Polymer(Korea), Vol. 31, No. 5, pp 454-459, 2007 효과적인유전자전달을위한표적성리간드가도입된저분자량수용성키토산나노입자의제조및특성 허선행ㆍ장민자ㆍ김동곤ㆍ정영일ㆍ장미경 ㆍ나재운 순천대학교공과대학나노고분자공학과 (2007년 6월 11일접수, 2007년 8월 28일채택 ) Characterization and Preparation of Low Molecular Weight Water Soluble Chitosan Nanoparticle Modified with Cell Targeting Ligand for Efficient Gene Delivery Sun-Heang Heo, Min-Ja Jang, Dong-Gon Kim, Young-Il Jeong, Mi-Kyeong Jang, and Jae-Woon Nah Department of Nano Polymer Science and Engineering, Sunchon National University, Jeonnam 540-742, Korea (Received June 11, 2007; Accepted August 28, 2007) 초록 : 본연구에서는 folic acid(fa) 가복합화된저분자량수용성키토산 (LMWSC) 나노입자 (water soluble chitosan-folic acid nanoparticle, WSCFA) 를제조하고, 또한 DNA와나노복합체합성및특성을분석함으로써 in vitro에서세포내독성을평가하였다. WSCFA 합성을확인하기위하여분광학적분석방법을사용하여분석하였으며, WSCFA 나노입자는 110 nm 이하의입자크기인구형의형태를가지고있음을알수있었다. In vitro 세포내독성실험에서, WSCFA-DNA 복합체는세포내독성을전혀나타내지않음으로높은세포생존율을보여주었다. 전기영동실험을통해 WSCFA 의 DNA 응축능력을확인하였고, in vitro에서의전이효율은형광광도계에의해평가하였다. Abstract: Gene therapy using low molecular weight water soluble chitosan (LMWSC) as polycationic polymer shows good biocompatibility, but low transfection efficiency. The mechanism of folic acid (FA) uptake in the cells to promote targeting and internalization could improve transfection rates. The objective of this study was to synthesize and characterize the WSCFA-DNA complex and evaluate their cytotoxicity, in vitro. In 1 H-NMR spectra, specific peaks appeared both of FA and LMWSC in D 2 O. WSCFA nanoparticles have spherical shapes with particle size show below 110 nm. In the cell cytotoxicity test, the WSCFA-DNA complex showed high cell viability, in vitro. Gel electrophoresis showed condensed DNA within the carriers. In vitro transfection efficiency was assayed by fluorescence spectroscopy. WSCFA nanoparticles have less cytotoxicity, good DNA condensation and particle size around 110 nm, which makes them a promising candidate as a non-viral gene vector. Keywords: LMWSC, folic acid, nanoparticle, gene therapy. 서 유전자치료법이란유전자를이용하여필수단백질의생성을유도하거나불필요한단백질의생성을억제함으로써인간의질병치료를목적으로하는의료수단이다. 이를위해단백질을발현하는유전자를효율적으로전달할수있는유전자전달체계 (gene delivery system, GDS) 의개발이절실히요구되고있으며, 현재양이온성고분자를이용한비바이러스성벡터 (non viral vector) 에대한연구가활발히진행되고있다. 유전자전달체계는크게바이러 론 To whom correspondence should be addressed. E-mail: jwnah@sunchon.ac.kr, jmk8856@sunchon.ac.kr 스성벡터 (viral vector) 와비바이러스성벡터를이용하는방법의두종류로나눌수있다. 바이러스성벡터는유전자발현효율성이높고장기적으로발현이일어난다는장점이있는반면면역반응과독성이일어날수있으며, 바이러스를이용한다는점에서체내축적이일어날수있는위험성을가지고있다. 1,2 반면비바이러스성벡터의경우, 유전자를조직에축적되도록조절할수있고유전자전달체의물리화학적인자인입자크기, 표면전하, 특이적리간드 (ligand) 의결합을쉽게조절할수있고면역반응이적게일어나는장점을가진반면유전자발현효율이바이러스성벡터에비해낮고유전자발현이단기적으로일어난다는단점을가지고있다. 3 비바이러스성전달체는리포솜을이용한리포플렉스 (lipoplex) 와양이온성고분 454
효과적인유전자전달을위한표적성리간드가도입된저분자량수용성키토산나노입자의제조및특성 455 자를이용한폴리플렉스 (polyplex) 운반체로분류할수있다. 4,5 본연구에사용한물질은비바이러스성전달체의유전자발현효율을높이고발현성을지속시키며체내에전혀독성을일으키지않는양이온성천연고분자인키토산을사용하였다. 키틴은 N- 아세틸- D-글루코사민이 β-(1,4) 결합한천연고분자이며게나새우등의갑각류, 오징어등의연체류, 곤충류및세균의세포벽등에광범위하게분포되어있다. 키틴은지구상에존재하는천연다당류중에서셀룰로오스다음으로많은양이존재하지만물과유기용매에잘용해되지않기때문에그용도가한정되어있다. 6 키토산은키틴을농축알칼리로처리하여얻어지는물질로서 D- 글루코사민이 β-(1,4) 결합을하고있으며 2번탄소위치에아민기를가지고있는천연고분자이다. 키토산은독성이없어서생체적합하며, 생체분해가잘된다는특징이있으며또한면역거부반응이없다는장점을가지고있어생체재료로사용하기에매우적합한조건을나타낸다. 그러나키토산은아세트산염산등의묽은산을포함한수용액에잘용해되기때문에지금까지는주로공업용으로이용하려는연구가대부분이었으나, 7-9 키토산은생리활성물질로면역활성, 10 콜레스테롤저하작용, 11 및상처치유작용등과 12 같은생체기능성이있기때문에건강식품, 식품보존제, 식물의생장촉진제및인공피부등으로이용하려는연구가활발히진행되고있다. 따라서기존의키토산을수용액에가용화하는기술을개발하는것이키토산을생체재료로이용하기위한가장중요한문제라고할수있다. 본연구에서는이러한목적으로제조된유리아민기 (free-amine group) 를가진저분자량수용성키토산 (low molecular water soluble chitosan, LMWSC) 을 13,14 이용하여생체적합하고체내독성이전혀없는유전자전달체로서의가능성을확인하고자하였다. 본실험을위하여수용성비타민으로서폴레이트 (folate) 수용체 (receptor) 에의해엔도사이토시스 (endocytosis) 과정으로세포내에흡수될수있는 folic acid(fa) 를 LMWSC 에복합화함으로써특정조직을표적할수있는유전자전달체를제조하고자하였다. FA 는엔도사이토시스를매개해주는폴레이트리셉트 (folate receptor) 을거쳐서종양을표적하기위해주로사용되어지는리간드로서, 인간종양조직의표면에풍부하게발현되어지는것으로알려져있으나, 정상조직에는아주작게분포하는것으로알려져있다. 그러므로 FR 은선택적으로종양조직에만특이적인수용체일뿐만아니라가장적합한종양마커 (marker) 로서의역할을제공한다. 15-17 이러한 FA의장점을이용해서 FA가복합화된 LMWSC 나노입자 (water soluble chitosan-folic acid nanoparticle, WSCFA) 를제조하였고또한 LMWSC 의양전하와 DNA 의음전하에의해형성된복합체 (complex) 를이용하여유전자를세포내로안전하게전달시켜유전자발현효율을높인유전자전달체를개발함으로써효율적인항암치료를위한유전자치료의계기를마련하고자하였다. 실험시약및재료. 본연구에사용된시약 LMWSC( 분자량 10 kda, 탈아세틸화도 97%) 는 ( 주 ) 키토라이프에서제공받았다. Folic acid (FA) 는 Sigma-Aldrich(approx.98%) 를사용하였고, EDC(Sigma chemical co. FW:191.7) 를사용하였다. 그리고용매는 DMSO (Junsei chemical co. 99%) 를사용하였다. Agarose 와 Ethidium bromide 는 Promega 사에서구입하였고, 이실험에사용된 DNA는 pegfp-n1 이며, 세포주는 293T 세포로 American Type Culture Collection(Rockville, MD) 에서분양받아사용하였다. Fetal bovine serum(fbs) 은 Hyclone 사에서구입하였고, Penicillinstreptomycin, 0.25%(w/v) Trypsin EDTA 용액, Dulbecco s modified 3-4[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide(mtt), Eagle s medium(dmem) 은 Sigma (St. Louis, MO) 를사용했다. 나머지기타용매및시약은정제된 1급시약을사용하였다. WSCFA의합성. 먼저 LMWSC(10K) 50 mg을증류수 (1 ml) 에녹인후 DMSO(10 ml) 를첨가하여실온에서교반하였다. LMWSC(10K) 50 mg에대한 FA를몰비 3, 5, 10, 15% 와각 FA에대한몰비 1.2 배의 EDC 를상온의암실에서 1시간동안 DMSO(2 ml) 에넣어용해하였다. LMWSC 용액에 FA-EDC 용액을천천히첨가한후상온의암실에서하루정도교반해준다. 그후에햇빛을차단한상태에서증류수로 4일간투석해주고용액을 3일동안동결건조함으로써 WSCFA 를얻었다. 적외선분광학측정. WSCFA 의합성여부를확인하기위하여 FT- IR spectroscopy(shimadzu, FT-IR 8700, Japan) 로분석하였다. 상온의암실에서 3일정도동결건조를시킨혼합물질을 KBr과 WSCFA 혼합비 100:1로약 10 분간혼합하여투명한펠렛을제조한후, 60 에서 12 시간동안감압하여수분을제거하고 FT-IR spectroscopy 로측정하였다. 핵자기공명측정. WSCFA 의합성여부를확인하기위해 1 H-NMR (Bruker AVANCE 400, Germany) 로측정하였다. FA와 LMWSC 는 NMR 용매인 D 2 O를사용하여측정하였다. WSCFA 의나노입자크기와투과전자현미경측정. WSCFA의나노입자크기는동적광산란 (dynamic light scattering, DLS) 을이용해서측정하였고 DLS는 ELS-8,000 electro phoretic LS Spectrophotometer(Otsuka Electronics Co., Japan) 를사용했다. 그리고 WSCFA 나노입자의표면형태는전자투과현미경 (transmission electron microscope, TEM, JEOLJEM-2000 FX-II) 을이용하여측정하였다. 나노입자용액에 phosphotungstic acid 0.01% 를첨가하여카본필름으로코팅된 TEM grid 위에적하하여건조시킨후측정하였다. WSCFA-DNA 복합체제조및전기영동. DNA와 WSCFA 가복합체를형성하기위하여 DNA 와 WSCFA 의무게비를각각 1:1, 1:4, 1:8, 1:12로혼합한다음 e-tube에증류수와함께넣고 60초동안 vortexing 하였고, 복합체형성유무를확인하기위하여전기영동장치 (gel electrophoresis) 를이용하여 gel retardation assay 를수행하였다. 사용된 gel 은 1% Agarose 이며 30분간 100 V 전압으로측정하였다. WSCFA-DNA 복합체의독성확인. 먼저제조된 DNA/WSCFA 복합체의세포독성유무를확인하기위해 293T 세포를사용하였고, 293T cell은 FBS 10% 함유된 DMEM medium 상태에서 CO 2 농도가 5% 이며온도가 37 인 incubator 에서배양하였다. 96 well plate에 1 10 4 cells/well 농도로세포를 seeding한후, 하루동안 incubator 에서배양하였으며, 이미제조된복합체를최종 Polymer(Korea), Vol. 31, No. 5, 2007
456 허선행 ᆞ 장민자 ᆞ 김동곤 ᆞ 정영일 ᆞ 장미경 ᆞ 나재운 농도 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001 mg/ml로첨가한후, 2, 3, 5일간격으로 MTT assay를수행하였다. 유전자발현효율. 5% CO 2 에 37 로유지된 incubator 에서 10% FBS 와항생제가들어있는 DMEM 배양액에인간배아신장세포 (HEK-293) 를배양시킨후 24 well plate 에세포를 4 10 4 cells/ well 로 seeding 후 24시간배양하였다. ph 6.2 와 7.0 분류하여 DMEM(+) 배양액으로갈아준후, 각무게비로계산된복합체용액을각 well 에첨가하고 4시간동안배양한다음 ph 6.2 well 의배양액을 ph 7.0 DMEM(+) 으로갈아주었다. 그후 3일간세포의전이를관찰하였다. 결과및토론 WSCFA의합성및분석. 본연구에서는 Figure 1에서와같이 LMWSC 의아민기와 FA의카복실기를 EDC 반응을이용하여 FA 가 3, 5, 10, 및 15% 치환된 WSCFA 를각각제조하였고, 유전자전달체로서의가능성을확인하고자하였다. Figure 2는제조된 WSCFA 3, 5, 10, 및 15% 의 FT-IR 스펙트럼결과를나타낸것이다. Figure 2에서보는바와같이 LMWSC 의아민기와 FA의카복실기가아미드결합을함으로써 1650 cm -1 부근에서아미드 I 의특성피크가증가하고아미드 II 피크가감소함을알수있다. Figure 3은제조된 WSCFA 3, 5, 10, 및 15% 의 1 H-NMR 스펙트럼을나타낸결과이다. 1 H-NMR 스펙트럼에서 LMWSC 의 1번탄소에결합되어있는수소가 4.3 ppm 에서, 2번-C의수소가 2.6 ppm, 그리고 3.4 3.1 ppm 에서 3 6번-C 의수소가나타남을확인하였으며, FA의특성피크로써 7.3 ppm 에서 7번-C 의수소, 3.6 ppm 에서 8번-C 의수소, 6.1 ppm 에서 9 10번 -C의수소, 6.4 ppm 에서 11 12 번-C 의수소, 그리고 3.1 ppm 에서 13 번- C의수소가확인됨으로써 WSCFA 의합성을확인할수있었다. 이러한결과로부터 FT-IR 과 1 H-NMR을측정하여 LMWSC의특 Figure 1. Scheme of nanoparticle for formation based on WSCFA. WSCFA 15% WSCFA 10% WSCFA 5% WSCFA 3% amide I amide II LMWSC 10K FA C=O 4000 3000 2000 1000 2000 1800 1600 1400 1200 1000 Figure 2. FT-IR spectroscopy of WSCFA nanoparticles. cm -1 cm -1 폴리머, 제 31 권제 5 호, 2007 년
효과적인유전자전달을위한표적성리간드가도입된저분자량수용성키토산나노입자의제조및특성 457 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm Figure 3. 1 H-NMR spectra of WSCFA nanoparticles. 성피크를확인하였고, FA 의치환정도가증가할수록 1550 cm -1 에나타나는아민기의특성피크가감소하는것을확인할수있었다. 이것은 FA가 LMWSC 의아민기에치환됨으로써유리아민 (freeamine) 기가전체적으로줄어들기때문에나타나는현상으로사료된다. 그러므로 FA의카복실기와 LMWSC 의아민기가결합함으로써새로운아미드 I이형성되었다는것을확인하였다. 1 H-NMR 측정결과 WSCFA 에서 2.5 ppm 에있는수소의면적비와 1.5 ppm 에있는키틴의아세틸기수소의면적비를이용하여본연구에서사용한 LMWSC 의탈아세틸화도 (degree of deacetylation, DDA (%)) 가 96% 임을확인하였고, 2.5 ppm 과 1.5 ppm 에있는 LMWSC 의수소에대한면적비와 8.4 ppm 에있는 FA의수소면적비를이용하여치환도 (degree of substitution, DS(%)) 를계산하였고, 결과로써각각 2, 4, 9, 및 13% 임을확인하였으며, 결과는 Table 1 에나타내었다. WSCFA-DNA 복합체의특성. WSCFA 의경우분자내에친수성을나타내는 LMWSC 와소수성을나타내는 FA가함께공존하는양친성 (amphiphilic) 물질의특성을나타내게된다. 소수성기와친수성기를모두갖는양친성물질은수용액상에서미셀이나, 입자를형성할수있다는독특한특성때문에생명공학이나의학분야에다양하게응용이되어진다. 소수성그룹은물에대한낮은용해도와물에용해되지않는부분의소수성결합을형성하기때문에양친성물질은수용액에서소수성 core 와친수성 shell 의형태를갖는자기회합체를형성하게된다. 특히양친성고분자미셀은소수성 core 에유전자치료제를담지할수있음으로생체내에서유전자전달체로활용가치가매우높은물질이다. 본연구에서제조한 Table 1. Characterization of WSCFA Samples DDA b DS c WSCFA 3% a 96.38% 2.48% WSCFA 5% 96.29% 4.20% WSCFA 10% 96.33% 9.22% WSCFA 15% 96.12% 13.74% a LMWSC conjugated FA 3%. b Degree of deacetylation, calculated from 1 H-NMR data of WSCFA. c Degree of substitution, calculated from 1 H-NMR data of WSCFA. WSCFA 도수용액하에서소수성결합을통하여자가응집의형태로나노입자를형성하였으며, 이나노입자의크기및분포는동적광산란 (DLS) 으로측정하였고입자의이미지를투과전자현미경 (TEM) 으로관찰하였다. Figure 4(a) 에서 DLS 로측정한나노입자의크기는 110 nm 정도이고입자의크기가고르게분포되었음을알수있는좁은분포도를확인하였다. 그리고 Figure 4(b) 에서 TEM 으로 WSCFA 의표면형태를확인한결과 100 nm 정도의표면이매우매끄러운구형의나노입자를확인함으로써 DLS 측정결과와거의일치함을알수있었다. 이러한결과로 WSCFA 가 100 nm 정도의나노입자를형성함으로써유전자전달체로서의높은응용가능성을확인하였다. 전기영동분석. WSCFA 와 DNA 의복합체형성유무를확인하기위하여전기영동분석을수행하였다. Figure 5에서복합체가형성되지않은 naked plasmid DNA 는정상적인이동성을나타내었으나, WSCFA-pDNA 복합체의무게비 1:1 를제외한그이상인 1:4, 1:8, 1:12 의무게비에서는복합체가완전히형성됨으로 Polymer(Korea), Vol. 31, No. 5, 2007
458 허선행 ᆞ 장민자 ᆞ 김동곤 ᆞ 정영일 ᆞ 장미경 ᆞ 나재운 40 30 110.5±15.2 Intensity(a.u.) 20 10 0 1 10 100 1000 Particle size(nm) (a) Figure 6. Transfection of WSCFA-pEGFP plasmid DNA complex. 180 160 140 Cell viability(%) 120 100 80 60 40 20 (b) 0 control WSCFA3 WSCFA5 WSCFA10 WSCFA15 Figure 4. Particlesize & TEM photograph of WSCFA(10%). Figure 7. Cell viability of HEK 293T cell with WSCFA nanoparticles. Figure 5. Gel Retardation Assay(WSCFA-DNA complex). 써 DNA 의이동성이완전히지연되어나타나는것을확인함으로써낮은무게비에서 WSCFA 에의해 DNA 가복합체를형성할수있음을확인하였다. 음이온성의 pdna 와복합체를형성하기위해서는양이온성의 WSCFA 와 DNA 의무게비가 1:4 이상임을알수있었다. WSCFA-pEGFP Plasmid DNA 복합체의전이효율. Figure 6은 293T 세포에대한세포전이효율을평가하기위하여 ph 6.2와 7.0 DMEM(+) 배양액에인간배아신장세포 (HEK-293) 를배양후 WSCFA 와 pdna 무게비 (1:20, 1:40) 로복합체를형성하여실험한결과시간이지날수록유전자발현효율이높아지며 ph 6.2 에서 1:40 일때유전자발현효율이가장높게나타남을알수있었다. 먼저무게비가 1:20 보다 1:40 이더높은발현효율을나타낸것은양이온의전하를가진 LMWSC 의양이많을수록세포표면의음전하와의강한상호작용에의해세포내로훨씬더많은양 의복합체가흡수될수있기때문인것으로사료된다. 또한 ph 6.2 에서배양했을때 ph 7.0 보다유전자발현효율이더높게나타난것을확인할수있었는데이것은일반적으로키토산의 pka 값이 6.3 정도임을감안할때낮은 ph 에서 LMWSC 가강한산성을나타내며따라서훨씬더안정한복합체를형성할수있기때문이다. 세포생존율. Figure 7은양이온성비바이러스성벡터인 WSCFA 의세포생존율에미치는영향을알아보기위하여 MTT 실험을하였다. WSCFA 3, 5, 10, 15% 모두세포생존율이대조군보다높은결과를나타냈으며, 최종농도가낮을수록세포생존율이높다는것을알수있다. 이결과로부터본연구에서제조한유전자전달체로서 WSCFA 는인체내에독성을나타내지않는안전한유전자전달체로서의가능성을확인하였다. 결론본연구에서는특정세포의표적성을높이고유전자발현효율을향상시키기위한유전자전달체로서 FA의카복실기와 LMWSC 의아민기를결합하여 WSCFA 를제조하였다. WSCFA 의입자크기를측정한결과 110 nm 정도이고, 입자형태는구형의나노입자를 DLS 와 TEM 으로확인하였으며, 이러한결과로인체내의유전자전달체로사용할수있는크기에대한적합성을확인할수있었다. FT-IR 스펙트럼에서는 FA의카복실기와 LMWSC 의아민기를 폴리머, 제 31 권제 5 호, 2007 년
효과적인유전자전달을위한표적성리간드가도입된저분자량수용성키토산나노입자의제조및특성 459 합성하여 1550 cm -1 에나타나는아미드 I 피크가증가하는반면, 아민기의특성피크가줄어드는것을확인할수있었다. 이결과로부터 FA 의카복실기와 LMWSC 의아민기가결합함으로써새로운아미드 I 결합이생성되었음을확인하였다. 1 H-NMR 스펙트럼에서는 FA 와 LMWSC 각각의특성피크를확인하였고 WSCFA 의탈아세틸화도 (DDA) 는 96% 이고, 치환도 (DS) 는각각 2, 4, 9, 및 13% 임을확인하였다. 그리고전기영동을측정한결과 WSCFApDNA 복합체의무게비 1:4 이상에서복합체가완전히형성됨을확인할수있었다. 유전자발현효율을알아보기위해 WSCFA 와 pdna 무게비 (1:20 및 1:40) 로복합체를형성하여실험한결과, ph 6.2 에서 1:40일때유전자발현효율이가장높게나타났다. 그리고무게비가 1:20 보다 1:40 이더높은발현효율을나타냈으며, ph 7.0 보다 6.2 에서유전자발현효율이더높게나타난것을확인할수있었다. WSCFA 의독성실험결과독성이없음을확인하였다. 이상의결과로부터 WSCFA 는유전자전달체로서의가능성을입증하였다. 감사의글 : 본연구는산학협동재단 (2007) 과중소기업청 (2007) 의재정적지원으로이루어졌으므로이에감사드립니다. 참고문헌 1. R. S. Kevin, Gene Ther., 34, 247 (2003). 2. E. Marshall, Science, 269, 1050 (1995). 3. K. Morimoto, M. Nishikawa, S. Kawakami, T. Nakano, Y. Hattori, S. Fumoto, F. Yamashita, and M. Hashida, Mol. Therpy, 7, 254 (2003). 4. M. D. Brown, A. G. Schatzlein, and I. F. Uchegbu, Int. J. Pharm., 229, 1 (2001). 5. C. Y. Choi, M. K. Jang, and J. W. Nah, Polymer(Korea), 30, 279 (2006). 6. R. A. A. Muzzarelli, Natural chelating polymers, Pergamon Press, Oxford, p 83 (1973). 7. C. J. Brine, P. A. Sanford, and J. P. Zikakis, Advances in Chitin and Chitosan, Elsevier Applied Science, London, p 30 (1992). 8. G. Skjak-Braek, T. Anthonsen, and P. Sanford, Chitin and Chitosan, Elsevier Applied Science, London, p 30 (1989). 9. C. H. Kim, H. S. Park, Y. J. Gin, Y. Son, S. H. Lim, Y. J. Choi, K. S. Park, and C. W. Park, Macromol. Res., 12, 367 (2004). 10. Y. Shigemasa, H. Sashimoto, and I. Azuma, Chitin Derivatives in Life Science, Japanese Society for Chitin/Chitosan, p 86 (1992). 11. I. Ikeda, M. Sugano, K. Yoshida, E. Sasaki, Y. Iwamoto, and K. Hatano, J. Agric. Food Chem., 41, 431 (1993). 12. R. A. A. Muzzarelli, C. Lough, and M. Emanuelli, Cabohydr. Res., 8, 433 (1987). 13. M. K. Jang, Y. I. Jeong, C. S. Cho, S. H. Yang, Y. E. Kang, and J. W. Nah, Bull. Korean Chem. Soc., 23, 914 (2002). 14. J. W. Nah and M. K. Jang, J. Polym. Sci.; Part A: Polym. Chem., 40, 3796 (2002) 15. P. Caliceti, S. Salmaso, A. Semenzato, T. Carofiglio, R. Fornasier, M. Fermeglia, M. Ferrone, and S. Pricl, Bioconjugate Chem., 14, 899 (2003). 16. S. Wang, R. J. Lee, C. J. Mathias, M. A. Green, and P. S. Low, Bioconjugate Chem., 7, 56 (1996). 17. K. M. Kamruzzaman Selim, J. H. Lee, S. J. Kim, Z. Xing, and I. K. Kang, Macromol. Res., 14, 646 (2006). Polymer(Korea), Vol. 31, No. 5, 2007