안동현.fm

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 28(2): 123-130 (2013) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2013.28.2.123 연구논문 송엽에탄올추출물의아토피저해활성 정다현 1, 김꽃봉우리 2, 정슬아 1, 김현지 1, 강보경 1, 박시우 1, 김태완 3, 안동현 1 * Effect of Pine needle Ethanol Extracts on the Inhibitory Activity of Atopic Dermatitis Da-Hyun Jeong 1, Koth-Bong-Woo-Ri Kim 2, Seul-A Jung 1, Hyun-Jee Kim 1, Bo-Kyeong Kang 1, Si-Woo Bark 1, Tae-Wan Kim 3, and Dong-Hyun Ahn 1 * 접수 : 2012 년 10 월 17 일 / 게재승인 : 2013 년 4 월 22 일 2013 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: The aim of this study was to examine inhibitory effects of pine needle ethanol extracts (PNEE) on atopic dermatitis (AD). To determine inflammatory activity PNEE was added to LPS-induced murine peritoneal macrophages for an in-vitro test. In addition, anti-ad test was carried out by spreading PNEE on the dorsal skin of 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB)- induced BALB/c mice. It was confirmed that the nitric oxide (NO) secretion was suppressed when 1~ 50 µg/ml of PNEE were added to LPS-induced murine peritoneal macrophages. Moreover, levels of TNF-α, IL-6, and IL-1β were decreased. For the anti-ad test, PNEE alleviated symptoms of the erythema in DNCB-induced mice. Furthermore, the IFN-γ secretion of the group treated with PNEE was increased in splenocytes from DNCB-induced mice compared to the positive control, while IL-4 secretion diminished. Through these results, we can conclude that PNEE can 1 부경대학교식품공학과 / 식품연구소 1 Department of Food Science & Technology/Institute of Food Science, Pukyong National University, Busan 608-737, Korea Tel: +82-51-629-5831, Fax: +82-51-629-5824 e-mail: dhahn@pknu.ac.kr 2 부경대학교수산과학연구소 2 Institute of Fisheries Sciences/Pukyong National University, 474, Ilgwang-ro, Ilgwang-myeon, Gijang-gun, Busan 619-911, Korea 3 안동대학교식품생명공학과 3 Department of Food and Technology, Andong University, Gyeongbuk 760-740, Korea inhibit AD by modulating the IFN-γ, IL-4 cytokines production and inhibiting inflammation. Keywords: Pine needle, Anti-atopy, Anti-inflammation 1. 서론 아토피피부염은외부항원에지속적으로노출되어발병되는염증질환으로전세계적으로약 10~20% 의인구가아토피피부염을겪고있다 [1]. 최근우리나라에서소아 청소년아토피피부염환자수가급증하고있으며, 2008 년국민건강영양조사에의하면아토피피부염은 1~5 세사이의어린이에서 19.2% 로 5 명중 1 명이앓고있는것으로나타났다. 아토피피부염은주로가려움과염증을수반하는만성염증성피부질환으로써 [2], 아토피피부염이유발되는원인은명확하게밝혀지지않았으나유전적소인, 면역학적요인및환경요인이복합적으로작용하여발생하는것으로알려져있다 [3-5]. 아토피피부염의발생에있어지금까지보고된면역학적특성으로는혈중 IgE 항체및 IL-4 cytokine 의분비량이증가하고 IFN-γ cytokine 의분비량은감소하는것으로, 질환초기에는항원을인식한 T 세포가 IL-4, IL-5 및 IL-13 cytokine 을분비하여 [6,7] naive CD4+ T 세포가 Th 2 세포로분화하도록조절하고, B 세포의활성화가촉진되어 IgE 의생성을증가시킨다 [8,9]. 또한 IFN-γ 및 IL-12 와같은 Th 1 type 의 cytokine 을감소시킨다 [10]. 반면후기에발생하는만성아토피피부염의경우에는 2 차적인미생물의감염에의해 IFN-γ cytokine 의발현수준이증가하는것으로, Th 1 세포면

124 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 28(2): 123-130 (2013) 역반응이증가하게된다. IFN-γ cytokine 은대식세포및 NK 세포를활성화시키고, 활성화된대식세포는 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 와같은 cytokine 을분비하여각질세포의자멸사를촉진시키는등만성적인염증을유발한다 [11,12]. 최근에는면역학적기전뿐만아니라피부장벽의손상도아토피피부염악화의주요한요인으로대두되고있다. 표피중에서도가장바깥에존재하는각질층은각질형성세포로부터형성되며, 분화된각질세포와그를둘러싼지질층으로구성되어있다 [13]. 이러한피부장벽은과도한세안이나목욕등의생활습관이나건조한대기, 오염물질등의환경적요인및각질형성세포의지질합성능력저하등과같은내인성질환등으로인해쉽게손상 [14] 되어아토피피부염을유발하는것이다. 아토피피부염치료제로염증반응과 cytokine 생산을억제하는스테로이드제가주로이용되고있으나, 장기간투여할경우피부의위축이나성장지연가능성등여러가지부작용을초래하여최근에는비스테로이드제의사용이증가하고있다. 그러나비스테로이드제역시홍반, 가려움, 부종, 짓무름및태선화등의증상과면역력약화등의다양한부작용을가지고있어근본적인아토피피부염의치료가어려운실정이다 [15,16]. 따라서안전성이입증된천연물로부터치료효과가높고부작용이적은새로운물질을찾고자하는연구가많이이루어지고있다. 현재까지보고된항아토피소재로는황금열수추출물 [17], 두충추출물 [18], 천년초추출물 [19], 김치추출물 [20], 어성초추출물 [21] 및비파엽과삼백초추출물 [22] 등이있다. 한편, 송엽 (pine needle) 은국내에자생하는상록침염교목인소나무 (Pinus densiflora) 의잎으로바늘과닮았다고해서침엽으로표현하고있으며예로부터신선한잎을따서그대로쓰여왔으며차를만들어신경통, 관절염, 팔다리마비, 동맥경화증등의치료에사용되었던기록이전해져오고있다 [23]. 송엽에는비타민 C 와 K, 카로틴, 플라보노이드, 안토시안, 탄닌및정유등이함유되어있으며다양한종류의 terpene 화합물이포함되어있는것으로보고되었다 [24]. 최근송엽의면역활성 [25], 항당뇨효과 [26], 송엽증류액의암세포에대한 in vitro 세포독성 [27], 지질저하및항산화효과와항균효과 [28] 등많은연구들이보고되면서송엽은다양한약리활성을가진천연식물로인정되고있다. 따라서본연구에서는아토피피부염을유발한마우스대식세포및비장세포의 cytokine 분비량및세포증식능을측정하여송엽의에탄올추출물의아토피저해효과를연구하고자하였다. 2. 재료및방법 2.1. 재료본실험에사용한송엽 (Pine needle) 은울진에서자생하는금강송으로부터채취된것으로 ( 주 ) 솔나라에서공급받아사용하였다. 시료에 10 배양의 70% 에탄올을가하여실온에서 10 시간교반하여추출하였다. 원심분리및여과한후, rotary evaporator (RE200, Yamato Co., Tokyo, Japan) 로농축하여 -20 o C 에서보관하며실험에사용하였다. 2.2. 실험동물생후 6 주령의암컷 BALB/c 마우스및생후 4 주령의수컷 BALB/c 마우스를사용하였다. 마우스는오리엔트바이오 (Orient Co., Seongnam, Korea) 로부터구입하여온도 20± 2 o C, 습도 50±10%, 12 시간명암주기가유지되는동물실에서 1 주일간예비사육한후실험에사용하였다. 2.3. ph 및색도송엽에탄올추출물의 ph 는 5mg/mL 의농도로 ph meter (HM-30V, Toa, Kobe, Japan) 를사용하여측정하였으며, 색도는색차계 (JC801 Color technosystem Co., Tokyo, Japan) 를이용하여측정하였다. 0.5 mg/ml 농도의송엽에탄올추출물을액체 cell 에 10 ml 씩넣고, 명도 (Lightness, L*), 적색도 (Redness, a*), 황색도 (Yellowness, b*) 값을측정하였다. 이때사용한표준백판값은 L* = 93.73, a* = -0.12, b* = 0.11 이었다. 2.4. 대식세포분리및배양 Mishell 등 [29] 의방법을약간변형하여마우스복강대식세포를분리하였다. 생후 6 주령의암컷 BALB/c 마우스에 3% thioglycollate 를복강주사하여대식세포의생성을유도하고, 4 일후 RPMI 1640 배지로복강을세척하였다. 회수한복강세척액은 4 o C, 1800 rpm 에서 5 분간원심분리 (UNION 32R, Hanil Co., Incheon, Korea) 한후, RBC lysis buffer (Trisbuffered ammonium chloride; 0.87% NH 4 Cl, ph 7.2) 에 10 분간정치시켜적혈구를제거하였다. 그후, 10% FBS (Fetal bovine serum)-rpmi 1640 배지를첨가하여 5 10 5 및 5 10 6 cell/ml 농도로희석하고이를 well plate 에분주하여 37 o C, CO 2 incubator (MCO-15 AC, Sanyo, Osaka, Japan) 에서 4 시간배양하였다. 배양후, RPMI 1640 배지로 3 회세척하여비부착세포를제거하고 10% FBS-RPMI 1640 배지를첨가하였다. 그후, PBS (Phospate buffered saline, ph 7.2), LPS (Lipopolysacchride, 5 µg/ml), 송엽 70% 에탄올추출물을첨가하여 37 o C, CO 2 incubator (MCO-15 AC, Sanyo, Osaka, Japan) 에서 12 및 24 시간동안배양하였다. 2.5. 대식세포의 nitric oxide 분비량측정대식세포로부터생성되는 nitric oxide (NO) 의양을 griess 반응을이용하여측정하였다. 각 microplate 에 24 시간배양한대식세포상층액을넣고, 동량의 griess 시약 (1% sulfanilamide + 0.1% naphthylendiamine dihydrochloride, 1:1) 을첨가하여실온에서 10 분간반응시킨후, microplate reader 기 (Model 550, Bio-rad, Richmond, USA) 를이용하여 540 nm 에서흡광도를측정하였다. 세포배양액내 NO 의농도는 sodium nitrite (NaNO 2 ) 의농도별표준곡선과비교하여산출하였다.

송엽에탄올추출물의아토피저해활성 125 2.6. 대식세포의 cytokine 분비량측정세포배양액내의 TNF-α, IL-6 및 IL-1β cytokine 의분비량을 ELISA-kit (Mouse ELISA set, BD Bioscience, San Diego, USA) 를이용하여측정하였다. 이를위해 microplate 에 capture antibody 로 anti-mouse TNF-α, IL-6 및 IL-1β 를분주하여 4 o C 에서하룻밤동안 coating 시켰다. 이를 PBST (0.01 M PBS, ph 7.2, 0.05% Tween 20) 로세척하여 10% FBS 용액으로 blocking 하였다. PBST 로세척한뒤, 각 miroplate 에 NO 를측정했던것과동일한배양상층액을분주하고실온에서 2 시간반응시켰다. 다시 PBST 로세척한뒤희석한 biotinylated antimouse TNF-α, IL-6 detection antibody 와 streptavidin-horseradish peroxidase conjugate 를첨가하여실온에서 1 시간반응시켰다. IL-1β 의경우, biotinylated anti-mouse IL-1β detection antibody 를첨가하고 1 시간반응후, streptavidin-horseradish peroxidase conjugate 를첨가하여 30 분반응시켰다. 그후, 이를다시 PBST 로세척한다음, OPD (o-phenylenediamine) 및 H 2 O 2 를첨가한 phosphate citrate buffer (ph 5.0) 을첨가하여실온에서 30 분동안암반응시켰다. 2 N H 2 SO 4 로반응을종료시킨후, microplate reader (Model 550, Bio-rad, Richmond, USA) 를이용하여 490 nm 에서흡광도를측정하였다. 2.7. 아토피피부염유발및시료처리 Ahn 등 [30] 의방법을약간변형하여아토피피부염을유발하였다. 생후 4 주령의수컷 BALB/c 마우스의등부위를깨끗하게제모한후, 미세상처가치유되도록 24 시간방치하였다. 24 시간후 1% DNCB (dinitrochlorobenzen) 용액 (acetone: olive oil = 3:1) 을일주일에 3 번마우스의귀뒤쪽과등부위에도포하고, 일주일후부터는 0.3% DNCB 용액을하루에한번동일한부위에고르게도포하였다. 시료는 0.3% DNCB 용액과 12 시간간격으로하루에한번 2 주동안마우스의귀뒤쪽과등부위에고르게도포하였다. 2.8. 비장세포분리및배양 Mishell 등 [29] 의방법을약간변형하여비장세포를분리하였다. 아토피피부염을유발시킨생후 4 주령의수컷 BALB/c 마우스를경추탈골법으로희생시킨후, 비장을무균적으로적출하였다. 적출한비장은 RPMI 1640 배지로세척한후, tissue grinder 로균질화하여세포를유리시켰다. 세포현탁액을 4 o C, 1800 rpm 에서 5 분간원심분리한후, RBC lysis buffer 에 10 분간정치시켜적혈구를제거하였다. 그후, 10% FBS- RPMI 1640 배지를첨가하여 2 10 6 cell/ml 농도로희석된비장세포현탁액을 37 o C, CO 2 incubator 에서 72 시간동안배양하였다. 2.9. 비장세포배양액의 cytokine 분비량측정비장세포배양액의 IFN-γ 및 IL-4 cytokine 분비량을대식세포배양액의 cytokine 분비량측정과동일한방법으로측정하였다. 2.10. 혈청의 total IgE 함량측정실험종료일에 eye bleeding 으로채혈한후, 이를 4 o C, 10,000 rpm 에서 5 분동안원심분리하여혈청을분리하였다. 분리한혈청은실험에사용하기전까지 -20 o C 에서보관하였으며, 마우스혈청내 total IgE 의함량은 ELISA kit 를이용하여측정하였다. 먼저, ELISA microplate 에 anti-mouse IgE 를분주하여 4 o C 에서하룻밤동안 coating 시켰다. 이를 PBST 로세척하고 2% BSA (Bovine serum albumin) 용액으로 blocking 하였다. 이를 PBST 로세척한뒤, 각 microplate 에 1/30 로희석한혈청을넣고실온에서 2 시간반응시켰다. 다시 PBST 로세척하고희석한 biotinylated anti-mouse IgE strepavidin-horseradish peroxidase conjugate 를넣어실온에서 1 시간반응시켰다. 이를다시 PBST 로세척한다음, OPD 및 H 2 O 2 를첨가한 phosphate citrate buffer 를첨가하여실온에서 30 분동안암반응시켰다. 반응을종료시키기위해각 microplate 에 2N H 2 SO 4 를넣은후, microplate reader 기를이용하여 490 nm 에서흡광도를측정하였다. 2.11. 비장세포의증식능측정비장세포현탁액을 2 10 6 cell/ml 농도로 well plate 에분주한후, 37 o C, CO 2 incubator 에서 72 시간배양하였다. 배양후, MTT (thiazol blue tetrazolium bromide, 5 mg/ml) 시약을첨가하고 2 시간재배양하여 formazan crystal 형성을유도하였다. 이를 4 o C, 2000 rpm 에서 10 분간원심분리한후, 상층액을제거하고 DMSO (dimethyl sulfoxide) 를첨가하여 540 nm 에서흡광도를측정하였다. 비장세포증식능은다음식에의해계산하였다. Proliferation Index (%) = (Sample 의흡광도 / Control 의흡광도 ) 100 2.12. 통계처리모든실험에대한통계처리는 SAS program (Statistical analytical system V8.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 을이용하여 one way ANOVA 법으로분산분석을실시하였으며, 조사항목들간의유의성검정은 Duncan 의다중검정법으로 p<0.05 수준에서실시하였다. 3. 결과및고찰 3.1. ph 및색도최근건강지향적인소비자의욕구로인해다양한생리활성을지니는천연물을식품산업에적용하려는시도가활발히이루어지고있다. 천연물의 ph 는가공식품제조시품질에영향을미치는중요한요인으로효모및효소의활성 [31], 단백질의용해도및추출수율 [32] 에관여한다. 또한천연물은 chlorophyll, carotenoid 및 flavonoid 등다양한색소성분을

126 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 28(2): 123-130 (2013) Table 1. ph and color value of Pine needle ethanol extracts Color ph L* a* b* Pine needle ethanol extract 5.46±0.00 70.41±0.03-11.30±0.00 83.19±0.15 다량함유하고있어식품에첨가시식품자체의색뿐만아니라저장및가공중최종제품의품질에영향을미칠수있다 [33]. 따라서송엽에탄올추출물의 ph 및색도를측정한결과를 Table 1 에나타내었다. 송엽에탄올추출물의 ph 는 5.46 의값으로약산성을나타냈으며색도는명도, 적색도및황색도가각각 70.41, -11.30 및 83.19 로명도, 황색도가높고적색도가아주낮은것으로나타났다. 3.2. 대식세포의 nitric oxide 분비량대식세포는박테리아와같은항원의침입에의한초기면역반응을담당하는세포로서, 이러한박테리아를사멸시키기위해여러가지물질을분비한다. 이중 nitric oxide (NO) 는생체내에서 NO synthase (NOS) 라는효소의촉매작용을통해 L-arginine 으로부터생성되는반응성이강한자유라디칼로써면역반응, 세포독성, 신경전달계및혈관이완등의생물학적과정에영향을미치며내피세포의증식억제및종양세포에대한방어작용을하는중요한신호전달물질이다 [34]. 하지만 LPS 에의해많은양의 NO 가생성되고, 이에의한세포독성으로조직의파괴및면역체계의이상으로나타나는염증반응및종양발생등에관여하게된다 [35]. 따라서송엽에탄올추출물이 LPS 로염증이유도된마우스대식세포의 NO 분비능에미치는영향을알아보기위해대식세포배양액의 NO 2 농도를측정하였다 (Fig. 1). LPS 처리후 NO 분비량은정상세포에비해 4 배이상증가되었으며, 송엽에탄올추출물을처리하였을경우, NO 생성량이 LPS 처리구보다유의적으로감소함을확인하였다. 특히 50 µg/ml 농도에서현저히낮은 NO 분비량을보였으며, 추출물을처리하지않은군과비교하여약 50% 이상의높은 NO 분비저 해능을보임을확인하였다. 유사한결과로, Yen 등 [36] 은솔잎에틸아세트산추출물 50 µg/ml 농도에서 86% 의높은 NO 합성저해율을보고한바있다. 따라서송엽에탄올추출물처리가 NO 분비량을저해함으로써항염증에효과가있을것으로사료된다. 3.3. 대식세포의 cytokine 분비량 TNF-α, IL-6 및 IL-1β cytokine 은활성화된대식세포에서분비되는대표적인항염증성 cytokine 으로초기면역반응에있어중요한역할을한다. 종양괴사인자인 TNF-α 는체내에서대식세포나림프구등백혈구에의해생성되어지는 cytokine 으로여러급성또는만성염증질환의발생및진행에중요한역할을한다 [37]. IL-6 는 B 세포의분화를촉진하여항체생산을증가시키는반면, 체내에서과잉생성될경우악성종양이나자가면역질환및감염성질환등의여러가지질환을유발하는것으로알려져있다. 또한 IL-1β 는 NO 를생성하게하는매개물질이며, T 세포의활성화, B 세포의성숙및 NK cell 을활성화시키는 cytokine 이다 [38,39]. 따라서송엽에탄올추출물을마우스대식세포에첨가하여배양한후, TNF-α, IL-6 및 IL-1β cytokine 의분비량을측정하였다 (Fig. 2~4). TNF-α 의경우 1~10 µg/ml 농도에서유의적으로증가하였으나, 50 µg/ml 농도에서현저히낮은분비량을보였으며 PBS 만을처리한군과유의적인차이가없었다. 이는 porcine peripheral blood mononuclear cell 에 CLA 를처리한뒤 TNF-α 분비량을측정한결과 [40] 와유사하다. IL-6 및 IL-1β 의경우, 송엽에탄올추출물첨가에의해농도의존적으로감소하였다. 이러한결과는송화에탄올추출물 [41] 및송엽에탄올추출물 [42] 을첨가하여처리한후분비량을측 Fig. 1. Inhibitory effects of pine needle ethanol extracts on the secretion of NO in peritoneal macrophages. a-d means with different superscripts are significantly different (p<0.05) as determined by duncan s multiple range test. Fig. 2. Inhibitory effects of pine needle ethanol extracts on the secretion of TNF-α in peritoneal macrophages. a-d means with different superscripts are significantly different (p<0.05) as determined by duncan s multiple range test.

송엽에탄올추출물의아토피저해활성 127 Fig. 3. Inhibitory effects of pine needle ethanol extracts on the secretion of IL-6 in peritoneal macrophages. a-d means with different superscripts are significantly different (p<0.05) as determined by duncan s multiple range test. Fig. 5. Effects of pine needle ethanol extracts on IFN-γ secretion in splenocyte from atopic dermatitis-like skin lesions mice. Negative control (NC): untreated, Positive control (PC): DNCB and vehicle, Pine needle: DNCB and pine needle ethanol extracts. a-c means with different superscripts are significantly different (p< 0.05) as determined by duncan s multiple range test. Fig. 4. Inhibitory effects of pine needle ethanol extracts on the secretion of IL-1β in peritoneal macrophages. a-d means with different superscripts are significantly different (p<0.05) as determined by duncan s multiple range test. 정한결과와유사한경향을보였다. 이러한결과로미루어볼때, 송엽에탄올추출물이효과적으로염증성 cytokine 의생성을억제시켜, 항아토피기능물질로이용할수있을것으로기대된다. 3.4. 비장세포배양액의 cytokine 분비량아토피피부염은알레르기증상의하나로, 면역학적으로 T 세포, 호산구, 비만세포등다양한세포들에의해발병되는것으로알려져있다. 최근아토피피부염의면역학적요인에관한연구가활발히진행되면서급성및만성에관여하는면역기전에차이가있음이밝혀지고있다 [4,5]. 이에본연구에서는송엽에탄올추출물이어떤면역학적요인에의해아토피피부염을억제하는지알아보기위해마우스에아토피피부염을유발하고비장을분리 배양하여 Th 1 cytokine 인 Fig. 6. Effects of pine needle ethanol extracts on IL-4 secretion in splenocytes from atopic dermatitis-like skin lesions mice. Negative control (NC): untreated, Positive control (PC): DNCB and vehicle, Pine needle: DNCB and pine needle ethanol extracts. a-c means with different superscripts are significantly different (p<0.05) as determined by duncan s multiple range test. IFN-γ 와 Th 2 cytokine 인 IL-4 의분비량을측정하였다. 그결과, IFN-γ 의분비량이유의적으로증가하였으나 negative control 에비해현저히낮은값을보였다 (Fig. 5). IL-4 의분비량의경우 (Fig. 6), positive control 에비해낮은값을보였다. 이는땅콩껍질추출물 [43] 및 Quillaja saponin [44] 을비장세포에처리한경우 IFN-γ 의분비량증가와더불어 IL-4 의분비량이감소하였다는연구결과와일치하였다. 따라서송엽에탄올추출물이 Th 1 세포와 Th 2 세포의조절을통한아토피피부염억제에효과적일것으로사료된다. 3.5. 혈정의 total IgE 함량아토피피부염을가진환자의 80~85% 가혈청중총 IgE 의

128 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 28(2): 123-130 (2013) Fig. 7. Effects of pine needle ethanol extracts on total IgE secretion in sera from atopic dermatitis-like skin lesions mice. Negative control (NC): untreated, Positive control (PC): DNCB and vehicle, Pine needle: DNCB and pine needle ethanol extracts. a-b means with different superscripts are significantly different (p< 0.05) as determined by duncan s multiple range test. 함량이상승되어있으며아토피피부염뿐만아니라천식, 비염등의알레르기성질환의발현에 IgE 가중요한역할을한다고알려져있다. 그러므로알레르기성질환에있어 IgE 의생산조절기전을알아내려는연구가많이보고되어왔다 [45]. 이에본실험에서는송엽에탄올추출물의처리가 IgE 의분비에미치는영향을알아보기위해혈청의 total IgE 함량을측정하였다. 그결과 (Fig. 7), 송엽에탄올추출물처리구의경우 positive control 과유의적인차이를보이지않았다. Fig. 8. Effects of pine needle ethanol extracts on the proliferation splenocytes from atopic dermatitis-like skin lesions mice. Negative control (NC): untreated, Positive control (PC): DNCB and vehicle, Pine needle: DNCB and pine needle ethanol extracts. a-b means with different superscripts are significantly different (p<0.05) as determined by duncan s multiple range test. Fig. 9. Effects of pine needle ethanol extracts in atopic dermatitislike skin lesions mice. Negative control (NC): untreated, Positive control (PC): DNCB and vehicle, Pine needle: DNCB and pine needle ethanol extracts. 3.6. 비장세포의증식능측정 MTT assay 는살아있는세포내미토콘드리아의탈수소효소작용에의하여노란색의수용성기질인 MTT tetrazolium 을청자색을띄는비수용성의 MTT formazan (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-di-phenyl-tetrazolium bromide) 으로환원시키는원리를이용하는검사법이다 [46]. 이에송엽에탄올추출물의도포가비장세포의증식에미치는영향에대해알아보기위해 DNCB 로아토피피부염을유발한마우스에 2 주간송엽에탄올추출물을처리한후, 비장세포를분리 배양하고 MTT assay 를실시하였다. 그결과, 송엽에탄올추출물처리구의비장세포증식능이약 50% 증가하였다 (Fig. 8). 따라서송엽에탄올추출물의도포는비장세포증식능을증가시켜면역세포를활성화시키는것으로사료된다. 3.7. 아토피피부염증상아토피피부염은태선화, 인설및건조와같은증상을유발한다. 또한급 만성기전반에걸쳐소양감이발생하게되는데, 이는긁는행위로인해창상, 2 차감염등 2 차적인피부증상악화를초래하기때문에아토피피부염치료에있어서중요시되고있다. 이에본연구에서는피부염을인위적으로일으키는 hapten 형성물질인 DNCB (2,4-dinitrochlorobenzene) 를 BALB/c 마우스의등부위에도포하여아토피피부염유사마우스모델을만든후, 송엽에탄올추출물을도포하여아토피피부염증상에미치는영향을알아보았다 (Fig. 9). 아토피피부염증상은제모직후, DNCB 로아토피피부염유발, 시료도포 1 주일과 2 주일에마우스등피부조직의외형적변화 ( 홍반, 가려움과건조피부, 부종, 짓무름및태선화 ) 를관찰하였다. 제모직후에는모든처리구에서큰차이를보이지않았으며, DNCB 를이용한아토피피부염유발기간동안 negative control 에비해 DNCB 처리구에서짓무름, 홍반및부종을관찰할수있었다. 송엽에탄올추출물을 1 주일도포하였을때, positive control 에비해홍반, 가피, 짓무름및건조함의증상이감소한것을확인할수있었고 2 주일도포시, 홍반및부종증상이현저히감소하였다. 이러한결과는황

송엽에탄올추출물의아토피저해활성 129 련해독탕 [47] 및자초추출물 [48] 도포에의해홍반및소양감증상이감소하였다는연구결과와일치하였다. 이상의결과를통해송엽에탄올추출물은아토피피부염증상을감소시켜아토피피부염치료외용제로이용할수있을것으로기대된다. 4. 결론 아토피피부염마우스모델을이용하여송엽에탄올추출물의아토피피부염억제효과를확인하기위해대식세포배양상층액의 NO 와 TNF-α, IL-6 및 IL-1β cytokine 분비량을측정하였다. 그결과, 50 µg/ml 농도에서현저히낮은 NO 분비량을보였으며, 추출물을처리하지않은군과비교하여약 50% 이상의높은 NO 분비저해능을보임을확인하였다. TNF-α, IL-6 및 IL-1β 의경우, 송엽에탄올추출물첨가에의해농도의존적으로감소하였다. 비장세포배양상층액의 IFN-γ 와 IL-4 cytokine 분비량을측정한결과, IFN-γ 의분비량이 negative control 에비해현저히낮은값을보였으며, IL-4 의분비량의경우, positive control 에비해낮은값을보였다. 따라서송엽에탄올추출물이 Th 1 세포와 Th 2 세포의조절을통한아토피피부염억제에효과적일것으로사료된다. 또한아토피피부염증상을관찰한결과, 송엽에탄올추출물을 1 주일및 2 주일도포하였을때, positive control 에비해홍반, 가피, 짓무름, 부종및건조함의증상이현저히감소함을확인하였다. 이상의결과를통해송엽에탄올추출물은아토피피부염치료외용제로이용할수있을것으로기대된다. 감사 본연구는 2011 년도지식경제부지역산업기술개발사업의지원을받아이루어진것으로이에감사드립니다. (NO.70006183) REFERENCES 1. Tanabe, W., T. Kobayachi, T. Takahata, F. Morimatsu, R. Shibata, and T. Nichimura (2002) Some human B cell and T cell epitopes bovine serum albumin, the major beef allergen. Biochem. Biophys. Res. Commun. 293: 1348-1353. 2. Jiang, J., T. Yamaguchi, N. Funakushi, T. Kuhara, P. S. Fan, R. Ueki, H. Suto, Y. Kase, S. Ikeda, and H. Ogawa (2009) Oral administration of yokukansan inhibits the development of atopic dermatitis-like lesions in isolated NC/Nga mice. J. Dermatol. Sci. 56: 37-42. 3. Leung, D. and Y., M. (2000) Atopic dermatitis: New insights and opportunities for therapeutic intervention. J. Allergy Clin. Immunol. 105: 860-876. 4. Leung, D., Y. M. M. Boguniewicz, M. D. Howell, I. Nomura, and Q. A. Harmid (2004) New insights into atopic dermatitis. J. Clin. Invest. 113: 651-657. 5. Sehra, S., M. Holbreich, M. H. Kaplan, F. M. B. Tuana, N. Mousdicas, and J. B. Travers (2008) Clinical correlations of recent developments in the pathogenesis of atopic dermatitis. An. Bras. Dermatol. 83: 57-73. 6. Akdis, M., C. Akdis, L. Weigl, R. Disch, and K. Skin-homing. Blaser (1997) CLA + memory T cells are activated in atopic dermatitis and regulate IgE by an IL-13-dominated cytokine pattern: IgG4 counter-regulation by CLA-memory T cells. J. Immunol. 159: 4611-4619. 7. Van Reijsen, F. C., C. A. F. M. Brukjnzeel-Koomen, F. S. Kalthoff, E. Maggi, S. Romagnani, and J. K. T. Westland (1992) Skinderived aeroallergen-specific T-cell clones of Th2 phenotype in patients with atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 90: 184-193. 8. Del Prete, G., E. Maggi, P. Parronchi, I. Chretien, A. Tiri, and D. Macchia (1988) IL-4 is an essential factor for the IgE synthesis induced in vitro by human T cell clones and their supernatants. J. Immunol. 140: 4193-4198. 9. Punnonen, J., G. Aversa, B. G. Cocks, A. N. Mckenzie, S. Menon, and G. Zurawski (1993) Interleukin 13 induces interleukin 4-independent IgG4 and IgE synthesis and CD23 expression by human B cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3730-3734. 10. Back, O., A. Scheynius, and S. G. O. Johansson (1995) Ketoconazole in atopic dermatitis: Therapeutic response in correlated with decrease in serum IgE. Arch. Dermatol. Res. 287: 448-451. 11. Homey, B., M. Steinhoff, T. Ruzicka, and D. Y. Leung (2006) Cytokines and chemokines orchestrate atopic skin inflammation. J. Allergy Clin. Immunol. 118: 178-189. 12. Abbas, A. K. and A. H. Lichtman (2003) Cellular and molecular immunology. 5th ed. pp. 31-31, 247-269, 285-288, 303-308, 432. WB Saunders Company, Philadelphia, USA. 13. Fry, L. (2007) An atlas of atopic eczema. Gunja Press. Seoul, Korea. 121-129. 14. Yoon, M. Y. (2008) Therapeutic effects of hydrolyzed preparation of Scutellanae radix extracts on atopic dermatitis of NC/Nga mice induced by D. pteronyssinus. DS Ph. D. thesis, Woosuk university, 23-24. 15. Arellano, F. M., C. E. Wentworth, and A. Arana (2007) Risk of lymphoma following exposure to calcineurin inhibitors and topical steroids in patients with atopic dermatitis. J. Invest. Dermatol. 127: 808-816. 16. Furue, M., H. Terao, Y. Moroi, T. Koga, Y. Kubota, J. Nakayama, F. Furusawa, Y. Tanaka, I. Katayama, N. Kinukawa, T. Nose, and K. Urabe (2004) Dosage and adverse effects of topical tacrolimus and steroid in daily management of atopic dermatitis. J. Invest. Dermatol. 31: 277-283. 17. Kim, Y. H. and Y. S. Park (2006) Effect of Scutellaria baicalensis water extract on antioxidative activity and epidermal thickness in DNCB-induced allergic contact dermatitis animal model. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 35: 543-548. 18. Shon, M. Y. and S. H. Nam (2007) Effect of Eucommia ulmoides extracts on allergic contact dermatitis and oxidative damage induced by repeat elicitation of DNCB. J. Korean Soc. Food Sci.

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