 PCR 검사는결핵을확진하거나비결핵항산균의가능성을제시하는데유용할것으로생각된다. 모든항산균도말양성검체를대상으로결핵균 PCR 검사가유용할지는향후국내에서비결핵항산균증의증가추세를고려하여검토되어야할것으로생각된다. 요약연구배경 : 결핵의유병률이낮고상대적으로비결핵항산균증의유병률이높은미국에서는항산균도말양성호흡기검체에서결핵의진단목적으로결핵균 PCR 검사가공인되었다. 최근국내에서도비결핵항산균증이증가하고있는추세로객담도말양성환자에서결핵균과비결핵항산균의신속감별이중요할것으로사료된다. 객담항산균도말양성이지만임상적으로결핵균과비결핵항산균과의감별이필요한경우에결핵균 PCR의시행이배양결과전신속한감별에도움이되는지알아보고자본후향적연구를시행하였다. 방법 : 항산균도말양성이지만비결핵항산균과의감별을위해결핵균 PCR 검사가시행된 56명의의무기록을조사하여결핵균 PCR 결과, 배양결과및최종진단을확인하여결핵균 PCR의유용성을검증하였다. 결과 : 총 56명의환자에서 62회의 PCR이시행되었다. 환자의평균나이는 58.7세 ( 범위 22-83세 ) 이었다. 최종진단은결핵 23명 (41.0%), 비결핵항산균폐질환 9명 457
JS Lee, et al.: PCR for tuberculosis in AFB smear-positive specimens (16.0%), 기타폐질환 24명 (42.8%) 이었다. 배양양성을기준으로 PCR 검사의결핵진단의민감도, 특이도, 양성예측도, 음성예측도는각각 88.8%, 86.8%, 76.1%, 94.3% 이었고, 최종임상진단을기준으로는각각 91.3%, 100%, 100%, 94.3% 이었다. 비결핵항산균이배양된 15 명 (26.7%) 은모두 PCR 음성이었다. 결론 : 결핵의발병률이중등도인국내에서도항산균도말양성이지만비결핵항상균과의감별이필요한경우에결핵균 PCR 검사는배양검사전신속한감별에유용하였다. 참고문헌 1. Korean Academy of Tuberculosis and Respiratory Disease. Diagnostic standards of pulmonary tuber culosis. Tuberc Respir Dis 1997;44:1447-53. 2. American Thoracic Society. Rapid diagnostic tests for tuberculosis: what is the appropriate use? Ame rican Thoracic Society workshop. Am J Respir Crit Care Med 1997;155:1804-14. 3. Centers for Disease Control and Prevention. Nucleic acid amplification tests for tuberculosis. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1996;45:950-2. 4. Centers for Disease Control and Prevention. Update: Nucleic acid amplification tests for tuberculosis. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2000;49:593-4. 5. Kim MN, Lee SH, Yang SE, Pai CH. Mycobacterial testing in hospital laboratories in Korea: results of a survey of 40 university or tertiary-care hospitals. Korean J Clin Pathol 1999;19:86-91. 6. Back SH, Lee JM, Kang MJ, Son JW, Lee SJ, Kim DK, et al. How reliable is sputum PCR test in the diagnosis of pulmonary tuberculosis when sputum smear is negative? Tuberc Respir Dis 2001;50:222-8. 7. Korean Academy of Tuberculosis and Respiratory Disease. National survey of mycobacterial diseases other than tuberculosis in Korea. Tuberc Respir Dis 1995;42:277-94. 8. Koh WJ, Kwon OJ, Yu CM, Jeon K, Suh GY, Chung MP, et al. Recovery rate of non-tuberculous my cobacteria from acid-fast bacilli smear-positive sputum specimens. Tuberc Respir Dis 2003;54:22-32. 9. American Thoracic Society. Diagnostic standards and classification of tuberculosis in adults and children. Am J Respir Crit Care Med 2000;161:1376-95. 10. Kim BJ, Hong SK, Lee KH, Yun YJ, Kim EC, Park YG, et al. Differential identification of Mycobacterium tuberculosis complex and nontuberculous mycobacteria by duplex PCR assay using the RNA polymerase gene (rpob). J Clin Microbiol 2004;42:1308-12. 11. American Thoracic Society. Diagnosis and treatment of disease caused by notuberculous mycobacteria. Am J Respir Crit Care Med 1997;156:S1-25. 12.Lim TK, Gough A, Chin NK, Kumarasinghe G. Relationship between estimated pretest probability and accuracy of automated Mycobacterium tuberculosis assay in smear-negative pulmonary tuberculosis. Chest 2000;118:641-7. 13. Hong YP, Kim SJ, Lew WJ, Lee EK, Han YC. The seventh national wide tuberculosis prevalence survey in Korea, 1995. Int J Tuberc Lung Dis 198;2:27-36. 14. Stone BL, Burman WJ, Hildred MV, Jarboe EA, Reves RR, Wilson ML. The diagnostic yield of acidfast-bacillus smear-positive sputum specimens. J Clin Microbiol 1997;35:1030-1. 15. James CB, Joseph JM. Decreasing reliability of acidfast smear techniques for detection of tuberculosis. Ann Intern Med 1975;82:489-92. 16. Paul WW, Richard JW, Nathan WW, Barbara AB, David EG. Sensitivity of fluorochrome microscopy for detection of Mycobacterium tuberculosis versus nontuberculous mycobacteria. J Clin Microbiol 1998; 36:1046-9. 17. Noordhoek GT, Van Embden JD, Kolk AH. Reliabi lity of nucleic acid amplification for detection of Mycobacterim tuberculosis: an international collaborative quality control study among 30 laboratories. J Clin Microbiol 1996;34:2522-5. 18. Troesch A, Nguyen H, Miyada CG, Desvarenne S, Gineras TR, Kaplan PM, et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J Clin Microbiol 1999;37:49-55. 19. Helb D, Jones M, Paul K, Levi M, McMillan W. In tegrating sputum processing with real-time PCR detection, quantitation, and susceptibility testing of M. tuberculosis into single, rapid hands-free step. Am J Respir Crit Care Med 2004;170:A259. 20. Yu CM, Koh WJ, Ryu YJ, Jeon K, Choi JC, Kang EH, et al. Usefulness of PCR test for M. tuberculosis for the differentiation of pulmonary tuberculosis and nontuberculous mycobacterial lung disease in patients with smear-positive sputum. Tuberc Respir Dis 2004; 57:528-34. 458