Korean Journal of Microbiology (2015) Vol. 51, No. 4, pp. 364-373 pissn 0440-2413 DOI http://dx.doi.org/10.7845/kjm.2015.5034 eissn 2383-9902 Copyright c 2015, The Microbiological Society of Korea 보문 알긴산분해능을갖는 Pseudoalteromonas 및 Vibrio 속해양세균들의분리및특성분석 윤영준 김정완 * 인천대학교생명공학부 Isolation and characterization of marine bacteria with alginate degrading activity Young-Jun Yoon and Jung-Wan Kim* Division of Bioengineering, Incheon National University, Incheon 22012, Republic of Korea (Received August 10, 2015; Accepted December 4, 2015) ABSTRACT: As an effort to utilize alginate, 103 bacterial isolates that were positive for the alginate lyase activity were isolated from various clams and seawater samples collected in Incheon coastal area. Among them, 3 strains (M1-2-1, M6-1, and C8-15) were finally selected for further analysis based on their activities at higher levels than others. These isolates were all Gram-negative and rod shaped halophilic bacteria with motility. According to their physiological and biochemical properties as well as DNA sequence of their 16S rrna genes, M1-2-1 and M6-1 were identified as a member of genus Pseudoalteromonas and C8-15 belonged to genus Vibrio. They exhibited the alginate degrading activity at the maximal level when they were cultured in APY broth for 6 8 h at 25 C. Both their growth and the enzyme activity were greatly enhanced when NaCl was added to the growth medium. The crude alginate lyases from the supernatants of the bacterial cultures showed the highest activity at 45 C and ph 7.0 8.0. M1-2-1 and M6-1 produced 2.723 and 1.976 g/l of reducing sugar from alginate, respectively, suggesting that they have potential for commercial application. Key words: Pseudoalteromonas sp., Vibrio sp., alginate, alginate lyase, brown algae 알긴산은갈조류세포벽의 40% 정도를차지하는주성분으로 β-d-mannuronic acid (MA) 와 α-l-guluronic acid (GA) 가 α-1,4 또는 β-1,4 공유결합으로연결된점액질의이형다당류이다 (Gacesa, 1988). 알긴산의 MA와 GA의비율은해조류의종류, 계절및해조부위등에따라다른데 (Fisher and Dorfel, 1955), 현재상용되는알긴산은대부분 Macrocystis perifera, Laminaria hyperborean, 그리고 Ascophyllum nodosum으로부터생산되고있다. 알긴산은비만억제, 장의연동운동촉진을통한변비치료, 콜레스테롤억제, 항응고, 중금속흡수및제거, 유해물질의독성억제 (Gűven et al., 1991) 등의유용생리활성을보이고겔 / 필름형성능이있어다양한형태의기능성식품소재로의활용 *For correspondence. E-mail: kjw5864@inu.ac.kr; Tel.: +82-32-835-8244; Fax: +82-32-835-0804 이가능할뿐만아니라, 상처를보호하는창상피복제및지혈 (Lee et al., 2009a) 등의효과가있어의약품소재로도응용될수있다 (Kim et al., 2011). 알긴산으로제조되는올리고당또한생장촉진, 항암및항균작용, 면역증강, 장내균총개선, 고혈압개선등부가적인생체조절기능이있는것으로보고된바있으며 (Yokose et al., 2009; Yan et al., 2011; Terakado et al., 2012; Ueno et al., 2012; Powell et al., 2013), 국내에서도오래전부터해조류의알긴산올리고당제조에대한연구가진행되어왔다 (Joo et al., 1993, 1996; Kim et al., 1998; Choi et al., 2009). 한편기존의전분질계 (1세대) 및목질계 (2세대) 자원을이용한바이오에너지생산이 (Lee et al., 2008) 각각곡물가의급등과고비용및비효율적인전처리등의단점으로인해한계에도달함에따라, 이를극복할수있는제 3세대신재생에너지자원으로해조류를이용하여다양한바이오연료를생산하
알긴산분해해양세균의분리및특성분석 365 는연구가활발히수행되고있다 (Park et al., 2008; Kim et al., 2011). 특히해양생물자원이풍부한우리나라의경우해조류를이용한바이오에너지생산은가장현실적인대체에너지인동시에청정에너지로서의가능성이높아적극적으로활용될수있을것으로기대되고있다. 그러나올리고당을비롯한기능성식품, 화장품및의약산업, 그리고바이오에너지생산등에알긴산을비롯한해조다당류를이용하기위해서는이들을분해하여저분자화하는과정이매우중요하다. 특히알긴산은수용성이낮아상온에서용해되는시간이길고, 알코올에도잘녹지않으며, 농도가증가되면점도가높아지는등의특성을갖고있어이를보완할필요가있다. 알긴산의분리및분해를위해고온고압, 방사선조사등의물리적방법이나산이나알칼리로처리하는화학적방법이보고된바있으나 (Uo et al., 2006b), 최근화학적가수분해법보다알긴산을선택적으로분해할수있는효소를사용하는방법이더효과적이라고알려지면서, 알긴산분해효소를분비하는미생물탐색과해당유전자분리및효소특성분석등에관심을갖게되었다 (Kim et al., 2009). 알긴산분해효소 (alginate lyase; EC 4.2.2.4) 는 uronic acid 중합체의 1,4 glycosidic 결합을 β-제거반응으로분해하여불포화비환원성말단을발생시키는효소로 (Wong et al., 2000; Zhu and Yin, 2015), 해조류섭식동물 (Jung et al., 1999) 과이들의분변, 그리고해수, 해토등에서분리된 Vibrio sp. (Joo et al., 1995), Pseudomonas sp. (Lee et al., 2009b; Li et al., 2011), Azotobacter vinelandii (Cote and Krull, 1988), Pseudoalteromonas sp. (Tomoo et al., 2001) 등의다양한세균들에서많이관찰된다 (Li et al., 2015). 이에본연구에서는여러종류의패류및해수로부터가장자연적인조건하에서알긴산유래올리고당생산및바이오에너지생산에응용할수있도록알긴산분해능이우수한해양세균들을분리, 동정하며그균주들의생장특성을파악하고그들이분비하는알긴산분해효소의특성을분석하고자하였다. 재료및방법 알긴산분해세균분리시료및전처리알긴산분해능을갖고있는세균을분리하기위하여 2013 년 5월부터 8월사이에인천광역시소재수산시장과대형마트등에서키조개, 맛조개, 소라, 바지락, 전복, 홍합을구입하였고, 연안부두에서해수를채수하였다. 패류시료들은내장을취하여잘게다져멸균된희석액 (NaCl 2.5%, ph 7.5) 을가한 다음 vortex하여잘혼합한후, 상등액을연속희석하였다. 알긴산분해세균의분리및배양배지알긴산분해세균들을분리하기위하여두층으로나뉘어진다층평판배지를사용하였다 (Kitamikado et al., 1990). 하층배지는 2.0% (w/v) NaCl, 0.1% (w/v) KH 2PO 4, 0.05% (w/v) MgSO 4 ㆍH 2O, 0.002% (w/v) FeSO 4 ㆍH 2O, 0.05% (w/v) KCl, 2.0% (w/v) agar (ph 7.0), 상층배지는 1.0% (w/v) sodium alginate, 2.0% agar (ph 7.0) 를사용하여제조하였다. 시료희석액과해수 0.1 ml를각각분리용배지위에도말한다음 30 C에서 3 4일간배양하였다. 다층평판배지위에형성된균집락의지름이 2 3 mm 이상인균주들을알긴산분해양성균으로분리하였다. 알긴산분해능이확인된균주는 PYA 배지 [2.0% (w/v) NaCl, 0.5% (w/v) peptone, 0.2% (w/v) yeast extract, 0.5% (w/v) MgSO 4 ㆍH 2O, 0.1% (w/v) CaCl 2, 0.05% KCl, 1.5% (w/v) agar, ph 7.2] 를이용하여순수분리하였다. 평판배지상의알긴산분해능분석분리된균주들의알긴산분해능을확인하기위해 PSA 배지 [0.5% (w/v) peptone, 0.8% (w/v) sodium alginate, 2.0% (w/v) NaCl, 1.5% (w/v) agar, ph 7.2] 에접종하고 30 C에서 36 48시간배양하였다. 배양후 10% cetylpyridinium chloride monohydrate (CPC; w/v) 를균집락이형성된배지에배지가잠길정도로분주하고, 10분후투명환의형성을육안으로관찰하여알긴산분해효소의활성유무를판정하였다 (Gacesa and Wusteman, 1990). 알긴산분해능의정량분석알긴산분해균주들을 APY 액체배지 [0.8% (w/v) sodium alginate, 0.5% (w/v) peptone, 0.2% (w/v) yeast extract, 0.1% (w/v) MgSO 4 ㆍH 2O, 0.1% (w/v) KH 2PO 4, 2.0% (w/v) NaCl, ph 7.2] 에접종한다음 30 C에서적정시간진탕배양 (230 rpm) 하였다. 배양액은원심분리 (4 C, 12,000 rpm, 10 min) 하여상층액 ( 균체외효소 ) 을취하여조효소액으로사용하였다. 생성되는환원당은 DNS 정량법으로측정하였다 (Miller, 1959). 기질용액 [0.8% (w/v) sodium alginate, 0.3 M NaCl, 50 mm Tris-HCl buffer, ph 7.0] 500 μl와조효소액 500 μl를혼합하여항온수조 (25 혹은 30 C) 에서 1시간반응시킨다음, 반응액을원심분리 (4 C, 12,000 rpm, 5분 ) 하여상층액 200 μl와 DNS 용액 [0.63% (w/v) 3,5-dinitrosalicyclic acid, 2.14% (w/v) NaOH, 18.25% (w/v) Rochell salt (potasium sodium tartrate), 0.54% Korean Journal of Microbiology, Vol. 51, No. 4
366 Yoon and Kim (v/v) phenol (p=1.071 g/ml) 5.375 ml, 5 g Na 2S 2O 5 (Sigma- Aldrich)] 800 μl을혼합하여 10분간가열한후 540 nm에서흡광도를측정하였다. Maltose를표준당으로사용하여작성한표준검량선에흡광도값을대입하여환원당량을결정함으로써활성도를분석하였다. 효소활성 1 unit는 1분에 1 μmole의환원당을생산하는효소의양으로정의하였다. 알긴산분해능에미치는물리화학적인자들의영향은배양온도 (15 37 C), 반응온도 (10 80 C), NaCl 농도 (0 8.0%), 산도 (2.0 10.0) 등에관해분석하였고 APY 액체배지에균주들을접종하여 25 C 에서 230 rpm으로교반하면서 1 2시간간격으로시료를취하여활성을측정하거나동일조건하에서 10시간진탕배양한후동일한방법으로효소활성을정량적으로분석하였다. Table 1. Alginate-degrading bacteria isolated from various marine samples Common name Sample Scientific name Number of colonies obtained Number of positive isolates Comb pen shell Atrina pectinata japonica 166 37 Manila clam Ruditapes philippinarum 89 15 Razor clam Solen corneus Lamarck 33 0 Mussel Mytilus coruscus GOULC 119 28 Abalone Haliotis gigantea 94 12 Spiny top shell Batillus cornutus 73 8 Small ark shell Barbatia stearnsii 66 3 Sea water 15 0 Total 687 103 분리균주의동정 분리된균주들은 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 1994) 의분류방법에따라그람염색, 형태, 생리 생화학적특성을분석하여동정하였다. 알긴산분해효소를분비하는균주의형태는투시전자현미경 (H-7600, Hitachi; 을지대학교전자현미경실 ) 으로관찰하였다. 또한당을이용한산생성실험등과같은생리 생화학적특성은 API 20E Kit (biomérieux Co.) 로분석하였다. 선별된분리균주들의유전학적인동정과계통학적유연관계의분석을위해염색체 DNA를분리하여 16S rrna 유전자에대한 Universal primer [fyu2, 5 -TAACACATGCAAGT CGAGCG-3 ; ryu2, 5 -TACGGCTACCTT GTTACGAC-3 ] 로 Yoon 등 (2003) 의방법을변형하여중합효소연쇄반응을수행하였다. 증폭된 16S rrna 유전자단편의염기서열을결정한후 (Solgent Co.) National Center for Biotechnology Institute (NCBI) 의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) search 를통하여동정하였다. 계통분류학적유연관계는 EzTaxon-e (Kim et al., 2012) 와 MEGA6 (Tamura et al., 2011) 를사용하여, neighbor joining method에따라 evolutionary distance matrix를얻고계통수를작성하여분석하였다 (Saitou and Nei, 1987). 결과및고찰 알긴산분해효소생산균주의선별및동정 Table 1에보인바와같이다양한패류의내장과해수시료를다층평판배지에배양한결과 1차적으로 687개의균집락이분리되었는데, 이들은모두알긴산을분해하여생장할수있 Fig. 1. Agar plate assay of the alginate degrading activity of the isolates. Clear zone around each colony represents degradation of alginate in the PSA medium. 는균들이었다. 이들의알긴산분해능을확정하기위해이들을 PSA 배지에배양한후 10% CPC 용액을가하여투명환이형성되는지여부를확인한결과, 278개의균주들이 2차로선발되었다. 이들을 PYA 배지에계대배양하여순수분리한다음다시 PSA 배지와 CPC 용액으로알긴산분해능을재확인하여 103개균주를알긴산분해양성균주로선별하였다 (Fig. 1 and Table 1). 이들가운데 PSA 평판배지상에서가장뚜렷한알긴산분해능을보인 9개분리균주를대상으로알긴산분해로생성되는환원당을정량분석하였다. 그결과바지락에서분리된 4개의 M 균주들이알긴산분해활성을가장많이나타냈는데 (Fig. 2), 특히 M1-2-1 균주는환원당생성능이 2.723 mg/ml로가장높았고, 그다음으로 M6-1이 1.976 mg/ml으로높았다. 이는 Joo 등 (1993) 이분리했던균주들이나 (0.09 0.738 mg/ml), Uo 등 (2006b) 이분리하여보고한 Bacillus licheniformis AL-577 (0.9 mg/ml) 보다알긴산을분해하여훨씬더많은환원당을생성시킬수있는것을알수있었다. 키조개에서분리된 미생물학회지제 51 권제 4 호
알긴산분해해양세균의분리및특성분석 367 Fig. 2. The amount of reducing sugars released from alginate by the isolates. C8-15, C9-1-17, C12-7 균주들과소라에서분리된 T2-8 균주는 M 균주들에비해알긴산분해능이상대적으로낮았으나 (0.29 1.06 mg/ml), 위의보고된사례들보다대체로높았다. 이들은균집락의형태면에서도바지락에서분리된 M 균주들과는확실하게구별되어다른종류의균주들인것으로사료되었다. 알긴산분해능이우수한 9개균주들을동정하기위하여 16S rrna 유전자를 PCR로증폭하여그염기서열을분석하였다. 그결과, 바지락에서분리한 M1-2-1, M1-2-2, M6-1 및 M6-2 균주는 Pseudoalteromonas 속균주들과 98 99% 의유사성을보여연관관계가매우높았으므로 Pseudoalteromonas 속균주로동정하였다. 키조개에서분리한 C8-15와 C9-1-17 균주들은 Vibrio 속균주와 99% 의높은유연성관계를보여이들은 Vibrio 속균주로동정하였다. 그러나, C12-7과 T2-8은북극에서분리된해양세균과의유사성이각각 98% 와 65% 인것으로나타나정확한동정이불가능하였으며, 특히 T2-8은새로운종일가능성이높은것으로판정하였다. 이들의 16S rrna 유전자염기서열을 neighbor joining method로계통분류학적유연관계를분석한결과는 Fig. 3에보인바와같았다. Pseudoalteromonas 속균주로동정된 M균주들은 P. atlantica 와연관성이높았고, C12-7 균주는 P. prydzensis와계통분류학적연관성이높았으며, T2-8 균주는변이가더큰것으로나타났으며, C9-1-17과 C8-15 및 C8-3 균주들은 Vibrio 속세균들과의연관성이높은것으로나타났다. 이러한계통분류학적동정결과를확인하기위하여형태적, 생리및생화학적특성을분석했을때, M1-2-1과 M1-2-2, 그리고 M6-1과 M6-2는각각시험한범위내에서특성이거의같았으며 Vibrio C8-15와 C9-1-17도특성이서로거의같았다 (Table 2). 이들은모두그람음성간균으로크기는 1.9 2.7 0.9 1.3 μm이었으며 (Fig. 4), 운동성이관찰되었다. 생리적으로 M1-2-1과 M6-1 균주는 5 37 C 범위에서생장하고, 40 C 이상에서는생장하지못하는반면, C8-15 균주는 40 C 에서도생장이가능하였다. 이들의최적생장온도는 25 C로저온균임을알수있었다. 또한 3 균주모두 1 13% NaCl 농도범위에서생장이가능한호염성세균으로 O-nitrophenyl-β- D-galactopyranoside 분해능과 oxidase 양성반응을보였고, polymyxin B와 gentamicin에대해감수성을보였다. 또한 M1-2-1과 M6-1은섬유질과젤라틴분해능은없었으나지질, 단백질및전분분해능을갖고있는등 Pseudoalteromonas 속 Fig. 3. Phylogenetic relationship among the isolates and type strains of closely related taxa on the basis of the DNA sequence of the 16S rrna gene. The dendrogram was established by the neighbor-joining method. The bar stands for 0.02 accumulated changes per nucleotide. Korean Journal of Microbiology, Vol. 51, No. 4
368 Yoon and Kim Table 2. Characteristics of the isolates Characteristics M1-2-1 M6-1 C8-15 Characteristics M1-2-1 M6-1 C8-15 Cell shape Rod Rod Rod Susceptibility to Gram staining - - - ampicillin (10 μg) - - - Motility + + + gentamycin (10 μg) + + + OX + + + polymyxin B (300 U) + + + ONPG + + + streptomycin (10 μg) - - + ADH - - - tetracycline (30 μg) - - - LDC - - - Growth at ODC - - - 5 C + + + H 2S - - - 37 C + + + URE - - - 40 C - - + IND - - - Growth in NaCl VP V V ND 0% - - + Hydrolysis of 1 12% + + + Cellulose - - - 13% ± ± + Gelatin - - - Growth at alginate Lipid + + + 0% - ± + Protein + + - 0.5 2.0% + + + Starch + + - Growth with GLU - - + 1% Fructose - - ± MAN - - - Galactose - - ± INO - - + Glucose - - + SOR - - - Starch + + - RHA - - + Sucrose - - + SAC - - + Growth with MEL - - - 1% Peptone + + + AMY - - + Urea ± - ± ARA - - + (NH 4) 2SO 4 ± ± ± CIT ± ± V NH 4Cl ± ± ± ±, negative or positive reaction; ND, no data; V, variable; N, negative Abbreviations: OX, oxidase; GLU, glucose; ONPG, O-nitrophenyl-β-D-galacto-pyranoside; MAN, mannitol; ADH, arginine dihydrolase; INO, inositol; LDC, lysine decarboxylase; SOR, sorbitol; ODC, ornithime dedcarboxylase; RHA, rhamnose; H 2S, H 2S production; SAC, sucrose; URE, urease; MEL, melibinose; IND, indole production; AMY, amygdalin; VP, Voges-Proskauer; ARA, arabinose; GEL, gelatinase; CIT, citrate (A) (B) Fig. 4. Transmission electron microscopy of Pseudoalteromonas sp. M1-2-1 (20,000X, left) and M6-1 (20,000X, right). 세균들과유사한특성을나타냈다 (Nam et al., 2007). 그러나이들은당분해및이에따른산생성시험에서는대부분음성 반응을보여기존에알려진 Pseudoalteromonas 속세균들과는다소차이가있었다. C8-15는단백질및전분분해능이없 미생물학회지제 51 권제 4 호
알긴산분해해양세균의분리및특성분석 369 는반면포도당과저당분해능이있는점에서 Pseudoalteromonas 속 M1-2-1과 M6-1균주와구별되었다. M1-2-1, M6-1 및 C8-15 균주들은 0.5 2.0% 의알긴산이포함된배지에서생장력이좋을뿐만아니라, 알긴산분해능이우수함을재확인할수있었다. 따라서이들을알긴산분해능이가장우수한분리균주들로최종선발하였으며, 이 3 균주들이생산하는알긴산분해능과관련된특성에대해다양한배양및반응조건하에서분석하였다. 배양시간에따른균주생장과알긴산분해효소활성 Pseudoalteromonas sp. M1-2-1과 M6-1 균주및 Vibrio sp. C8-5 균주의배양시간에따른생장도및알긴산분해능발현양상을파악하기위하여이들을 APY 액체배지에접종하여 30 C에서 120시간배양하면서 24시간간격으로배양액을취하여분석하였다. 그결과, 24시간이경과하면 M1-2-1과 M6-1 균주들의경우알긴산분해활성이감소하기시작하였고, C8-15 균주는활성에큰차이가없었다 ( 결과미제시 ). 따라서이들을동일조건하에서 20시간배양하면서 2시간마다배양액을취하여다시분석하였다 (Fig. 5). 그결과, 3균주모두배양시작 10시간후정체기에이르렀는데, M1-2-1과 M6-1 균주는대수기말기인 8시간후에알긴산분해능을가장많이나타낸반면, C8-15 균주는이른대수기인 6시간만에가장 높은활성을보였다. 이때 C8-15 균주는 M 균주들에비해생장은매우빠르고많이증식했으나, 최대알긴산분해활성은 M1-2-1 균주의활성의 15% 정도밖에되지않았다. B. licheniformis AL-577 균주는 144 150시간배양했을때, 생장및알긴산분해활성이최대로나타났다고보고되었으며 (Uo et al., 2006b), Streptomyces sp. MET 0515의경우 72시간배양후알긴산분해활성이최고점에이르렀다는보고 (Kim et al., 2007) 와비교했을때, 본연구에서분리된균주들은생장과알긴산분해활성이 10시간이내에최대로나타났으므로산업적으로응용하는데효율성이높을것으로기대되었다. 배양온도에따른분리균주들의생장과알긴산분해활성 Pseudoalteromonas sp. M1-2-1과 M6-1 균주및 Vibrio sp. C8-15 균주의배양온도에따른생장력과알긴산분해활성을 15 37 C 범위에서 APY 액체배지에접종하여 8시간동안 230 rpm으로진탕배양하면서분석하였다 (Fig. 6). 3균주모두 25 C 가최적생장온도로확인되었는데, M1-2-1과 M6-1는 20 30 C에서생장하였고, Vibrio sp. C8-15 균주는 20 37 C의비교적넓은범위에서생장이가능하였으며, 다른두균주에비해서훨씬많이생장하였다. 또한, 위의온도구간에서동일한조건으로배양하면서상등액을취하여 30 C에서알긴산분해활성을측정하였는데 C8-15 균주는 25 C에서배양했을때가 Fig. 5. Effect of culture time on growth and alginate degrading activity of the isolates. The isolates were cultured in APY medium at 30 C for 20 h with shaking at 230 rpm. Relative enzyme activity is shown in percentages, taking the highest activity of M1-2-1 as 100%. The black bars represent the relative enzyme activity produced by M1-2-1; grey bars, M6-1; white bars, C8-15. The graph marked with circles represents the growth of M1-2-1; squares, M6-1; triangles, C8-15. Fig. 6. Effect of culture temperature on growth and alginate degrading activity of the isolates. The isolates were cultured in APY medium at 30 C for 8 h with shaking at 230 rpm. Relative enzyme activity is shown in percentages, taking the highest activity of M1-2-1 as 100%. The black bars represent the relative enzyme activity produced by M1-2-1; grey bars, M6-1; white bars, C8-15. The graph marked with circles represents the growth of M1-2-1; squares, M6-1; triangles, C8-15. Korean Journal of Microbiology, Vol. 51, No. 4
370 Yoon and Kim 장많은활성을생산하였고, M1-2-1과 M6-1는 30 C에서배양했을때가장많은활성을생산하였는데, 25 C에서도최대활성의 90% 정도를생산하였다. 이두균주들은그외의온도범위에서는알긴산분해효소활성이매우낮았던반면에, Vibrio sp. C8-15 균주는 15 30 C 범위내에서는최대활성의약 80%, 35 C에서는약 48% 정도의활성을보였다. 따라서, Vibrio 속세균인 C8-15 균주는 Pseudoalteromonas 속균주들에비해알긴산분해활성생산력은낮았지만, Pseudoalteromonas 균주들보다넓은범위의온도에서생장하며, 알긴산분해능을거의일정하게발현하는것으로나타났다. NaCl 이분리균주의생장과효소활성에미치는영향본연구에서분리된균주들은패류에서유래한해양세균들이기때문에염농도가높은환경에서도활성이있을것으로사료되어염농도가분리균주들의생장및알긴산분해활성생산에미치는영향을분석하였다 (Fig. 7). 본연구에서선발된 3균주들은 NaCl이포함되지않는배지에서는거의생장하지않았고, 1.0 12.0% (w/v) 의 NaCl 농도범위에서생장할수있어호염성균주로판정된바있다 (Table 2). 특히 2.0 5.0% (w/v) 범위에서잘생장하였다. C8-15 균주는 2% (w/v) NaCl 이가해졌을때가장생장도가높았고, 농도가증가함에따라생장도가점차감소하였다. 반면에, M1-2-1과 M6-1 균주들의 생장도는 NaCl 농도가 5% (w/v) 로증가될때까지증가하다가그이상이되면급격히저하되었으며, 특히 M6-1의생장은 M1-2-1에비해 3 5% (w/v) 농도의 NaCl에의해현저하게증가되었다. 해양미생물들은생장및효소생산에적정농도의 1가또는 2가이온이필요하다고알려져있는데, 이는삼투조절과밀접한관련이있다 (Baxter, 1959). Pseudoalteromonas sp. M1-2-1과 M6-1 균주의알긴산분해효소활성은배지에 6.0% (w/v) NaCl을가했을때각각 199.91 unit/ml와 180.61 unit/ml로가장많이생산되었다 (Fig. 7). M1-2-1 균주는 1.0-5.0% 범위내에서비슷한양의효소활성을생산한반면, M6-1 균주는생장이많이일어나는조건하에서는효소활성을적게생산하였다. Vibrio sp. C8-15 균주는 1.0% (w/v) NaCl를가했을때효소활성이가장높게나타났고 (34.54 unit/ml), 2.0 4.0% 범위내에서는큰차이가관찰되지않았다. 그러나 NaCl 농도가 5.0% (w/v) 이상이되면생장도와효소활성이급격하게감소하는것으로나타났다. 이는 B. licheniformis의성장과환원당생성의최적 NaCl 농도가 2.0% (w/v) 라는보고 (Uo et al., 2006b) 와 Vibrio sp. AL-145의경우 0.5 M NaCl ( 약 2.9%/ w/v) 에서효소활성이가장높았다는보고 (Joo et al., 1995) 와비교할때, Pseudoalteromonas sp. M1-2-1과 M6-1 균주는이들과매우다른양상을보인반면에 Vibrio sp. C8-15 균주는비슷한양상을보이는것으로판명되었다. 또한, 이러한결과를토대로본연구에서분리된 3균주들은염농도와관련해서생장도나알긴산분해활성발현양상이서로다르다는것을알수있었다. 반응온도및산도가알긴산분해효소활성에미치는영향 Fig. 7. Effect of NaCl on growth and alginate degrading activity of the isolates. The isolates were cultured as in Fig. 6. Relative enzyme activity is shown in percentages, taking the highest activity of M1-2-1 as 100%. The black bars represent the relative enzyme activity produced by M1-2-1; grey bars, M6-1; white bars, C8-15. The graph marked with circles represents the growth of M1-2-1; squares, M6-1; triangles, C8-15. 본연구에서분리된균주들의알긴산분해능을보다자세히분석하기위하여, 이들을 APY 액체배지에접종하여 25 C 에서 230 rpm으로 8시간진탕배양한후원심분리 (7,000 rpm, 5 min, 4 C) 하고그상등액을취하여조효소액을준비하였다. 그조효소액을 0.8% 알긴산용액과혼합하여다양한반응온도 (10 80 C) 에서그분해활성을분석하였다. 그결과 3균주모두 45 C에서알긴산분해효소활성이가장높았다 (Fig. 8A). 특히 Pseudoalteromonas 속균주들은 25 60 C의범위내에서최대활성의 90% 이상의활성을보였고 10 C에서최대활성의 80% 이상그리고 80 C에서도 65 70% 정도유지되어, 활성온도범위가상당히넓은것을알수있었다. Vibrio 속 C8-15 균주는 10 45 C 온도구간에서비교적고르게높은활성을보인반면 50 C에서는최대활성의 55%, 그이상의온도에서는단지 10% 미만으로나타났다. 따라서, Pseudoalteromonas 속균주들이생산하는알긴산분해효소가열에더안정하였고, 미생물학회지제 51 권제 4 호
알긴산분해해양세균의분리및특성분석 371 (A) (B) Fig. 8. Effect of reaction temperature (A) and ph on the crude alginate degrading enzymes from the isolates. Relative enzyme activity is shown in percentages, taking the highest activity of M6-1 (A) or M1-2-1 (B) as 100%. The graph marked with circles represents the growth of M1-2-1; squares, M6-1; triangles, C8-15. 이는산업적응용에매우유리한특성인것으로사료되었다. 이전에보고된알긴산분해효소들의최적반응온도와비교해보면 Vibrio와 Enterobacter 속세균유래알긴산분해효소들의경우는최적온도가 25 C 혹은 30 C였으며 (Joo et al., 1993), B. licheniformis는 35 C (Uo et al., 2006a), Pseudomonas fluorescens HZJ216 균주는 35 C였고 (Li et al., 2011), Streptomyces sp. MET 0515의경우최적온도가 70 C였다 (Kim et al., 2007). 이효소들은모두본연구에서분리된균주들의효소들보다좁은온도범위내에서활성을보였다. 최근에유전자분리를통해서특성이분석된해양세균 Agarivorans sp. L11 의 alginate lyase는최적 ph가 8.6, 최적온도가 40 C였으며, 15 C와 20 C 같은저온에서도각각최대활성의 54.5% 와 72.1% 를유지되는점에서본연구에서분리된균주들의효소와매우유사하다고사료되었다. Pseudoalteromonas sp. M1-2-1과 M6-1 그리고 Vibrio sp. C8-15 균주들이생산하는알긴산분해효소활성에산도가미치는영향을 ph 2.0 10.0의범위에서분석하였다 (Fig. 8B). 이들의알긴산분해활성은중성및약알칼리성 (ph 7.0과 8.0) 조건에서가장높았으며, 약산성 (ph 6.0) 조건에서최대활성의 90% 이상의활성이유지되었고, 염기성조건인 ph 9.0에서도중성조건하에서보다는약하지만어느정도활성이높았다 (70 85%). 그러나산성 (ph 5.0 이하 ) 조건에서는효소활성이매우낮았다. 또한, 특히 M1-2-1과 M6-1의경우 ph 3.0에서최대활성의 50% 정도되는활성이관찰되었는데, 이는중성에서활성을보이는알긴산분해효소와는또다른효소가조효 소내에존재하는것으로사료되었다. Streptomyces sp. MET 0515 균주의알긴산분해효소는최적 ph가 7.5이었고, ph 8.0 에서가장높은활성을나타냈으며 (Kim et al., 2007), B. licheniformis의 AL-755 균주의알긴산분해효소활성은 ph 6.0에서가장높았으며 ph 8.0까지최대활성의 80% 가유지되었다고보고된바있다 (Uo et al., 2006b). P. fluorescens HZJ216 균주는 3개의알긴산분해효소들을갖고있고그들의최적 ph는 7.0이나, 그중 2개는 ph 5.0 9.0, 다른하나는 5.0 7.0 범위에서활성이유지되었다고보고된바있다 (Li et al., 2011). 따라서, 본연구에서분리된균주들은활성온도및 ph 범위가넓은알긴산분해효소를생산하거나 Li 등 (2011) 이보고한바와같이여러알긴산분해효소를생산하는것으로사료되며, 따라서바이오에너지생산을위해서사용되기에적절한것으로기대되었다. Joo 등 (1993) 이분리한균주의환원당생성능은 0.355 g/l 이었고, Uo 등 (2006a) 이분리한 B. licheniformis의환원당생성능은 0.899 g/l이었으며또한 Kim 등 (2010) 이분리한 Methyobacterium sp. 는 1.217 g/l에환원당생성능을보여상업적인가치가있다고보고된바있다. 본연구에서분리한 Pseudoalteromonas sp. M 1-2-1과 M 6-1의환원당생성능은각각 2.723 g/l와 1.976 g/l로분석되어 (Fig. 2) 이들의산업적활용가능성도높을것으로기대되었다. 알긴산은매년산업적으로 3만여톤이생산되는데염료고정제, 제제첨가제, 응집제등일반상용화제품의판매가격은 50 20 달러 /kg이지만면역촉진제나세포고정화용등의의약품용고순도알긴산의 Korean Journal of Microbiology, Vol. 51, No. 4
372 Yoon and Kim 경우는 40,000 달러 /kg이되는고부가가치를지니고있다 (Kim et al., 2011). 또한화학연료의고갈과환경오염문제에따른친환경바이오연료의공급이시급해짐에따라바이오에너지생산을위한새로운생물량으로서해조류유래다당류의이용에도관심이집중되고있다 (John et al., 2011; Lee et al., 2011). 향후해조다당류를보다효율적으로가수분해할수있도록 Pseudoalteromonas sp. M1-2-1이나 M6-1 균주가분비하는알긴산분해효소생산조건을최적화시키거나, 이들의알긴산분해효소 ( 들 ) 의유전자분리를통해해당효소를대량생산할수있다면해조다당류를이용한화장품, 의학및바이오에너지개발산업에이들을유용하게활용할수있을것으로사료된다. 적요 알긴산의응용을위하여인천지역에서수집한다양한패류와해수로부터알긴산분해효소활성이우수한 103개의균주를분리하고그중 M1-2-1, M6-1, C8-15 등분해능이가장우수한 3균주를선발하여그특성을분석하였다. 이들은모두그람음성간균이었고, 운동성이있는호염성세균이었다. 또한생리 생화학적특성분석과 16S rrna 유전자의염기서열분석으로 M1-2-1과 M6-1은 Pseudoalteromonas 속, C8-15은 Vibrio 속에속하는세균으로동정되었다. 이들의알긴산분해효소활성은알긴산이유일한탄소원인 APY 배지에접종하여 25 C에서 6 8시간배양했을때최대로나타났고, NaCl을가했을때생장및효소활성모두증진되었다. 이분리균주들의알긴산분해조효소들은 45 C와 ph 7.0 8.0에서가장높은활성을나타냈으며, Pseudoalteromonas sp. M1-2-1과 M6-1 균주는각각 2.7232 g/l와 1.976 g/l의환원당생성능을보여, 산업적으로활용가능성이높은것으로사료되었다. 감사의말 본연구는인천대학교 2013년도자체연구비지원을받아수행되었으며이에감사드립니다. References Baxter, R.M. 1959. An interpretation of the effect of salts on the lactic dehydrogenase of Halobacterium salinarium. Can. J. Microbiol. 5, 47 57. Choi, D., Piao, Y.L., Shin, W.S., and Cho, H. 2009. Production of oligosaccharide from alginate using Pseudomonas agarovorans. Appl. Biochem. Biotechnol. 159, 438 452. Cote, G.L. and Krull, L.H. 1988. Characterization of the extracellular polysaccharide from Azotobacter chroococcum. Carbohydr. Res. 181, 143 152. Fisher, F.G. and Dorfel, H. 1955. The polyuronic acids of brown algae. Part Ⅰ. Z. Physiol. Chem. 302, 186 203. Gacesa, P. 1988. Alginates. Carbohydr. Polym. 8, 161 182. Gacesa, P. and Wusteman, F.S. 1990. Plate assay for simultaneous detection of alginate lyase and determination of substrate specificity. Appl. Environ. Microbiol. 56, 2265 2267. Gűven, K.C., Őzsoy, Y., and Ulutin, O.N. 1991. Anticoagulant, fibrinolytic and antiaggregant activity of carrageenans and alginic acid. Botan. Marin. 34, 429 435. Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneaht, P.H.A., Staley, J.T., and Williams, S.T. 1994. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9th, Williams Wilkins, USA. John, R.P., Anisha, G.S., Nampoothiri, K.M., and Pandey, A. 2011. Micro and macroalgal biomass: a renewable source for bioethanol. Bioresour. Technol. 102, 186 193. Joo, D.S., Cho, S.Y., and Lee, E.H. 1993. Isolation of alginatedegrading bacteria and production of alginate degrading activities by the bacteria. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 21, 207 213. Joo, D.S., Lee, J.S., Park, J.J., Cho, S.Y., Ahn, C.B., and Lee, E.H. 1995. Purification and characterization of the intracellular alginase from Vibrio sp. AL-145. Korean J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 23, 432 438. Joo, D.S., Lee, J.S., Park, J.J., Cho, S.Y., Kim, H.K., and Lee, E.H. 1996. Preparation of oligosaccharides from alginic acid enzymatic hydrolysis. Korean J. Food Sci. Technol. 28, 146 151. Jung, J.Y., Hur, S.S., and Choi, Y.H. 1999. Studies on the efficient extraction process of alginic acid in sea tangle. Food Eng. Prog. 3, 90 97. Kim, O.S., Cho, Y.J., Lee, K., Yoon, S.H., Kim, M., Na, H., Park, S.C., Jeon, Y.S., Lee, J.H., Yi, H., Won, S., and Chun, J. 2012. Introducing EzTaxon-e: a prokaryotic 16S rrna gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62, 716 721. Kim, B.J., Ha, S.D., Lim, D.J., Song, C., and Kong, J.Y. 1998. Production of agarase from marine bacterium Bacillus cereus ASK202. Korean J. Biotechnol. Bioeng. 13, 524 529. Kim, J., Kim, Y., Kim, S., Kim, B., and Nam, S. 2011. Properties and industrial applications of seaweed polysaccharides-degrading enzymes from the marine microorganisms. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 39, 189 199. Kim, H.K., Lee, J.C., Kang, N.H., Kim, S.H., Kim, J.G., and Chung, K.C. 2007. Purification and characterization of the extracellular alginate lyase from Streptomyces sp. MET 0515. J. Life Sci. 17, 미생물학회지제 51 권제 4 호
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