(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2016년03월22일 (11) 등록번호 10-1605312 (24) 등록일자 2016년03월16일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 36/35 (2006.01) A61P 1/00 (2006.01) A61P 1/04 (2006.01) (21) 출원번호 10-2013-0104395 (22) 출원일자 2013 년 08 월 30 일 심사청구일자 2013 년 08 월 30 일 (65) 공개번호 10-2015-0026063 (43) 공개일자 2015 년 03 월 11 일 (56) 선행기술조사문헌 HARMANANDA, S. CHLOROGENIC ACID FOR HEALTHY LIVER AND GALLBLADDER FUNCTION. Article URL: http://www.itmonline.org/arts/chlorogenic.ht m. (2006.04.) KR1020120113879 A (73) 특허권자 주식회사녹십자 경기도용인시기흥구이현로 30 번길 107 ( 보정동 ) ( 주 ) 녹십자웰빙 경기도용인시기흥구이현로 30 번길 107 ( 보정동 ) (72) 발명자 박효진 서울특별시강남구언주로 211 강남세브란스병원내과 손의동 서울특별시동작구흑석로 84 중앙대학교약학대학 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 특허법인공간, 백경업전체청구항수 : 총 3 항심사관 : 고일영 (54) 발명의명칭금은화분획물을포함하는위장관운동장애치료또는예방용약학조성물 (57) 요약 본발명은금은화 (Lonicera japonica Thunberg) 의물, 탄소수 1 내지 4 의저급알코올또는이들의혼합용매로이루어진군으로부터선택한극성용매추출물에대한추가의유기용매분획물을함유하는기능성소화불량을포함한위장관운동장애질환의치료또는예방용추출물에관한것이다. 본발명에따른금은화극성용매추출물의유기용매분획물은부작용없이기능성소화불량을포함하는위장관운동장애질환의치료, 예방또는개선에매우효과적으로사용될수있다. 대표도 - 도 1-1 -
(72) 발명자 이선미 경기도수원시장안구서부로 2066 성균관대학교약학대학 김선옥 경기도성남시중원구둔촌대로 474 선텍시티 1 차 813 호주식회사녹십자에이치에스 김주영 경기도성남시중원구둔촌대로 474 선텍시티 1 차 813 호주식회사녹십자에이치에스 조정래 경기도용인시기흥구이현로 30 번길 107 주식회사녹십자 한혜정 경기도용인시기흥구이현로 30 번길 107 주식회사녹십자 이정숙 경기도용인시기흥구이현로 30 번길 107 주식회사녹십자 - 2 -
명세서청구범위청구항 1 삭제청구항 2 금은화 (Lonicerae Flos) 의물추출물농축물의수성현탁액을에틸아세테이트로추출한분획물이고 3,5-디-카페오일퀴닌산을함유하는것을특징으로하는기능성소화불량, 변비, 과민성대장증상, 당뇨병성위장운동장애, 화학요법으로인한위장운동장애, 소화관운동장애로인한장폐쇄증및근긴장성이영양증 (myotonic dystrophy) 으로인한위장관운동장애중의하나이상인위장관운동장애질환치료또는예방용약학조성물. 청구항 3 삭제청구항 4 제2항에있어서, 상기약학조성물은기능성소화불량치료제인돔페리돈 (Domperidone), 메토클로프라마이드 (metoclopramide), 레보설프라이드 (levosulpiride), 모사프라이드 (mosapride), 및이토프라이드 (itopride) 중에서하나이상을추가로함유하는것을특징으로하는위장관운동장애치료또는예방용약학조성물. 청구항 5 금은화 (Lonicerae Flos) 의물추출물농축물의수성현탁액을에틸아세테이트로추출한분획물이고 3,5-디-카페오일퀴닌산을함유하는것을특징으로하는기능성소화불량, 변비, 과민성대장증상, 당뇨병성위장운동장애, 화학요법으로인한위장운동장애, 소화관운동장애로인한장폐쇄증및근긴장성이영양증 (myotonic dystrophy) 으로인한위장관운동장애중의하나이상인위장관운동장애질환의개선또는예방용건강기능식품조성물. 청구항 6 삭제 발명의설명 [0001] [0002] 기술분야본발명은금은화 (Lonicera japonica Thunberg) 의물, 탄소수 1 내지 4의저급알코올또는이들의혼합용매로이루어진군으로부터선택한극성용매추출물에대한추가의유기용매분획물을함유하는기능성소화불량을포함한위장관운동장애질환의치료또는예방용추출물에관한것이다. 본발명에따른금은화극성용매추출물의유기용매분획물은부작용없이기능성소화불량을포함하는위장관운동장애질환의치료, 예방또는개선에매우효과적으로사용될수있다. 보다상세하게는기능성소화불량을포함한위장관운동장애에우수한치료효과또는예방효과를가지면서세포독성을나타내지않는금은화극성용매추출물의유기용매분획물을함유하는약학적조성물또는건강기능식품조성물에관한것이다. [0003] 배경기술위장관운동장애중하나인기능성소화불량 (functional dyspepsia) 은조직병리적및생화학적인기질적병변이아닌기능적증상으로상복부에지속적인불쾌감또는통증등의증상을나타내는질환으로서의학적으로는지속및반복적으로상복부에국한에서불쾌감이나통증등에따르는제반증상을의미한다. 구체적으로기능성 - 3 -
소화불량중하나인, 비궤양성소화불량은식후포함감, 식욕부진, 복부팽만감, 조기포만감, 트림, 상복부불 쾌감또는통증, 속쓰림, 오심 ( 메스꺼움 ), 구토, 위산역류, 가슴앓이 (heartburn) 등의소화기계증상을모두 포함하며아직병태생리가확실히밝혀져있지않다. [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] 기능성소화불량은뚜렷한기질적병변이없이여러가지다양한소화불량증상에의한진단이기때문에치료또한단순하지않고, 대부분의증상이호전과악화를반복하며음식, 스트레스등에의해변화가심하다. 이러한병적기전들은동시에작용하여한가지증상을나타낼수도있지만, 주로복합적작용으로발생한다. 대표적기능성소화불량치료제로는위장관운동촉진제로서, 돔페리돈 (Domperidone), 메토클로프라마이드 (metoclopramide), 레보설프라이드 (levosulpiride), 모사프라이드 (mosapride), 이토프라이드 (itopride) 등의약물이있다. 또한기능성소화불량의증상중대표적인증상이속쓰림및궤양이므로위산분비억제제및제산제가사용되나, H2 길항약을비롯한위산분비억제제및제산제는주로일시적인효과를나타내는경우가많다 (Vincenzo Stanghellini et al., Delayed Gastric Emptying in Functional Dyspepsia, Current Treatment Options in Gastroenterology, 7, 259-264, 2004). 최근새로운기능성소화불량을포함한위장관운동촉진제의개발은, 세로토닌조절약물 (Serotonergic modulating drug) 을중심으로이루어지고있는데, 이세로토닌 (serotonin, 5-hydroxytrypamine, 5-HT) 은약 80% 가위장관에, 특히그중 95% 가소장내의장내분비세포에분포하고있고, 위장연동운동에서중심적인역할을하기때문이다. 특히, 5-HT 관련수용체들의특이적효능약 (agonist) 과길항약 (antagonist) 이개발되고있으며, 5-HT4 효능약은위장수축력과추진압증가로위장관연동운동을촉진시키는작용이있어기능성소화불량을비롯한변비치료제로개발이이루어지고있다. 또한 5-HT3 길항약은구토억제나내장과민성감소에효과가있으며, 5-HT1P 효능약은위기저부이완작용이있어기능성소화불량치료제로개발이이루어지고있다 (Robin spiller,serotonergic modulating drugs for functional gastrointestinal disease, J Clin Pharmacol., 54, pp.11-20, 2002). 구체적으로, 5-HT3 수용체의길항약인그라니세트론 (granisetron) 은과민성대장증후군환자의직장감각을감소시키고, 온단세트론 (ondansetron) 은과민성대장증후군환자에게는무효하지만건강한사람의십이지장내지방유입시나타나는팽창으로인한구토나위장감각을감소시킨다. 실란세트론 (cilansetron) 은위장관민감성조절과위장팽창에의한소화관의적응력을향상시키고, 연동운동과관련된흥분성 5-HT3 수용체를차단하며, 공장액의흡수를증가시킨다. 그러나, 트로피세트론 (Tropisetron) 과온단세트론 (ondansetron) 을비롯한대부분의 5-HT3 수용체길항약은랫트의위장공복지연증상을개선하나사람을비롯한다른종에서는개선효과가확실치않다. 기능성소화불량증치료를위해효과적으로사용되었던위장관운동촉진제약물중하나로 5-HT4 수용체효능약 (agonist) 이면서 5-HT3 수용체길항약 (antagonist) 인시사프라이드 (cisapride) 는다른약물에비해통계적으로유의한효과가인정되었다. 시사프라이드 (cisapride) 의반응율은 50~82% 로위약의반응율 27~53% 보다높았으며, 보통시사프라이드 (cisapride) 를 4~8주간투여시 70% 이상에서약효를나타내는보고도있다. 또한, 시사프라이드는동반질환인과민성대장증후군의증상에도효력이있는것으로보고되고있으며, 또한도파민길항약인레보설프라이드 (levosulpiride), 돔페리돈 (domperidone) 에치료불응성인환자에서증상개선효과가있다. 그러나 1993년역류성식도질환치료제로승인받은후 2000년 7월판매중지되었다. 한편, 메토클로프라미드 (metoclopramide), 돔페리돈 (domperidone), 시사프라이드 (cisapride), 레보설프라이드 (levosulpride), 에리스로마이신 (erythromycin) 등의위장운동촉진제는기능성소화불량증환자들에서위약에비해증상호전에효과가우수하다는것이여러연구에서알려져있으며, 메토클로프라미드는가장흔히사용되는항도파민약제로서, 중추신경계과위장관의도파민수용체를억제하는데도파민은위장관운동을억제하는역할을한다. 메토클로프라미드는위십이지장의운동을증강시키고위배출기능을호전시키며진통작용이있어기능성소화불량증환자들의증상을개선하나, 장기간사용시, 증상의호전효과가감소하고중추신경계의도파민수용체에작용하여많게는약 24% 의환자에서신경계통의부작용을일으키므로조심스럽게사용되어야한다. 따라서기능성소화불량의치료효과가우수하고장기복용시에도인체에안전한기능성소화불량을포함한위장관운동장애질환의위장관운동촉진제의개발이절실히요구되고있는실정이다. 위장관운동촉진제는상기기능성소화불량이나변비, 과민성대장증상뿐아니라, 당뇨병성위장운동장애, 화학요법으로인한위장운동장애, 소화관운동장애로인한장폐색증, 근긴장성이영양증 (myotonic dystrophy) 환 - 4 -
자의위장운동장애등에사용될수있다. [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] 현재까지상기의약물들은소화관운동장애에대하여효과가있으나, 여러가지독성및부작용이존재하여실제적으로안전한약물의개발이필요한상황이다. 이에본발명자는금은화추출물을이용한새로운기능성소화불량을포함한위장운동촉진제를개발하게되었다. 금은화 (Lonicerae Flos) 는인동과 (Caprifoliaceae) 에속하는인동덩굴 (Lonicera japonica Thunb.) 의꽃으로, 한방이나민간에서는이뇨, 건위, 관절염, 화농성피부염, 기관지염에사용되고있다. 금은화의성분으로는 tannin, inositol, sterol, chlorogenic acid, isochlogenic acid 등이보고되어있으며, flavonoid 성분으로서는 luteolin, apigenin, luteolin-7-o-rhamnoglucoside, quercetin 등이알려져있다. 이러한금은화의 flavonoid 성분은항염증작용 (Lee, S. J.; Arch. Pharm. Res. 16, 25, 1993) 및항돌연변이작용등이보고되어있으며, 또한금은화를포함하는 12종생약을포함한단낭처방 No. 2(Dannang Recipe No. 2, DNR2) 의열수추출물이복강경담낭절제술 (laparoscopic cholecystectomy) 수술전처방에의해수술후급성염증억제또는위장관증진효과 (Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi, 中國中西醫結合雜志, 28(12), 1090-1092, 2008) 가보고되었다. 본발명자들은대한민국특허등록제10-0878436호에서 " 금은화추출물을포함하는소화성궤양치료또는예방용약학조성물 " 이라는내용으로금은화추출물이위염위궤양에치료효과가있음을확인하였고, 대한민국특허등록제10-1074839호에서 " 금은화추출물을포함하는역류성식도염또는예방용약학조성물 " 이라는내용으로금은화추출물이역류성식도염에치료효과가있음을확인하였다. 또한, 본발명자들은대한민국공개특허제10-2012-0113879호에서 소화기능개선효과를갖는생약추출물 이라는내용으로금은화의물및 / 또는탄소수 1 내지 4 개의알코올추출물이담즙분비를촉진하여지방소화에도움을주고, 위장관운동에도움을주는소화기능개선효과와이들의기능성건강식품으로서용도를확인하였다. 이에본발명자들은대한민국공개특허제10-2012-0113879호에개시된금은화의물또는탄소수 1 내지 4 개의알코올추출물보다는이들물또는알코올추출물의추가적인유기용매분획물이기능성소화불량을포함한위장관운동장애질환에효과가우수함을확인하였다. 이러한금은화의물및 / 또는탄소수 1 내지 4 개의알코올추출물보다는이들의물및 / 또는알코올추출물의추가적인유기용매분획물이우수한위장관운동촉진작용작용은기존기능성소화불량을포함한위장관운동장애치료제 [ 돔페리돈 (Domperidone), 메토클로프라마이드 (metoclopramide), 레보설프라이드 (levosulpiride), 모사프라이드 (mosapride), 이토프라이드 (itopride)] 의문제점인낮은치료효율과재발률을낮추고, 나아가기능성소화불량을포함한위장관운동장애질환에대한예방효과를나타내어, 이를유효성분으로함유하는조성물을기능성소화불량을포함한위장관운동장애질환의치료또는예방을위한의약품및건강기능식품으로사용될수있음을밝힘으로써본발명을완성하였다. 발명의내용 [0020] [0021] 해결하려는과제본발명의목적은금은화의물, 탄소수 1 내지 4 개의알코올또는이들혼합용매추출물 ( 이하, 금은화극성용매추출물 이라칭함 ) 의추가적인유기용매분획물 ( 이하, 금은화유기용매분획물 이라칭함 ) 을함유하는기능성소화불량을포함한위장관운동장애질환의치료및예방용약학적조성물을제공하는데있다. 본발명의다른목적은금은화유기용매분획물을유효성분으로함유하는기능성소화불량을포함한위장관운동장애질환의예방또는개선용건강기능식품조성물을제공하는데에있다. [0022] [0023] [0024] 과제의해결수단상기목적을달성하기위하여, 본발명은금은화유기용매분획물을유효성분으로함유하는기능성소화불량을포함한위장관운동장애질환의치료용또는예방용약학적조성물을제공한다. 본발명은기능성소화불량을치료하는금은화유기용매분획물을유효성분으로함유하는기능성소화불량을포함한위장관운동장애질환의치료용또는예방용건강기능식품조성물을제공한다. 또한본발명에따른금은화유기용매분획물을단독으로사용되거나, 현재임상에서기능성소화불량치료제로 - 5 -
사용되고있는 [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] 기능성소화불량치료제 ( 돔페리돈 (Domperidone), 메토클로프라마이드 (metoclopramide), 레보설프라이드 (levosulpiride), 모사프라이드 (mosapride), 이토프라이드 (itopride) 등과병용또는적당한조합으로사용하여보다우수한기능성소화불량을포함한위장관운동장애질환의치료효과를갖는치료및예방용약학적조성물을제공한다. 이하, 본발명을자세히설명한다. 본발명에따른금은화추출물은금은화또는이의건조물로부터추출하여얻을수있으며, 상기금은화는야생및사람이재배한것등제한없이사용할수있다. 본발명에따른금은화추출물은초임계추출, 상온추출, 고온추출, 고압추출또는초음파추출법등의추출장치를이용한방법또는 XAD 및 HP-20을포함한흡착수지를이용하는방법등당업계의통상적인추출방법을사용할수있으며, 바람직하게는가용하며환류추출또는상온에서추출하여제조할수있으나, 이에한정되는것은아니다. 추출회수는 1 내지 5회인것이바람직하며, 3회반복추출하는것이더욱바람직하나, 이에한정되는것은아니다. 상기금은화추출물은물, 탄소수 1개내지 4개의알코올또는이들의혼합용매의극성용매를이용하여추출될수있다. 일례로, 본발명에따른금은화추출물은금은화건조물을적당한크기로분쇄하여추출용기에넣고물, 탄소수 1개내지 4개의알코올또는이들의혼합용매의극성용매를넣어끓이며환류추출한후, 일정시간방치한후여과지등으로여과하여추출물을얻을수있다. 추출시간은 2 내지 12시간인것이바람직하며, 3 내지 6시간인것이더욱바람직하다. 이후에농축또는동결건조등의방법을추가할수있다. 본발명에따른금은화유기용매분획물은상기금은화극성용매추출물을헥산, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름및부탄올등유기용매중에서 1종이상선택한유기용매를사용하여독립적으로또는순차적으로계통분획을수행하여얻을수있다. 나아가, 본발명은상기금은화유기용매분획물을유효성분으로함유하는기능성소화불량을포함한위장관운동장애치료또는예방용약학적조성물을제공하며이의제조방법은다음과같다. 상기금은화에물, 탄소수 1개내지 4개의알코올또는이들의혼합용매의극성용매를가하여금은화극성용매추출물을수득하는단계 ( 단계 1): 상기단계 1에서수득한금은화극성용매추출물의농축물을물에현탁시킨다음에틸아세테이트또는부탄올을포함하는유기용매로분획하여금은화유기용매분획물을얻는단계 ( 단계 2): 를포함하여이루어지는제조방법에의해제조될수있다. 본발명에따른금은화극성용매추출물또는금은화유기용매분획물에대하여기능성소화불량의치료효과를확인하기위해문헌 (Lee 등의방법, Phytomedicine, 2008 Oct;15(10):836-43, Gastroprokinetic effects of DA-9701, a new prokinetic agent formulated with Pharbitis Semen and Corydalis Tuber 및 Takahashi 등의방법, Gastroenterology, 1991 Sep;101(3):703-10. Mechanism for the gastrokinetic action of domperidone. In vitro studies in guinea pigs..) 에기재된위장운동기능관련위장통과시간위장수축력에대한측정방법을응용하여본실험에사용하였다. 본발명에따른금은화유기용매분획물을유효성분으로함유하는기능성소화불량치료또는예방용약학적조성물은하기의다양한경구또는비경구투여형태로제형화할수있으나, 이에한정하는것은아니다. 경구투여용제형으로는예를들면정제, 환제, 경 / 연질캡슐제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제등이있는데, 이들제형은상기유효성분이외에통상적으로사용되는충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면활성제등의희석제또는부형제를 1종이상사용할수있다. 붕해제로는한천, 전분, 알긴산또는이의나트륨염, 무수인산일수소칼슘염등이사용될수있고, 활택제로는실리카, 탈크, 스테아르산또는이의마그네슘염또는칼슘염, 폴리에틸렌글리콜등이사용될수있으며, 결합제로는마그네슘, 알루미늄실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로오스, 나트륨카복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리딘, 저치환도하이드록시프로필셀룰로오스, 글리신등을희석제로사용할수있으며, 경우에따라서는일반적으로알려진비등혼합물, 흡수제, 착색제, 향미제, 감미제등을함께사용할수있다. 또한금은화유기용매분획물을유효성분으로함유하는기능성소화불량을포함한위장관운동장애치료또는 - 6 -
예방용약학적조성물은비경구투여할수있으며, 비경구투여는피하주사제, 정맥주사제, 근육내주사제또는흉부내주사제를주입하는방법에의한다. 이때비경구투여용제형으로제제화하기위하여금은화유기용매분획물을안정제또는완충제와함께물에서혼합하여용액또는현탁액으로제조하고, 이를앰플또는바이알의단위투여형으로제조할수있다. [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] 상기조성물은멸균되거나또는방부제, 안정화제, 수화제또는유화촉진제, 삼투압조절을위한염, 완충제등의보조제및기타치료적으로유용한물질을함유할수있으며, 통상적인방법인혼합, 과립화또는코팅방법에따라제제화할수있다. 본발명의금은화유기용매분획물을유효성분으로함유하는기능성소화불량포함위장관운동장애치료또는예방용약학적조성물을단위용량형태로제형화하는경우, 유효성분으로서이들금은화유기용매분획물을약 0.1~1500 mg의단위용량으로함유되는것이바람직하다. 투여량은환자의체중, 나이및질병의특수한성질과심각성과같은요인에따라의사의처방에따른다. 그러나, 성인치료에필요한경구또는비경구투여량은투여의빈도와강도에따라하루에약 0.1~1000 mg범위가보통이다. 성인에게근육내또는정맥내투여시일회투여량으로분리하여하루에보통 0.1~300 mg의전체투여량이면충분할것이나, 일부환자의경우더높은일일투여량이바람직할수있다. 본발명에따른금은화유기용매분획물을기능성소화불량치료또는예방용목적으로식품, 음료등의건강보조또는건강기능성식품에첨가할수있다. 이경우, 금은화유기용매분획물을식품첨가물로사용시에원료에대하여 0.01~30중량 %, 바람직하게는 0.1~10중량 % 의양으로첨가할수있다. 유효성분의혼합양은사용목적에따라적합하게결정될수있다. 그러나건강및위생을목적으로하거나건강조절을목적으로하는장기간의섭취의경우에상기양은상기범위이하일수있으며, 안정성면에서아무런문제가없기때문에유효성분은상기범위이상의양으로도사용될수있다. 상기금은화유기용매분획물을다른식품또는식품성분과함께사용될수있고, 통상적인방법에따라적절하게사용될수있다. 상기식품의종류에는특별한제한이없다. 상기금은화유기용매분획물을첨가할수있는식품의예로는육류, 소세지, 빵, 초컬릿, 캔디류, 스넥류, 피자, 라면, 기타면류, 껌류, 아이스크림류를포함하는낙농제품, 각종스프, 음료수, 드링크제, 알코올음료및비타민혼합제등이있으며, 통상적인의미에서의건강식품을모두포함한다. 본발명의식품보존첨가제는여러가지향미제또는천연탄수화물등을사용할수있다. 상기천연탄수화물은포도당, 과당과같은모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스등과같은디사카리이드및덱스트린, 시클로덱스트린과같은폴리사카라이드, 자일리톨, 솔비톨, 에르트리톨등의당알코올이다. 감미제로서는타우마틴, 스테비아추출물과같은천연감미제나사카린, 아스파르탐과같은합성감미제등을사용할수있다. 상기천연탄수화물의비율은본발명에따른조성물 100중량부당일반적으로약 0.01~0.04중량부, 바람직하게는 0.02~0.03중량부이다. 상기외에본발명에따른조성물은여러가지영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트및그의염, 알긴산및그의염, 유기산, 보호성콜로이드중점제, ph 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에사용되는탄산화제등을함유할수있다. 이러한성분은독립적으로또는조합하여사용할수있으며, 첨가제의비율은크게중요하지않지만본발명에따른조성물 100중량부당 0.001~1중량부의범위에서선택되는것이일반적이다. [0045] [0046] [0047] [0048] 발명의효과본발명에따른금은화유기용매분획물을유효성분으로함유하는조성물은기능성소화불량에대하여기존의치료제보다부작용없이동등이상의효과를나타내며, 콜린성, 항도파민, 세로토닌 (5-HT3, 5-HT4) 작용을통해위장관운동을촉진시키는우수한치료효과를나타낸다. 본발명에따른금은화유기용매분획물은기능성소화불량치료및예방에유용하게사용될수있다. 또한본발명에따른금은화유기용매분획물을단독으로사용되거나, 현재임상에서기능성소화불량치료제 [ 돔페리돈 (domperidone), 메토클로프라마이드 (metoclopramide), 레보설프라이드 (levosulpiride), 모사프라이드 (mosapride), 이토프라이드 (itopride)] 로사용되고있는기능성소화불량치료제등과병용또는적당한조합으로사용하여보다우수한기능성소화불량포함위장관운동장애치료효과를갖는다. 본발명자는상기금은화유기용매분획물을이용한위장관운동장애질환의예방및치료효과를확인하기위 - 7 -
하여본발명의금은화극성용매추출물또는금은화유기용매분획물을기니픽실험모델을이용하여위장관운동정도에미치는영향을실험한결과, 부형제만사용한대조군또는금은화극성용매추출물에비해본발명의금은화유기용매분획물에의한위장운동성이현저하게증가하였고, 임상실험에서도유의성있는치료효과를확인하였고, 오랜기간복용시에도참작할만한만성독성의부작용을보여주지않아위장관운동촉진에효과적임을확인할수있었다. [0049] [0050] 따라서, 본발명의금은화유기용매분획물은조기포만감, 통증, 상복부불쾌감, 헛배부름, 가슴앓이, 오심, 구토의증상을포함하는기능성소화불량, 변비, 과민성대장증상, 당뇨병성위장운동장애, 화학요법으로인한위장운동장애, 소화관운동장애로인한장폐쇄증및근긴장성이영양증 (myotonic dystrophy) 등의하나이상의조합을포함하는위장관운동장애질환에우수한효과가있다. 본발명을다음예에의거하여더욱상세히설명하나, 본발명을이에의해제한하지는않는다. [0051] [0052] < 실험예 : 금은화추출물의기능성소화불량에대한약효시험 > 본발명에따른금은화극성용매추출물또는금은화유기용매분획물에대한기능성소화불량치료효과를확인하기위해수컷기니픽의위장통과시간및위장근육수축모델에서그효과와수컷랫드를이용한위장통과시간에미치는효과및고양이하부식도평활근수축에미치는효과를실험하였다. [0053] [0054] <1-1> 약제실험에사용되는약제는금은화추출물과함께사용약물인아트로핀 (atropine) 과도파민 (dopamine) 은시그마 (St.Louis, MO, USA) 에서구입하였으며, 활성탄 (charcoal) 은바륨 (barium), 활성탄 (charcoal), 생리식염수를 2 : 1 : 6의중량비율로녹여사용하였다. [0055] [0056] [0057] <1-2> 금은화유기용매분획물의장에서소화관이동거리 GIT(gastric intestinal transit) 의영향평가본발명에따른금은화극성용매추출물및금은화유기용매분획물에대한소화관이동거리측정평가방법으로는 6주령 ICR계수컷흰쥐를사용하였으며 24시간동안절식시키고, 물은충분한양을공급하였다. 체중을측정한다음대조약물인메토클로프라이드 (Metoclopride, Sigma-Aldrich) 와실험예 1에서선정된시험약물인금은화물, 에탄올추출물은소화관이동거리확인물질인 5% 에반스블루 (evans blue) 투여 30분전에경구투여하였다. 5% 에반스블루투여 30분후에흰쥐를경추탈골하여흰쥐의복부를정중선을따라절개하고위의유문부부터직장까지장이끊어지지않도록적출하였다. 적출한소화관은측정하기쉽도록펼쳐서유문부에서 5% 에반스블루선단부까지의이동거리를측정하였으며유문부에서직장부까지의거리 ( 소화관전체길이 ) 를측정하였다. 투여한 5% 에반스블루의소화관이동률 (T) 을구하기위해소화관전체길이 (A) 와 5% 에반스블루의최선단부까지의거리 (B) 로부터식을이용해산출하였다. (T=(B/A)*100(%)) 표 1은대조군및금은화극성용매추출물대비본발명시험물질인금은화유기용매분획물투여군의위장통과이동거리 GIT(gastric intestinal transit) 를표시하였으며, 표 1에서알수있는바와같이금은화유기용매분획물인금은화에틸아세테이트분획물이투여용량 50 mg / kg에서대조군과금은화물추출물에비해각각 74%, 58% 위장통과이동거리를증가시켰다. 이러한효과는금은화유기용매분획물의위장통과시간에미치는영향은양성대조군과금은화극성용매추출물보다우수한효과가있음을확인할수있었다. [0058] 구분 투여용량 ( mg / kg ) GIT (%) 대조군 - 41.4 실시예 1 25 mg / kg 61.2 ( 금은화물추출물의 에틸아세테이트분획물 ) 실시예 2 ( 금은화물추출물의 부탄올분획물 ) 표 1 50 mg / kg 72.2 50 mg / kg 57.4-8 -
실시예 3 25 mg / kg 58.9 ( 금은화에탄올추출물의에틸아세테이트분획물 ) 50 mg / kg 69.7 비교예 1 50 mg / kg 48.1 ( 금은화물추출물 ) 비교예 2 50 mg / kg 42.3 ( 금은화에탄올추출물 ) 비교예 4 50 mg / kg 46.5 ( 금은화에틸아세테이트추출물 ) Metoclopride 20 mg / kg 69.8 [0059] [0060] <1-3> 금은화유기용매분획물의위배출능 GE(gastric emptying) 의영향평가본발명에따른금은화유기용매분획물의위배출능측정평가방법으로 6주령스프라그도울리 (Spraugue- Dawley: SD) 계수컷흰쥐를 24시간동안절식시키고, 물은충분한양을공급하였다. 체중을측정한다음대조약물인모사프라이드 (Mosapride, Sigma-Aldrich) 와실험예 1에서선정된시험약물인금은화물추출물, 에탄올추출물은위배출능확인물질 0.05% 페놀레드 (phenol red) (w/v) 1.5 ml를투여 30분전에경구투여하였다. 0.05% 페놀레드 (phenol red, w/v) 경구투여후 20분후에테르마취하에개복하고유문과분문을결찰한후위를적출하였다. 적출한위는 0.01N NaOH 3 ml내에서균질화시킨후, 균질액 1 ml에 20% trichloroacetic acid (w/v) 0.2 ml를가하여단백질을침전시키고 1,600 g의속도로 20분간원심분리하였다. 원심분리후상층액 0.6 ml에 0.5N NaOH 0.8 ml를가한후 560 nm에서흡광도를측정하였다. [0061] [0062] 표 2는대조군및금은화극성용매추출물대비본발명시험물질인금은화유기용매분획물투여군의위배출능 GE(gastric emptying) 를표시하였으며, 표 2에서알수있는바와같이금은화유기용매분획물인금은화에틸아세테이트분획물이용량의존적으로대조군과금은화극성용매추출물에비해우수한위배출능을증가시켰다. 이러한효과는금은화유기용매분획물의위배출능에미치는영향은양성대조군과금은화극성용매추출물보다우수한효과가있음을확인할수있었다. [0063] 구분 투여용량 ( mg / kg ) GE (%) 대조군 - 40.0 실시예 1 25 mg / kg 63.2 ( 금은화에틸아세테이트분획물 ) 실시예 2 ( 금은화부탄올분획물 ) 비교예 1 ( 금은화물추출물 ) 비교에 2 ( 금은화에탄올추출물 ) 비교에 4 표 2 50 mg / kg 72.1 50 mg / kg 58.8 50 mg / kg 49.8 50 mg / kg 50.0 50 mg / kg 48.5 ( 금은화에틸아세테이트추출물 ) Mosapride 3 mg / kg 80.0 [0064] [0065] <1-4> 금은화유기용매분획물의위장통과시간에미치는영향평가금은화유기용매분획물의위장통과시간에미치는영향을알아보기위해활성탄 (charcoal) 을이용한위장통과시간측정방법을사용하였으며, 대조군 (control group) 은경구위도관을삽입하고 30분뒤활성탄 (charcoal) 을주입후 5분뒤의길이를측정하였다. 금은화유기용매분획물을 25, 50mg / kg각각위내주입하며, 30분뒤활성탄 (charcoal) 을위에주입후 5분뒤후두부를강타하여기절시킨후경동맥을절단하여실혈시켜 - 9 -
희생시킨다. 위의유문부에서활성탄 (charcoal) 이이동한거리를측정하여약제비투약군 (control group) 과비 교관찰하였고, 이동한거리는전체소장의길이에활성탄 (charcoal) 이이동한소장의길이를백분율로표시하 였다. [0066] [0067] 표 3은대조군대비본발명시험물질투여군의위장통과이동거리 ( mm ) 를표시하였으며, 도 1은본발명시험물질인금은화유기용매 ( 에틸아세테이트 ) 분획물로서금은화에틸아세테이트분획물에대한위장통과시간의효과를나타낸도면이다. 표 3에서알수있는바와같이금은화에틸아세테이트분획물이용량의존적으로대조군에비해 54% 위장통과이동거리를증가시켰다. 이러한효과는금은화유기용매분획물의위장통과시간에미치는영향은양성대조군과금은화극성용매 ( 물또는에탄올 ) 추출물보다우수한효과가있음을확인할수있었다. [0068] 구분 투여용량 (/) 이동거리 ( 백분율 %) 대조군 - 39 ± 4 (100%) 실시예 1 25 / 54 ± 5 (138%) ( 금은화에틸아세테이트분획물 ) 실시예 2 ( 금은화부탄올분획물 ) 비교예 1 ( 금은화물추출물 ) 비교에 2 ( 금은화에탄올추출물 ) 표 3 50 / 63 ± 5 (154%) 25 / 51 ± 5 (131%) 25 / 46 ± 6 (118%) 25 / 48 ± 5 (123%) [0069] [0070] [0071] 아울러, 금은화추출물의작용기전을알아보기위해, 복강내로아트로핀 (atropine, 0.1mg / kg ), 도파민 (dopamine, 0.4mg / kg ), GR-113808(5-HT4 수용체길항제, 1-methyl-1H-indole-3-carboxylic acid, [1-[2- [(methylsulfonyl)amino] ethyl]-4-piperidinyl]methyl ester, 1mg / kg ) 을투여하고 30분의회복시간을가진뒤활성탄 (charcoal) 을주입후 5분뒤희생시킨후위의유문부에서활성탄 (charcoal) 이이동한위와같은방법으로거리를측정하였다. 금은화에틸아세테이트분획물 50mg / kg를투여한군에서는아트로핀 (atropine), 도파민 (dopamine), GR-113808을투여하고 30분뒤금은화에틸아세테이트분획물 50mg / kg를주입하였고 30분의회복시간을가진뒤활성탄 (charcoal) 을위에주입후 5분뒤후두부를강타하여기절시킨후경동맥을절단하여희생시켰다. 마찬가지로이동한거리는전체소장의길이에활성탄 (charcoal) 이이동한소장의길이를백분율로표시하였다. 도 2는아트로핀 (atropine) 0.1mg / kg으로위장통과시간지연유발시킨동물모델에서본발명시험물질인금은화에틸아세테이트분획물 50mg / kg을주입한경우에지연유발시킨위장통과시간이회복되어지는효과를나타낸도면이고, 도 3은도파민 (dopamine) 0.4mg / kg으로위장통과시간지연유발시킨동물모델에서본발명시험물질인금은화에틸아세테이트분획물 50mg / kg을주입한경우에지연된위장통과시간이회복되어지는효과를나타낸도면이고, 도 4는 GR-113808 1mg / kg으로위장통과시간지연유발시킨동물모델에서본발명시험물질인금은화에틸아세테이트분획물 50mg / kg을주입한경우에위장통과시간이회복되어지는효과를나타낸도면이다. 도 2 내지 4 에서보는바와같이금은화에틸아세테이트분획물은아트로핀 (atropine), 도파민 (dopamine) 또는 GR-113808(5-HT4 길항제 ) 에의해억제된위장운동을회복시키는효과가있는것으로보아이는금은화에틸아세테이트분획물이콜린성, 항도파민, 세로토닌작용을포함한혼합기전을통해위장관운동을촉진시키는것을확인할수있었다. [0072] [0073] <1-5> 금은화에틸아세테이트분획물의위수축운동에미치는영향평가금은화에틸아세테이트분획물의위수축에대한영향및작용기전을알아보기위하여수축파의압력을측정하였다. 기니픽위전정부 (antrum) 를채취하여점막과점막하조직을제거한뒤, 윤상근조직절편을 3mm너비, 10 mm길이로만들어혼합기체 (95% O 2 + 5% CO 2 ) 를충분히공급하고, 온도를 37 로유지시키는 Krebs'-Henseleit 용액 (in mmol L -1 : 138.5 Na +, 4.6 K +, 2.5 Ca 2+, 1.2 Mg 2+, 125 Cl -, 21.9 HCO 3 -, 1.2 H2 PO 4 -, 1.2 SO4 - 및 11.5-10 -
glucose) 을채운 5mL의조직욕조에위치시킨후, 근육절편의한쪽면은전극에연결하고, 다른한쪽면은장력측정기 (BIOPAC TSD 105;BIOPAC system, Inc., Santa Barbara, CA, USA) 에연결한다 ( 참고도-1). 근육절편은혼합기체 (95% O 2 + 5% CO 2 ) 를충분히공급하고온도를 37 로유지시키는 Krebs'-Hanseleit 용액내에고정시킨후, 1g의기초장력을가한후, 60분간평형을유지시킨다. 조직욕조의용액을교체한후, 금은화에틸아세테이트분획물농도를증량하면서 (10-6 ~10-9 M) 각농도에서 5분후기저실험과동일한방법으로수축정도를비교하였으며, 아울러금은화에틸아세테이트분획물의작용기전을알아보기위해, 위수축에최대효과를보이는농도의금은화에틸아세테이트분획물 5mg / kg과아트로핀 (atropine, 10-6 M), 도파민 (dopamine, 10-8 M), 또는 GR- 113808(5-hydroxytryptamine(HT) 4 수용체길항제, 10-7 M) 을투여하여동일한방식으로수축압력의변화를관찰하였다. [0074] < 참고도 -1> [0075] [0076] [0077] 도 5 는본발명시험물질인금은화에틸아세테이트분획물의 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 mg / kg에대한위장 근육의수축력을나타낸도면이다. 도 6 내지 8 은본발명시험물질인금은화에틸아세테이트분획물 5 mg / kg단독주입한경우와금은화에틸아세 테이트분획물 5 mg / kg과아트로핀 (atropine, 10-6 M), 도파민 (dopamine, 10-8 M) 또는 GR-113808(10-7 M) 에서선택 한약물과같이주입한경우에위장수축력에변화를나타낸도면이다. [0078] [0079] 도 5에서보는바와같이, 금은화에틸아세테이트분획물이용량의존적으로대조군에비해위장근육의수축력 (% charge from control) 이증가하는효과를발휘하였으며, 도 6 내지 8로부터금은화에틸아세테이트분획물단독주입한경우보다금은화에틸아세테이트분획물에아트로핀 (atropine), 도파민 (dopamine) 또는 GR- 113808(5-HT4 길항제 ) 로부터선택한약물과같이주입한경우에위장수축파의강도 (Maximal amplitude, % control) 가감소된것을확인할수있었으며, 이는금은화에틸아세테이트분획물의위장수축력에미치는효과는콜린성, 항도파민, 세로토닌작용을통해위장관운동을촉진시키는것을확인할수있었다. 도 9에서는정상랫드에서의금은화에틸아세테이트분획물 (1, 3 mg / kg ) 이대조물질인모사프라이드 (Mosapride, 10mg / kg ) 와유사한위배출능을보임을보여주며, 도 10은시스플라틴 (Cisplatin, 10 mg / kg, ip) 으로지연된위배출랫드모델에서금은화에틸아세테이트분획물 (1, 3 mg / kg ) 이모사프라이드 (Mosapride, 10mg / kg ) 와유사한위배출회복효과를보임을보여주며, 도 11은고양이하부식도평활근에모사프라이드 (Mosapride, 10-8 M) 과금은화에틸아세테이트분획물 (0.5 μg / ml ) 을병용처리하였을때단독처리시보다수축반응 이증가함을보여주고있다. - 11 -
[0080] [0081] <1-6> 금은화에틸아세테이트분획물의식도평활근세포에서수축반응효과고양이식도조직을적출한후 Collagenase buffer에 12-24시간정도 overnight 하고 water bath에서 31, 15분정도 warm up 한후 Nitex filter를이용해식도평활근을분리한다음금은화에틸아세테이트분획물을농도별로처리하고 60초후 1% acrolein을처리해고정시킨후세포길이를측정하였다. 에틸아세테이트분획물처리 1분후 fixing reagent 처리후 CCD가장착된현미경을통해컴퓨터화면상으로 Image analyzer를이용해세포길이를 40~50개가량측정한결과식도평활근세포에서농도에따라서수축반응이증가하는것이관찰되었다.( 도 13 참조 ) [0082] [0083] <1-7> 금은화에틸아세테이트분획물의 Cat LES(lower esophageal sphincter muscle) 에서 Carbachol 수축반응효과 Cat LES 수축에대한금은화에틸아세테이트분획물의 cholinergic contraction 영향을보기위해적출된 LES에금은화에틸아세테이트분획물 1, 5, 10, 50ug/ml을처리하고 2분후 Carbachol을재처리하여수축반응을평가하 였다. Cat의 LES에서 Carbachol(10-7 M) 에의한수축반응에대한금은화에틸아세테이트분획물의영향을본결과로 Carbachol 전처리후금은화에틸아세테이트분획물을농도별로처리하였을때 1μg / ml에서 10μg / ml까지수축반응이농도의존적으로증가함을보여 (Student t-test; *p<0.05; **p<0.01 vs. Carbachol alone(gc7101 0μg / ml ).) 금은화에틸아세테이트분획물은 Carbachol에의한 LES 수축을증가시키는효과가있는것으로판단된다.( 도 14 참조 ) [0084] [0085] <1-8> 금은화에틸아세테이트분획물의 Cat LES에서 NOS Inhibitor 처리후 EFS(Electric field stimulation) 수축반응효과 Cat LES 수축에대한금은화에틸아세테이트분획물의 NANC(Nonadrenergic non cholinergic) 수축영향을보기위해적출한고양이의하부식도괄약근에 NOS(nitric oxide synthesizer) 억제제인 L-NNA(N-ω-nitro-Larginine) 10-3 M을먼저처리하고 1분후금은화에틸아세테이트분획물을처리한후 EFS에의한수축반응을비교하였다. NANC 차단제인 L-NNA를처리한후 Cat LES에서의금은화에틸아세테이트분획물의 EFS 수축반응에대한효과를관찰한결과금은화에틸아세테이트분획물은 EFS 수축반응을증가시킴을보였다. (Student t- test; *p<0.01 vs. Control, # p<0.05 vs 0μg / ml )( 도 15 참조 ) [0086] [0087] <1-9> 금은화에틸아세테이트분획물의 Loperamide로유발된배출지연 Rat에서위배출능향상효과금은화에틸아세테이트분획물을경구투여한뒤 60분후 phenol red 용액 2ml과 loperamide(10mg / kg ) 를강제경구투여하고, 45분뒤위를적출하여남아있는용액의양을흡광도를측정하여비교하였다. Loperamide(p.o., 10 mg / kg ) 에의해유도된지연된위배출능에대한금은화에틸아세테이트분획물의회복효과를관찰한결과 GC7101 3mg / kg, 10mg / kg에서는유의성있게회복됨을보였다. [Student t-test(*, P<0.05 vs Con, #,P<0.05 vs Vehicle)] ( 도 16 참조 ) [0088] [0089] <1-10> 금은화에틸아세테이트분획물의 Normal Rat에서의 GI motility에대한영향평가금은화에틸아세테이트분획물을경구투여한뒤 1시간후 Phenol red 용액 ( 반유동식 ) 을 1ml 경구투여하고 15분후십이지장부터맹장까지회수한후, 회수된장기를 12등분하여각절편의흡광도를측정하였다. Control군과금은화에틸아세테이트분획물 0.03mg / kg. 1mg / kg, 3mg / kg, 10mg / kg으로군을나누어실험한결과금은화에틸아세테이트분획물이 3mg / kg, 10mg / kg투여군에서유의성있게geometric Center가증가한것으로보아 GI motility를증가시키는것으로관찰되었다. [Student t-test(*, P<0.05 vs Vehicle)] ( 도 17 참조 ) [0090] [0091] <1-11> 금은화에틸아세테이트분획물의 Atropine 으로유발된배출지연 Rat 에서의 GIT 향상효과 금은화에틸아세테이트분획물을경구투여한뒤 1 시간후 Phenol red 용액 ( 반유동식 ) 1ml(po) 와 - 12 -
atropine(i.p., 1mg / kg ) 을동시에투여하고 15분후십이지장부터맹장까지회수한후, 회수된장기를 12등분하여각절편의흡광도를측정하였다. Control군과 Atropine을투여한군, Atropine과금은화에틸아세테이트분획물을같이투여한군으로나누어실험을진행한결과 Atropine이정상군에비해 GI motility를감소시키는데금은화에틸아세테이트분획물이 atropine에의해감소된 GI motility를 3mg / kg, 10mg / kg투여군에서유의성있게회복시키는것을확인함. [Student t-test(*, P<0.05 vs Con, #,P<0.05 vs Vehicle)] ( 도 18 참조 ) [0092] [0093] <1-12> 금은화에틸아세테이트분획물의외과적수술방법 (POI, Postoperation ileus) 로유발된배출지연 Rat에서의 GIT 향상효과 Rat에개복수술 (3cm) 을진행하고즉시회복시킨뒤 (4시간) 금은화에틸아세테이트분획물을경구투여한뒤 1시간후 Phenol red 용액 ( 반유동식 ) 을 1ml 투여하고 (po) 15분후십이지장부터맹장까지회수. 회수된장기를 12 등분하여각절편의흡광도를측정하였다. 외과적수술방법 (POI, Postoperation ileus) 으로상처를주면면역학적기전으로인해위장관의 motility가감소하게되는데외과적수술방법으로상처를준후금은화에틸아세테이트분획물을농도별로처리한결과 3mg / kg, 10mg / kg투여군에서유의성있게 motility를회복시키는것을볼수있었다. [Student t-test(*, P<0.05 vs Con, #,P<0.05 vs Vehicle)] ( 도 19 참조 ) [0094] 도면의간단한설명 도 1 은본발명시험물질인금은화에틸아세테이트분획물에대한위장통과시간의효과를나타낸것이다. 도 2는아트로핀 (atropine) 0.1mg / kg으로위장통과시간지연유발시킨동물모델에서본발명시험물질인금은화에틸아세테이트분획물 50mg / kg을주입한경우에지연유발시킨위장통과시간이회복되어지는효과를나타낸도면이다. 도 3은도파민 (dopamine) 0.4mg / kg으로위장통과시간지연유발시킨동물모델에서본발명시험물질인금은화에틸아세테이트분획물 50mg / kg을주입한경우에지연된위장통과시간이회복되어지는효과를나타낸도면이다. 도 4는 GR-113808 1mg / kg으로위장통과시간지연유발시킨동물모델에서본발명시험물질인금은화에틸아세테이트분획물 50mg / kg을주입한경우에위장통과시간이회복되어지는효과를나타낸도면이다. 도 5는본발명시험물질인금은화에틸아세테이트분획물의 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10mg / kg에대한위장근육의수축력변화를나타낸것이다. 도 6은본발명시험물질인금은화에틸아세테이트분획물 5mg / kg단독주입한경우와금은화에틸아세테이트분획물 5mg / kg과아트로핀 (atropine, 10-6 M) 과같이주입한경우에위장수축력변화를나타낸것이다. 도 7은본발명시험물질인금은화에틸아세테이트분획물 5mg / kg단독주입한경우와금은화에틸아세테이트분획물 5mg / kg과도파민 (dopamine, 10-8 M) 약물과같이주입한경우에위장수축력변화를나타낸것이다. 도 8은본발명시험물질인금은화에틸아세테이트분획물 5mg / kg단독주입한경우와금은화에틸아세테이트분획물 5mg / kg과 GR-113808(10-7 M) 약물과같이주입한경우에위장수축력변화를나타낸것이다. 도 9는정상랫드에서의금은화에틸아세테이트분획물 (1, 3 mg / kg ) 이대조물질인 Mosapride(10mg / kg ) 와유사한위배출능을보임을나타낸것이다. 도 10은시스플라틴 (Cisplatin, 10mg / kg, ip) 으로지연된위배출랫드모델에서금은화에틸아세테이트분획물 (1, 3 mg / kg ) 이모사프라이드 (Mosapride, 10mg / kg ) 와유사한위배출회복효과를보임을나타낸것이다. 도 11은고양이하부식도평활근에모사프라이드 (Mosapride, 10-8 M) 과금은화에틸아세테이트분획물 (0.5 μg / ml ) 을병용처리하였을때단독처리시보다수축반응이증가함을나타낸것이다. 도 12는본발명의금은화물추출물 ( 비교예 1) 과금은화에틸아세테이트분획물 ( 실시예 1) 의 HPLC 프로파일을나타낸것이다. 도 13은식도평활근세포에서금은화에틸아세테이트분획물 ( 실시예 1) 의농도별효과를나타낸것이다. - 13 -
도 14는 Cat LES(Lower Esophageal Sphincter muscle, 하부식도괄약근 ) 에서 Carbachol 수축반응에대한금은화에틸아세테이트분획물 ( 실시예 1) 의효과를나타낸것이다. 도 15는 Cat LES에서 NOS Inhibitor 처리후 EFS(Electric field stimulation) 수축반응에대한금은화에틸아세테이트분획물 ( 실시예 1) 의효과를나타낸것이다. 도 16은 Loperamide로유발된배출지연 Rat에서금은화에틸아세테이트분획물 ( 실시예 1) 의위배출능향상효과를나타낸것이다. 도 17은금은화에틸아세테이트분획물 ( 실시예 1) 의 Normal Rat에서의 GI motility에대한영향을나타낸것이다. 도 18은 Atropine으로유발된배출지연 Rat에서의금은화에틸아세테이트분획물 ( 실시예 1) 의 GIT 향상효과를나타낸것이다. 도 19는외과적수술방법 (POI, Postoperation ileus) 로유발된배출지연 Rat에서금은화에틸아세테이트분획물 ( 실시예 1) 의 GIT 향상효과를나타낸것이다. [0095] [0096] [0097] [0098] [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] [0105] [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] 발명을실시하기위한구체적인내용이하, 본발명의금은화유기용매분획물의제조는대한민국특허등록제10-1074839호 " 금은화추출물을포함하는역류성식도염또는예방용약학조성물 " 에개시된금은화유기용매분획물제조방법을인용하여제조하였다. < 비교예 1> 금은화열수추출물제조본발명에사용된금은화는꽃이피기전꽃봉오리건조물로서, 분쇄하여얻은분말을적당한크기로세절하여추출용기에 1 kg을넣고물 10 L를가하여 100 에서 6시간동안교반하면서추출하였고, 여과지로여과하여추출물을얻었다. 추출과정을 3회반복하였고, 이후용매를감압농축및건조하여 300 g의금은화열수추출물의농축물을얻었다. < 비교예 2> 금은화에탄올추출물제조상기비교예 1과같이실시하되, 비교예 1의물추출용매대신에에탄올을사용하여 320g의에탄올추출물을각각얻었다. < 비교예 3> 금은화 70% 에탄올수용액추출물제조상기비교예 1과같이실시하되, 비교예 1의물추출용매대신에 70% 에탄올수용액을사용하여 130g의에탄올추출물을각각얻었다. < 비교예 4> 금은화에틸아세테이트추출물제조상기비교예 1과같이실시하되, 비교예 1의물추출용매대신에에틸아세테이트를사용하여 100g의에틸아세테이트추출물을각각얻었다. < 실시예 1> 금은화열수추출물의에틸아세테이트분획물제조상기비교예 1의금은화열수추출물의농축물을물 1L에현탁시킨후동량의에틸아세테이트를넣은후에틸아세테이트층을분리하여농축건조하여농축물 30g을얻었다. < 실시예 2> 금은화열수추출물의부탄올분획물제조상기비교예 1의금은화열수추출물의농축물을물 1L에현탁시킨후동량의부탄올을넣은후부탄올층을분리하여농축건조하여농축물 65g을얻었다. < 실시예 3> 금은화에탄올추출물의에틸아세테이트분획물제조상기비교예 2의금은화에탄올추출물의농축물을물 1L에현탁시킨후동량의에틸아세테이트를넣은후에틸아세테이트층을분리하여농축건조하여농축물 70g을얻었다. < 실시예 4> 금은화에탄올추출물의부탄올분획물제조상기비교예 2의금은화에탄올추출물의농축물을물 1L에현탁시킨후동량의부탄올을넣은후부탄올층을 - 14 -
분리하여농축건조하여농축물 62g 을얻었다. [0112] [0113] < 실시예 5> 금은화극성용매추출물과금은화유기용매분획물 HPLC 분석상기비교예 1 및실시예 1에서수득한각각의시료 50mg을 50ml메탄올에녹인다. 상기용액 1ml을취한후 4 ml메탄올을첨가하여 5ml이되도록시료용액을만든후 0.2μm시린지필터 (syringe filter) 로여과한후 HPLC 에주입한다. 하기표 4 조건의 HPLC 조건으로성분들의패턴분석을하여비교예 1( 금은화물추출물 ) 의주요성분은클로로제닉산 (chlorogenic acid) 인데대해실시예 1( 금은화에틸아세테이트분획물 ) 의주요성분이 3,5- 디-카페오일퀴닌산을포함하는것으로나타내었고, 그결과를도 12에나타내었다. 표 4 [0114] 항 목 조건 기 기 Shiseido nanospace SI-2 컬 럼 Capcell Pak C18 UG80 4.6x150mm (5μm) 컬럼온도 40 주입량 5uL Absorbance UV 330 nm Mobile phase 정량 : 5% Acetonitrile (0.1% 인산 ) 정성 : A) 5% acetonitrile (0.1% 인산 ), B) 80% Acetonitrile Gradient Min A(%) B(%) 0 100 0 10 95 5 20 80 20 25 75 25 35 50 50 40 100 0 45 100 0 [0115] [0116] [0117] [0118] [0119] [0120] [0121] [0122] [0123] [0124] [0125] [0126] [0127] [0128] [0129] [0130] [0131] [0132] < 제제예 1> 약학적제제의제조 ( 제제예 1-1) 금은화에틸아세테이트분획물산제제조실시예 1의금은화에틸아세테이트분획물 20 mg유당 100 mg탈크 10 mg상기의성분들을혼합하고기밀포에충진하여산제를제조한다. ( 제제예 1-2) 정제의제조실시예 1의금은화에틸아세테이트분획물 10 mg옥수수전분 100 mg유당 100 mg스테아린산마그네슘 2 mg상기의성분들을혼합한후통상의정제의제조방법에따라서타정하여정제를제조한다. ( 제제예 1-3) 캅셀제의제조실시예 1의금은화에틸아세테이트분획물 10 mg결정성셀룰로오스 30 mg락토오스 14.8 mg마그네슘스테아레이트 0.2 mg통상의캡슐제제조방법에따라상기의성분을혼합하고젤라틴캡슐에충전하여캡슐제를제조한다. - 15 -
[0133] [0134] [0135] [0136] [0137] [0138] [0139] [0140] [0141] [0142] [0143] [0144] [0145] [0146] [0147] [0148] [0149] [0150] [0151] [0152] [0153] [0154] [0155] [0156] [0157] [0158] [0159] [0160] [0161] [0162] [0163] [0164] [0165] [0166] [0167] ( 제제예 1-4) 주사제의제조실시예 1의금은화에틸아세테이트분획물 10 mg만니톨 180 mg주사용멸균증류수 2974 mg Na 2 HPO 4,12H 2 O 26 mg통상의주사제의제조방법에따라 1 앰플당 (2 ml ) 상기의성분함량으로제조한다. ( 제제예 1-5) 액제의제조예실시예 1의금은화에틸아세테이트분획물 20 mg이성화당 10 g 만니톨 5 g 정제수적량통상의액제의제조방법에따라정제수에각각의성분을가하여용해시키고레몬향을적량가한다음, 상기의성분을혼합한후정제수를가하여전체 100 ml로조절한후갈색병에충진하여멸균시켜액제를제조한다. < 제제예 2> 건강기능식품의제조 ( 제제예 2-1) 음료의제조꿀 522 mg치옥토산아미드 5 mg니코틴아미드 10 mg염산리보플라빈나트륨 3 mg염산피리독신 3 mg이노시톨 30 mg오르트산 50 mg실시예 1의금은화에틸아세테이트분획물 100 mg정제수 200 ml상기조성및함량으로하여통상적인방법을사용하여음료를제조하였다. ( 제제예 2-2) 비타민혼합제실시예 1의금은화에틸아세테이트분획물 100 mg페놀산화합물 100 mg비타민 A 아세테이트 70 μg비타민 E 1.0 mg비타민 B1 0.13 mg비타민 B2 0.15 mg비타민 B6 0.2 μg비타민 C 10 mg비오틴 10 μg니코틴산아미드 1.7 mg - 16 -
[0168] [0169] [0170] [0171] [0172] [0173] [0174] [0175] [0176] 엽산 50 μg판토텐산칼슘 0.5 mg산화아연 0.82 mg탄산마그네슘 25.3 mg제1인산칼륨 15 mg구연산칼륨 90 mg탄산칼슘 100 mg염화마그네슘 24.8 mg상기의비타민및미네랄혼합물은비교적건강식품에적합한성분으로바람직한실시예로혼합조성하였지만, 그배합비를임의로변형실시하며, 통상의건강식품제조방법에따라상기의성분을혼합한다음, 과립을제조하고, 통상방법에따라건강식품조성물제조에사용할수있다. 도면 도면 1-17 -
도면 2 도면 3-18 -
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