제 24 회서울학생탐구발표대회보고서 출품번호계피알데하이드 (c aldehyde 가검은빵곰팡이 (Rhizopus stolonifer 의생장에미치는영향 2009. 09. 28. 소속청학교명학년성명 ( 팀명 서울특별시교육청 세종과학고등학교 1 서호연 ( 친환경연구반 서울특별시교육청 세종과학고등학교 1 안성진 ( 친환경연구반
초록 미생물에의한오염및부패는실생활에서많은문제를일으키고있으며특히일상생활에서는곰팡이에의한피해가두드러지게나타나고있다. 그에상응하여친환경항균제, 곰팡이제거제에대한연구가활발히이루어지고있으나뚜렷할만한성과가보이지않고있으며, 이미개발되어시중에판매되는항균제의대부분성분들은인공적으로합성된것이라아토피와같은피부병을가진사람들에게는매우유해하다. 따라서본실험에서는항암효과와방부효과, 살충효과가있다고알려진계피를이용해계피의가장주된성분인계피알데하이드 (caldehyde 를추출하여우리생활에서흔히나타나많은피해를주는곰팡이를제거해보고자한다. 계피를다양한용매를사용하여계피성분을추출한뒤, 이를가스크로마토그래피 (Gas Chromatography Mass Spectrometer 를이용해분석하여계피알데하이드 (c aldehyde 의추출여부와추출되는정도를분석하였다. 또한설비부족으로계피알데하이드 (caldehyde 를직접적으로추출할수없었기때문에정제된계피알데하이드 (c aldehyde 를구입하여이용하였다. 검은빵곰팡이 (Rhizopus stolonifer 에대한계피알데하이드 (caldehyde 의항곰팡이효과를실험하기위해곰팡이를배양한감자 (Potato 배지에계피알데하이드 (caldehyde 를함유한 paperdisc 들을올려놓고배양하여 paperdisc 의억제대의직경을측정하는 paperdisk 확산법을이용하였다. 계피알데하이드 (caldehyde 는에탄올 (Ethylalcohol, 헥세인 (n-hexane, 부탄올 (n-butylalcohol 추출액에서검출되었고, 메탄올 (Methylalcohol 추출액에서는검출되지않은걸로보아용매에따라추출여부나추출정도에차이가있다는것을알수있었다. 또한검은빵곰팡이 (Rhizopusstolonifer 의생장이저해되었고억제대가형성된것으로보아계피알데하이드 (caldehyde 에는항곰팡이효과가있다는것을알수있었다. 이에따라계피알데하이드 (caldehyde 는천연곰팡이제거제로서활용이가능할것이라예상된다. - 2 -
1. 탐구주제 계피알데하이드 (caldehyde 가검은빵곰팡이 (Rhizopusstolonifer 의생장에 미치는영향 2. 탐구동기및목적 여름이되면곰팡이로인한각종피부병이나농작물피해가급증한다. 이로인해많은곰팡이제거제, 방부제등이시중에나오고있지만이들은대부분인공적으로합성된것들로몸에해로울뿐아니라아토피같이특정피부병이있는사람들에게는매우유해하다. 현재까지양파, 가시오가피, 감귤, 쑥, 참외, 된장등을이용한친환경항균제에대한연구가활발히진행되었으나아직뚜렷할만한성과를얻지못하고있으며, 주로인공적으로만들어진항균제만이사용되고있다. 또한 Wel-being 열풍으로많은소비자들은인체에전혀해가없는친환경제품을선호하고있어친환경항균제에대한개발이시급한실정이다. 따라서본실험에서는항암효과와방부효과, 살충효과가있다고알려진계피를이용해우리생활에서흔히나타나많은피해를주는곰팡이를제거해보고자한다. 계피의경우에는주요성분인계피알데하이드 (c aldehyde 를액체크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography 를이용하여추출하고, 곰팡이의경우각종과일, 채소등의무름 ( 연부 병을유발하는원인균으로알려졌으며가정에서쉽게볼수있는검은빵곰팡이 (Rhizopusstolonifer 를사용하여이를배양한배지에 Paperdisk 확산법을적용시켜항곰팡이효과를알아보려한다. 3. 탐구내용 가. 계피알데하이드 (caldehyde 의추출및분석실험 -에탄올 (Ethyl alcohol, 메탄올 (Methyl alcohol, 부탄올 (n-butyl alcohol, 헥세인 (n-hexane 을용매로하여 c aldehyde 의추출여부를확인하고성분을분석한다. 나. 균주배양실험 -Paperdisk 확산법을이용하여계피알데하이드 (caldehyde 가검은빵곰팡이 Rhizopusstolonifer 에대해항곰팡이효과가있는지확인한다. 4. 탐구방법 - 3 -
1. 실험재료가스크로마토그래피 (GasChromatography MassSpectrometer 를이용해계피속에함유되어있는성분을조사하여계피알데하이드 (caldehyde 가있다는것을확인하고액체크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography 를이용하여이를직접추출하려하였으나설비부족으로인하여인위적으로합성된계피알데하이드 (caldehyde 를사용하였다. * 계피알데하이드 (caldehyde 그림 1. 계피알데하이드 (caldehyde 의구조식 계피알데하이드 (caldehyde 는신남알데하이드라고도하며화학식은 이다. 녹는점 -7.5, 끓는점 252, 비중 1.051 1.056, 굴절률 n(20,d1.619 1.625 등의성질을가지고있고계피와같은향기와타는듯한단맛을가지고있으며, 노란색의유동성액체이며공기와빛에노출되면흑갈색의끈끈한액체로변한다. 물에녹지않으며알코올, 에테르, 기름에녹고석유에테르에서는녹지않는다. 공기중에서산화되고 -7.5 에서단단해지며, 방향족알데하이드류에속한다.1 일허용섭취량 (ADI 은정해져있지않으나조건부로 1~1.25mg/kg 이다. 계피에서분리한계피유의수증기증류로얻을수있으며, 감압증류로서정제한다. 공업적으로는수산화나트륨또는수산화칼슘과같은촉매를이용하여벤즈알데하이드와아세트알데하이드를축합시켜합성한다. 주로향료산업에쓰이며식품, 음료, 의약품, 코디얼 ( 향기롭고달콤한알코올음료 등다양한제품의첨가제로서그용도의폭이넓다. 2. 시약및기기 1 시약부탄올 (n-butylalcohol(, 메탄올 (Methylalcohol(, 헥세인 (n-hexane(, 에탄올 (Ethylalcohol(, 계피알데하이드 (caldehyde( 2 기기 Homogenizer( 균질기,Gas Chromatography Mass Spectrometer, 원심분리기,Clean - 4 -
Bench, 교반기,Magneticbar,Autoclave, 항온기,Petridish,Pipet,MicroPipet, 전자저 울, 삼각플라스크 (1000ml, 매스실린더 (25ml, 스포이드, 막자사발, 파라필름, 소독용에 탄올 (Ethylalcohol(70%, 백금이, 장갑, 비커,A4 용지 *GasChromatographyMassSpectrometer GasChromatography MassSpectrometer 는고온고압의반응을하지않는기체를용매로해서시료를흘러나오는순서에따라서분리하는방식이다. 넣어준시료는그것의질량과가스크로마토그래피안에있는컬럼에발라져있는물질과의친화정도에따라서나오는속도, 즉컬럼안에서흘러가는속도가달라지게된다. 따라서질량이무겁고컬럼안의물질과의인력이강할수록늦게나오게된다. 따라서결과로나오게되는그래프들은가로축은시간, 즉 GasChromatography 가작동하는시간이고, 세로축은각시간대별로물질들이얼마나나왔는지를알려주는것이다. 하지만절대적인기준이정해져있지않아서정성적인분석은가능하지만정량적인분석은할수없다. GasChromatography 에서분리되어져나온물질은고온또는고압에의해서쪼개어진다. 따라서그쪼개어진물질을가지고재조합을하여원래의물질을찾아내는방식이다. 그렇게재조합을한뒤내재되어있던화합물사전에서원래의물질을찾아간다. 따라서쪼개어진물질들을재조합하는과정에서원래의물질로재조합이되지않을가능성이있는것이다. 따라서결과에나타난표를보면맨 Qu 에확률이표시되어있다. 그리고위쪽으로갈수록 Qu 의값이커진다. 즉위쪽으로갈수록그물질이맞을확률이커지는것이다. 그리고여기에나타난표는화합물사전에서원래의물질을추측해서보여주는표이다. 3 균주및사용배지 - 5 -
* 검은빵곰팡이 (Rhizopusstolonifer 균주균주번호배양조건배양배지 Rhizopusstolonifer (R.nigricans KCCM 35486 ( 한국미생물 보존센터에서분양 32~34 PotatoDextrose Agar ( 감자한천배지 그림 2. 검은빵곰팡이 (Rhizopusstolonifer Rhizopus 속의대표적균종으로맥아, 곡류, 빵, 과일등여러식품에잘발생한다. 균층은회흑색이며접합포자와후막포자를형성하고가근 ( 헛뿌리 도잘발달한다. 전분당화력이강하며알코올발효력도있으나약하다.Gelatine 을빨리용해시키며옥살산 (Oxalicacid, 푸말산 (Fumaricacid 을생성한다. 각종채소나과일의무름 ( 연부 병의원인균이되며마섬유의효소정련에관여한다. 생육적온은 32~34 이다. 3. 계피알데하이드 (caldehyde 추출및분석실험 1 통계피를막자사발을이용해최대한부순뒤 1g 씩 4개의메스실린더에넣고, 에탄올 (Ethylalcohol, 메탄올 (Methylalcohol, 부탄올 (n-butylalcohol, 헥세인 (n-hexane 을 19g 씩붓는다. 2 각각의메스실린더에있는용액을 homogenizer 를이용하여 10 초간분쇄한다. (35000RPM 3 분쇄한용액의부유물이침전될때까지 20 여분간기다린뒤스포이드를이용하여상층부 10mL 만분리해 1분간원심분리한다.(3500RPM 4 원심분리한용액을 MicroPipet 을이용해상층부를분리하여,10ppm 으로희석시킨 - 6 -
다. 5 희석시킨각각의추출물의성분을 GasChromatography MassSpectrometer 를이 용하여분석한다. 그림 3. 계피추출물추출과정 4. 균주배지배양실험 11 차배양 1 1L 의삼각플라스크에 PotatoDextroseAgar39g 과증류수 1L 를넣고배지를잘녹인다. 2 잘섞은배지용액에 Magneticbar 를넣고교반기를이용하여 (Stir 모드,Heat 모드를동시에작동시킨다. 배지를휘저으면서끓인다.( 단, 끓기시작하면 1분간지속시킨뒤교반기를끈다. 3 1000mL 한천용액을 2개의 1000mL 짜리삼각플라스크에각각 500mL 씩나눠담은뒤입구를거즈와호일로잘밀봉하여 Autoclave 에넣고멸균시킨다.(121,15 분 4 멸균한배지를멸균된 8개의페트리접시에넣어서굳힌다. 5 동결건조된 Rhizopus Stolonifer(R.nigricans 의용기를다이아몬드칼을이용하여제거한뒤이를멸균한배지와잘섞는다.( 단, 이때멸균한배지의온도는 50~55 로유지한다. 6 잘섞은균을멸균한백금이 (loop 를이용하여굳힌 8개의배지에잘접종한뒤 37.5 의배양기에서 2일간배양한다. ( 단,4~6 과정은 cleanbench 에서진행한다. - 7 -
그림 4. 배지제작과정 2Paperdisk 확산법을이용한항곰팡이효과실험 1 직경 8mm 의페이퍼디스크를 Autoclave 를이용하여멸균한다.(121,15 분 2 멸균한페이퍼디스크에계피알데하이드 (caldehyde 에 3방울씩떨어뜨린후건조한다. 3 건조한페이퍼디스크를멸균한핀셋을이용하여배양된곰팡이위에 3개씩올려놓는다. 4 배양기에넣고 2일동안보관한다. 5. 탐구결과 1. 계피알데하이드 (caldehyde 추출및분석실험 그래프를보면가로축은 Time, 세로축은 Abundance 로나타나있다. 즉가로축은작동시간 (= 기록한시간 을나타내는것이고세로축은그시간에서물질이얼마나나왔느냐하는것을알려주는값이다. 그래프를확대해서특정구간만찍어놓은것은그구간에서계피알데하이드 (caldehyde 가분리되어나왔다는것을의미한다. 표는원래의물질이맞을확률이높은순서대로검출된성분을나열한것이다. 표에서보면 MW라고되어있는부분은해당성분의분자량이며,Formula 는해당성분의분자식이다. - 8 -
graph1. 에탄올 (Ethylalcohol 을용매로한계피추출물에서계피알데하이드 (caldehyde 가추출되었을확률이가장높은곳 표 1.Rankof 에탄올 (Ethylalcohol graph1 에서에탄올 (Ethylalcohol 의경우전체 32.5 분중 9.408 분에서계피알데하이드 (caldehyde 가분리되어나왔다는사실을알수있다. - 9 -
graph2. 부탄올 (n-butylalcohol 을용매로한계피추출물에서계피 알데하이드 (caldehyde 가추출되었을확률이가장높은곳 표 2.Rankof 부탄올 (n-butylalcohol Graph 2 에서부탄올 (n-butylalcohol 의경우전체 32.5 분중 9.413 분에서계피알데하 이드 (caldehyde 가분리되어나왔다는것을알수있다. - 10 -
graph3. 헥세인 (n-hexane 을용매로한계피추출물에서 caldehyde 가 추출되었을확률이가장높은곳 표 3.Rankof 헥세인 (n-hexane graph 4 에서헥세인 (n-haxane 의경우전체 32.5 분중 9.408 분에서계피알데하이드 (caldehyde 가분리되어나왔다는것을알수있다. - 11 -
표 4.Rankof메탄올( Me t hylal c ohol 메탄올( Me t hylal c ohol 의 경우 32. 5분 중 어느 곳에서도 계피 알데하이드( c al de hyde 의 성분이 검출되지 않은 것을 보아 추출되지 않았다는 것을 알 수 있다. 위의 표들을 보면 2-Pr openal3-phe nyl 이라고 쓰여진 물질이 많은데 그것과 계피 알데 하이드( cal de hyde 는 같은 물질로 봐도 무방하다.화학자료에서는 계피 알데하 이드( c al dehyde 와 3-Phe nyl -2-pr onpe nal 가 동일한 물질이라고 표시되어 있다. 따라서 이는 계피 알데하이드( c al de hyde 의 구조에 있는 이중결합에서의 s-tr ans 이성질체를 표시한 것이라 추측된다. 위의 결과들을 종합적으로 정리해보면,에탄올( Et hylal c ohol 과 헥세인( n-he xane 에서 는 계피 알데하이드( c al de hyde 가 9. 408분에서 검출되었고, 부탄올( n-but yl al c ohol 에서도 9. 413분에 계피 알데하이드( cal de hyde 를 검출 할 수 있었다.그 러나 메탄올( Me t hylal c ohol 에서는 계피 알데하이드( cal de hyde 가 검출되지 않 은 것으로 보아 같은 유기용매라 할지라도 용매에 따른 추출여부나 추출되는 정도가 다 르다는 것을 확인할 수 있었다. 2.Pape rdi s kagardi f f us i on법을 이용한 항곰팡이 효과 실험 그림 5.계피 알데하이드( cal de hyde 의 항곰팡이 효과 - 12 -
Chart1. 곰팡이생장억제대의직경비교 전체적으로검은빵곰팡이 (Rhizopusstolonifer 의생장이눈에띄게감소하였으며, 모두억제대가생성되었고각각의직경이 10mm,12mm,13mm,15mm,16mm 이었으며평균값은 12.7mm 으로나타나항곰팡이효과가있는것으로나타났다. 이번실험에서억제대가타원형에가깝기때문에직경을측정하기가힘들었으며, 각각장직경과단직경의평균값을구하여기록하였다. 6. 고찰 이번실험에서는눈에띄는결론을 2가지얻을수있는데 1차적으로계피알데하이드 (caldehyde 는용매에따라추출여부와추출되는정도가확연히차이가난다는것을알수있었으며,2 차적으로는검은빵곰팡이 (Rhizopus stolonifer 에대한항곰팡이효과가있다는것이다. Gas Chromatography Mass Spectrometer 분석결과에탄올 (Ethylalcohol, 부탄올 (n-butylalcohol, 헥산 (n-hexane 에서는계피알데하이드 (caldehyde 가추출되었으나, 메탄올 (Methylalcohol 에서는추출되지않았다. 같은유기용매임에도불구하고계피알데하이드 (caldehyde 의추출여부에차이가있는것으로보아실용적인측면에서 caldehyde 를추출할수있는최적조건의용매를알아보고싶다. 또한계피알데하이드 (caldehyde 의검은빵곰팡이 (Rhizopusstolonifer 에대한항곰팡이효과는배지전체적으로도나타났고억제대또한형성된것으로보아뛰어나다. 이를좀더실용화시키기위해서는단순히검은빵곰팡이 (Rhizopusstolonifer 뿐아니라다양한종류의곰팡이를이용하여일반화시키는과정이필요하며, 또한계피알데하이드 (caldehyde 의농도별항곰팡이효과를탐구하여보다효율적인곰팡이제거제로서의가능성을확인해보고싶다. - 13 -
7. 결론 친환경곰팡이제거제로서의활용가능성을확인하기위해이번실험에서계피알데하이드 (c aldehyde 는에탄올 (Ethyl alcohol, 부탄올 (n-butyl alcohol, 헥세인 (n-hexane 에서추출되었고메탄올 (Methylalcohol 에서는추출되지않은것으로보아용매에따라추출여부와추출되는양의차이가있다는것을알수있었으며, 계피알데하이드 (caldehyde 가검은빵곰팡이 (Rhizopusstolonifer 에대해억제대를형성하고전체적으로검은빵곰팡이 (Rhizopusstolonifer 의생장이약화된걸로보아항곰팡이효과가있다는것을알수있었다. 이상의모든결과를종합해보면계피알데하이드 (caldehyde 가천연항균제로서의가능성이있는것으로판단된다. 8. 참고문헌 강성태, 윤재영.(2002 식품미생물학, 형성출판사균류생물학번역위원회.(2006 균류생물학제 4판, 윌스사이언스이건형외역.(2008 미생물학실험, 지코사이언스권진혁. 박창석,2002,Rhizopusstolonifer 에의한감귤무름병권진혁.2007,Rhizopusstolonifer 에의한바나나무름병발생권진혁.2008,Rhizopusstolonifer 에의한멜론무름병발생김민경외 5인.2006, 가시오갈피열매의성분분석과항산화효과및항균활성최정이외 2인.2006, 뽕잎추출물의구강미생물에대한항균효과조경환, 박수길.2005, 두유에서자몽씨추출물의 Bacilus 균에대한항균효과안명수외 2인.2007, 감귤과피추출물의항산화및항균효과에관한연구임금옥외 2인.2009, 자몽종자추출물을함유한 GelatinFilm 의항균효과신용습외 9인.2008, 참외 (CucumismeloL.varmakuwaMakino 의물과에탄을추출물의항산화및항균효과송명종외 2인.2005, 을이용한계피의 t- 계피알데하이드 (c aldehyde 정량분석김나미, 김영회.2000, 에탄올의농도가계피의향기성분용출에미치는영향이태희외 2인.2001, 계피부위별 cacid 와계피알데하이드 (c aldehyde 의정량 www.kccm.or.kr < 그림 1> 사진출처 : htp:/www.alibaba.com/product-tp/104595637/cic_aldehyde.html < 그림 2> 사진출처 : htp:/www.botany.hawai.edu/faculty/wong/bot201/zygomycota/zygomycota.htm htp:/filebox.vt.edu/users/chagedor/biol_4684/microbes/rhizopus.htm - 14 -