J Plant Biotechnol (2015) 42:6 12 DOI:http://dx.doi.org/10.5010/JPB.2015.42.1.6 ISSN 1598-6365 Review 약용작물의기원판별에관한분자생물학적기술개발현황 한은희 김윤희 이신우 Development of molecular biological techniques for the differentiation of medicinal plant species Eun-Heui Han Yun-Hee Kim Shin-Woo Lee Received: 5 March 2015 / Revised: 15 March 2015 / Accepted: 15 March 2015 c Korean Society for Plant Biotechnology Abstract Medicinal plants resources are becoming important assets since their usages have been expanded to the development of functional foods for human health, more attractive cosmetics, and pharmaceutical industries. However, their phylogenetic origins and names are different from each country and quite often they are mixed each other resulting in the confusion for consumers. In particular, when they are very similar based on their morphological characteristics and distributed as dried roots, it is extremely difficult to differentiate their origins even by specialists. Recently, DNA barcodes have been extensively applied to identify their origin of medicinal plant species. In this review, we tried to overview the current research achievements for the development of suitable DNA barcodes regarding to the differentiation of medicinal plant species. Furthermore, more advanced techniques including amplification refractory mutation system (ARMS)-PCR, multiplex single base extension (MSBE), high-resolution melting (HRM) curve analyses are also discussed for their practical applications in the authentification of particular medicinal plant species. E.-H. Han S.-W. Lee ( ) 경남과학기술대학교, 생명과학대학, 농학ㆍ한약자원학부 (Dept. of Agronomy & Medicinal Plant Resources, Gyeongnam National University of Science & Technology, JinJu, Korea) e-mail: shinwlee@gntech.ac.kr Y.-H. Kim 경상대학교, 사범대학, 생물교육과 ( 농업생명과학연구원 ) (Dept. of Biology Education, College of Education, IALS, Gyeongsang National University, Jinju, Korea) 서론 최근약용작물은기존에이용되던한약재뿐만아니라기능성식품, 화장품, 의약품등의원료로그용도가점차확대됨으로서수요가기하급수적으로늘어나고있는실정이며가격또한상승하고있는실정이다. 그러나우리나라는수입에의존도가높아이러한한약재의수급불균형이발생할가능성이높다. 또한한약재의경우유통과정에서그기원이부정확하거나명칭이유사하여혼 오용되는사례가많다. 특히국가별로한약재를약으로사용하면서약용식물의기원을다르게규정하고있어우리나라는한약재의정확한기원을모르고위품이시장에유통되는경우가많아유통질서가제대로확립되지않아향후중국과일본등 3 국간에분쟁우려가많이발생할것으로우려되고있다. 기존의관능검사, 형태학적, 이화학적, 세포생화학적검사법등에의존하기보다는보다과학적인진보된기술의도입이시급한실정이다. 이러한문제점을해결하기위하여 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), Sequence Characterized Amplified regions (SCARs), Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS), Amplificon Length Polymorphism (ALP), Sequence Tagged Site-Restriction fragment Length Polymorphism (STS-RFLP) 등의분자생물학적기술을적용하기위하여지난수년간많은연구자들에의하여수행되어왔으나아직까지반복성과신뢰도등의문제점으로인하여실제한약재의위품을구분하기에유용한기술의개발은아직미진한실정이다. 따라서최근에는단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 을보이는부분을이용하는 DNA barcodes 의개발에관한연구에많은관심을갖게되었다. DNA barcodes
J Plant Biotechnol (2015) 42:6 12 7 라는용어는 Arnot et al. (1993) 에의하여처음사용되었으며, 그후 Hebert et al. (2003) 에의하여 cytochrome C oxidase 유전자단편을이용한동물의 barcoding 에관한논문의발표와함께전성기를맞이하였다. 이후 Consortium for the Barcode of Life (CBOL, http://barcoding.si.edu) 가조직되어국제적인 DNA barcoding 연구가활성화되기시작하였다. 그러나아직까지도동물의 barcode 는미토콘드리아 cytochrome C oxidase I (COI) 유전자에해당하는 658bp 가가장유효한것으로결정될수있었으나식물의경우에는논란이많고 COI 처럼대표할수있는 barcode 가없는실정이다. 최근에는 Next Generation DNA Sequencing (NGS) 기술의급속한발전과함께생물다양성의유지보존과관련된자연생태계에서채취한샘플중에서단일종의판별, 다양한가공기술에의하여개발된가공식품에포함된단일종의판별, GMO 의혼재여부판별등다양한분야에응용될수있는기술의개발에관한연구가활발하게보고되고있다 (Valentini et al. 2008). 따라서본리뷰논문에서는최근까지보고된주요약용작물특히향후중국, 일본등과국가간분쟁의우려가높은것으로사료되는하수오, 당귀등의주요약용작물을중심으로그기원을판별하기위하여사용된분자생물학적기술 (DNA barcoding 등 ) 에관하여기술의원리, 성과, 실용화가능성그리고향후문제점등을정리하여보았다. 식물의분류에이용되는 Barcodes 개발현황 DNA barcoding 에있어서 3 가지주요원칙은표준화 (standardization), 최소화 (minimalism), 응용범위 (scalability) 이라고기술된바있다 (Hollingsworth et al. 2011). 동물의경우에는 COI DNA barcode 가이원칙에아주적절한것으로확인되었다 (Hebert et al, 2003). 그러나식물의경우에는엽록체의게놈에존재하는 rpoc1, rpob, matk, trnh-psba, rbcl, atpf-h, psbki 유전자등에관한많은연구결과가발표되었으나, 현재까지의연구결과에의하면한가지만으로는충분하지않으며이들중여러개를복합적으로비교분석한결과어느정도만족할만한결과를얻었다고하였다. 예를들면 rpoc1+rpob+matk 또는 rpoc1+matk+ trnh-psba (Chase et al, 2007); rbcl+trnh-psba (Kress and Erickson, 2007) 등의조합에의하여어느정도분류가가능하였다고하였다. 또한 CBOL 의 Plant working group 의검토결과에의하면 rbcl 과 matk 를조합한경우에가장좋은결과를얻을수있었으며이조합을 core barcode 로정한바있다 (CBOL, 2009). matk 와 rbcl barcode 는모두애기장대 (Arabidopsis thaliana) 의엽록체게놈의염기서열로부터프라이머를디자인하여전장의유전자단편을 polymerase chain reaction (PCR) 로증폭하여얻은단편을염기서열로확인한것이다. 식물 체의 matk 유전자는진화속도가가장빠른것으로알려져있어동물의 COI barcode 와가장유사한것이다. 그러나불행하게도애기장대에서디자인한프라이머가모든식물의 matk 유전자를증폭시킬수있는광역프라이머로사용될수없다는게단점이다. 따라서 clade-specific primer 또는 phylogenic tree 상에서보다가까운그룹에서디자인한프라이머세트를다시개발하여사용하여야한다 (Wickie et al. 2009; Dunning et al. 2010; Kuo et al. 2011). 반면에 rbcl 프라이머는비교적넓은범위의식물종을대상으로 PCR 증폭이가능하나그만큼상동성이높아다형성 (polymorphism) 을많이나타내지않는것이단점이라고알려져있다. 한편 rbcl+matk core barcode 에이어그다음으로많이연구되어온엽록체 barcodes 는 trnh-psba 의유전자간 DNA (IGS, intergenic spacer) 영역이다. 이 barcodes 를사용하여 Ficus (Roy et al. 2010), Alnus (Ren et al. 2010), Quercus (Piredda, 2010) and Salix (von Cräutlein et al. 2011) 속의종간구분에는오히려 rbcl+matk core barcode 보다좋은결과를보였다고하였다. 또한 trnl intron 지역그리고 trnl 과 trnf 사이의 IGS 영역역시많은연구대상이되어왔다. 특히 trnl intron 에는작은 stem-loop 구조를하고있어이지역주변의잘보존되어있는양쪽에서디자인한프라이머세트로증폭하여이영역을 minibarcode 화하여아주유용하게사용될수있을것이라고주장된바도있다 (Valentini et al. 2009). 약용작물의분류및위품판별을위한 barcodes 개발현황 이미전술한바와같이약용작물의경우에는국가별로명칭이다르고서로혼재하여사용되는경우가많으며, 모양이나형태가유사한것을위품으로유통되는경우가많다. 특히건조된뿌리나약간의 1 차가공과정만하여도전문가가아닌일반인은구분을할수없어서시중에유통되는이들위품을판별하기위한 barcodes 를개발한다면그응용성은무한할것으로사료된다. 따라서약용작물의구분을위한 barcodes 의개발은핵내라이보좀구성 RNA 를암호하는 (nuclear ribosomal) DNA 의 internal transcribed spacer region (ITS1 과 ITS2) 과염록체게놈의여러가지 DNA 단편을이용하여연구되어왔다. 먼저 ITS 를이용한연구현황을 Table 1 에요약하였다. 감초등이속하여있는콩과 (Fabaceae) 에해당하는약용작물들의 ITS2 영역을 PCR 로증폭하여염기서열분석결과를비교하여종내에는평균 1.7% 의변이를보이고전체적으로는 0 에서 14.4% 까지변이를보였다고하였다. 종간에는 0 에서 63% 까지의변이를보여평균 8.6% 의변이를보였다고하였다. 따라서시중에유통되는위품들의판별에도유용하게사용될수있었다고보고된바있다
8 J Plant Biotechnol (2015) 42:6 12 Table 1 List of medicinal plant species that have been differentiated by using internal transcribed spacer (ITS) of nuclear ribosomal DNA as a barcode Family/genus/species References Comments Fabaceae (Leguminosae) 753 genera 4,800 species Gao et al. 2010 Chen et al. 2010 (Licorice) Glycyrrhiza uralensis polymorphism (92.7%) 50,790 plants 12,221 animals Yao et al. 2010 Angelica species He et al. 2011 Breeae & Cirsii herba Moon et al. 2013 Angelica species Kim et al. 2012 Schizonepta spike Baigalmaa et al. 2009 Hyung-Gae Fallopia multiflora Sun et al. 2013 Cnidii Rhizoma Song et al. 2009 Fallopia multiflora Zheng et al. 2009 Ligusticum chuanxiong hort vs Cnidium officinale Makino Liu et al. 2002 primer design for differentiation by PCR Chinese Chuanxiong vs Japan Chuanxiong (Gao et al. 2010). Chen 등 (2010) 은 753 속 4,800 종에해당하는방대한시료에대하여 ITS2 영역의염기서열을분석한결과 92.7% 에해당하는종의구분이가능하여약용식물의종간구분을위한범용바코드로지정하자고제의를하였다. 또한 Yao et al. (2010) 도 50,790 종의식물과 12,221 종의동물에대하여 ITS2 영역의염기서열을비교분석한결과 67 ~ 91% 까지종의구분이가능하였으며여기에다가 ITS2 영역의 secondary structure 를이용하면범용으로사용될수있는식물용 barcode 로의사용가능성을제시하였다. 또한 He 등 (2011) 도당귀속에속하는다양한종에대하여 ITS 지역의염기서열을비교하여 phylogenic tree 를제작하여유연관계를분석할수있었다고하였다. 특히중국의시중에서말린뿌리상태로유통되어구분이어려운당귀시료들을시중에서수집하여조사한결과일부위품의판별이가능하였다고하였다. Kim 등 (2012) 도 ITS 지역을이용하여분석한결과토당귀와일당귀가중국당귀보다유연관계가가까운것으로조사되었으며, 한 중 일 3 국에서각기다른기원종으로규정하고있는당귀 ( 當歸 ) 류의구별을위해시중에서유통중인당귀 ( 當歸 ) 를종별로 3 점씩, 총 9 점을구입하여미각패턴과 ITS DNA 의염기서열을비교한결과일치하는결과를얻었다고보고하였다 (Kim et al. 2012). 천궁역시 ITS1 과 ITS2 유전자단편의염기서열을비교 Table 2 Chloroplast barcodes for the differentiation of medicinal plant species Family/Genus/Species Chloroplast barcodes References Polygonaceae rbcl, trnh-psba, ndhj, rpob, rpoc, accd Song et al. 2009 Cnidium officinale, trnk Ligusticum chuanxiong Zhu et al. 2007 Breeae, Cirsii herba matk, rbcl Moon et al 2013 Pinellia species matk, rbcl Lee et al. 2013 Fallopia multiflora (Thumb) Harald matk, rbcl, psba-trnh Sun et al. 2013 Fagopyrum species trnk, matk Ohsako & Ohnishi,2001 Cnidium officinale, matk Ligusticum chuanxiong Liu et al. 2002 Fallopia multiflora (Thumb) Harald matk Yan et al. 2008 Liriope platyphylla Wang et Tang, Phiopogon japonicus Ker-Gwaler rpoc1 Park et al. 2014 분석한결과토천궁과일천궁, 중국천궁은모두천궁속 (Cnidium) 보다는고본속 (Ligusticum) 과같은분계조를형성하고있는것으로나타났으며, 또한한국산천궁과중국산천궁의두집단간에식별이가능한 SNPs (Single nucleotide polymorphisms) 를확보하여서로간에구분이가능하였다고함 (Song et al. 2009). Baigalmaa et al. (2009) 은 26 계통의형개 (Schizonepeta spike) 로알려진한약재시료를채취하여 ITS 영역의염기서열을분석하여비교한결과 Schizonepeta tenuifolia plants 로표기된 9 종은모두진품으로판명할수있었다고보고하였다. 또한 Song et al. (2009) 은일천궁, 토천궁, 중국천궁을수집하여 ITS 영역의염기서열을분석한결과이들을구분할수있는 SNP 들을확인할수있었다고하였다. 이외에도 6 계통의 Fallopia multiflora 에속하는시료를대상으로 ITS 영역의 SNP 를구분할수있는 primer 를디자인하여위품으로부터종을판별하는데성공하였다고보고한바있다 (Zheng et al. 2009). 또한중국의 Liu 등도이미 2002 년도에일본천궁 (Cnidium officinale Makino) 과중국천궁 (Ligusticum chuanxiong Hort) 의 ITS 영역의염기서열을조사한결과단한개의염기치환이있었다고보고하였다 (Liu et al. 2002). 다음으로엽록체 barcodes 의개발을위한연구를 Table 2 에요약하였다. 이들을검토하여보면적하수오등이속한붉은조롱과 (Polygonaceae) 약용작물을위품으로부터판별하기위하여 18 종에속하는 38 계통에대하여 6 가지의엽록체 barcodes 와핵내존재하는 ITS 등을 PCR 로증폭한다음염기서열을분석하여조사한결과 trnh-psba 가가장
J Plant Biotechnol (2015) 42:6 12 9 높은다양성을보였고 (20.05%), 위품에해당되는유사약용작물들을쉽게판별할수가있었다고보고하였다 (Song et al. 2009). 대계 ( 大薊 ) 와소계 ( 小薊 ) 의기원종을구분하기위하여 rdna-its, matk 및 rbcl 부위 DNA 바코드분석을수행한결과 ITS 가가장많은다형성을보여이들의구분은물론위품인 Carduus 속의지느러미엉겅퀴를종단위에서감별할수있었다고보고하였다 (Moon et al. 2013). 반하 ( 半夏 ) 의기원식물을구분하기위하여 Pinellia ternata, Pinellia pedatisecta, Pinellia tripartita, Typhonium flagelliforme 에속하는 19 계통을채취하여 matk 와 rbcl 두유전자영역의염기서열을비교한결과, matk 유전자영역에서 rbcl 유전자보다반하류의종감별에유용한 SNP 를다수포함하고있어 matk 유전자가 rbcl 유전자보다반하류의종감별에더유용한 DNA 바코드로이용될수있을것으로사료된다고보고하였다 (Lee et al. 2013) 또한 Sun et al. (2013) 은 Fallopia multiflora 종에속하는계통들을중국의 17 성에서서식또는재배되고있는야생종과재배종으로부터 105 계통을수집하여 matk, rbcl, psba-trnh 그리고 ITS barcodes 들을사용하여분석한결과 psba-trnh 가가장양호한결과를보였으며이들 4 가지 barcodes 를조합하여보다판별효율을증진시킬수있었다고하였다. 또한 trnk 와 matk 영역을이용하여 Polygonaceae 과의메밀속 (Fagopyrum) 에속하는 F. leptopodum 종으로알려진 10 계통과과 F. statice 종으로알려진 5 계통을대상으로분석한결과상호간에 9 개의염기치환이있었음을확인하고구분이가능하였다고하였다 (Ohsako & Ohnishi 2001). 이외에도중국천궁과일본천궁의 matk 영역을비교분석한결과단하나의염기치환을확인하였다고하였으며 (Liu et al. 2002), 중국에서만서식하는것으로알려진중국토종인 Fallopia multiflora (Thumb) Harald 의 matk 영역의염기서열을이용하여위품을구분할수있는 SNP 를확인할수있었다고하였다 (Yan et al. 2008). 뿐만아니라국내외에서수집된 26 계통의맥문동에대하여 rpoc1 유전자의염기서열을비교분석하여 SNP 를확인하고이들을판별할수있는프라이머까지개발하여국내특허를획득한것으로알려졌다 (Park et al. 2014). DNA barcodes 를이용한진보된기술의개발현황 전술한바와같이 DNA barcodes 는 SNPs 를찾아내어상호간에구분을하는기술로고도로전문화된전문가가필요하다. 따라서보다단순화되고효율적으로반복이가능하고저렴한가격에수행할수있는기술들을개발하여현장에서실용화가가능하여야한다. 이러한관점에서가장쉬운방법은 SNP 를포함하는프라이머를제작하여 PCR 에의하여증폭되는단편을전기영동하여밴드의유무로판단하는것일것이다. 그러나대부분의경우 Table 3 Advanced techniques for the identification of medicinal plant species Techniques Target regions Family/Genus /Species ARMS-PCR Chs Panax ginseng MSBE HRM trnk ITS, trnl-f, rpl36-ps8 matk ITS2 Chloroplast IGS(62) Cnidium officinale Ligusticum chuanxiong Berry species Hellevorous niger Veratrum niger Sideritis species References Yang et al. 2012 KR Patent 10-2012-0106414 Zhu et al. 2007 Jaakola et al. 2010 Mader et al. 2011 Kalivao et al. 2014 Panax species Kim et al 2013 에단하나또는두개의염기서열의차이가나는프라이머를제작하여 PCR 을수행하였을경우에도동일한 PCR 산물을생산하기때문에보다정밀한기술이필요하다. 현재까지이러한진보된기술을이용하여약용작물에적용한사례들을요약하여보면 Table 3 과같다. Amplification refractory mutation system (ARMS) 일반적으로 PCR 은 3 - 말단의염기가주형과완전히일치할때에가장확실하게이용될수있는기술이다. 그러나실제로는 3 - 말단의염기가하나혹은두개틀려도 PCR 로증폭이가능하기때문에판별이어려운경우가대부분이다. 따라서 ARMS-PCR 은이러한문제점을극복하기위하여 SNP 에가장가깝게인접한 2, 3 번째염기서열을변경하여 SNP 프라이머의특이성을높이고자하는기술이다. 실제로인삼의경우금품종과청선종에만유일하게나타나는 SNP 를포함하는프라이머를제작하여 ARMS-PCR 을수행한결과다른인삼품종과구분이가능한특정밴드를생산할수있었다. 이때프라이머는 SNP 가 3 - 말단에위치하게하고그로부터 5 - 쪽으로 3 번째의염기서열을변이가일어나도록디자인하여금품종과청선종은한개의염기서열이차이가있으나다른품종들은두개의염기서열이차이가나게하여 PCR 을수행하였을경우보다확실하게밴드의유무를확인할수있는결과를얻어이기술을특허로등록하였다 (Yang et al. 2012). ARMS 기술은 Newton et al.(1989) 에의하여처음보고된기술로서, 기본적으로는 allele-specific (AS)-PCR 기술이다. 그러나예를들어 G 가 C 로점돌연변이 (point mutation) 가일어난경우에 ARMS primer 의 3 - 말단은 G 가되어야치
10 J Plant Biotechnol (2015) 42:6 12 Table 4 The strength of mismatch pairings (Little, 1994) Strength Maximum Strong Medium Weak None Mismatch types G-A, C-T, T-T C-C A-A, G-G, C-A, G-T A-T, G-C 환된 C 와결합이될것이다. 하지만이프라이머는정상적인유전자단편과도 G-G mismatch 결합이가능하며이는약한 mismatch 이어서 primer 의 extension 을효율적으로저해하지못하여 PCR 반응에의하여증폭된동일한크기의밴드를형성한다. 다만강한 mismatch 에해당하는 C-C, G-A, A-A 의경우에만 100% 또는 95% 까지염기서열의합성을저해할수있다. 따라서 3'- 말단의 SNP 위치에서 2, 3, 4 번째에 C-C, G-A, A-A mismatch 염기를도입하여제작한프라이머를사용하여 PCR 증폭을 100% 저해할수있도록고안한기술이다. 일반적으로 3'- 말단의 SNP 가약하면두번째 mismatch 는강한것으로디자인한다. 그리고두번째것을디자인하여결과를보고세번째염기를변경하도록디자인것을시도한다. Litte(1994) 는 mismatch 결합의강약을 Table 4 와같이보고하였으며이들조합을적당하게사용하여프라이머를제작하여몇번의시도를거쳐가장적당한조건을설정하는것이중요하다고하였다. Multiplex Single base Extension (MSBE) 분석기술 이기술은일종의 mini-sequencing 기술로분석하고자하는 SNP 를포함하는부위를증폭한다음 dntp 와프라이머를제거한후 SNP 바로앞부분까지를포함하는프라이머 (extension primer) 를넣고형광색소로표지된 ddntp 를이용하여하나의염기만신장시킨다. 이렇게하면서로다른형광색을나타내는 ddntp 중하나만신장하고반응은종결되며이를자동염기서열분석장치를이용하여분석하는기술이다. 따라서이기술은여러종의 SNP 를포함하는부위를이용하여길이가서로다른여러개의 extension primer 를사용하면 2 종이상의시료가혼재되어있을경우에이들을구분하기에용이한기술이다. 약용작물에이용된사례로는천궁즉 Cnidium officinale ( 일본에서사용되는천궁학명 ) 과 Ligusticum chuanxiong ( 중국에서사용되는천궁학명 ) 을확실하게구분이가능하였다고하였다. 보다자세하게살펴보면이들의속간구분을위하여엽록체유전자인 trnk 유전자의염기서열을비교분석하여상류 (upstream) 에서각각 767, 924, 964 번째염기서열에해당하는위치에서나타나는 SNP 를확인하 고, 이위치에서각각 14mer, 23mer, 30mer 길이로디자인된프라이머를사용하여 multiplex single base extension (MSBE) 을수행하여두종을쉽게구분할수있었다고하였다 (Zhu et al. 2007). 또한이기술로 Dongxiong 이라고불리는중국의또다른지역에서재배되고있는천궁은그기원이 Cnidium officinale 인것으로판명할수있었다. 중국에서는천궁을 Chuanxiong 이라고부르며일본식발음으로는 Senkyu, 한국에서는천궁이라고부른다. 이들의외부형태학적인모양은유사하나그식물기원은서로다르다. 그러나 rbcl 유전자와 18S rrna 유전자의염기서열을조사한결과상호간에 100% 일치하여구분이불가능하였다고하였다 (Fushimi et al. 1997). High-resolution melting (HRM) curve 분석기술 post-pcr melting curve 분석기술은 SNP 를포함하는유전자단편을증폭시킨다음초당 0.5 ~ 1.0 C 씩온도를증가시키면서 melting curve 를조사하여그차이를이용하여종을판별하는기술이다. 주로 SYBR Green 이라는형광염색화합물을사용하는데이는이중나선 (dsdna) 을한 DNA 의 minor groove 에삽입되면서강한발색을나타낸다. PCR 로이중나선 DNA 를많이증폭하게되면그만큼상대적으로발색이강하여진다. 따라서 SYBR Green dye 를포함하는반응용액에서 PCR 로증폭시킨이중나선 DNA 를초당 0.5 ~ 1.0 C 씩온도를올리면서 melting curve 를보면초기에많은양의이중나선 DNA 가존재하기때문에강한발색에서온도를서서히상승하면서단일가닥으로 melting 되면서발색정도가서서히약하여진다. 이러한 melting curve 의굴곡의차이를갖고 data 를분석하거나또는시간별온도에대한음의형광값 (-df/dt) 으로계산하여얻은 melting peak 를갖고분석을한다. 그러나이기술로는아주적은수 ( 하나또는두개 ) 의 SNP 를구분할수없다는단점이있다. 따라서보다정밀하고효율이띄어난것으로알려진 High Resolution Melting (HRM) Curve analysis 기술이보고되었다. 이기술의기본원리는 post-pcr melting curve analysis 기술과동일하다. 그러나고농도에서도 DNA 중합효소의기능을저해하지않는형광색소인 LC Green PLUS, Eva Green, SYT09, ResoLight 등을사용하여모든증폭된 DNA 의전체길이에형광색소가삽입이될수있도록하고, 아주미세한단위즉초당 0.01 ~ 0.2 C 로온도상승조절이가능한특수기계 (High Resolution Melting Master, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany 또는 SsofatTM EvaGreen supermix, BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA, Light Cycler R 480) 를사용한다. 이렇게하면하나의 SNP 차이도구분이가능하다. 따라서이기술은극도로민감하여해바라기, 땅콩, 옥수수, 참깨, 쌀등에서추출한기름에적
J Plant Biotechnol (2015) 42:6 12 11 용하여상호간에구분이가능하다고보고하였다 (Vietina et al. 2013). 이러한연구결과는향후 HRM 기술의응용범위는각종한약재의가공품뿐만아니라한약재를이용한탕재등에적용하는등그응용범위가크게늘어갈것으로전망된다. ITS 영역또는엽록체 DNA 에해당하는 trnl-f, rpl36-ps8 영역을증폭하여얻은단편을대상으로 HRM 분석기술을적용한결과시중에유통되는야생형은물론다양한베리 (berry) 종들의판별이가능하였다고하였다. 특히불과 4 시간내에 DNA 시료를채취하여 HRM 분석까지마칠수있었다고하였다. 또한가공제품의원료로사용되는혼합시료로부터손쉽게특정종의존재여부를판별할수있었다고보고하며, 향후유통과정에서위품들을판별할수있는기술로크게이용될것이라고예견하였다 (Jaakola et al. 2010). 또한크리스마스장미라고불리는 Helleborus niger 와영국에서 Black Hellebore 로불리는 Veratrum niger 와시중에쉽게혼재하여유통되므로이들을구분하기위한 barcode 로 matk 영역을선택하여 HRM 기술을적용한결과 1 : 1,000 비율로모르는시료에혼재되어있거나 1 : 200,000 비율로 Veratrum niger 가혼재한경우에도판별이가능할정도로민감하였다고보고하였다 (Mader et al. 2011). 또한최근에는그리스의고산지대에서군락을이루고있는 Sidertis 종은약용식물로항균, 소염, 진정제로효과가띄어나차로애용되고있는식물인데다양한종류의종이자라며일부는약효가아주띄어나고일부는독성도있는것으로알려져이들을정확하게판별할수있는기술이필요하였다. 따라서 ITS2 영역에대한 HRM 분석기술을적용하여특별한처리과정이필요없고짧은시간에아주효율적으로서로간에구분이가능하였다고보고된바있다 (Kalivas et al. 2014). 또한인삼의엽록체게놈의모든유전자간 DNA 의염기서열을분석하고이들에대한 HRM 분석기술을적용하여본결과 62 개의 IGS 영역에서다형성을확인하였으며이중에서특히 trne-trnt, trnt-psbd, ndhfrpl32, rpl14-rpl16 spaces 가인삼종간에가장다양성이높게나타났으며, 분자시계 (molecular clocks) 를계산한결과 130 만년전에 P. notoginseng 이다른 Panax 종으로부터분지되었을것이라고추정하였다 (Kim et al. 2013). 사사 본연구는농림축산식품부농생명산업기술개발사업 ( 과제번호 : 314021-03- 1-SB050) 에의해이루어진결과입니다. References Arnot DE, Roper C, Bayoumi RA (1993) Digital codes from hypervariable tandemly repeated DNA sequences in the Plasmodium falciparum circumsporozoite gene can genetically barcode isolates. Mol Biochem Parasitol 61:15-24 Baigalmaa J, Kim MK, Noh JH, Hua S, Yang DC (2009) Phylogenetic analysis of Schizonepeta Spike on the basis of DNA sequences. K J Med Crop Sci 17:46-53 CBOL Plant Working Group (2009) A DNA barcode for land plants. Proc Natl Acad Sci 106:12794 12797 Chase MW, Cowan RS, Hollingsworth PM, van den Berg C, Madriñán S, Petersen G, Seberg O, Jørgsensen T, Cameron KM, Carine M, Pedersen N, Hedderson TAJ, Conrad F, Salazar GA, Richardson JE, Hollingsworth ML, Barraclough TG, Kelly L, Wilkinson M (2007) A proposal for a standardised protocol to barcode all land plants. Taxon 56: 295-299 Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, Shi L, Zhu Y, Ma X, Gao T, Pang X, Luo K, Li Y, Li X, Jia X, Lin Y, Leon C (2010) Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS One 5:1-8, e8613 Dunning LT, Savolainen V (2010) Broad-scale amplification of matk for DNA barcoding plants, a technical note. Botanical J of the Linnean Society 164:1-9 Fushimi H, Komatsu K, Isobe M, Namba T (1997) A new approach for the identification of a Chinese traditional medicine, Chuanxiong by 18S ribosomal RNA gene sequences. Phytomedicin 3:387 389 Gao T, Yao H, Song J, Liu C, Zhu Y, Ma X, Pang X, Xu H, Chen S (2010) Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS 2. J Ethnopharmacology 130:116-121 He Y, Hou P, Fan G, Song Z, Liu H, Li Y, Zhang Y (2011) Internal transcribed spacers (ITS) identification of Angelica anomala Lallem Chuanbaizhi (in Chinese) cultivars collected in Sichuan and their molecular phylogenetic analysis with other Angelica L. species. J Med Plants Res 5:3653-3659 Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, de Waard JR (2003) Biological identifications through DNA barcodes. Proc Royal Soc London, series B 270:313-321 Hebert PDN, Ratnasingham S, de Waard JR. (2003) Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc Biol Sci 270:S96-99 Hollingsworth PM, Graham SW, Little DP (2011) Choosing and using a plant DNA barcode. PLoS One 6:e19254 Jaakola L, Suokas M, Haggman (2010) Novel approaches based on DNA barcoding and high-resolution melting of amplicons for authenticity analyses of berry species. Food Chem 123:492-500 Kalivas A, Ganopoulos I, Xanthopoulou A, Chatzopoulou P, Tsaftaris A, Madesis P (2014) DNA barcode ITS2 coupled with high resolution melting (HRM) analysis for taxonomic identification of Sideritis species growing in Greece. Mol Biol Rep 41:5147-155 Kim JH, Jung JY, Choi HI, Kim NH, Park JY, Lee Y, Yang TJ (2013) Diversity and evolution of major Panax species revealed
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