대한임상병리학회지 : 제 19 권제 1 호 1999 Korean J Clin Pathol 1999; 19: 78-85 임상미생물학 E-test 를이용한 Candida species 의항진균제감수성검사 김민 임우현 신종희 서순팔 양동욱 전남대학교의과대학임상병리학교실 E-test for Antifungal Susceptibility Testing of Candida Species Min Kim, M.D., Woo Hyun Lim, M.D., Jong Hee Shin, M.D., Soon Pal Suh, M.D., and Dong Wook Ryang, M.D. Department of Clinical Pathology, Chonnam University Medical School, Kwang Ju, Korea Background : Although standardized broth dilution methods for antifungal susceptibility testing are available, easier testing procedures are desirable. We evaluated the E-test (AB Biodisk, Sweden) as a possible alternative instead of NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) broth macrodilution method. Methods : Fifty-two bloodstream isolates of Candida spp. (including 11 C. albicans, 13 C. tropicalis, 18 C. parapsilosis, 1 C. glabrata, 4 C. krusei, 2 C. pelliculosa, 2 C. lipolytica, and 1 C. guilliermondii) were tested. Amphotericin B and fluconazole MICs for each isolate were determined by both NCCLS broth macrodilution method and E-test. The results of E-test for Candida spp. were compared with those of NCCLS macrodilution method. For selecting plating media for E-test, we compared E-test results in two different media (RPMI and Casitone medium) using five ATCC Candida strains. Results : As E-test media, we selected RPMI medium for amphotericin B and Casitone medium for fluconazole because of higher agreement with NCCLS method. The E-test and NCCLS method of 52 Candida spp. yielded a narrow range of MICs (0.064-2.0 g/ml) for amphotericin B and a broad range of MICs (0.5-64 g/ml) for fluconazole. The agreements of E-test within one doubling dilutions of the macrodilution reference were 90.4% (24h and 48h) for amphotericin B, and 90.4% (24h) and 96.2% (48h) for fluconazole. Conclusions : The E-test is a valuable alternative to the NCCLS macrodilution method for amphotericin B and fluconazole susceptibility testing of Candida species. (Korean J Clin Pathol 1999; 19: 78-85) Key words : Candida, E-test, NCCLS macrodilution method, Fluconazole, Amphotericin B 서론 최근광범위항생제의사용, 항암제및면역억제제의치료, 그리고정주영양공급의증가등으로인하여침습성칸디다감염의 접수 : 1998 년 6 월 17 일접수번호 : KJCP1177 수정본접수 : 1998 년 9 월 14 일교신저자 : 신종희우 501-757 광주광역시동구학 1 동 8 전남대학교병원임상병리과전화 : 062-220-5342, Fax: 062-224-2518 * 본논문은 1998 년도전남대학교병원임상연구비지원에의해일부이루어졌음. 빈도가증가되고있다. 칸디다혈증을비롯한중증의칸디다감염의치료에는 amphotericin B와 fluconazole의두가지항진균제가흔히사용되고있다 [1]. 1956년에개발된 amphotericin B는심한독성과정맥주사를해야하는번거로움이있으나아직도중증의진균증의치료를위한 gold standard 이며, fluconazole은경구로투여가가능하고부작용이적은 azole계진균제로서근래중증의칸디다감염의치료에널리이용되기시작하였다 [1, 2]. 그런데칸디다감염환자의수가증가함에따라최근항진균제치료에도불구하고임상적으로치료에실패한경우나검사실적으로항진균제에내성인균주들이출현했다는보고들이있다 [3, 4]. 이 78
E-test 를이용한항진균제감수성검사 79 는 fluconazole의치료를받은환자에서더흔하며, amphotericin B에대한내성균도산발적으로보고되고있다 [1]. 따라서세균감염에서와마찬가지로진균감염에서도치료제의선택과내성균주의검출을위하여신뢰성있는항진균제감수성검사의필요성이대두되고있다. 항진균제검사는균의농도, 진균의형태, 검사하는항진균제의물리적및화학적성상, 검사배지, 배양온도및기간에크게영향받는것으로알려져있다. NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) 에서는항진균제검사의표준화를시도하여, 1992년 NCCLS M27-P (proposed) 에이어 1995년 NC CLS M27-T (tentative standard) 를문서화하여항진균제감수성검사도세균과비슷한검사실간의일치율을얻을수있다고하였다 [5]. 즉, NCCLS M27법은검사약제의선택과사용, 검사방법과그해석법, 필요한정도관리등항진균제검사에영향을주는다양한인자들을표준화시킨법으로, 검사실간의재현성이우수하여항진균제검사의표준법으로추천되며다른새로운검사의평가에이용될수있다고한다. 그러나 NCCLS법은일반검사실에서사용하기에는번거롭고노동력이많이드는단점이있다. 따라서간편하게이용할수있는 microdilution법, E-test법혹은 disk diffusion법등이시도되고있다 [6-8]. E-test는 MIC (minimum inhibitory concentration, 항생제최소억제농도 ) 를측정하기위한한천희석법의일종으로, 시행이간편하고값비싼장비가필요없는장점이있어일반세균에대한 MIC 검사에광범위하게이용되기시작하였다. E-test는한천상에균을바르고연속적인농도로약제가포함되어있는 strip을놓아배양한후 strip 중심으로생긴타원형의억제대를읽어 MIC로측정하는매우간단한검사법이다 [9]. 최근항진균제검사로서의 E-test가시행되어간단하고재현성이높으며 NCCLS M27법과일치도가비교적높다고보고되고있다 [7]. 저자들은최근혈액에서분리된 Candida spp. 를대상으로 amphotericin B와 fluconazole에대한감수성검사로 E-test와 NC CLS법을실시하여 MIC를검사하고, E-test와 NCCLS법의성적을비교하여 E-test가 NCCLS법대신사용될수있는가를알아보았다. 대상및방법 1. 대상균주 1993년부터 1996년사이에전남대학교병원의 44 명의환자혈액검체에서분리된 52주의 Candida spp. (C. albicans 11주, C. tropicalis 13주, C. parapsilosis 18주, C. glabrata 1주, C. krusei 4 주, C. pelliculosa 2주, C. lipolytica 2주, C. guilliermondii 1주 ) 를대상으로하였다. 동일인에서연속 Candida spp. 가분리된경우처음과맨나중의분리균만을대상균속에포함시켰다. 또각 검사의정도관리와 E-test를위한배지의선정을위해 5주의 ATCC 표준균주 (C. albicans ATCC 90028, C. albicans ATCC 90029, C. krusei ATCC 6258, C. parapsilosis ATCC 90018, C. glabrata ATCC 90030) 를이용하였다. 혈액배양에서자란 Candida spp. 는혈액한천배지나 Sabouraud dextrose agar (SDA) 에 계대배양한후발아관시험, API 20C (biomerieux, France), ATB.. 32C system (biomerieux, France), CHROMagar 와 cornmeal agar에서의색깔혹은형태관찰등을이용하여동정하였다 [10]. 2. NCCLS broth macrodilution법 NCCLS M27-T의지침에따라감수성검사를시행하였는데간기하면다음과같다 [11]. Amphotericin B (Fungizone, GIBCO- BRL, U.S.A.) 와 fluconazole (Diflucan, 한국화이자, Korea) 은각각 1,600 g/ml와 1,280 g/ml로만든원액에서 0.165 M의 MOPS (morpholinepropane-sulfonic acid) 가든 RPMI 1640 (ph 7.0) 을이용하여 amphotericin B는 0.31-160 g/ml로, fluconazole은 1.25-640 g/ml의농도가되도록희석하여각각 0.1 ml씩 10개의시험관에넣었다. 균주는 SDA에서 35, 24시간배양후, 0.85% 식염수에균을풀어잘섞은후 0.5 McFarland 탁도 (spectrophotometer, 530 nm) 로맞추고 RPMI-MOPS medium에 1:2,000으로희석하여최종균수가 0.5 10 3-2.5 10 3 개가되게하였다. 균액은농도를조절한후 15분이내에 0.9 ml 씩을 10개의시험관 (1번-10 번 ) 에각각분주하였다. 11번시험관은항진균제가없는성장대조시험관으로서 RPMI 배지 0.1 ml 와균액 0.9 ml을, 12번시험관에는배지의정도관리를위하여배지만을넣어분주하였다. 그후 35 에 48시간배양하였다. MIC 의판정은 amphotericin B의경우 100% 억제된희석배수까지판정하였고, fluconazole의경우는 growth control 시험관을 1:5로희석하여 1번부터 10번시험관까지비교하며 80% 억제된희석배수까지로판정하였다. 3. E-test 검사 E-test strip (AB Biodisk, Sweden) 은 amphotericin B의경우 0.002-32 g/ml까지, fluconazole은 0.016-256 g/ml의 MIC 측정범위를갖는데, strip은사용할때까지 -20 에보관하였다. E-test에적합한평판한천배지를선택하기위해서 RPMI medium과 Casitone agar를 E-test strip 제조회사의지침에따라 90 ml Petri 평판에각각제조하였다 [9]. 각균주는 0.85% NaCl 에 0.5 McFarland 탁도로맞춘후고체평판배지 (RPMI 또는 Casitone 배지 ) 에면봉으로접종하였다. 균접종후 15분간평판을말린후, E-test strip을겸자로조심스럽게놓고 35 에서 24 시간과 48시간배양하여 MIC를판정하였다. E-test의 MIC 판정은항진균제 strip의수치 scale을가로지르는타원형의억제대경계상에있는가장낮은농도의약물농도를 MIC로판정하였는데,..
80 김민 임우현 신종희외 2 인 amphotericin B의경우 100% 억제된희석농도까지로, fluconazole의경우는 80% 억제된희석농도까지로 MIC를판정하였다. E-test와 NCCLS법과의일치율은 NCCLS법에의한 MIC 결과를기준으로 E-test의 MIC가 NCCLS 1배희석배수 (1개시험관희석배수이내, log2 dilution) 혹은 2배수희석배수 (2개시험관희석배수이내, 2 log2 dilution) 이내인경우를일치한것으로판정하여각각의백분율을구하였다. 결과 1. 표준균주의 NCCLS법성적 5종의 Candida spp. ATCC 표준균주를대상으로 amphotericin B와 fluconazole의 MIC를검사하였는데, 그결과 NCCLS법에의한 48시간배양후의 MIC성적은모두표준균주의알려진 MIC 정도관리범위에속하였다 (Table 1 및 2). 2. RPMI와 Casitone배지에서의 E-test 성적 E-test를시행하기위한한천배지를선택하기위해 RPMI와 Casitone의두평판배지를이용하여 5주의표준균주에대해 amphotericin B와 fluconazole에대해각각 E-test를시행하여 NCCLS 법에의한결과와비교한성적은 Table 1 및 2와같다. 먼저 amphotericin B의경우, RPMI 배지를이용한 E-test 결과는 24시간배양후 MIC가 0.38-0.5 g/ml의범위로서표준균주에대한정도관리범위에속하였고, 48시간성적도 C. parapsilosis가약간증가된 1.5 g/ml을보인것을제외하고는거의일치하였다. 그러나 Casitone 배지의경우 5주가모두매우낮은 MIC 결과 (0.032-0.25 g/ml) 를보여 ATCC균주의정도관리범위나 NCCLS법으로시행한성적과일치하지않았다. Table 2. Fluconazole MICs ( g/ml) for five ATCC strains determined by E-test and NCCLS reference method Incubation ATCC strain time (hour) Q.C. range NCCLS C. albicans 24 0.5 1.5 0.75 ATCC 90028 48 0.25-1 1 >256 0.75 C. albicans 24 0.5 2 0.75 ATCC 90029 48 0.25-1 0.5 >256 0.75 C. glabrata 24 4 4 4 ATCC 90030 48 8-32 16 >256 8 C. krusei 24 32 48 16 ATCC 6258 48 16-64 64 96 32 C. parapsilosis 24 0.5 0.75 1 ATCC 90018 48 0.25-1 1 1 1 : from reference [5,14] E-test on: RPMI Casitone Fluconazole의 MIC는 RPMI 배지를이용한 E-test의경우 24 시간성적에서 C. krusei와 C. parapsilosis는정도관리허용범위안에들었으나 C. albicans와 C. glabrata에서는 MIC가각균주의정도관리범위보다더높았다. 그런데 48시간배양후의성적은 C. parapsilosis를제외한표준균주들이모두배지내과도성장을하여 MIC가 256 g/ml까지높게측정되는결과를보였다. 반면 Casitone 배지를이용한 E-test의경우는 24시간배양후 C. glabrata가정도관리범위 (8-32 g/ml) 에비해약간낮은 4 g/ml의 MIC를보였으나 48시간배양후 8 g/ml이었고나머지 4주는 24시간및 48시간성적이모두권장되는정도관리범위안에속하였다. 즉, E-test를이용한 amphotericin B에대한검사는 RPMI 배지가, fluconazole을위한검사는 Casitone 배지가 NCCLS법과더높은일치율을보였다 (Table 2). 따라서본연구에서는 am-photericin B에대한검사는 RPMI 배지를, fluconazole을위한검사는 Casitone 배지를선택하였다. Table 1. Amphotericin B MICs ( g/ml) for five ATCC strains determined by E-test and NCCLS reference method ATCC strain Incubation time (hour) E-test on: RPMI Casitone C. albicans 24 0.5 0.38 0.032 ATCC 90028 48 0.25-1 0.5 0.38 0.032 C. albicans 24 0.5 0.25 0.023 ATCC 90029 48 0.25-1 1 0.5 0.032 C. glabrata 24 0.5 0.5 0.016 ATCC 90030 48 0.25-1 0.5 0.5 0.032 C. krusei 24 0.5 0.5 0.25 ATCC 6258 48 0.5-2 0.5 0.75 0.25 C. parapsilosis 24 0.5 0.5 0.047 ATCC 90018 48 0.5-1 1 1.5 0.094 : from reference [5,14] Q.C. range NCCLS 3. NCCLS법에의한항진균제감수성성적혈액에서분리된 52주의 Candida spp의 NCCLS의표준법에의한 amphotericin B의 MIC분포는 Table 3과같았다. 검사된균주들에대한 MIC는 0.064 g/ml에서 2 g/ml사이에분포하였는데, MIC 1 g/ml이상인균주는모두 4주로서, 3주 (C. parapsilosis 1주, C. glabrata 1주및 C. tropicalis 1주 ) 는 MIC 1 g/ml이었고, C. krusei 1주는 MIC 2 g/ml이었다. 혈액에서분리된 52주의 Candida spp. 에대한 fluconazole의 MIC분포는 Table 4와같았다. 검사된균주들에대한 MIC는 0.5 g/ml에서 64 g/ml까지넓게분포하였다. 가장많이분리된세균종, 즉, C. albicans (11주), C. parapsilosis (18주) 및 C. tropicalis (13주) 에대한 MIC는 8 g/ml이하였고 C. pelliculosa와 C. guilliermondii에대한 MIC도모두 8 g/ml이하였다.
E-test 를이용한항진균제감수성검사 81 Table 3. Distribution of amphotericin B MICs for 52 Candida spp. by NCCLS method and E-test Organism Method No. of occurrence at MICs ( g/ml) of: < 0.06 0.06 0.09 0.12 0.19 0.25 0.38 0.5 0.75 1.0 1.5 2.0 C.A (11) NCCLS 9 2 E-test (24h) 1 4 4 2 E-test (48h) 1 4 5 1 C.P (18) NCCLS 4 13 1 E-test (24h) 2 1 8 3 3 1 E-test (48h) 1 4 4 8 1 C.T (13) NCCLS 1 11 1 E-test (24h) 1 1 1 5 4 1 E-test (48h) 2 7 4 C.K (4) NCCLS 3 1 E-test (24h) 1 1 2 E-test (48h) 1 2 1 C.Pe (2) NCCLS 1 1 E-test (24h) 1 1 E-test (48h) 1 1 C.L (2) NCCLS 2 E-test (24h) 1 1 E-test (48h) 2 C.Gu (1) NCCLS 1 E-test (24h) 1 Et-est (48h) 1 C.Gl (1) N-CCLS 1 E-test (24h) 1 E-test (48h) 1 Total (52) NCCLS 3 14 31 3 1 E-test (24h) 2 2 1 3 5 15 11 8 2 3 E-test (48h) 4 1 1 4 6 14 10 10 1 1 Abbrerviations: C.A, C. albicans; C.P, C. parapsilosis; C.T, C. tropicalis; C.K, C. krusei; C.Pe, C. pelliculosa; C.L, C. lipolytica; C.Gu, C. guilliermondii; C.Gl, C. glabrata. 그러나 C. krusei (4주), C. lipolytica (2주) 및 C. glabrata (1 주 ) 는모든균주가 MIC 16 g/ml이상으로서 fluconazole MIC 는균종간에차이를보였다. NCCLS법을이용한 fluconazole의감수성검사에서는대상균주의 16% (9주/56주) 에서 trailing 효과가관찰되었는데, 균종별로는 C. albicans 3주 (27%), C. tropicalis 4주 (30.7%), C. glabrata 1주 (100%) 및 C. parapsilosis 1 주 (5.5%) 였다. 64 g/ml사이로넓게분포하였다. 또한 fluconazole에대해 16 g/ml이상의 MIC를보인균종은 24시간배양후에 C. krusei 4주및 C. lipolytica 2주였는데, 48시간배양후에는 6주외에도 C. glabrata 1주및 C. guilliermondii 1주에서 16 g/ml이상의 MIC를보였다 (Table 4). 5. NCCLS법과 E-test의결과의비교 4. E-test에의한항진균제감수성성적 Amphotericin B에대하여 RPMI 배지를이용하여 E-test를실시한결과, 52주의 Candida spp. 의 MIC는 24시간배양후에는 0.064 g/ml에서 1 g/ml사이였으며 48시간배양에서는 0.092 g/ml에서 2 g/ml였는데 48시간배양후 E-test에서 C. parapsilosis 1주가 2 g/ml의 MIC를보였다 (Table 3). Fluconazole에대해서 Casitone 배지를이용하여 E-test를실시한결과검사균들에대한 MIC는 24시간배양후 0.38 g/ml 에서 48 g/ml사이였고 48시간배양후에는 0.38 g/ml에서 Amphotericin B에대해 E-test와 NCCLS법에의해검사된성적의일치율은 Fig. 1과같다. 1 희석배수이내의경우두방법간의일치율은 24시간과 48시간배양후모두 90.4% (47/52) 였으며, 2 희석배수이내의경우 24시간배양후 96.2% (50/52), 48시간에는 98.1% (51/52) 로서, 24시간과 48시간배양후결과사이에큰차이가없었다. NCCLS 법을기준으로할때 fluconazole에대한 E-test법의일치율은 1 희석배수의경우 24시간배양후 90.4% (47/52), 48시간에는 96.2% (50/52) 였으며, 2 희석배수의경우 24시간과 48시간배양후모두 100% (54/54) 로 amphotericin B에서와마찬가지로배양시간간의결과가큰차이
82 김민 임우현 신종희외 2 인 Table 4. Distribution of fluconazole MICs for 52 Candida spp. by the NCCLS method and E-test Organism Method No. of occurrence at MICs ( g/ml) of 0.38 0.5 0.75 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 6.0 8.0 12 16 24 32 48 64 C.A (11) NCCLS 5 5 1 E-test (24) 2 4 4 1 E-test (48) 2 3 3 3 C.P (18) NCCLS 6 8 2 2 E-test (24h) 1 7 4 6 E-test (48h) 3 2 7 3 1 2 C.T (13) NCCLS 2 7 4 E-test (24h) 1 3 2 4 3 E-test (48h) 1 4 4 3 1 C.K (4) NCCLS 1 2 1 E-test (24h) 1 1 1 1 E-test (48h) 1 2 1 C.Pe (2) NCCLS 2 E-test (24h) 1 1 E-test (48h) 1 1 C.L (2) NCCLS 1 1 E-test (24h) 2 E-test (48h) 1 1 C.Gu (1) NCCLS 1 E-test (24h) 1 E-test (48h) 1 C.Gl (1) NCCLS 1 E-test (24h) 1 E-test (48h) 1 Total (52) NCCLS 13 20 9 2 1 3 3 1 E-test (24h) 4 14 10 11 3 1 2 1 3 1 1 1 E-test (48h) 2 6 6 14 7 4 3 1 1 1 2 2 2 1 Abbrerviations: C.A, C. albicans; C.P, C. parapsilosis; C.T, C. tropicalis; C.K, C. krusei; C.Pe, C. pelliculosa; C.L, C. lipolytica; C.Gu, C. guilliermondii; C.Gl, C. glabrata. 30 25 20 15 10 5 0 No. of isolates 2 >-2 1 3 1 Fig. 1. Concordance between amphotericin B MICs obtained by NCCLS macrodilution method and those obtained by E-test. 가없었다 (Fig. 2). 29 8 14 Fluconazole 의 MIC 가한번이라도 16 g/ml 이상이었던균주는 8 주 (C. krusei 4 주, C. lipolytica 2 주, C. glabrata 1 주및 C. 16 4 23 : 24 hours : 48 hours 3 0 0 0-2 -1 0 1 2 >2 No. of tube dilutions discordant from NCCLS method 30 25 20 15 10 5 0 No. of isolates 28 15 13 15 6 4 1 2 0 0 0 4 0 0 >-2-2 -1 0 1 2 >2 Fig. 2. Concordance between fluconazole MICs obtained by NCCLS macrodilution assay and those obtained by E-test. guilliermondii 1주 ) 로이중 C. guilliermondii의경우에서만 48 시간배양후 E-test에서 16 g/ml이상의 MIC를보인것외에모든균주가 NCCLS법과 E-test에서 16 g/ml이상의 MIC를보여방법간의큰차이는없었다. 20 : 24 hours : 48 hours No. of tube dilutions discordant from NCCLS method
E-test 를이용한항진균제감수성검사 83 고찰항진균제감수성검사는최근큰진전을보이고있다. 1992년 NCCLS M27-P [12] 가문서화되고, 이어 1995년 NCCLS M27- T [11] 가발표되어검사실간의검사의재현성이안정화되었으며간편한 microdilution법이나 E-test 등이활발히연구되고있다. 또각균의임상적치료결과와 MIC와의관계에대한연구들이진행되고있다. 본연구에서는 NCCLS법과아울러새로운검사법인 E-test법을이용하여최근혈액에서분리된 Candida spp. 를대상으로항진균제검사를실시하여보았다. 본성적에서 52주의 Candida spp. 에대한 amphotericin B의 MIC는 E-test와 NCCLS법에의해모두 0.064-2.0 g/ml 사이의범위안에있었다. Powderly 등 [13] 은 0.8 g/ml이상의 MIC 를갖는진균에의한감염환자는그이하의 MIC의균에의한경우보다임상적으로더나쁜예후를보인것으로보고한바있고반면 Espinel-Ingroff 등 [8] 은 amphotericin B의경우 1 g/ ml이하의농도에서대부분의진균들이억제되지만 2 g/ml이상일때임상적으로내성인균주로제시한바있다. 그러나 NCCLS M27-T [11] 에의하면현재까지검사된대부분의 Candida 균들이 MIC 0.25-1 g/ml 사이의범위로모여있으며, 동물실험에서 amphotericin B에내성이었던균들을검사했을때의 MIC도 1-2 μg/ml이어서 NCCLS M27-T법이 amphotericin B 내성균과감수성인균을감별하는데문제가있다고한다. Rex 등 [14] 도분리된균의 amphotericin B MIC range가좁은범위에분포하는것은 NCCLS M27-T법에의해내성균검출이어렵다는것을말해주며이를수정하기위한연구가필요하다고하였다. 즉, amphotericin B 내성기준의임상적용은아직논란의여지가많으며특히 amphotericin B의 MIC가내성균주와감수성균주를감별하는데문제가있는점까지고려할때, amphotericin B MIC의측정방법의개선과 MIC와임상적치료결과와의관계에대해추후더많은연구가필요할것으로사료된다. 본성적에서 E-test에의한 fluconazole MIC는 0.5-64 g/ ml의넓은범위에분포하였는데 Rex 등 [14] 도 fluconazole MIC가 0.125 - >64 g/ml사이로넓게분포하여임상적결과와연관이가능하다고하였다. 최근 fluconazole MIC가 8 g/ ml 이하는감수성을의미하고, 16-32 g/ml 사이는 100 mg/ day 이하의낮은용량의 fluconazole치료엔반응이없지만고용량의치료에는반응이있는약제용량의존성감수성 (dose dependent susceptible) 을, 그리고 64 g/ml이상은 1일 400 mg이상의치료에도반응이없는내성을의미한다는해석법이제안된바있다 [5]. Fluconazole은구강이나인후등의점막감염이나전신감염의칸디다감염의치료에성공적으로사용되어왔는데, 최근장기간사용후치료의실패가보고되고있다. 그이유는두가지인데, 첫째치료도중원래내성인 C. glabrata나 C. krusei에의해감염이되거나, 둘째 HIV 감염환자에서 fluconazole의장기간사용으 로진균이 fluconazole내성을획득하기때문이다 [1,14]. 본성적에서는가장많이분리된 C. albicans, C. parapsilosis, 및 C. tropicalis 등은모두 MIC 8 g/ml이하인반면, C. krusei, C. lipolytica 및 C. glabrata는모든균주가 16 g/ml이상으로서균종간에차이를보였고, 이러한성적은 C. glabrata 1주의 MIC 가 NCCLS법에서는 16 g/ml이었으나 E-test에서는 24시간에는 12 g/ml, 48시간에는 24 g/ml로나온외에는두방법에서모두 16 g/ml이상으로같은결과를보였다. 혈액에서분리된 Candida spp. 는균종별로 fluconazole MIC50이다르다고알려져있는데, C. albicans 0.25 g/ml, C. tropicalis 1 g/ml, C. parapsilosis 1 g/ml, C. glabrata 32 g/ml, C. krusei 32 g/ml이라고보고되었다 [13]. Espinel-Ingroff 등 [15] 도대부분의 Candida spp. 가 fluconazole MIC 4 g/ml이하이지만 C. krusei와 C. glabrata는각각 16-32 g/ml과 4-8 g/ml이상의 MIC범위를갖는다고보고한바있다. Wanger 등 [16] 은 Candida lipolytica (1주) 에대한 fluconazole의 MIC가 64 g/ ml로자연내성을갖는것으로보고하였다. 이러한성적들을참고할때본성적에서원래 fluconazole에내성을갖는균종을제외한다른 Candida spp. 에서는내성을관찰할수없어서최근본병원환자들의혈액에서분리된 Candida spp. 중 fluconazole 획득내성을갖는균은아직없다고생각되었다. 구미에서도 fluconazole에대한획득내성은 HIV 감염환자를제외하고는내성의보고가극히적다고한다. 따라서현상태에서는 HIV 감염이나구인두및식도칸디다감염으로오랫동안 fluconazole투여를한환자를제외하고는 fluconazole 내성검사는균종의정확한동정으로대치될수있으리라생각된다. 최근 fluconazole에자연내성인 C. glabrata와 C. krusei가혈액에서분리되는빈도가많아짐에따라 PCR (polymerase chain reaction) 을이용하여칸디다혈증의원인균을조기에검출동정하여항진균제의선택의지표로이용하고자하는시도 [17] 도이루어지고있다. 본실험에서는 E-test의시행을위한적절한배지를선택하기위하여 5종의 ATCC Candida spp. 를이용하여 RPMI와 Casitone 배지의두가지를사용하여각각 E-test를시행하였는데, ATCC 균주의알려진 MIC 정도관리범위와비교하여볼때 amphotericin B 검사에는 RPMI 배지가, fluconazole에대하여는 Casitone 배지가더일치하였다. 이러한성적은 Espinel- Ingroff 등 [8] 이 E-test를시행하는평판배지로 amphotericin B 에는 Casitone 배지가, fluconazole에대하여는 RPMI 배지가검사실간의일치도가더높다고보고한것과는상반되는결과이나, 최근 Pfaller 등 [18] 은 402예의효모양진균류를대상으로한 fluconazole검사에서 RPMI 배지와 Casitone 배지의일치율이각각 94% 와 97% 로 Casitone 배지가약간더좋은성적을보였다고보고하였다. 또한이러한성적은 E-test의시행을위하여, amphotericin B검사는 Casitone 배지보다는 RPMI 배지가, fluconazole검사에는 RPMI 배지보다 Casitone 배지가더좋은성적을보인다고한 E-test 제조회사 (AB Biodisk) 의설명서의기
84 김민 임우현 신종희외 2 인 술과도일치하였다 [9]. E-test는 Candida spp. 에대한항진균제 MIC를판정하는데일반검사실에서쉽게이용할수있을것으로기대되나, 아직연구가진행중이며특히 E-test의 NCCLS법과의일치율은보고자에따라, 접종후배양시간에따라그리고균종의종류에따라논란이많다. Sewell 등 [19] 은 fluconazole에대하여 E-test와 NCCLS 법과의일치율이 48시간배양후전체 71% 이었는데, 24시간배양후에는 C. glabrata 37%, C. tropicalis 56%, C. albicans 93%, 그리고그외Candida spp. 는 90% 로서균종간의일치율에도차이가있었고 24시간배양후일치율이전체 84% 로서 48시간보다더좋다고보고하였다. 또한최근에 van Eldere 등 [7] 은 RPMI 배지를이용하여 E-test (24시간배양후판독 ) 를시행한결과, E-test의 NCCLS법과의 2배희석배수내일치율은 amphotericin B에대해서는 89%, fluconazole에대해서는 96% 로매우높다고보고하였다. 반면, Ruhnke 등 [20] 은 C. albicans를대상으로 YNB (modified yeast-nitrogen base) 배지에서 E-test를실시한결과 NCCLS법과의 2배희석배수내에서 24시간과 48시간배양후일치율이 69% 와 67% 로낮았고배양시간에따른큰차이는없었다고보고하였다. Wanger 등 [16] 도 48시간배양후 E-test의 NCCLS법과의일치율은 2배희석배수내에서사용한배지에따라 amphotericin B에대해서는 96-97%, fluconazole에대해서는 92-100% 로매우높다고보고하였다. 본성적에서는 24 시간과 48시간배양후의 E-test와 NCCLS법의일치율은 1희석배수내에서는 amphotericin B에서모두 90.4%, fluconazole에서는 90.4% 와 96.2% 이었고, 2희석배수내에서는 amphotericin B에서 96.2% 및 98.1%, fluconazole에서는모두 100% 로서, Wanger 등 [16] 및 Ruhnke 등 [20] 의보고와유사하게 24시간과48시간배양후일치율에큰차이가없어 C. glabrata 등의일부균종을제외하고는 24시간배양후에 MIC를판독하는것이더적합하리라사료된다. Espinel-Ingroff 등 [15] 은 azole계항진균제감수성검사를시행하는데주요한문제로 trailing을지적하였다. 이는약제의농도가계속증가해도균의성장이부분적으로계속관찰되는현상으로이에대한해결로는균의성장 80% 되는부위를 MIC로판독하여야하는데, 특히 NCCLS법의액체배지희석법을시행시자주문제되는것으로알려져있다. Tiballi 등 [21] 은 C. glabrata 의 fluconazole 감수성검사의시행에서 NCCLS법에서는 17% 에서 trailing이관찰되었다고하였고, van Eldere 등 [7] 은 fluconazole에대한 trailing은특히 C. glabrata에서 60% 까지발생하는것으로보고하였다. 본실험에서도 trailing이 NCCLS법을이용한 fluconazole 감수성검사에서대상균주의 16% 에서관찰되었으나 E-test에서는경미하였다. 결론적으로 E-test는시행이간편하고 NCCLS법과비교할때좋은일치율을보여기존의 NCCLS법대신이용할수있으리라생각되었다. 요약배경 : 최근침습성칸디다감염의빈도가증가함에따라치료제선택과내성균주의검출을위해항진균제감수성검사의필요성이대두되고있다. 저자들은 Candida spp. 를대상으로 E-test 를이용하여 amphotericin B와 fluconazole의 MIC를검사하였고이를동시에실시한 NCCLS법과비교하여보았다. 방법 : 1993년부터 1996년사이에혈액에서분리된 52주의 Candida spp. (C. albicans 11주, C. tropicalis 13주, C. parapsilosis 18주, C. krusei 4주, C. pelliculosa 2주, C. lipolytica 2주, C. guilliermondii 1주및 C. glabrata 1주 ) 를대상으로 amphotericin B와 fluconazole에대해 NCCLS의 broth macrodilution 법과 E-test (AB Biodisk, Sweden) 를이용하여항균제최소억제농도 (MIC, minimum inhibitory concentration) 를검사하였다. 또 E-test를위한평판배지를선택하기위해 5종의 ATCC Candida 균주를이용하여 RPMI와 Casitone의두배지에서의성적을비교하였다. 성적 : E-test를위한배지로는 amphotericin B 검사에는 RPMI배지가, fluconazole에대해서는 Casitone 배지가더좋은일치율을보여선택되었다. NCCLS법과 E-test (24시간) 에의해 52주의 Candida spp. 에대한 amphotericin B의 MIC는모두 0.064-2.0 g/ml 사이의좁은범위안에있는반면 fluconazole 에대해서는 MIC 0.5-64 g/ml의넓은범위로분포하였다. NCCLS법을기준으로할때희석배수 1배수내에서의 E-test법의일치율은 24시간과 48시간배양후에 amphotericin B의경우모두 90.4% 였고, fluconazole의경우 90.4% 와 96.2% 였다. 결론 : E-test는 NCCLS법과높은일치율을보이고시행이간편하여 NCCLS법대신이용될수있으리라생각되었다. 참고문헌 1. Rex JH, Rinaldi MG, Pfaller MA. Resistance of Candida species to fluconazole. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 1-8. 2. Georgopapadakou NH, Walsh TJ. Antifungal Agents: Chemotherapeutic targets and immunologic strategies. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40: 279-91. 3. Nguyen MH, Peacock JE, Morris AJ, Tanner DC, Nguyen ML, Snydman DR, et al. The changing face of candidemia: emergence of non-candida albicans species and antifungal resistance. Am J Med 1996; 100: 617-23. 4. Cameron ML, Schell WA, Bruch S, Bartlett JA, Waskin HA, Perfect JR. Correlation of in vitro fluconazole resistance of candida isolates in relation to therapy and symptoms of individuals seropositive for human immunodeficiency virus type 1. Antimicrob Agents Chemother 1993; 37: 2449-53. 5. Ghannoum MA, Rex JH, Galgiani JN. Susceptibility testing of fungi:
E-test 를이용한항진균제감수성검사 85 Current status of correlation of in vitro data with clinical outcome. J Clin Microbiol 1996: 489-95. 6. 신종희. 항진균제감수성검사와임상적응용. 대한화학요법학회지 1998; 16: 291-8 7. van Eldere J, Joosten L, Verhaeghe A, Surmont I. Fluconazole and amphotericin B antifungal susceptibility testing by national committee for clinical laboratory standards broth macrodilution method compared with E-test and semiautomated broth microdilution test. J Clin Microbiol 1996; 34: 842-7. 8. Espinel-Ingroff A, Pfaller MA, Erwin ME, Jones RN. Interlaboratory evaluation of Etest method for testing antifungal susceptibilities of pathogenic yeasts to five antifungal agents by using casitone agar and solidified RPMI 1640 medium with 2% glucose. J Clin Microbiol 1996; 34: 848-52. 9. AB BIODISK. 1994. Etest technical guide 4b : antifungal susceptibility testing of yeasts. AB BIODISK, Piscataway, N.J. 10. 신종희, 조덕, 김수현, 변동억, Nolte FS, 양동욱. 혈액배양에서 CHROMagar Candida를이용한 Candida species의동정. 대한임상병리학회지 1997; 17: 128-36. 11. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing for yeasts. Tentative standard M27-T. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 1995. 12. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing for yeasts. Proposed standard M27-P. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 1992. 13. Powderly WG, Kobayashi GS, Herzig GP, Medoff G. Amphotericin B-resistant yeast infection in severely immunocompromised patients. Am J Med 1988; 84: 826-32. 14. Rex JH, Cooper CR, Merz WG, Galgiani JN, Anaissie EJ. Detection of amphotericin B-resistant Candida species in a broth-based system. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 906-9. 15. Espinel-Ingroff A and Pfaller MA. Antifungal agents and susceptibility testing. In: Murray PR, Barton EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH, eds. Manual of clinical microbiology. 6th ed. Washington DC: American Society for Microbiology, 1995; 33: 1405-14. 16. Wanger A, Mills K, Nelson PW, Rex JH. Comparison of Etest and National Committee for Clinical Laboratory Standards broth macrodilution method for antifungal susceptibility testing: Enhanced ability to detect amphotericin B-resistant Candida isolates. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 2520-2. 17. Shin JH, Nolte FS, Morrison CJ. Rapid identification of Candida species in blood culture by a clinically useful polymerase chain reaction method. J Clin Microbiol 1997; 35: 1454-9. 18. Pfaller MA, Messer SA, Karlsson A, Bolmstrom A. Evaluation of the Etest method for determining fluconazole susceptibilities of 402 clinical yeast isolates by using three different agar media. J Clin Microbiol 1998; 36: 2586-9. 19. Sewell DL, Pfaller MA, Barry AL. Comparison of broth microdilution, and E test antifungal susceptibility tests for fluconazole. J Clin Microbiol 1994; 32: 2099-102. 20. Ruhnke M, Schmidt-Westhausen A, Engelmann E, Trautmann M. Comparative evaluation of three antifungal susceptibility test methods for Candida albicans isolates and correlation with response to fluconazole therapy. J Clin Microbiol 1996; 34: 3208-11. 21. Tiballi RN, Zarins LT, He X, Kauffman CA. Torulopsis glabrata: azole susceptibilities by microdilution colorimetric and macrodilution broth assays. J Clin Microbiol 1995; 33: 2612-5.