운동과학, 2012 년, 제 21 권제 2 호 Exercise Science, 2012, Vol.21, No.2 일회성유산소운동에따른흰쥐비복근내미토콘드리아기능및구조조절단백질의발현 김정하 김재철 박대령 강윤석 전북대학교 Abstract Kim, J. H., Kim, J. C., Park, D. R., Kang, Y. S. The effect of acute exercise on the expression of mitochondria functiom and content protein in rat skeletal muscle. Exercise Science, 21(2): 191-200, 2012. The aim of this study was to investigate the expression of Drp 1, Mfn 2, PGC-1α, p53 and αb-crystallin protein in the skeletal muscle of Sprague-Dawley rats by endurance exercise(26 m/min, 10, 45 min, 90 min, recovery 12 h). The expression of Drp 1, Mfn 2, PGC-1α, p53 and αb-crystallin protein in skeletal muscle analyzed by western blotting. The expression of Drp 1, Mfn 2 and PGC-1α protein significantly were increased in red gastrocnemius during exercise(45 min) and recovery 12 h. The expression of B-crystallin protein significantly were increased in red gastrocnemius during exercise(45 min). The expression of p53 protein in both red and white gastrocnemius was increased in all periods. These findings suggest that Drp 1, Mfn 2, PGC-1α, p53 and αb-crystallin protein plays a role of mitochondrial homeostasis in skeletal musce by endurance exercise. Key words:acute endurance exercise, skeletal muscle, Drp 1, Mfn 2, PGC-1α, p53, αb-crystallin 초록 김정하, 김재철. 박대령, 강윤석. 일회성유산소운동에따른흰쥐비복근내미토콘드리아기능및구조조절단백질의발현. 운동과학, 제21권제2호, 191-200, 2012. 일회성유산소운동 (26 m/min, 10 ) 에따른운동중 (45, 90 min) 과회복기 (12 h) 시흰쥐비복근내 Drp 1, Mfn 2, PGC-1α, p53 및 αb-crystallin 단백질의발현을규명하는데연구의목적이있으며, 골격근내단백질발현은 western blotting 방법을통해분석하였다. 미토콘드리아기능및구조와관련된인자인 Drp 1, Mfn 2, PGC-1α 의발현이적색비복근에서운동 45분과회복기 12시간에서높게증가한반면백색비복근에서는증가하지않는것으로나타났다. αb-crystallin 은적색비복근에서운동 45분에증가하였고 p53의경우적색비복근과백색비복근모두운동 45분과 90분, 회복기 12시간에서증가하는것으로나타났다. 이러한결과는 Drp 1, Mfn 2, PGC-1α, p53, 및 αb-crystallin 이운동중골격근내미토콘드리아기능과구조의변화에적응을유도하여미토콘드리아의항상성유지에긍정적으로작용하고있는것으로사료된다. 주요어 일회성유산소운동, 골격근, Drp 1, Mfn 2, PGC-1α, p53, αb-crystallin
192 일회성유산소운동에따른흰쥐비복근내미토콘드리아기능및구조조절단백질의발현 Ⅰ. 서론 골격근내미토콘드리아는골격근수축에필요한에너지생산에서매우중요한역할을담당하고있기때문에미토콘드리아의수와크기에의해에너지생산능력은증가하거나감소하게된다. 특히규칙적인유산소운동은골격근의적응은미토콘드리아수와크기를증가시켜지질대사능력뿐만아니라운동능력향상에긍정적인영향을미치게된다 (Saltin & Rowell, 1980). 하지만비규칙적인일회성유산소운동은젖산축적, 체내온도상승, 대사성스트레스증가, reactive oxygen species (ROS) 생성, 세포내칼슘증가, 세포막손상 (Noble 등, 2006; Febbraio 등, 2002) 과같은스트레스를유발하고골격근내여러기관특히, 미토콘드리아의손상을야기하게된다. 이처럼운동중생성된스트레스에의해손상된미토콘드리아는산화적인산화능력및 ATP 생산능력이저하되고결국운동지속능력에부정적인영향을미치게된다 (Bo et al., 2010). 따라서골격근세포의항상성유지를위해손상된미토콘드리아의빠른제거와미토콘드리아생합성을통한미토콘드리아수와밀도증가 (Hood et al., 2006) 그리고, 융합과분열을통한미토콘드리아의형태및기능적변화가유도되어야한다 (Chan, 2006). 미토콘드리아의융합은미토콘드리아내막과외막의결합뿐만아니라미토콘드리아물질 (material) 의통합도함께이루어지는과정이며 (Chen et al., 2005) 미토콘드리아의분열은보다작은미토콘드리아로분리되는과정으로기능적결함을야기하게된다 (Saleem et al., 2011). 그중미토콘드리아의분열은 fission 1(Fis 1) 과 dynamin-related protein 1(Drp 1) 에의해조절된다고알려져있다. 그중 Drp 1은 GTPase 로써미토콘드리아분열지점에결합하여미토콘드리아외막을분리하고미토콘드리아분열을촉진하게된다. 골격근에서의과도한 Drp 1의활성은미토콘드리아의분열을촉진하여대사적장애를야기하고결국세포사멸 (apoptosis) 을유발하게된다 (Tanaka & Youle, 2008). 미토콘드리아의융합은 Mitofusin(Mfn) 1과 2에의해조절된다. Mfn 1과 2는미토콘드리아융합뿐만아니라미토콘드리아의기능및형태조절에중요한역할을수행한다. 특히 Mfn 2는미토콘드리아외막에존재하며글루코스와지방산산화 (oxidation), 막전위 (membrane potential) 그리고산화적인산화 (oxidative phosphorylation) 에관여한다 (Cartoni et al., 2005). 이러한 Mfn 2의억제는미토콘드리아분열을촉진하고세포의산소소비및 ATP 생산을감소시키게된다 (Bach et al., 2003; Santei et al., 2003; Koshiba et al., 2004; Bach et al., 2005). 미토콘드리아의생합성은 peroxisomal proliferator-activated receptor γ coactivator-1α(pgc-1α) 에의해조절된다고알려져있다. 골격근에서의 PGC-1α 는운동과같은대사적스트레스에의한반응으로활성이증가하여 (Baar et al., 2002; Koves et al., 2005; Norrbom et al., 2004) 미토콘드리아생합성, 에너지대사조절, 미토콘드리아 DNA 복제및전사과정에관여하게된다 (Mootha et al., 2003; Lin et al., 2002). 운동중발생하는여러스트레스에의한골격근의손상은 heat shot protein(hsp)27 과 αb-crystallin 과같은 small heat shot proteins (small HSP) 의발현을촉진하게된다 (Kostenko & Moens, 2009). small HSP 안정시 200~800kDa 의세포내복합체형태를이루다가산화적스트레스에의해인산화되어 molecular chaperone 을형성근손상을예방하고단백질구조의안정성유지에관여한다 (Ferns et al., 2006). 따라서 α B-crystallin 발현증가는운동중발생한스트레스에대한방어기전으로작용하게된다. 운동에의한손상된근세포내기관및미토콘드리아의제거에관여하는단백질로 p53이알려져있다. p53은전사인자 (transcription factor) 로서일반적인상황에서세포내 p53 수준은낮게유지되지만스트레스에의해급격하게증가하여 (Zhang 등, 2005) 유전자보호및에너지항상성유지에관여하게된다 (Maddocks & Vousden, 2011). 특히손상된세포의증식을억제하고자가소화작용및세포사멸그리고미토콘드리아분열을통해손상된세포내기관을분해하게된다 (Saleem et al., 2011). 운동은미토콘드리아기능향상과크기및수의증가를유도하는강력한유도체로잘알려져있다. 특히운동자극에의해활성이증가하는 PGC-1α 는미토콘드리아생합성뿐만아니라분열과융합을조절하는 Drp 1과 Mfn 2의발현에영향을미쳐미토콘드리아형태변화와기능향상에관여하게된다 (Liesa et al., 2008). 또한 small HSP 발현증가를통해산화적스트레스에대한저항력증가와 p53 단백질의활성으로세포의항상성유지능력을향상시킬수있는것으로제안되고있다. 따라서일회성유산소운동이나회복기동안다양한생리생화학적반응들에의해미토콘드리아의기능및구조가영향을받을수있기때문에이를조절하는인자들의발현양상과이를조절하는인자들간의관련성이매우중요하다. 그러나, 이를규명하고자하는연구는거의이루어지지않
김정하 김재철 박대령 강윤석 193 고있어이들인자들의발현양상과관련성을규명하는것이매우중요하다하겠다. 본연구에서는일회성유산소운동중과운동후회복기에근섬유특성에따른미토콘드리아분열, 융합및생합성조절인자들인 Drp 1, Mfn 2, PGC-1α 와미토콘드리아손상예방및항상성유지에작용하는 αb-crystallin 그리고 p53의발현양상과이들인자들간의상호관련성을규명하는데그목적이있다. Ⅱ. 연구방법 1. 실험동물 이연구에서사용된실험동물은출생시기 (8주령 ) 가동일한 Spargue-Dawley 계수컷 (n=24) 을중앙동물실험 ( 주 ) 에서공급받아 10주령 (321±5.4g) 째에무작위로선정하여각 6마리씩 4개집단 ( 통제집단, 운동 45분, 90분, 운동후회복기 12시간 ) 으로구분하였다. 2. 실험방법및분석 1) 실험동물사육실험동물은 J대학교실험동물센터 (2011-2-0041) 에서 plastic cage를이용하여 2마리씩사육하였으며, 사육실의온도는 23~25, 습도는 70~80%, 명암은 12시간주기로조절하였다. 선정된실험동물은전실험기간을통하여시판되는고형사료 ( 단백질 22.5%, 지방 3.5%, 저섬유 7.0%, 회분 9.0%, 칼슘 0.7%, 인 0.5%; 대한동물 ) 와충분한물을공급하였다. 2) 운동방법본실험을하기전모든실험동물은통제집단과트레이닝집단에무작위로배정된다음실험 3일전 5~15 m/min 와 10 의경사에서 15분동안설치류용 traedmill (Omnipacer model LC-4, Omni tech columbus) 에서적응훈련을실시하였다. 이러한적응훈련이끝난후운동집단은 V O 2 max의약 70% 인 26 m/min 의속도와 10 의경사도에서각각 45분과 90분동안일회성트레드밀달리기를실시하였고 (Bedford 등, 1979) 운동후회복기발현양상을확인하기위해일회성운동 12시간후샘플을적출하였다. 운동이종료된후모든실험동물 은 sodium pentobarbital (60mg/ kg )(Sigma, U.S.A) 을복강에주입하여마취한후비복근을 type I 섬유의분포가높은적색비복근과 type Ⅱ 섬유의분포가높은백색비복근으로구분하여적출한다음분석할때까지 -80 에보관하였다. 3. 분석방법 1) Western blotting 분석적출된조직에서단백질을추출하기위하여각조직 100 μg에단백질분해용액 [150 mm NaCl, 5 mm EDTA, 50 mm Tri-HCI(pH8.0), 1%-NP 40] 에단백질분해효소억제제 (1mM aprotinin 0.1 mm leupeptin, 1mM pepstatin) 가함유된용액 (1ml) 을첨가하여분쇄기 (Ultra-Turrax T8, Germany) 를이용하여분쇄한다음원심분리기 (Eppendorf, USA) 를이용하여 4 에서 14,000 rpm에서 30분동안원심분리하였다. 원심분리된용액중상층액만을분리한후상층액중 2 μl를단백질분석용액 (Bio-Rad, USA) 998 μl에첨가한다음 spectrophotometer (Eppendorf, USA) 를이용하여 560 nm의흡광도에서단백질량을정량하였다. 정량화된단백질에서각샘플당동일한단백질량 (20 μg ) 을 SDS gel loading 용액에총 20 μl가되도록혼합한다음 100 에서 5분간변성시켰다. 변성된단백질 (20 μl ) 을스탠다드단백질마커 (SDS-PAGE molecular weight maker, Bio-Rad, USA) 와함께 Mini-protein Ⅱ dual-slab apparatus (Bio-Rad, USA) 에의해만들어진 10% SDS- polyacrylamide gel에각샘플을주입한다음 100 volt에서 2시간동안전기영동하였다. 전기영동된 gel를 PVDF membrane (Amersham, USA) 에전이시키기위해 Mini trans -module (Bio-Rad, USA) 를이용하여 transfer 용액 (190 mm Glycine, 50 mm Tris-base, 20% methanol, 0.05% SDS) 속에단백질이전기영동된젤과 PVDF membrane 및 3M paper 를차례로겹치도록한다음 200 volt에서 4시간동안전이하였다. 단백질이전이된 membrane 은 Phosphate - buffered saline (PBS) (NaCl 8 g, KCI 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4 0.24 g, PH 7.4) 에 5% skim milk가첨가된용액에서 1시간동안 blocking 하였다. 그다음 membrane 은 PBS에 0.1% tween 20 이함유된용액 (PBST) 에서 10분간 3번세척되었으며, 세척된 membrane 은일차항체인 Drp 1 (Santacruz, Ca), Mfn 2 (Santacruz, Ca), PGC-1α (Santacruz, Ca), αb-crystallin (Santacruz, Ca), p53 (Santacruz, Ca) 이첨가된용액에서 1시간동안반응시킨후 PBST 용액에서 1x15분, 2x5분동안세척되
194 일회성유산소운동에따른흰쥐비복근내미토콘드리아기능및구조조절단백질의발현 었다. 일차항체에서반응된 membrane 은 anti- mouse 및 rabbit 1gG conjugated 이차항체가첨가된용액에서 1시간동안반응시킨다음 PBST 용액에서 1x15 분, 2x5분동안세척되었다. 세척된 membrane 은 ECL detection reagent (Amersham, USA) 용액 1 ml에 1분간노출된후 imaging system인 LAS -3000 (FUJIFILM, Japan) 을통해 immunoreactive bands 의상대적강도가정량화되었다. 발현된반면에운동 90분 (8.14±1.12) 에서는발현이감소하였다. 사후검증결과운동전과운동 45분, 90분그리고회복기 12시간에서유의한차이 (p<.05) 가있는것으로나타났다. 백색비복근내 Drp 1 단백질의발현은운동전 (6.62±0.99) 에비해운동 45분 (8.61±1.97) 증가를나타냈고운동 90분 (5.97±0.72) 회복기 12시간 (4.82±0.75) 에는통제군에비해감소하는것으로나타났다 <Fig 1>. 4. 자료처리방법측정된자료는 SPSS Win 10.0 통계프로그램을이용하여평균과표준편차를산출하였으며, 집단간평균차검증은일원변량분석 (one-way ANOVA) 을적용하였다. 가설의수락기준은 p<.05 수준에두었으며, 분석결과통계적으로유의한차이가있을경우 Student Newman-Keul 방식에의해사후검증을실시하였다. Ⅲ. 연구결과 1. 일회성트레드밀운동및운동후회복기골격근내 Drp 1 단백질의발현일회성트레드밀운동을실시한결과적색비복근내 Drp 1 단백질의발현은운동전 (12.57±0.97) 에비해운동 45분 (25.28±1.70) 과운동후회복기 12시간 (28.38±1.98) 에서높게 2. 일회성트레드밀운동및운동후회복기골격근내 Mfn 2 단백질의발현일회성트레드밀운동을실시한결과적색비복근내 Mfn 2 단백질의발현은운동전 (9.33±1.13) 에비해운동 45분 (32.88±0.59) 과회복기 12시간 (39.72±1.03) 에서높게발현된반면운동 90분 (2.76±0.30) 에서는통제군에비해감소하였다. 특히, 회복기 12시간에서현저하게증가하는것으로나타났다. 사후검증결과운동전과운동 45분, 운동후회복기 12시간에서유의한차이 (p<.05) 가있는것으로나타났으며운동 90분에서는유의 (p<.05) 하게감소하였다. 백색비복근내 Mfn 2 단백질의발현은운동전 (4.71±0.72) 에비해운동 90분 (4.71±0.56) 에서변화가관찰되지않았지만운동 45분 (3.66±0.73) 과회복기 12시간 (2.72±0.44) 에는다소감소하였다. 사후검증결과운동전과회복기 12시간에서유의한차이 (p<.05) 가있는것으로나타났다 <Fig 2>. Fig 2. Western blot analyses of Mfn 2 protein in rat skeletal muscle by acute traedmill exercise. Fig 1. Western blot analyses of Drp 1 protein in rat skeletal muscle by acute traedmill exercise; R(rest), E45(exercise 45 minutes), E90(exercise 90 minutes), 12H(recovery 12 hours). Values represents the mean±se of 6rats per each group; *p<.05:different between R(rest) groups.
김정하 김재철 박대령 강윤석 195 3. 일회성트레드밀운동및운동후회복기골격근내 PGC-1α단백질의발현일회성트레드밀운동을실시한결과적색비복근내 PGC-1α 단백질의발현은운동전 (7.63±0.94) 에비해운동 45 분 (33.71±1.95) 과회복기 12시간 (39.78±1.28) 에서높게발현된반면, 운동 90분 (5.37±1.16) 에서는발현이감소하였다. 특히, 운동후회복기 12시간에서현저하게증가하는것으로나타났다. 사후검증결과운동전과운동 45분, 회복기 12시간에서운동집단간에유의한차이 (p<.05) 가있는것으로나타났다. 백색비복근내 PGC-1α 단백질의발현은운동전 (4.72±0.71) 에비해운동 45분 (2.51±0.62) 과 90분 (4.15±0.80) 그리고회복기 12시간 (2.92±0.58) 에서감소하는것으로나타났다 <Fig 3>. 유의한차이 (p<.05) 가있는것으로나타났다 <Fig 4>. Fig 4. Western blot analyses of αb-crystallin protein in rat skeletal muscle by acute traedmill exercise. 5. 일회성트레드밀운동및운동후회복기골격근 내 p53 단백질의발현 Fig 3. Western blot analyses of PGC-1α protein in rat skeletal muscle by acute traedmill exercise. 4. 일회성트레드밀운동및운동후회복기골격근내 αb-crystallin 단백질의발현 일회성트레드밀운동을실시한결과적색비복근내 α B-crystallin 단백질의발현은운동전 (13.49±1.51) 에비해운 동 45 분 (20.50±1.75) 증가하였고운동 90 분 (10.65±0.44) 에서 는감소하였고회복기 12 시간 (13.66±1.19) 에서운동전수 준을유지하였다. 특히, 운동 45 분에서현저하게증가하는 것으로나타났다. 사후검증결과운동전에비해운동 45 분 유의한 (p<.05) 증가를보였으며운동 90 분에서유의하게감 소하였다. 백색비복근내 αb-crystallin 단백질의발현은운 동전 (12.23±0.50) 에비해운동 45 분 (10.17±0.55), 90 분 (10.37±0.75) 그리고회복기 12 시간 (8.76±1.01) 에서낮게발 현되었다. 사후검증결과운동전보다회복기 12 시간에서 일회성트레드밀운동을실시한결과적색비복근내 p53 단백질의발현은운동전 (8.46±1.10) 에비해운동 45 분 (17.75±1.19) 과운동 90 분 (11.25±1.01) 그리고회복기 12 시간 (12.48±0.89) 에서높게발현되었으며특히, 운동 45 분에서현 저하게증가하는것으로나타났다. 사후검증결과운동 45 분 과 90 분그리고회복기 12 시간에서통제집단에비해유의한 차이 (p<.05) 를나타냈다. 백색비복근내 p53 단백질의발현은 운동전 (5.40±0.64) 에비해운동 45 분 (20.24±1.89) 과운동 90 분 (10.98±0.91) 그리고회복기 12 시간 (12.05±0.75) 에서높게발 현되었으며특히, 운동 45 분에서높은발현증가를나타냈다. 사후검증결과운동 45 분과 90 분그리고회복기 12 시간에서 통제집단에비해유의한차이 (p<.05) 를나타냈다 <Fig 5>. Fig 5. Western blot analyses of p53 protein in rat skeletal muscle by acute traedmill exercise.
196 일회성유산소운동에따른흰쥐비복근내미토콘드리아기능및구조조절단백질의발현 Ⅳ. 논의 이연구의주요한결과는미토콘드리아분열과융합그리고생합성을조절하는 Drp 1, Mfn 2, PGC-1α 의발현이적색비복근에서운동전보다운동 45분과회복기 12시간에서유의하게증가하는것으로나타났으며, 골격근손상을예방하는 αb-crystallin 의발현은운동중 45분에서유의하게증가되는것으로나타났다. 손상된미토콘드리아의분해를조절하는 p53의발현은운동 45분과 90분그리고운동후 12시간에서증가하는것으로나타났다. 하지만백색비복근에서는 p53을제외한 Drp 1, Mfn 2, PGC-1a 와 αb-crystallin 은유의한증가는나타나지않았다. 이러한결과는일회성유산소운동을하는동안주로동원되는근섬유의특성에기초한것으로서 type I 섬유의분포가높은적색비복근이주로사용되었음을의미한다. 이러한결과는이들인자들이운동중생성된다양한스트레스반응에대하여미토콘드리아기능및구조에긍정적으로작용하고있을뿐만아니라회복기 12시간에서의증가된발현은근세포내손상된미토콘드리아의회복과치료에긍정적영향을미치는것으로사료된다. 운동을하는동안반복적으로일어나는골격근의수축은높은에너지동원을요구하게되고미토콘드리아에서지방과산소를이용한산화적인산화과정을통해많은에너지를생산하게되지만산화적인산화과정중사용된산소는완전연소되지못하고부산물인 ROS를생성하게된다 (Naqui et al., 1986). 일상생활또는저강도운동에의해생성된 ROS 는체내항산화방어시스템에의해제거되지만과도한운동에의해생성된 ROS는항산화방어시스템의능력을초과하게되고결국미토콘드리아의손상을야기하게된다 (Gonenc et al., 2000). 따라서손상된미토콘드리아는세포사멸, 자가소화작용및미토콘드리아분열을통해제거되고미토콘드리아융합과생합성을통한미토콘드리아형태와기능의변화그리고미토콘드리아수와밀도의증가를통해미토콘드리아및세포내환경그리고에너지생산능력은항상성을유지하게된다 (Saleem et al., 2009; Saleem et al., 2011). 미토콘드리아의분열을조절하는단백질은 Fis 1과 Drp 1로알려져있다. 그중 Drp 1은주로세포질에존재하며미토콘드리아에결합하여외막의분해를촉진하고미토콘드리아분열을야기하게된다 (Smirnova et al., 1998; Smirnova et al., 2001). 분열된미토콘드리아는형태적변화뿐만아니 라산화능력저하와같은미토콘드리아기능저하를유도하게된다 (Saleem et al., 2011). 또한골격근에서의 Drp 1의발현증가는세포사멸관련인자인 Bax의활성과 cytochrome-c 방출을증가시켜세포사멸에도관여하게된다 (Tanaka & Youle, 2008). Li(2010) 등은 hydrogen peroxide 로유도된골격근세포에서의산화적스트레스로인해 Drp 1의발현과미토콘드리아분열이증가하였음을보고하였고다양한자극에의한세포사멸에서 Drp 1이미토콘드리아분열의시작을유도한다고제시하였다. 본연구결과운동 45분에서 Drp 1 의발현증가는산화적스트레스로부터미토콘드리아항상성유지를위한미토콘드리아기능과구조의변화에긍정적으로작용하고있음을의미한다. 미토콘드리아융합을조절하는단백질은 Mfn 1과 2로알려져있다. 미토콘드리아융합은두개의다른미토콘드리의외막과내막의결합뿐만아니라미토콘드리아내물질의융합을촉진하여세포성장과미토콘드리아막전위 (membrane potential), 세포호흡등의기능향상을촉진하게된다 (Sheridan & Martin, 2010; Chen et al., 2005). 이러한 Mfn 2의결핍은미토콘드리아의산화적능력과글루코스산화의저하를유도하여미토콘드리아의정상적인기능을억제하게된다 (Bach et al., 2003). Cartoni(2005) 등은 10km 싸이클운동후회복기 24시간외측광근에서 Mfn 2 및미토콘드리아기능과관련된단백질의발현이증가하여운동에의한미토콘드리아기능향상과구조변화는회복기에이루어지고있음을보고하였다. 본연구에서도회복기 12시간에서 Mfn 2 발현이증가한것은운동으로미토콘드리아기능향상및손상된미토콘드리아의회복과치료를위해하나의결과로써사료되며, 운동중 45분에서의유의한증가는운동중생성된스트레스에의한미토콘드리아기능과구조의변화를긍정적방향으로유도하기위한하나의결과로사료된다. 운동에의한미토콘드리아생합성은미토콘드리아의기능및구조변화에중요한역할을담당하며이를조절하는인자는 PGC-1α 이다. PGC-1α 는핵내전사조절도움인자로서미토콘드리아생합성, 순응성열생성 (adaptive thermogenesis), 세포호흡, 당신생합성과같은대사적과정을조절하는중요한인자로잘알려져있다 (Knutti & Kralli, 2001; Puigserver & Spiegelman, 2003; Kelly & Scarpulla, 2004). 골격근에서의 PGC-1α 의발현은운동과같은대사적스트레스에의한반응으로활성이증가하여 ( Goto et al., 2000; Baar et al., 2002; Pilegaard et al., 2003; Russell et al., 2003) 미토콘드리아생합
김정하 김재철 박대령 강윤석 197 성및산화적인산화와관련된유전자의발현을촉진하게된다 (Wu et al., 1999; Lin et al., 2002; Mootha et al., 2004; Schreiber et al., 2004). 수영운동을실시한 Wright(2006) 등의연구에서운동직후유의한증가를보이지않았지만운동후회복기 3시간부터 18시간까지 PGC-1α 단백질의발현이증가하였고트레드밀운동을실시한 Leick(2008) 등의연구에서도운동후 PGC-1α 의발현과미토콘드리아생합성및호흡체인관련인자들의발현이증가하여운동으로인한미토콘드리아의생합성과산화적능력이증가하였음을보고하였다. 본연구결과에서도적색비복근에서 PGC-1α 의발현이운동 45분과회복기 12시간에서유의한증가를나타났는데특히, 회복기 12시간에서유의한증가는운동중손상된미토콘드리아의회복및기능향상을위해발현이증가된것으로사료되며, 운동 45분에서의발현은운동중생성된스트레스에대한미토콘드리아의방어기전및기능유지를위한항산화반응으로발현이증가된것으로사료된다. 본연구의중요한결과중하나는운동과운동후회복기에서미토콘드리아구조및기능조절에관여하는 Drp 1, Mfn 2, PGC-1α 의발현양상에관련성이높다는점이다. 운동후회복기에서이들인자들의유의한증가는많은연구에서논의되어왔지만운동 45분에서의이들인자들의발현증가와비슷한발현양상에따른관련성은매우의미있는결과로사료된다. 본연구와유사한일회성운동을실시한 Bo(2010) 등의연구에서 Mfn 2 mrna 의발현은 150분운동과운동후회복기 6시간까지감소하였고 12시간이후증가하였지만 Drp 1과유사한 Fis 1의발현은운동과운동후회복기모두증가하여운동을하는동안발현양상이상이하게나타났다. 하지만본연구결과일회성운동자극에대한미토콘드리아분열과융합이동시에일어나고있음을의미하며, 특히운동 45분에서의급격한발현증가와운동후회복기 12시간에서의발현증가는운동중생성된스트레스에의한미토콘드리아의산화적손상에대한방어와미토콘드리아구조및기능유지및회복기손상된미토콘드리아의회복과치료과정에상호연관되어긍정적으로작용하고있는것으로사료된다. 운동중발생된스트레스에의한골격근손상을방어하기위해 small HSP인 HSP27 과 αb-crystallin 의발현이증가하게된다 (Kostenko & Moens, 2009). small HSP은안정시 200~ 800kDa 의세포내복합체형태를이루다가산화적스트레스에의해인산화되어 molecular chaperone 을형성근손상을예방하고단백질구조의안정성유지에관여한다 (Ferns et al., 2006). 따라서운동에의한골격근내 αb-crystallin 발현의증가는운동으로야기된스트레스가증가하고있음을의미한다. 본연구결과적색비복근에서 αb-crystallin 의발현이운동 45분에서유의하게증가하였다. 이러한결과는고강도트레드밀운동중발생된스트레스에의해골격근손상이이루어지고있고있음을의미한다. 운동중손상된기관의분해및제거를통한항상성유지는 p53에의해이루어진다. p53은핵내전사인자로서스트레스상황에서활성이증가하여세포순환억제, 세포사멸, 자가소화작용, 항산화, DNA repair, 세포분화, 노화등의기능을수행한다고알려져있다 (Vogelstein et al., 2000). 그중 p53의대표적인기능은손상된세포및기관의분화를억제하여추가적인손상을방지하고세포사멸과자가소화작용의촉진으로손상이진행된세포및기관을제거하여세포의항상성유지에기여하게된다 (Olovnikov et al., 2009). 골격근에서의 p53 발현증가는 Bax 활성과미토콘드리아에서 cytochrome c 방출을유도하여세포사멸을촉진하게된다 (Miyashita & Reed, 1995). 또한스트레스상황에서발현이증가하여 AMPK와 TSC(tuberous sclerosis complex) 를통한자가소화작용을촉진하여손상된세포및세포내기관을제거하게된다 (Maiuri et al., 2010). 본연구결과에서도적색비복근과백색비복근모두운동 45분과 90분, 회복기 12시간유의한증가를보여운동중발생한스트레스에의해손상된미토콘드리아의분해를유도하고세포의항상성유지에관여하는것으로사료된다. 또한최근연구에서 p53의활성이미토콘드리아형태및기능유지에도관여하고있다고제시하였다. Li(2010) 등은 hydrogen peroxide 처치에의해미토콘드리아분열이증가하였고 p53과 Drp 1 활성이증가를나타냈다. 하지만hydrogen peroxide 와 p53rnai 를함께처치한그룹에서는 Drp 1의발현과미토콘드리아분열은감소하였다. 따라서 p53의활성은 Drp 1을경유하여미토콘드리아분열에관여하고있음을제시하였다. 또한본연구결과에서 p53과 Drp 1의발현이운동 45분과회복기 12시간에서증가하여두단백질의발현과미토콘드리아분열에상관관계가있을거라사료되지만추후형질전환및활성억제를이용한좀더명확하고체계적인연구로운동상황에서 Drp 1 발현과미토콘드리아분열그리고 p53발현의상관관계를구명하는연구가필요할것으로사료된다.
198 일회성유산소운동에따른흰쥐비복근내미토콘드리아기능및구조조절단백질의발현 Ⅴ. 결론 일회성유산소운동과운동후회복기골격근내 Drp 1, Mfn 2, PGC-1α, αb-crystallin 및 p53 단백질의발현을구명하기위해일회성트레드밀운동을실시한결과다음과같은결론을얻었다. 1. 미토콘드리아분열, 융합, 생합성에관여하는 Drp 1, Mfn 2, PGC-1α 단백질의발현은적색비복근에서운동 45분과회복기 12시간에서유의하게증가한반면백색비복근에서는증가하지않는것으로나타났다. 2. αb-crystallin 단백질의발현은적색비복근에서운동 45 분에서유의하게증가하였으며, 백색비복근에서는유의하게증가하지않는것으로나타났다. 3. p53 단백질의발현은적색및백색비복근에서운동 45분과 90분, 회복기 12시간에서유의하게증가하는것으로나타났다. 이러한결과들은일회성트레드밀운동에의한미토콘드리아분열과융합그리고생합성에관여하는 Drp 1, Mfn 2, PGC-1α 의발현이동시에일어나미토콘드리아형태및기능변화에관여하고있으며 αb-crystallin 과 p53 발현에의해미토콘드리아손상예방및항상성유지에작용하는것으로사료된다. 참고문헌 Baar, K., Wende, A. R., Jones, T. E., Marison, M., Nolte, L. A., Chen, M., Kelly, D. P., & Holloszy, J. O. (2002). Adaptations of skeletal muscle to exercise:rapid increase in the transcriptional coactivator PGC-1., FASEB J., 16:1879 1886. Bach, D., Pich, S., Soriano, F. X., Vega, N., Baumgartner, B., Oriola, J., Daugaard, J. R., Lloberas, J., Camps, M., Zierath, J. R., Rabasa-Lhoret, R., Wallberg-Henriksson, H., Laville, M., Palacin, M., Vidal, H., Rivera, F., Brand, M., & Zorzano, A. (2003). Mitofusin-2 determines mitochondrial network architecture and mitochondrial metabolism. A novel regulatory mechanism altered in obesity., J Biol Chem., 278; 17190 17197. Bach, D., Naon, D., & Pich, S., et al. (2005). Expression of Mfn2, the Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2A gene, in human skeletal muscle:effects of type 2 diabetes, obesity, weight loss, and the regulatory role of tumor necrosis factor alpha and interleukin-6., Diabetes, 54:2685 2693. Bedford, T. G., Tipton, C. M., Wilson, N. C., Oppliger, R. A., & Gisolfi, C. V. (1979). Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures. J Appl Physiol, 47(6):1278-83. Bo, H., Zhang, Y., & Ji, L. L. (2010). Redefining the role of mitochondria in exercise:a dynamic remodeling., Ann N Y Acad Sci, 1201:121-8. Cartoni, R,. Léger, B., Hock, M. B., Praz, M., Crettenand, A., Pich, S., Ziltener, J. L., Luthi, F., Dériaz, O., Zorzano, A., Gobelet, C., Krall,i A., & Russell, A. P. (2005). Mitofusins 1/2 and ERRalpha expression are increased in human skeletal muscle after physical exercise., J Physiol., 15;567:349-58. Chan, D. C. (2006). Mitochondrial fusion and fission in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 22:79 99. Chen, H., Chomyn, A., & Chan, D. C. (2005). Disruption of fusion results in mitochondrial heterogeneity and dysfunction. J. Biol. Chem., 280:26185 26192. Febbraio, M. A., Steensberg, A., Fischer, C. P., Keller, C., Hiscock, N., & Pedersen, B. K. (2002). IL-6 activates HSP72 gene expression in human skeletal muscle., Biochem Biophys Res Commun., 6;296(5):1264-6. Ferns, G., Shams, S., & Shafi, S. (2006). Heat shock protein 27:its potential role in vascular disease. Int J Exp Pathol., 87(4):253-74. Gonenc, S., Acikgoz, O., Semin, I., & Ozgonul, H. (2000). The effect of moderate swimming exercise on antioxidant enzymes and lipid peroxidation levels in children. Indian J Physiol Pharmacol., 44(3):340-344. Goto, M., Terada, S., Kato, M., Katoh, M., Yokozeki, T., Tabata, I., & Shimokawa, T. (2000). cdna Cloning and mrna analysis of PGC-1 in epitrochlearis muscle in swimming-exercised rats. Biochem Biophys Res Commun., 274:350 354. Hood, D. A., Irrcher, I., Ljubicic, V., & Joseph, A. M. (2006).
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