大韓本草學會誌제 24 권제 4 호 (2009 년 12 월 ) Kor. J. Herbology 2009;24(4):127-135 Balb/c 마우스에서 Ovalbumin 면역반응에대한加減拱辰丹추출물의억제효과 김홍준 1, 황성연 1,5, 목지예 2, 황병순 3, 정승일 3, 장선일 2,4* 1) 1: 우석대학교한의과대학본초방제학교실 2: 전주대학교아토피ㆍ건강전문연구소 3: 전주생물소재연구소 4: 전주대학교대체의학대학대체건강관리학부 5: 한국전통의학연구소 Gagam-Gongjin-dan Extract Attenuates Immune Responses to Ovalbumin in Balb/c Mice Hong-Jun Kim 1, Sung-yeoun Hwang 1,5, Ji Ye Mok 2, Byung-Soon Hwang 3, Seung-Il Jeong 3, Seon-Il Jang 2,4* 1: Department of Oriental Medical Prescription, College of Oriental Medicine, Woosuk University 2: Atopy & Health Research Institute, Jeonju University 3: Jeonju Biomaterials Institute 4: School of Alternative Medicine & Health Science, College of Alternative Medicine, Jeonju University 5: Korea Bio Medical Science Institute ABSTRACT Objectives : Gagam-Gongjin-dan (GGD) composited with Cervi parvum Cornu, Corni Fructus, Angelica gigantis Radix, Lycii Fructus, Dioscoreae Rhizoma, Citri Pericarpium, Gastrodiae Rihzoma, Agastachis Herba, Cassiae cortkex, Scutellariae Radix, Schisandrae Fructus has been traditionally used for chronic diseases or weakness after illness in oriental countries. However, little is known about the effects of methanol extract of GGD on immune responses to ovalbumin (OVA) plus alum. Therefore, the purpose of this study was to investigate the effects of GGD on immune responses to ovalbumin plus alum in Balb/c mice. Methods : In this study, the extract of GGD was prepared by extracting with methanol for 7 days. The extract was freeze-dried following filtration through vacuum distillation system. Mice were orally administrated with or without GGD extract of different doses (50-200 mg/kg/day) for 30 days. We examined the effects of GGD extract on the serum levels of total IgE, OVA-specific IgE, IgG1, IgG2a, and CTACK/CCL27 production and CCR10 expression in lymph node cells and body weight change and foot pad swelling responses in ovalbumin treated Balb/c. Results : The oral administration of GGD dose-dependently reduced the serum levels of total IgE, OVA-specific immunoglobulin (IgE, IgG1 and IgG2b) and CTACK/CCL27 production in ovalbumin treated BALB/c mice. The levels of CCR10 expression from lymph node cells of OVA treated mice were markedly suppressed by treatment with GGD in a concentration dependent manner. Furthermore, foot pad swelling responses were also markedly suppressed by GGD. However, body weight were significantly increased dose dependently by GGD treatment.. Conclusions : These results suggest that GGD treatment suppresses immune responses to ovalbumin, and these properties may contribute to allergic disease care. Key words : Ovalbumin, Gagam-Gongjin-dan, OVA-specific immunoglobulin, CTACK/CCL27, CCR10 * 교신저자 : 장선일, 전북전주시완산구효자동3가 1200번지전주대학교대체의학대학대체건강관리학부 Tel : 063-220-3124 E-mail : sonjjang@jj.ac.kr 접수 :2009년 11월 22일 수정 :2009년 12월 14일 채택 :2009년 12월 21일
128 大韓本草學會誌 Vol. 24, No. 4, 2009 서론 拱辰丹은元末危亦林의 世醫得效方 虛損篇 1) 에최초로수록된처방으로 東醫寶鑑 2) 에는肝虛藥이라하여助陽補精하는鹿茸, 養血潤燥하는當歸, 固精强陰 助陽收澁하는山茱萸, 開竅하는麝香의 4 가지약물로구성하여先天의氣를補하고水升火降을순조롭게하여心身을補益함으로써장부의虛損에대한예방및치료를하는방제로볼수있다. 拱辰丹에대한실험적연구로는張 3) 은혈청 thyroxine, cortisol, testosterone 및혈중 hemoglobin 의함량변화를통하여공진단의强精補氣하는효능이우수하다고보고하였고김 4) 은 Rosette 형성세포수, 적혈구응집소가, 적혈구용혈소가, 혈청중 testosterone 농도변화등을통하여공진단이면역반응, 항피로및내분비기능에효과가있다고보고하였다. 그리고정 5) 과황 6) 은 CT105 로유도된 Alzheimer s disease 실험모델과 Aβ 로유도된 Alzheimer s disease 생체실험모델에서拱辰丹이효과가있다고보고하였다. 또최 7) 는공진단의성분분석및항산화작용을분석하여공진단의성분이항산화및항노화작용이있는아미노산과무기질성분이많이있음을밝혀내었다. 최근에사향의진위에대한논란으로대체품이나다른처방에대한개발의필요성이제기되고있다. 이에 동의보감 을보면공진단과같은조문에黑元이라는처방이당귀와녹용만으로사향을사용하지않더라도공진단과같은의미의약효를낼수있다는데착안하여기존의공진단에약물을가감하여새로운처방의조합을만들었다. 약물은한약재중면역기능향상에우수하거나항산화효과등이우수한약물로선정하였다. 알레르기성과민반응은체내에이물질이침입했을때, 즉병원균, 기생충, 바이러스등의이종단백질항원이체내에서면역세포와과민하게반응하는면역학적현상을말하는데, 주로혈청내 IgE 항체의증가와함께일련의 Th2 세포의편향을유도하여 Th2 사이토카인 (IL-4, IL-5, Il13) 의유도와케모카인 (TARC/CCL17, MDC/CCL22, CTACK/ CCL27) 의생산이증가된다 13-20). 특히 Th2 케모카인은말초혈액또는림프절의면역세포에작용하여염증부위로침윤을야기하는화학주성 (chemotaxis) 을촉진하는데, CTACK/ CCL27 는 CCR10 에특이하게결합하여화학주성을일으킨다고최근에보고되었다 13-20). 면역반응에있어, 식품의부작용은특정음식물이나첨가물에의해알레르기반응으로나타나는데, 특정물질에대한항체를생산함으로써과민반응을더욱향상시킨다. 특히 ovalbumin (OVA) 은마우스와렛트에감작 (sensitization) 하면, 혈청내 IgE 와 Th2 사이토카인이매우높게증가되는데, 천식과아토피피부염과유사한알레르기성질환을유발한다 21-24). OVA 에감작되면, 혈청내항체뿐만아니라호산구 (eosinophils) 의침윤이높게일어나고 21), 비만세포 (mast cell) 와호염구에서 FcεRI 와매우강력한결합에의하여알레르기성질환을유발하는 것으로알려졌다. 이와같이 OVA 항원에의해증가된 IgE 와 Th2 사이토카인은기관지천식, 알레르기성고초열과아토피피부염등환경성질환의핵심지표로알려져있다 21-24). 따라서 OVA 유도알레르기마우스모델에서약물을평가하는것이매우중요하다할수있다. 따라서본연구는 BALB/c 계마우스를대상으로 OVA 에의해유도된혈청내항체와 CTACK/CCL27 의생산, 발부종반응 (footpad selling response) 및림프절세포의 CCR10 의발현에미치는加減供辰丹의효과를조사하여유의한결과를얻었기에보고하는바이다. 1. 재료 1) 시약 재료및방법 Chicken egg albumin (ovalbumin), aluminium hydroxide, NH4Cl 는 Sigma-Ardrich 사 (St Louis, MO) 로부터구입하였다. Total IgE, OVA-specific IgE, IgG1, IgG2a 등 ELISA kits 는 Shibayagi 사 (Japan) 로부터구입하였고, CTACK/ CCL27 ELISA kit 와 Anti mouse CCR10-PE conjugated antibody 는 R&D 사 (Minneapolis, MN, USA) 로부터구입하였다. 2) 약물의추출 가감공진단약물의선정은공진단기본처방에사향을빼고면역활성이우수한약물을중심으로선정하였다. 실험에사용한녹용 산수유 당귀 구기자 산약 진피 천마 배초향 계피 홍삼 오미자 황금은울산시소재약제상 ( 광명당 ) 에서구입하여우석대학교한의과대학본초방제학교실에서동정하였다. 약물의구성은 Table 1 과같으며, 구성약물 1,000 g 를분말로제조하여증류수 (4L) 로 3 시간동안추출기로열수추출하였다. 추출물은 0.45 μm 필터를사용하여여과한후동결건조기 (Model, EYELA FDU-2100, Japan) 에서건조하여 227 g 을회수한후 -20 에서보관하면서실험에사용하였다. Table 1. Oriental Herbal Medicine Composition of Gagam- Gongjin-dan (GGD) Drug name Crude drug name Scientific name % 鹿茸 Cervi parvum Cornu Cervus nippon 20 山茱萸 Corni Fructus Cornus officinalis 20 當歸 Angelica gigantis Radix Angelica gigas 20 枸杞子 Lycii Fructus Lycium chinense 10 山藥 Dioscoreae Rhizoma Dioscorea japonica 10 陳皮 Citri Pericarpium Citrus unshiu 10 天麻 Gastrodiae Rihzoma Gastrodia elata 2 藿香 Agastachis Herba Aqastache rugosa 2 桂皮 Cassiae cortkex Cinnamo- mum zeylanicum 2 黃芩 Scutellariae Radix Scutellaria baicalensis 2 五味子 Schisandrae Fructus Schisandra chinensis 2
Balb/c 마우스에서 Ovalbumin 면역반응에대한加減拱辰丹추출물의억제효과 129 3) 실험동물 무균환경에서사육된 7 주령의암컷 BALB/c 계마우스는중앙동물실험실 ( 서울 ) 사로부터구입하였다. 마우스는 1 주일간스트레스를해소하기위해 1 주일간낮과밤의주기를 12 시간씩고정하여사료 ( 중앙동물실험실 ) 와멸균물을공급하면서사육한후실험동물위원회의실험규정에준하여실험에사용하였다. 2. 방법 1) OVA 감작 마우스등쪽털을안가용가위로주의깊게자르고제모크림을바르고 25 물을이용하여털을제거한후 400 mg/ml OVA 를용액을제조하고감작일에 Spergel 등 25) 의방법을변형하여 Fig. 1 과같은프로그램에의하여 100 μl OVA 을복강에주사하였고 2 주후에같은방법으로복강에주사하여 1 주일간방치후 20 μl OVA (500 μg/ml) 을왼쪽발에주사하여공격한후발두께, 혈청내항체, 림프절, 세포독성등을검사하였다. S ensitiz ation S ensitiz ation Ch alleng e S eru m immu nog lobu lin Serum CCL27/CTACK Nymph node CCR10 Body weight Cy totox ic test Fig. 1. Schematic diagram of sensitization protocol Mice were sensitized on abdominal cavity with 100 μl of 400 μg OVA or saline on day 0 Two week later, 100 μl of 400 μg OVA or saline was reapplied to the same site. On day 28, left foot were challenged with 20 μl of 500 μg/ml OVA and right ears were applied with 20 μl of saline. Control group received only filtered water for 29 or 31 days and experimental groups received the different dose of GGD (50~200 mg/kg body weight). 2) 약물의처리와체중의측정 스트레스가해소된 8 주령의 BALB/c 계마우스를 5 마리씩분주하여 OVA 로감작하기 1 시간전부터실험종료시까지대조군과실험군은각각생리식염수와약물 (50-400 mg/kg 체중 ) 을하루에 1 회씩경구투여하였다. 약물이투여되는기간동안체중의변화를보기위해서실험시작일로부터종료까지약물투여전에개체하였다. 3) 발부종의측정 마우스발부종의측정은 OVA 로 2 회감작된마우스를대상으로 28 일에 OVA 를왼쪽발에공격한다음 8 시간후에디지털두께측정기 (Model 7326, Japan) 로측정하였다. 발의부종 (footpad swelling response, FRS) 은다음과같이계산한후 % 로표현하였다. FRS (%) = ( 공격 8 시간후발의두께 공격전발의두께 ) 100/ 공격전발의두께 4) 혈청의 OVA 특이 IgE, IgG1, IgG2a 및 CTACK/CCL27 측정혈청내 IgE와 OVA 특이 IgE의정량은 ELISA법으로측정하였다. 요약하면 anti-mouse IgE, anti-igg1 과 anti- IgG2a 는코팅완충액 (0.1 M NaHCO 3, ph 8.2) 을이용하여 high binding immunoplate 에 well 당 100 μl을주입하고 4 에서 24시간방치한다음 0.1% Tween 20이포함되어있는 PBS로 3회세척하고 3% (wt/vol) BSA-PBS 를주입하고 2시간동안블로킹하였다. 혈청은 1:10으로희석하여주입한후 4 상태에서 12시간이상방치한후 0.05% gelatin 용액에 biotin-conjugated monoclonal rat anti-mouse IgE 또는 OVA specific rat anti-mouse IgE mab을주입하고실온에서 1시간동안방치했다. 발색은 avidin-alkaline phosphatase (1 : 1,000) 를주입하고실온에서 1시간동안반응시킨다음 6회세척하여 phosphatase 기질인 ρ-nitrophenylphosphate, disodium을첨가하고발색시켜 405 nm에서 microplate reader (Molecular Devices) 로흡광도를측정하였다. 혈청내CTACK/CCL27의측정은 R&D사가제시하는방법에준하였다. 5) 복강대식세포의세포독성평가 OVA 로감작과공격된마우스에 Brewer s thioglycollate broth 를마리당 2 ml씩복강내로주사기를이용하여주입하고 3 일후생쥐를후경골탈추법으로즉사시킨다음 heparin (5 U/ ml ) 이첨가된 HBSS 10 ml를복강에주입하고복강을잘마사지하였다. 마사지후 26 케이지 10 ml용주사기를이용하여복강으로유입된세포를얻은후 2 회원심세척하였다. 분리된세포는 10% FBS 와 1% penicillin/streptomycin 이첨가된 RPMI 1640 배지에부유시켜배양접시에접종한후 37 와 5% CO 2 가유지되는배양기에서 2 시간동안방치하였다. 그후대식세포외다른세포를제거하기위해냉각 HBSS 를이용하여 3 회반족세척하였다. 부착된생쥐복강대식세포는 10% FBS 와 1% penicillin/streptomycin 이첨가된 RPMI 1640 배지에접종한후약물 (50~4003mg/ml) 을처리하고 24 시간동안배양한다음 MTT 방법으로세포생존율을평가하였다. 요약하면 1 mg/ ml의농도로배양하기위해서 MTT 용액을첨가하고다시 4 시간동안배양하였다. MTTformazan 생성물은동일한용량의용해완충액 (50% n,ndimethylformamide 을포함하는 20% SDS 용액, ph 4.7) 을첨가함으로써용해했다. Formazan 의양은 570 nm 에흡수되는양을측정함으로써결정했다. 6) Flow cytometry에의한 CCR10의발현 OVA 공격후 48시간에각대조군과실험군의마우스를경추탈골법에의해즉사시킨후목, 사지및장내림
130 大韓本草學會誌 Vol. 24, No. 4, 2009 프절을적출한후슬라이드글레스를이용하여단일세포부유액을제조한후세포부유액을 40 μm 의나일론매쉬에통과시킨후 Ficoll-hypaque 을활용하여밀도구배법으로림프구를분리하였다. 분리된림프구는 HBSS 용액으로 3 회원심세척한후 PE 가부착된 anti-mouse CCR10 항체를주입하고 1 시간동안방치후 2% paraformaldehyde 용액을주입하여고정한후 Flow cytometry (FACS, BD) 를활용하여형광강도를측정하여 CCR10 의발현을측정하였다. 7) 통계처리 모든실험값은평균 ± 표준오차로표시했으며, 통계분석은 ANOVA 와 Student s t-test 로처리했으며, 유의성한계는 p<0.05 로정하였다. 결과 가 OVA 감작에따른체중의감소를회복시키는효과가있다는것을제시해주었다. 2. 加減拱辰丹의세포독성효과 加減拱辰丹투여가세포독성에미치는효과를알아보기위해서 OVA로감작과공격된마우스에 Brewer s thioglycollate broth를마리당 2 ml씩복강내로주사기를이용하여주입하고 3일후마우스를경추탈골법으로즉사시킨다음 heparin 이첨가된 HBSS 10 ml를복강에주입하고복강을잘마사지하여탐식세포를페트리접시부착방식에의하여분리한후加減拱辰丹을 24시간처리한다음 MTT assay 방법으로세포독성을평가하였다. 그결과 Fig. 3과같이加減拱辰丹 (50~200 μg/ml) 을처리한결과세포의생존율에아무런영향을주지않았다. 따라서본실험에서사용된加減拱辰丹의약물농도에서는세포에독성은없는것으로평가되었다. 1. OVA 감작된마우스에서加減拱辰丹의효과 OVA 로감작되고加減拱辰丹이투여된마우스의체중의변화를알아보기위하여스트레스가해소된 8 주령의 BALB/c 계마우스를대상으로실험시작일로부터종료일까지 3 일간격으로약물을투여하기전에체중을계측하였다. 그결과 Fig. 2 와같이아무런약물과 OVA 로감작되지않은음성대조군은정상적인성장을보인반면, OVA 로감작된양성대조군의경우 21 일까지는음성대조군에비해체중의증가량은감소되었으나두번째감작한 21 일이후에는체중의감량이현저했다. 그러나加減拱辰丹이투여된실험군의경우 50 mg/kg 투여군을제외하고 100 mg/kg 투여군과 200 mg/kg 투여군에서는 21 일감작후체중의증가가음성대조군과비슷하게증가했다 (p<0.05 와 p<0.01). 이러한결과는加拱辰丹의투여 Fig. 3. Effects of Gagam-Gongjin-dan (GGD) on cytotoxicity of peritoneal macrophages Peritoneal macrophages were isolated as described in materials and methods. Cells (5 105/well plate) were treated with or without each extract at indicated concentrations for 24 h, and then incubated for 24 h. Cell viability was measured by MTT assay as described in materials and methods. Each column represents the mean ± S.D. from 5 mice. 3. OVA 감작된마우스에서加減拱辰丹의발부종억제효과 Fig. 2. Effects of Gagam-Gongjin-dan (GGD) on body weight change in OVA-sensitized mice Mice were sensitized as described in Fig. 1 and kept in pathogenfree environment. Body weight was measured 0 day and every 3 days for 30 days. Each column represents the mean ± S.D. from 5 mice. *p<0.05 and **p<0.01 versus control group treated with OVA alone. 加減拱辰丹투여가발부종에미치는효과를알아보기위해서 OVA 로감작된 28 일째각실험군의마우스왼쪽발의두께를측정한후에 20 μl OVA (500 μg/ml) 을마우스왼쪽발에주사하고 8 시간후에두께를측정하여발부종률을계산하였다. 그결과 Fig. 4 와같이음성대조군의경우부종에효과가없었지만, OVA 로감작되고공격된양성대조군에서는발부종이현저히증가한반면, 加減拱辰丹의투여군은농도에의존적으로부종이감소되었다. 특히 100 mg/kg 투여군 (p<0.05) 과 200 mg/kg 투여군 (p<0.01) 에서는그효과가유의하였다.
Balb/c 마우스에서 Ovalbumin 면역반응에대한加減拱辰丹추출물의억제효과 131 특히 100 mg/kg 투여군 (p<0.05) 과 200 mg/kg 투여군 (p<0.01) 은그감소효과가유의하였다. OVA 특이 IgE 의경우도총 IgE 의결과와매우비슷하게그양이현저히감소하였고, OVA 특이 IgG1 은 200 mg/kg 투여군에서만감소하였다 (p<0.05). 그러나 IgG2a 는加減拱辰丹투여군모두에서큰영향을미치지못하였다. 이러한결과는加減拱辰丹투여가과민반응유도지표로알려진 IgE 의생산량을감소시키는데효과가있다는것을나타내주었다. Fig. 4. Effects of Gagam-Gongjin-dan (GGD) on OVA specific footpad swelling responses (FRS) following OVA challenge in the footpad of BALB/ c mice Mice were orally administrated with or without GGD of different doses (50~200 mg/kg) for 28 days. FRS were analyzed as described in materials and methods. Each column represents the mean ± S.D. from 5 mice. *p<0.05 and **p<0.01 versus control group treated with OVA alone. 4. OVA 감작된마우스에서加減拱辰丹이 OVA 특이항체생산에미치는영향 加減拱辰丹투여가혈청내항체생산에미치는효과를알아보기위해서 OVA 로감작된 30 일째각실험군의마우스를대상으로혈청을분리한다음총 IgE 와 OVA 특이 IgE, IgG1 및 IgG2a 의항체를 ELISA 법으로측정하였다. 그결과 Fig. 5 와같이 IgE 의총량은음성대조군에비해서양성대조군에서현저히증가되었지만, 加減拱辰丹을투여한실험군에서는농도에의존적으로감소하였다. 5. OVA 감작된마우스에서加減拱辰丹이 CTACK/CCL27 케모카인생산에미치는영향 加減拱辰丹투여가혈청내 CTACK/CCL27 케모카인생산에미치는효과를알아보기위해서 OVA 로감작된 29 일째각실험군의마우스를대상으로혈청을분리한다음 CTACK/CCL27 케모카인을 ELISA 법으로측정하였다. 그결과 Fig. 6 과같이음성대조군에비해서양성대조군에서현저히증가되었지만, 加減拱辰丹을투여한실험군에서는농도에의존적으로감소하였다. 특히 100 mg/kg 투여군 (p<0.05) 과 200 mg/kg 투여군 (p<0.01) 은그감소효과가유의하였다. 이러한결과는염증반응에관여하는면역세포의화학주성을약화시키는데加減拱辰丹의효과가있다는것을나타내주었다. Fig. 6. Effects of Gagam-Gongjin-dan (GGD) on CTACK/ CCL27 production following OVA challenge Mice were orally administrated with or without GGD of different doses (50~200 mg/kg) for 29 days. Serum was collected at 1 day after OVA challenge. CTACK/CCL27 production was analysed using an ELISA assay. Each column represents the mean ± S.D. from 5 mice. *p<0.05 and **p<0.01 versus control group challenged with OVA alone. Fig. 5. Effects of Gagam-Gongjin-dan (GGD) on total IgE, OVA-specific IgE, IgG1 and IgG2a production following OVA challenge Mice were orally administrated with or without GGD of different doses (50~200 mg/kg) for 30 days. Serum was collected at 2 days after OVA challenge. Total IgE, OVA-specific IgE, IgG1 and IgG2a production was analysed using an ELISA assay. Each column represents the mean ± S.D. from 5 mice. *p<0.05 and **p<0.01 versus control group challenged with OVA alone. 6. OVA 감작된마우스에서加減拱辰丹이 CCR10 발현에미치는영향 마지막으로우리는加減拱辰丹투여가림프절의면역세포에서발현되는 CTACK/CCL27 케모카인특이수용체인 CCR10 의발현을 flow cytomery 법으로측정하였다. 그결과 Fig. 7 과같이 OVA 단독감작군인양성대조군에서 CCR10 의발현이현저히증가되었지만, 加減拱辰丹
132 大韓本草學會誌 Vol. 24, No. 4, 2009 을투여한실험군에서는농도에의존적으로감소하였다. 특히 100 mg/kg 투여군 (p<0.05) 과 200 mg/kg 투여군 (p<0.01) 은그감소효과가유의하였다. 이러한 CCR10 발현억제결과는 Fig. 6 에서보여준 CTACK/CCL27 케모카인생산량의감소와밀접한관계가있는것을나타내주며, 加減拱辰丹이 OVA 감작에따른염증반응을효과적으로억제시킨다는것을제시해주었다. Fig. 7. Effects of Gagam-Gongjin-dan (GGD) on CCR10 expression following OVA challenge Mice were orally administrated with or without GGD of different doses (50~200 mg/kg) for 29 days. Lymphatic cells was isolated at 1 day after OVA challenge. CCR10 expression was analysed using flow cytometry as described in materials and methods. Each column represents the mean ± S.D. from 5 mice. *p<0.05 and **p<0.01 versus control group challenged with OVA alone. 고찰 危亦林의 世醫得效方 虛損편 1) 에최초로수록된拱辰丹은先天의氣를補하고水升火降을순조롭게하여心身을補益함으로써장부의虛損에대한예방및치료를하는방제이다. 동의보감 2) 에는肝虛藥으로되어있으며 拱辰丹凡男子方當壯年而眞氣猶怯此乃稟賦素弱非虛而然僣燥之藥尤宜速戒滋益之方羣品稍衆藥力細微難見功效但固天元一氣使水升火降則五藏自和百病不生此方主之鹿茸酥炙當歸山茱萸各四兩麝香五錢另硏右爲末酒麪糊和丸梧子大溫酒或鹽湯下七十丸至百丸 이라하여그효능과조제용법을 세의득효방 을인용하여기록하고있다. 공진단에대한실험적연구로張 3) 은혈청 Thyroxine, cortisol, testosterone 및혈중 hemoglobin 의함량변화를통하여공진단의强精補氣하는효능이우수하다고보고하였고김 4) 은 Rosette 형성세포수, 적혈수응집소가, 적혈구용혈소가, 혈청중 testosterone 농도변화등을통하여공진단이면역반응, 항피로및내분비기능에효과가있다고보고하였다. 그리고정 5) 과황 6) 은 CT105로유도된 Alzheimer s disease 실험모델과 Aβ로유도된 Alzheimer s disease 생체실험모델에서공진단이효과가있다고보고하였다. 또최 7) 는공진단의성분분석및항산화작용을분석하여공 진단의성분이항산화및항노화작용이있는아미노산과무기질성분이많이있음을밝혀내었다. 면역이란생체가자기와비자기를식별하여외부로부터침입하는각종미생물, 동종의조직, 체내에생긴불필요한산물들과특이하게반응하여항체를만들고이것을배제하여개체의정상상태와항상성을유지하는현상이다. 이는한의학에서질병의발생및전변과정을正氣와外邪및七情, 飮食, 痰飮, 瘀血등의발병인자간에소장진퇴의과정으로설명하고있는것과연관지어생각할수있다. 즉면역을病邪로부터인체를보호하는正氣와밀접한상관성을두고, 正氣不足은곧면역기능저하와관련지어설명할수있다. 또한 黃帝內經ㆍ靈樞ㆍ營衛生成編 27) 에서 衛出於下焦 라하였으니衛氣의근본이되는下焦즉肝腎을보하는것이면역능력을강하게하는것임을유추할수있다. 즉腎陽을强壯케하고精血을補益하며筋骨을强하게하는약물을투여함으로써면역기능의증강을유추해볼수있다. 최근에사향의진위에대한논란으로대체품이나다른처방에대한개발의필요성이제기되고있다. 이에 동의보감 을보면공진단과같은조문에黑元이라는처방이당귀와녹용만으로사향을사용하지않더라도공진단과같은의미의약효를낼수있다는데착안하여肝腎을補하는기존의공진단에약물을가감하여 12 개의약물로구성된새로운처방의조합을만들고이를이용하여면역력의저하로인한과민반응에대한효과를살펴보았다. 처방의구성은鹿茸 山茱萸 當歸 枸杞子 山藥 陳皮 天麻 藿香 桂皮 黃芩 五味子등 11 가지약제로그주요약재의구성성분을살펴보면녹용은 16 종류의아미노산이함유되어있는데, 그중에서 proline, lysine, serine 의함량이가장높은것으로알려져있다. 녹용의상대에는 amine 류가다량함유되어있는데그중에서 spermine, spermidine, putrescine 이풍부하다. 녹용의중대와하대는골화가많이진행된상태이며 spermidine 의함량이감소되어있다. 이외에도 collagen, estrone, proteolipid 등이함유되어있다. 산수유는 cornin, 즉 verbenalin, saponin, tannin, ursolic acid, tartaric acid, malic acid 및 vitamin A 가함유되어있고, 종자의지방유에는 palmitin acid, olein acid, linol acid 등이함유되어있다. 성분중코르닌은신진대사에활력을향상시켜주며, 항당뇨효과가추정되는물질도포함하고있다. 당귀의성분으로는 coumarine 계물질인 decursin, decursinol, nodakenetin, umbelliferon, nodakenin, β-sitosterol 등이며, 구기자에함유된성분은 carotenoid, cholin, meliscic acid, zeaxanthin, physalien (dipalmityl zeaxanthin), betaine, β-sitosterol, vitamin B1 과불포화지방산이다량함유되어있다. 산약에는뿌리줄기에는 Saponin, 점액, cholin, 전분 (16%), glycoprotein 과유리 amino 산을함유하며, 또한 abscisin Ⅱ, polyphenol 산화효소, vitamin C (5mg%), 3,4-dihydroxy-phenyle-thylamine (dopamine) 을함유하고점액중에는 mannan 과 phytin 산이함유되어있고, 진피
Balb/c 마우스에서 Ovalbumin 면역반응에대한加減拱辰丹추출물의억제효과 133 의주성분은 d-limonine이며이외에도 hesperidin, myoinositol, vitamin C 등이함유되어있으며, 또한 flavonoide 배당체가많이함유되어있다 27). 각각의약재는면역계통이나항산화능력이우수한것으로알려져있다 3-7). 알레르기성과민반응 (allergic hypersensitivity) 은즉시형과민반응과지연형과민반응으로분류되는데, 다양한항원 (antigen) 들에의해동반된형태로유발될수있다 8-12,21-25). OVA와같은항원은효과적으로과민반응을야기할수있는물질로알려져있는데, 그특징은 B세포의활성에의한혈청내 IgE의증가와함께 T세포매개에의한염증성사이토카인은물론화학주성의원인인케모카인의생산을증가시키는것으로알려졌다 14). 특히 OVA는 alum 과함께면역시킬때이러한면역반응이잘유발되는데, 천식및피부습진을야기하는동물모델로많이활용되고있다 21,24). 아토피피부질환과천식을비롯한알레르기면역반응은 IgE에의한즉시형면역반응 ( 제1형 ) 으로표현되는데, histamine, prostaglandin 등매개물에이어서후기에나타나는 pro-inflammatory cytokines 및 chemokines과같은염증성매개물이대량생산된다는특징이있다 8-10). 또한즉시형면역반응에서생성된물질은이미생성된염증성매개물질과이들이상호작용에의해혈관투과성을증가시킨다. 이어서비만세포가활성화되고호산구를비롯한면역세포가염증부위로침윤되면서, leukotrine, proinflammatory cytokines 및 chemokines과같은매개물에의해서알레르기반응으로대표되는 Th2 세포가활성화됨으로써만성적염증반응을유발시키는것으로알려졌다 17,19,20). 본연구에서도마우스에 OVA와 alum을혼합하여복강에감작하고발에공격한결과음성대조군에비해염증성면역반응이효과적으로유도되었다. 즉발의부종, 혈청내 OVA 특이 IgE, IgG1과 IgG2a 의생산, CTACK/ CCL27의생산및 CTACK/CCL27 ligand인특이적수용체 CCR10의발현이뚜렷이증가하였다 (Fig. 4~7). 또한加減拱辰丹의투여가모델동물의체중변화와세포독성에미치는영향을조사한결과본실험에사용한모든농도에서그영향이없다는것을확인하였다 (Fig. 2). 따라서 OVA 유도염증모델동물에서加減拱辰丹의투여는체중의변화와세포독성없이 (Fig. 4) OVA가유도하는염증매개물을효과적으로제거하는효과를증명하였다. 한편 TARC/CCL17, MDC/CCL22 및 CTACK/ CCL27 등은대표적인 Th2 케모카인으로염증부위에 Th2 세포의이동과침윤을유도한다. 특히말초혈액단핵구 (peripheral blood monocytes) 에의해생산된 TARC/CCL17과 MDC/ CCL22는 Th2 세포의 CCR4와결합함으로써염증부위로이동하는결정적인화학주성 (chemoattractant) 을야기하는분자로인간의성인 AD환자의혈청에높은양으로검출될뿐만아니라 Th2 세포의이동과침윤을가속화시키는중요한케모카인이다 11,12,17,28). 특히 ovalbumin 으로자극된환자의경우더욱더많은양이검출되는것으로 밝혀지고있어아토피피부염의병인규명에중요한표적분자로주목받고있다 9). 또한 CTACK/CCL27은 CCR10을경유하여그효과를나타내는데 13,14), NC/Nga 마우스의피부병변부위인표피의기저층에서중요하게발현되는현상이밝혀졌다 16). 그러므로 CTACK/CCL27의과도한생산은병변부위의심각한염증반응을유도하며, cutaneous lymphocyte-associated antigen (CLA) 양성림프구의이동을매개하는중요한역할을한다 15,16). 본연구의결과 OVA로감작된마우스의혈청의 CTACK/ CCL27 등은정상대조군에비해현저히높았으나, 加減拱辰丹이투여된실험군에서는혈청내 CTACK/ CCL27 케모카인의생산량이약물의농도에다라현저히억제되었다 (Fig. 6). 또한 CTACK/ CCL27과특이적으로결합하는 CCR10의경우도加減拱辰丹투여에의해서그발현이현저히억제되는결과를얻었다 (Fig. 7). 이러한결과는 OVA 항원으로유도되는염증성면역반응을加減拱辰丹투여가효과적으로억제하는것으로조사되었다. 그러나 CTACK/ CCL27과 CCR10의발현에미치는加減拱辰丹의추출물의효과는약물의유효성분, 및분자신호전달기전을더조사해야확실한알레르기개선및치료약물로활용될수있을것이라사료된다. 이상의결과를종합해볼때加減拱辰丹추출물의투여는 OVA 항원감작된알레르기성모델마우스의발부종개선효과와과민반응으로대표되는 IgE의혈청학적증가에대한억제효과및염증부위로면역세포를이동하여침윤시키는데결정적인역할을하는 CTACK/ CCL27의생산억제효과는물론 CTACK/ CCL27과특이적으로결합하는 CCR10 의발현을현저히줄이는효과가있었다. 따라서加減拱辰丹추출물은인간의 AD의개선에이용할수있는효과적인물질이라사료된다. 결론 加減拱辰丹은鹿茸 山茱萸 當歸 枸杞子 山藥 陳皮 天麻 藿香 桂皮 黃芩 五味子등 11 가지약제로구성된처방으로기존의만성및허약체질에활용될수있는처방으로 ovalbumin (OVA) 과같은과민반응에대한실험적증명자료는없는실정이다. 그러므로본연구는 Balb/c 마우스를대상으로 OVA 와 alum 으로감작되고공격하여加減拱辰丹의효과를조사하였다. 加減拱辰丹의추출은 7 일간메탄올을주입한후가용화된추출물을진공감압기를이용하여농축한후동결건조하여실험에사용하였다. 약물의투여는매일 1 회씩경구투여하였다 (50~200 mg/kg). OVA 의감작은스트레스가해소된 8 주령의마우스를대상으로실험군당 5 마씩을배정하여복강에 OVA 와 alum 을잘교반한후주사하여면역하였고 3 주후다시면역하였다. 1 주후에 OVA 로발에공격하여발부종의측정, 혈청내총 IgE, OVA 특이 IgE, IgG1 및 IgG2 와 CTACK/CCL27 의생산량과
134 大韓本草學會誌 Vol. 24, No. 4, 2009 CCR10 의발현을측정하였다. 그결과加減拱辰丹추출물의경구투여는 OVA 가유도하는혈청내총 IgE 의량을농도의존적으로간소시켰을뿐만아니라 OVA 특이 IgE, IgG1 및 IgG2a 를효과적으로억제하였고, 혈청내 CTACK/CCL27 의억제와더불어림프절의면역세포에서 CCR10 의발현을현저히억제시키는효과를나타내었다. 또한임상적으로 OVA 가유도하는체중의감소에대한증가효과를보였을뿐만아니라발의부종에대한억제효과가있었다. 이러한결과는加減拱辰丹추출물이 OVA 반응에대한면역억제효과가있다는것을제시해주었고, 알레르기질환케어에유용한물질로활용될가능성이있음을시사해주었다. 감사의글 이논문은 2009 학년도우석대학교교내학술연구비지원에의하여연구되었음 참고문헌 1. 危亦林. 世醫得效方. 도서출판醫聖堂. 1990 ; 271. 2. 許浚. 新對譯東醫寶鑑. 법인문화사. 2007 ; 1251. 3. 장용훈. 拱辰丹이强精補氣作用에미치는영향. 대구한의과대학대학원. 1989. 4. 김장현. 拱辰丹이면역반응, 항피로및내분비기능에미치는영향. 경희대학교대학원. 1990. 5. 장하정, 성우용, 이승현, 손지형, 한승혜, 정효창. 공진단 ( 拱辰丹 ) 이알츠하이머형치매환자에게미치는영향. 동의신경정신과학회지. 2004 ; 15(2) : 141-8. 6. 정대규, 황선미. 공진단 ( 拱辰丹 ) 이 CT105 로유도된 Alzheimer s disease 병태 ( 病態 ) 모델에미치는영향. 동의신경정신과학회지. 2004 ; 15(2) : 103-618. 7. 최금희, 박치상. 공진단 ( 拱辰丹 ) 의성분분석및항산화 ( 坑酸化 ) 작용에미치는영향. 대한본초학회지. 2007 ; 22(2) : 51-63. 8. Grabbe S, Schwarz T. Immunoregulatory mechanisms involved in elicitation of allergic contact hypersensitivity. Immunol. Today. 1998 ; 19 : 37-44. 9. Kim JY, Choi SP, La SJ, Seo JS, Kim KK, Nam SH, Kwon BS. Constitutive expression of 4-1BB on T cells enhances CD4(+) T cell responses. Exp Mol Med. 2003 ; 35 : 509-17. 10. Piguet PF, Grau GE, Vassalli P. Subcutaneous perfusion of tumor necrosis factor induces local proliferation of fibroblasts, capillaries, and epidermal cells, or massive tissue necrosis. Am J Pathol. 1990 ; 136 : 103-10. 11. Kondo S, Pastor S, Fujisawa H, Shivji GM, McKenzie RC, Dinarello CA, Sauder DN. Interleukin-1 receptor antagonist suppresses contact hypersensitivity. J Invest Dermatol. 1995 ; 105 : 334-8. 12. Wang B, Esche C, Mamelak A, Freed I, Watanabe H, Sauder DN. Cytokine knoctouts in contact hypersensitivity research. Cytokine Growth Factor Rev. 2003 ; 14 : 381-9. 13. Sebastiani S, Danelon G, Gerber B, Uguccioni M. CCL22-induced responses are powerfully enhanced by synergy inducing chemokines via CCR4: evidence for the involvement of first beta-strand of chemokine. Eur J Immunol. 2005 ; 35(3) : 746-56. 14. Reiss Y, Proudfoot AE, Power CA, Campbell JJ, Butcher EC. CC chemokine receptor (CCR)4 and the CCR10 ligand cutaneous T cell-attracting chemokine (CTACK) in lymphocyte trafficking to inflamed skin. J Exp Med. 2001 ; 194(10) : 1541-7. 15. Homey B, Alenius H, Müller A, Soto H, Bowman EP, Yuan W, McEvoy L, Lauerma AI, Assmann T, Bünemann E, Lehto M, Wolff H, Yen D, Marxhausen H, To W, Sedgwick J, Ruzicka T, Lehmann P, Zlotnik A. CCL27-CCR10 interactions regulate T cell-mediated skin inflammation. Nat Med. 2002 ; 8(2) : 157-65. 16. Nakazato J, Kishida M, Kuroiwa R, Fujiwara J, Shimoda M, Shinomiya N. Serum levels of Th2 chemokines, CCL17, CCL22, and CCL27, were the important markers of severity in infantile atopic dermatitis. Pediatr Allergy Immunol. 2008 ; 19(7) : 605-613. 17. Morales J, Homey B, Vicari AP, Hudak S, Oldham E, Hedrick J, Orozco R, Copeland NG, Jenkins NA, McEvoy LM, Zlotnik A. CTACK, a skin-associated chemokine that preferentially attracts skin-homing memory T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 ; 96(25) : 14470-5. 18. Kaneko M, Kishihara K, Kawakita T, Nakamura T, Takimoto H, Nomoto K. Suppression of IgE production in ssiontreated with a traditional Chineed medicine, bu-zhong-yi-qi-tang (Japaneed name: hochu-ekki-to). Immunopharmacology. 1997 ; 36(1) : 79-85. 19. Nakada T, Watanabe K, Matsumoto T, Santa K, Triizuka K, Hanawa T. Effect of orally administered Hochu-ekki-to, a Japanese herbal medicine, on contact hypersensitivity caused by repeated application of antigen. Int Immunopharmacol. 2002 ; 2(7) : 901-11. 20. Gao XK, Fuseda K, Shibata T, Tanaka H, Inagaki
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