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최종보고서 은나노물질의설치류에대한만성독성연구 2011. 11 국립환경과학원

최종보고서 은나노물질의설치류에대한만성독성연구 2011. 11 연구기관 : 동덕여자대학교산학협력단 국립환경과학원

제출문 국립환경과학원장귀하 본보고서를 은나노물질의설치류에대한만성독성연구 과제의 최종보고서로제출합니다. 2011 년 11 월 연구기관 : 동덕여자대학교산학협력단 - 2 -

참여연구진 총괄책임연구자박광식동덕여자대학교 연구원 이무열 동국대학교 이병환 계명대학교 서영록 동국대학교 배희경 ( 주 )TO21 김미경 ( 주 )TO21 연구보조원 이연진 동덕여자대학교 김 화 동국대학교 류영추 동국대학교 권지영 동국대학교 김혜림 동국대학교 이상민 동국대학교 박준수 서울대학교 신소향 광운대학교 이상돈 계명대학교 김지연 ( 주 )TO21 이진주 ( 주 )TO21 보조원 조혜은 동덕여자대학교 최신영 동덕여자대학교 GLP 시험기관 한국화학융합시험연구원 ( 주 ) 켐온 ( 주 ) 바이오톡스텍 협력기관 광운대학교 서울대학교 - 3 -

- 목차 - 요약문 I 연구사업의개요 1 II 연구사업의범위및세부과제내용 1 III 연구방법 3 1. 독성시험계에서의나노물질안정성확인 3 2. 급성경피독성시험 16 3. 피부자극성시험 19 4. 피부과민성시험 23 5. 유전독성시험 27 6. 독성동태시험 41 7. 반복투여및생식발생병합시험 49 8. 독성유전체시험 59 9. 시험자료및검체관리 65 10. OECD 나노물질안전성사업보고서작성 66 IV 연구결과 72 1. 독성시험계에서의나노물질안정성확인 72 2. 급성경피독성시험 117 3. 피부자극성시험 124 4. 피부과민성시험 129 5. 유전독성시험 145 6. 독성동태시험 166 7. 반복투여및생식발생병합시험 187 8. 독성유전체시험 220

9. 시험자료및검체관리 259 10. OECD 나노물질안전성사업보고서작성 260 V 결론 261 VI 기대성과및활용방안 263 VII 부록목록 264 VIII OECD 나노물질안전성보고서 265-5 -

< 요약문 > - 6 -

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μ - 5 -

1 drh ( q, t) é sin(2 rq) ù æ 1 ö = 1 1 kn r ( q,0) d ê + ç - 2rq ú ë û è a ø h t t 0 0 α ( ) q 4p æ q ö = sin l ç è 2 ø λ θ - 6 -

μ - 7 -

μ - 8 -

μ - 9 -

1 + - - ph ph - - -[ ] + [ - -10 + 10 14 a Cb H OH a Cb Q = ( C a 1 ]) = ( C a ) - 10 -

그림 3-1-2 시스템의 ph 에따른 Q 값의변화 μ - 11 -

Σ - 12 -

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à 1 2 + + Ag ( s) + O + 2H 2( ) ( aq) Û 2Ag aq ( aq) + H 2 O ( l) - 15 -

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샘타코 BIO KOREA] - 20 -

시험군번호마리투여량 초기시험 확인시험 - 21 -

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시험군번호마리감작유도단계감작유발단계 시험물질투여군 시험물질 시험물질 음성대조군 멸균증류수 시험물질 양성대조군 - 24 -

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μ μ μ μ μ - 27 -

μ μ μ μ μ μ μ μ μ μ μ μ - 28 -

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μ μ μ - 31 -

μ - 32 -

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μ - 34 -

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μ μ - 36 -

μ μ μ μ - 37 -

μ - 38 -

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종및계통 특정병원체부재 (SPF) 토끼, New Zealand White 계 생산자및공급원 샘타코 BIO KOREA ( 경기도오산시서랑동 77-1) 본시험에사용될토끼는약물동태등의시험에많이사용 선정사유 되고있으며풍부한시험기초자료가축적되어 있어서시 험결과의해석에이를이용할수있다. 성별 수컷 동물수 입수시 31 투여개시시 28 체중범위 입수시 투여개시시 1.9 kg 이상 2 ~ 3 kg 잔여동물의처리 켐온의 SOP 에따라안락사처리하였다 - 41 -

군 성별 동물수 ( 마리 ) 동물번호 투여액량 (ml/kg) 투여량 (mg/kg) G1 a) M 4 1-4 2 0 G2 b) M 12 5-16 2 5 G3 c) M 12 17-28 2 0.5-42 -

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적혈구 (RBC) 혈소판수 (PLT) 헤마토크리트치 (HCT) 백혈구 (WBC) 혈색소량 (HGB) 호중구 (NEU) 평균적혈구용적 (MCV) 림프구 (LYM) 평균적혈구헤모글로빈량 (MCH) 단핵구 (MONO) 평균적혈구헤모글로빈농도 (MCHC) 호산구 (EOS) 적혈구분포폭 (RDW) 호염기구 (BASO) 헤모글로빈분포폭 (HDW) 대형비염색성세포 (LUC) 평균혈소판용적 (MPV) 아스파테이트아미노기알라닌아미노기알부민 (ALB) 전이효소 (AST) 전이효소 (ALT) 알부민 / 글로불린비 (A/G) 알칼라인포스파타제 (ALP) 혈액요소질소 (BUN) 크레아틴인산활성효소 (CPK) 크레아티닌 (CRE) 총빌리루빈 (TBIL) 무기인 (IP) 당 (GLU) 칼슘 (Ca 2+ ) 총콜레스테롤 (TCHO) 나트륨 (Na + ) 중성지방 (TG) 칼륨 (K) 총단백 (TP) 염소 (Cl - ) - 44 -

당 (GLU) ph 빌리루빈 (BIL) 요단백 (PRO) 케톤체 (KET) 유로빌리노겐 (URO) 백혈구 (WBC) 잠혈 (OB) 아질산염 (NIT) 요비중 (SG) 요색조 (urine color) 투명도 (clarity) - 45 -

μ μ - 46 -

표 은나노독성동태실험을위한샘플링현황요약 - 47 -

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α α - 57 -

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1) 나노물질분석법 표 4-1-1 PChem 에대한국제표준시험법 물리화학적특성 표준분석법 후보분석법 1 Agglomeration/aggregation state( 응집 / 집적 ) - ELS, DLS 2 Crystalline phase/crystallite size( 결정상, 결정크기 ) - TEM, XRD 3 Representative TEM(TEM사진 ) - HR-TEM 4 Size/size distribution( 크기, 분포도 ) TG100 ELS, DLS, TEM 5 Zeta potential/surface charge( 제타전위, 표면전하 ) - ELS 6 Surface chemistry( 계면화학 ) - UV, FT-IR 7 Photocatalytic activity( 광촉매활성 ) 광활성 TG316 수제작 8 Dispersion stability in water( 물분산성 ) TG112 ELS, MLS 9 Abiotic degradability/hydrolysis( 비생물학적분해 ) TG111 ICP, ISE 10 Octanol-water partition coefficient( 물 / 옥탄올분배계수 ) TG107, 123 ICP 11 Redox potential( 산화환원전위 ) - ORP 미터, CV 12 Radical formation potential( 라디칼형성가능성 ) - 현광분석기 - 72 -

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그림 4-1-1 AgNP 의나노독성기작 [ 출처 : J. Nanopart. Res., 12, 1531 (2010)] 표 4-1-2 은나노입자의독성기작에따른특성 PChem 독성기작독성경향관련 PChem 액상내용출된은이온이자유롭게용액내부유할수 기 작 1 Ag + 의흡착으로 인해 ATP 생산과 DNA 복제를억제 있는상태로존재하다가 ATP 생산과 DNA 복제를방해하는현상으로화학독성을유발할수있다. 세포내부로직접 AgNP가들어가서변화된 ph 조건에의해 Ag + 를용출하는트로이목마기법이적용되기도한다. 광활성 물분산성 가수분해 기작 2 AgNP과 Ag + 에의한 ROS 생성 활성산소종을발생하는것으로세포내, 세포밖에서유발되며, 간접적인독성유발기작이라할수있다. 이는화학적인독성에해당된다. 산화환원전위라디칼형성 기작 3 세포막에대한 AgNP의직접적인손상 AgNP의직접적인세포막공격으로, 돌멩이로세포막을치는것과같이물리적인독성을유발한다. 나노입자의표면전하변형으로인해세포막에흡착되어유기물 / 영양물의입출입을억제하게되면세포가괴사하게되는현상을보인다. 표면전하와나노입자의세포막과의친화력을살펴야한다. 응집크기제타전위표면화학옥탄올 / 물분배계수 - 75 -

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그림 4-1-2 생산된기본물성자료의제공 - 77 -

그림 4-1-3 무료프로그램인 ImageJ 를이용한 TEM 자료기반입도분포도계산법 - 78 -

그림 4-1-4 TEM 이미지와 ImageJ 로해석한입도분포도 그림 4-1-5 XRD 의특성피크 ( 좌 ) 와 DLS 를이용한입도분포해석 표 4-1-3 다양한분석법으로측정한 AgNPs 평균입자크기 분석법 평균크기 물리적의미 제공정보 20.0 nm 생산시점의크기 TEM + ImageJ 20.8 nm Primary particle 크기 DLS 56.8 nm 수동력학적, 집단거동 ( 응집 ) 의 크기 XRD 18.2 nm 최소결정의크기 - 79 -

그림 4-1-6 분산정도에따른 3 가지 HDD 의차이 그림 4-1-7 수, 부피, 세기기준 DLS 분포도의차이 - 80 -

그림 4-1-8 TEM 분석시분석자의의지가반영될수있는문제 - 81 -

그림 4-1-9 Citrate-AgNP 의 ph 에따른제타전위 - 82 -

그림 4-1-10 ph 에따른분산안정성 - 83 -

그림 4-1-11 교반에따른 DLS contour plot : 무교반 (A), 교반 (B) - 반면교반의가장극한상태인원심분리기를이용하여강제로침전을시켜보았다. DW에들어있는 AgNP를원심분리시에는응집현상이심하게발생되어서로뭉쳤으며, prism 형태로의입자성장도발견되었다. 반면원심분리없이단순히시료를채취하여분석하면 20~60 nm의입자가발견되었다. 입자의모양은균일하지는않았지만, 구형에가까운형태를보인다. 따라서단순교반은허락되지만입자의응집을초래할수있는원심분리의작업은허용되지않는것으로보인다. 그림 4-1-12 원심분리기이용시응집 ( 좌 ) 현상과 AgNP 원액의 TEM 이미지 - 84 -

그림 4-1-13 5 일간냉장보관시 AgNP/Ag + 의비율변화 - 85 -

그림 4-1-14 5 일간상온노출시 UV 특성피크의감소현상과입도분포의불규칙성증가 - 5일간상온보관시, 육안으로는침전여부를뚜렷이확인하기는어렵다. 그러나 UV를이 그림 4-1-15 DW 에분산시킨농도별용액의색상변화 - 86 -

그림 4-1-16 10 ppm 에서의 ph 에따른변화 그림 4-1-17 10 ppm 에서의 ph 에따른변화에대한 3 가지평균분포도 - 87 -

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그림 4-1-18 100 ppm 에서의 ph 에따른변화와 3 가지평균분포도 - 89 -

그림 4-1-19 1000 ppm 에서의 ph 에따른변화와 3 가지평균분포도 - 90 -

그림 4-1-20 ph 에따른 TEM 사진 그림 4-1-21 DW 에분산시킨 100( 좌 ), 1000 ppm 에대한실시간 DLS - 91 -

그림 4-1-22 ph 4( 좌 ), 9 에분산시킨 1000 ppm 에대한실시간 DLS - 92 -

그림 4-1-23 10( 좌상 ), 100( 우상 ), 1000 ppm 에서의제타와입자크기상관성 - 93 -

그림 4-1-24 ph 변화에따른제타전위의의존도 (5) 용액의장단기안정성 가. 단기안정성 (24시간 ) - 입자의단시간안정성이아닌하루동안의안정성을평가하였다. 농도는최대농도인 25000 ppm과 2500, 1000 ppm을선택하였고 1000 ppm에대해서는제타전위를측정하였다. 하루동안시료를저온 (4 o C), 상온 (22 o C), 체온 (37 o C) 에방치시켜놓고 3시간단위로분석하였다. - 농도에무관하게하루동안의입자크기변화폭은크기않았으며, 대체로 40~50 nm의크기를유지하였다. 저온보관이라고해서입자크기변화가더적은것은아니였으며, 상온이나체온조건에서도모두유사한크기를보였다. 개별입자크기는 TEM상 20 nm 이지만, 용액내거동에서는 40~50 nm로입자가쌍을이룬정도의크기로거동하는것으로파악된다. 즉농도와온도에따른입자크기변화는뚜렷이나타나지않았다. - 1000 ppm에서제타전위를함께찍었을때, 체온조건의제타전위변화폭이다른온도보다크게나타났다. 제타전위값은용액내에서끊임없이변하게되며, 온도가높으면입자의 thermal motion 과이온교환이활발해져서이러한현상이나타났다고본다. 제타전위와입자크기의의존도를 plot해보면, 제타전위는 -40~-60 mv 범위에서넓게변하지만모두안정된콜로이드존재범위이므로입자크기변화를없어야하며, 실제 DLS로도확인되었다. - 단기 (24시간 ) 안정성평가결과, 제타전위는콜로이드안정범위내에서변하지만입자크기변화는별로없으며온도에영향도크지않았다. - 94 -

그림 4-1-25 25000, 2500 ppm 에서의단기안정성과 3 가지평균분포도 - 95 -

그림 4-1-26 1000 ppm 에서의단기안정성, 제타전위변화와 3 가지평균분포도 - 96 -

그림 4-1-27 1000 ppm 에대한제타전위와입자크기의의존도 - 97 -

그림 4-1-28 25000, 2500, 1000 ppm 에서의이온농도경향 그림 4-1-29 하루가지난후의 TEM 분석결과 - 98 -

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그림 4-1-30 농도에따른장기안정성평가 그림 4-1-31 1000 ppm 에대한제타전위의장기측정 - 100 -

그림 4-1-32 온도에따른제타전위와입자크기의의존성 - 101 -

그림 4-1-33 2500, 1000 ppm 에서의장기간은이온농도평가 그림 4-1-34 온도에따른 TEM 사진 - 102 -

그림 4-1-35 요청된물성자료의제공 μ - 103 -

그림 4-1-36 1000 ppm AgNPs 를 PBS( 좌 ) 와 MEM 배지노출시실시간응집성평가 그림 4-1-37 기본배지내은나노물질의분산안정성 - 104 -

그림 4-1-38 MEM, PBS 배지에서응집경향 그림 4-1-39 PBS( 좌 ) 와 MEM 에서의 TEM 이미지 - 105 -

그림 4-1-40 글루코스용액에서의분산안정성 - 106 -

그림 4-1-41 글루코스배지내농도에따른제타전위와입자크기의의존성 - 10~1000 ppm의제타전위와입자크기의의존성을 plot해보면, 고농도로갈수록제타전위값변화폭이커진다는것을알수있다. 10 ppm에서가장좁은영역을보이고가장작은제타전위를보인데반면, 고농도에서는제타전위변화폭이크지만높은전위값을나타내서입자의안정성이확보되는것으로판단된다. - TEM 결과를살펴보면입자들이개별로있기보다는서로연결된상태를보이고있다. 그렇지만 24시간이지나더라도입자의비가역응집인 aggregation 은나타나지않은것으로보인다. 즉이는교반이나초음파분산으로쉽게개별입자로돌아갈수있는것으로글루코스와글리세롤모두분산특성이좋은것으로파악되었다. < 그림 4-1-42 글루코스배지내 AgNPs 의 TEM : 초기 ( 좌 ), 24 시간후 ( 우 )> - 107 -

그림 4-1-43 글리세롤함유배지내 AgNPs 의 TEM : 초기 ( 좌 ), 24 시간후 ( 우 ) 그림 4-1-44 글루코스 ( 좌 ) 와글리세롤이포함된혈청내 AgNPs 분산 - 108 -

그림 4-1-45 인공위액에노출시켰을때침전여부확인 μ 그림 4-1-46 인공장액에서의 AgNP 분포에관한 contour plot - 109 -

μ μ μ 그림 4-1-47 여러생체배지내은이온의용출정도해석 - 110 -

그림 4-1-48 평준화시킨은이온용출농도 μ μ - 111 -

그림 4-1-49 인공장액내노출된 AgNPs 의크기와제타전위변화 - 112 -

그림 4-1-50 인공장액내제타전위에대한입자크기의의존도 그림 4-1-51 Top agar 배지내 AgNPs 의침전현상 - 113 -

입자크기 (nm) 기평균세피평균부 그림 4-1-52 최소배지내 AgNPs 분산성 : 상온 ( 우 ) 에서응고 1400 1200 수평균 1000 800 600 400 200 0 10 100 1000 AgNPs 농도 (mg/l) 그림 4-1-53 최소배지내 AgNPs 농도별입자크기및제타전위 - 114 -

μ 그림 4-1-54 균주별, 투입한 AgNPs 농도별입자크기 - 115 -

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표 4-2-1 시험동물용량별사망률 Group Dose (mg/kg B.W.) Male Mortality (dead / total) Female G1 0 0% 0% (0 / 5) a (0 / 5) G2 62.5 G3 125 G4 250 0% (0 / 5) 0% (0 / 5) 0% (0 / 5) 0% (0 / 5) 0% (0 / 5) 0% (0 / 5) a : No. of dead animals / No. of tested animals 표 4-2-2 시험동물의특이적임상증상 Group Dose (mg/kg B.W.) Sex Number of animal Clinical signs G1 0 G2 62.5 G3 125 G4 250 Male 5 5 NAD Female 5 5 NAD Male 5 5 NAD Female 5 5 NAD Male 5 5 NAD Female 5 5 NAD Male 5 5 NAD Female 5 5 NAD NAD: No abnormalities detected - 118 -

표 4-2-3. 시험동물군의체중변화 Group Dose (mg/kg B.W.) G1 0 G2 62.5 G3 125 G4 250 Sex Male Female Male Female Male Female Male Female N:Number of animals, S.D. : Standard deviation Days after administratsion Unit : g 0 7 14 Mean 248.3 313.5 358.3 S.D. 3.7 21.5 15.2 N 5 5 5 Mean 181.6 205.1 224.7 S.D. 6.0 8.9 7.3 N 5 5 5 Mean 247.5 299.5 347.2 S.D. 6.9 12.6 16.6 N 5 5 5 Mean 180.4 211.9 237.7 S.D. 6.6 14.4 17.3 N 5 5 5 Mean 247.6 300.3 352.6 S.D. 5.3 10.6 11.4 N 5 5 5 Mean 180.1 214.4 235.2 S.D. 8.2 13.0 16.7 N 5 5 5 Mean 252.3 305.3 350.6 S.D. 5.4 7.6 12.9 N 5 5 5 Mean 182.0 212.9 236.5 S.D. 8.6 15.7 20.9 N 5 5 5 표 4-2-4 시험동물부검결과 Findings Number of examined Group (mg/kg B.W.) G1 (0) G2 (62.5) G3 (125) G4 (250) M F M F M F M F 5 5 5 5 5 5 5 5 NAD 5 5 5 5 5 5 5 5 NAD: No abnormalities detected, M : Male, F : Female - 119 -

동물입수시 사진1 동물입수시 사진1 동물 순화 및 일반증상 관찰시 사육케이지 시험물질 시험물질 도포 전 준비 동물 제모 그림 4-2-1 급성경피독성시험 과정 1-120 -

시험물질 분취 시험물질 거즈 적용 시험물질 투여 1 시험물질 투여 2 시험물질 투여 3 시험물질 투여 4 그림 4-2-2 급성경피독성시험 시험물질 투여 - 121 -

일반증상관찰 (1101-1day) 일반증상관찰 (1401-1day) 일반증상관찰 (1101-7day) 일반증상관찰 (1401-7day) 일반증상관찰 (1101-14day) 일반증상관찰 (1401-14day) 그림 4-2-3 급성경피독성시험의일반증상관찰 (a) - 122 -

일반증상관찰 (2101-1day) 일반증상관찰 (2401-1day) 일반증상관찰 (2101-14day) 일반증상관찰 (2401-7day) 부검시육안소견관찰 일반증상관찰 (2401-14day) 그림 4-2-3 급성경피독성시험의일반증상관찰 (b) - 123 -

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표 4-3-1 시험동물의사망률과특이적임상증상 Animal No. Days after application 0 1 2 3 Mortality 1 - - - - 2 - - - - 0/3 a - : Normal 3 - - - - a : Number of dead animals/number of total animals 표 4-3-2 시험동물의체중변화 Sex Animal number Hours after application (g) 0 72 Weight gains (g) 1 2673.4 2866.1 192.7 Female 2 2201.4 2389.2 187.8 3 2251.1 2272.5 21.4 표 4-3-3 피부자극성평가결과 Chance Erythema & Eschar Edema Animal No. Phases 1 1 24 48 72 1 24 48 72 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 1 : Time after topical application - 125 -

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동물입수 체중측정 군분리 투여부위설정 투여 투여완료 - 128 -

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NAD : No Abnormalities Detected 1) : In all animals, coloring of skin (black color) was observed on the day of induction, challenge treatment and continued for 1 ~ 6 days after treatment. 2) : In all animals, coloring of skin (black color) was observed on the day of challenge treatment and continued for 2 days after treatment. - 130 -

Unit : g G1 ( 시험물질군 ) G2 ( 음성대조군 ) G3 ( 양성대조군 ) Mean 352.69 395.71 437.63 478.43 522.76 S.D 12.28 15.96 21.34 27.01 35.02 N 20 20 20 20 20 Mean 348.97 383.35 420.36 462.03 509.21 S.D 19.87 20.93 20.17 24.73 24.99 N 10 10 10 10 10 Mean 348.26 393.58 434.53 469.18 520.09 S.D 14.05 20.07 31.63 29.21 35.08 N 10 10 10 10 10 a : 1 st induction, b : Body weight at the time of allocation N : No. of Animal G1 ( 시험물질군 ) G2 ( 음성대조군 ) G3 ( 양성대조군 ) 20 10 10 24 20 0 0 0 0.0 0.0 48 20 0 0 0 0.0 0.0 24 10 0 0 0 0.0 0.0 48 10 0 0 0 0.0 0.0 24 0 3 2 5 2.2 100 48 0 4 3 3 1.9 100-131 -

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Score 3 Score 3 Score 3 Score 1 Socore 3 Score 2 Score 1 Score 1 Score 2 Score 3-136 -

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- 140 -

(Score "3") (Score 3") (Score "2") (Score "1") (Score "3") (Score "2") (Score "1") (Score "1") - 141 -

(Score "1") (Score "2") - 142 -

- 143 -

- 144 -

μ μ - 145 -

- 146 -

Tester Strain TA98 TA100 TA1535 TA1537 WP2uvrA Chemical Treated Test Solution Test Solution Test Solution Test Solution Test Solution Dose (μ g/plate) Colonies/plate (Mean±S.D.) [Factor] a) Without S9 mix With S9 mix 0 22 ± 6 41 ± 2 0.625 27 ± 3 [ 1.3 ] 44 ± 9 [ 1.1 ] 1.25 28 ± 2 [ 1.3 ] 47 ± 8 [ 1.1 ] 2.5 24 ± 4 [ 1.1 ] 39 ± 8 [ 1.0 ] 5 25 ± 7 [ 1.2 ] 41 ± 5 [ 1.0 ] 10 31 ± 3 [ 1.4 ] 43 ± 3 [ 1.1 ] 0 110 ± 9 84 ± 9 0.625 108 ± 4 [ 1.0 ] 91 ± 6 [ 1.1 ] 1.25 107 ± 4 [ 1.0 ] 95 ± 3 [ 1.1 ] 2.5 113 ± 9 [ 1.0 ] 107 ± 5 [ 1.3 ] 5 112 ± 7 [ 1.0 ] 109 ± 15 [ 1.3 ] 10 106 ± 6 [ 1.0 ] 109 ± 10 [ 1.3 ] 0 12 ± 4 11 ± 5 0.625 9 ± 4 [ 0.8 ] 12 ± 3 [ 1.1 ] 1.25 16 ± 4 [ 1.4 ] 10 ± 0 [ 0.9 ] 2.5 13 ± 3 [ 1.1 ] 17 ± 3 [ 1.5 ] 5 16 ± 3 [ 1.4 ] 16 ± 5 [ 1.4 ] 10 16 ± 3 [ 1.4 ] 17 ± 3 [ 1.5 ] 0 7 ± 1 22 ± 5 0.625 8 ± 1 [ 1.1 ] 18 ± 4 [ 0.8 ] 1.25 10 ± 5 [ 1.4 ] 20 ± 7 [ 0.9 ] 2.5 8 ± 4 [ 1.1 ] 24 ± 6 [ 1.1 ] 5 10 ± 2 [ 1.3 ] 17 ± 1 [ 0.8 ] 10 10 ± 1 [ 1.3 ] 21 ± 3 [ 1.0 ] 0 47 ± 2 59 ± 6 0.625 33 ± 3 [ 0.7 ] 55 ± 8 [ 0.9 ] 1.25 38 ± 5 [ 0.8 ] 59 ± 5 [ 1.0 ] 2.5 44 ± 7 [ 0.9 ] 65 ± 7 [ 1.1 ] 5 55 ± 5 [ 1.2 ] 64 ± 8 [ 1.1 ] 10 46 ± 5 [ 1.0 ] 65 ± 5 [ 1.1 ] Positive controls TA98 AF-2 0.1 352 ± 16 [ 16.2 ] TA100 AF-2 0.01 411 ± 12 [ 3.7 ] TA1535 NaN 3 0.5 400 ± 12 [ 34.3 ] TA1537 9-AA 80.0 731 ± 29 [ 99.7 ] WP2uvrA AF-2 0.01 340 ± 16 [ 7.3 ] TA98 2-AA 0.5 359 ± 14 [ 8.8 ] TA100 2-AA 1.0 526 ± 32 [ 6.2 ] TA1535 2-AA 2.0 152 ± 11 [ 13.4 ] TA1537 2-AA 2.0 268 ± 6 [ 12.4 ] WP2uvrA 2-AA 10.0 315 ± 16 [ 5.4 ] - 147 -

Tester Strain TA98 TA100 TA1535 TA1537 WP2uvrA Chemical Treated Test Solution Test Solution Test Solution Test Solution Test Solution Dose (μ g/plate) Colonies/plate (Mean±S.D.) [Factor] a) Without S9 mix With S9 mix 0 30 ± 2 42 ± 1 0.625 29 ± 8 [ 1.0 ] 40 ± 10 [ 0.9 ] 1.25 24 ± 1 [ 0.8 ] 43 ± 8 [ 1.0 ] 2.5 24 ± 5 [ 0.8 ] 41 ± 3 [ 1.0 ] 5 28 ± 6 [ 0.9 ] 36 ± 11 [ 0.9 ] 10 26 ± 3 [ 0.9 ] 38 ± 8 [ 0.9 ] 0 102 ± 12 88 ± 2 0.625 84 ± 13 [ 0.8 ] 97 ± 8 [ 1.1 ] 1.25 80 ± 9 [ 0.8 ] 118 ± 7 [ 1.3 ] 2.5 95 ± 7 [ 0.9 ] 126 ± 7 [ 1.4 ] 5 94 ± 6 [ 0.9 ] 110 ± 5 [ 1.3 ] 10 79 ± 11 [ 0.8 ] 118 ± 17 [ 1.3 ] 0 11 ± 2 8 ± 3 0.625 13 ± 3 [ 1.2 ] 9 ± 3 [ 1.1 ] 1.25 9 ± 4 [ 0.9 ] 9 ± 1 [ 1.1 ] 2.5 13 ± 5 [ 1.2 ] 9 ± 4 [ 1.1 ] 5 13 ± 4 [ 1.2 ] 6 ± 1 [ 0.8 ] 10 15 ± 3 [ 1.4 ] 7 ± 1 [ 0.8 ] 0 6 ± 1 15 ± 3 0.625 5 ± 1 [ 0.9 ] 20 ± 4 [ 1.3 ] 1.25 7 ± 1 [ 1.1 ] 14 ± 5 [ 0.9 ] 2.5 7 ± 2 [ 1.1 ] 13 ± 4 [ 0.8 ] 5 6 ± 0 [ 1.0 ] 13 ± 4 [ 0.8 ] 10 7 ± 1 [ 1.1 ] 14 ± 5 [ 0.9 ] 0 37 ± 1 41 ± 2 0.625 43 ± 6 [ 1.2 ] 50 ± 2 [ 1.2 ] 1.25 45 ± 4 [ 1.2 ] 58 ± 6 [ 1.4 ] 2.5 43 ± 4 [ 1.2 ] 47 ± 4 [ 1.1 ] 5 44 ± 8 [ 1.2 ] 59 ± 4 [ 1.4 ] 10 53 ± 1 [ 1.4 ] 56 ± 5 [ 1.4 ] Positive controls TA98 AF-2 0.1 281 ± 17 [ 9.5 ] TA100 AF-2 0.01 509 ± 10 [ 5.0 ] TA1535 NaN 3 0.5 303 ± 9 [ 28.4 ] TA1537 9-AA 80.0 668 ± 23 [ 111.3 ] WP2uvrA AF-2 0.01 316 ± 5 [ 8.6 ] TA98 2-AA 0.5 292 ± 6 [ 6.9 ] TA100 2-AA 1.0 522 ± 23 [ 5.9 ] TA1535 2-AA 2.0 202 ± 5 [ 24.2 ] TA1537 2-AA 2.0 272 ± 10 [ 17.8 ] WP2uvrA 2-AA 10.0 303 ± 12 [ 7.3 ] - 148 -

표 복귀돌연변이시험결과요약 확정시험 Tester Strain TA98 TA100 TA1535 TA1537 WP2uvrA Chemical Treated Test Solution Test Solution Test Solution Test Solution Test Solution Dose (μ g/plate) Colonies/plate (Mean±S.D.) [Factor] a) Without S9 mix With S9 mix 0 17 ± 6 17 ± 3 312.5 18 ± 1 [ 1.0 ] 23 ± 3 [ 1.3 ] 625 17 ± 5 [ 1.0 ] 25 ± 3 [ 1.5 ] 1250 18 ± 3 [ 1.0 ] 19 ± 3 [ 1.1 ] 2500 17 ± 5 [ 1.0 ] 18 ± 4 [ 1.0 ] 5000 21 ± 3 [ 1.2 ] 19 ± 3 [ 1.1 ] 0 69 ± 10 84 ± 5 312.5 75 ± 12 [ 1.1 ] 84 ± 9 [ 1.0 ] 625 81 ± 10 [ 1.2 ] 111 ± 7 [ 1.3 ] 1250 71 ± 5 [ 1.0 ] 100 ± 17 [ 1.2 ] 2500 82 ± 7 [ 1.2 ] 96 ± 8 [ 1.1 ] 5000 95 ± 12 [ 1.4 ] 110 ± 8 [ 1.3 ] 0 13 ± 4 17 ± 3 312.5 13 ± 6 [ 1.0 ] 13 ± 4 [ 0.8 ] 625 16 ± 3 [ 1.3 ] 17 ± 3 [ 1.0 ] 1250 16 ± 4 [ 1.2 ] 17 ± 4 [ 1.0 ] 2500 10 ± 1 [ 0.8 ] 17 ± 3 [ 1.0 ] 5000 17 ± 5 [ 1.3 ] 15 ± 2 [ 0.8 ] 0 9 ± 2 6 ± 3 312.5 6 ± 2 [ 0.7 ] 8 ± 3 [ 1.3 ] 625 8 ± 3 [ 0.9 ] 5 ± 1 [ 0.9 ] 1250 7 ± 1 [ 0.8 ] 7 ± 3 [ 1.2 ] 2500 7 ± 2 [ 0.8 ] 9 ± 2 [ 1.6 ] 5000 8 ± 3 [ 0.9 ] 7 ± 1 [ 1.2 ] 0 50 ± 11 61 ± 2 312.5 63 ± 2 [ 1.3 ] 61 ± 8 [ 1.0 ] 625 64 ± 4 [ 1.3 ] 60 ± 9 [ 1.0 ] 1250 55 ± 11 [ 1.1 ] 60 ± 6 [ 1.0 ] 2500 61 ± 7 [ 1.2 ] 62 ± 6 [ 1.0 ] 5000 53 ± 5 [ 1.1 ] 58 ± 7 [ 1.0 ] Positive controls TA98 AF-2 0.1 286 ± 7 [ 16.8 ] TA100 AF-2 0.01 551 ± 19 [ 8.0 ] TA1535 NaN 3 0.5 318 ± 13 [ 24.5 ] TA1537 9-AA 80.0 726 ± 15 [ 83.8 ] WP2uvrA AF-2 0.01 333 ± 19 [ 6.7 ] TA98 2-AA 0.5 267 ± 15 [ 15.4 ] TA100 2-AA 1.0 515 ± 28 [ 6.1 ] TA1535 2-AA 2.0 203 ± 9 [ 11.7 ] TA1537 2-AA 2.0 281 ± 12 [ 46.8 ] WP2uvrA 2-AA 10.0 303 ± 8.7 [ 5.0 ] - 149 -

- 처리농도의결정 - 150 -

- 151 -

Treatment Negative Control Test item Positive Control (MMC) Treatment Time (h) 100 6 0 100 0-6 Concentration (mg/ L) 2.5 5 10 Observed Cells 200 0 (0.0) 1 (0.5) 2 (1.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 100 100 200 0 (0.0) 1 (0.5) 1 (0.5) 3 (1.5) 0 (0.0) 0 100 100 200 0 (0.0) 1 (0.5) 1 (0.5) 1 (0.5) 0 (0.0) 0 100 100 200 1 (0.5) 0 (0.0) 1 (0.5) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 100 Numbers and percents (%) of cells showing polyploid 6 0.5 100 0-0 0 0 0 0 1 0 0 Judgement - - - Gap g 0 1 1 0 1 0 0 0 13 16 Chromatid type 200 0 (0.0) 29 (14.5) 36 (18.0) 62 (31.0) 0 (0.0) 1 ctb 1 1 0 1 0 1 0 1 19 17 Numbers and percent (%) of cte 0 0 1 2 1 0 0 0 47 0 15 0 Chromosom csb 0 0 0 0 0 0 0 0 *p<0.01, g, gap; ctb, chromatid break; cte, chromatid exchange; csb, chromosome break; cse, chromosome exchange; CPA, cyclophospham ( ), average - 152 -

Treatment Negative Control Test item Positive Control (CPA) Treatment Time (h) 6 Concentration (mg/ L) 6 0 Observed Cells 100 100 200 0 (0.0) 1 (0.5) 1 (0.5) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 100 2.5 100 0-0 200 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (0.5) 1 (0.5) 0 (0.0) 0 100 5 100 0-0 1 200 0 (0.0) 1 (0.5) 1 (0.5) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 100 10 100 0-1 200 0 (0.0) 1 (0.5) 1 (0.5) 1 (0.5) 0 (0.0) 1 100 Numbers and percents (%) of cells showing polyploid 6 10 100 0-14 21 0 0 0 0 0 0 Judgement - Gap g 1 0 0 1 0 15 200 0 (0.0) 29 (14.5) 41 (20.5) 92 (46.0) 0 (0.0) 0 0 1 0 0 1 Numbers and percent (%) of Chromatid type ctb 0 1 20 cte 0 0 1 0 0 0 1 0 49 43 Chromosom csb 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 *p<0.01, g, gap; ctb, chromatid break; cte, chromatid exchange; csb, chromosome break; cse, chromosome exchange; CPA, cyclophospham ( ), average - 153 -

Treatment Negative Control Test item Positive Control (MMC) Treatment Time (h) 100 24 0 100 0-24 Concentration (mg/ L) 2.5 5 10 Observed Cells 200 0 (0.0) 1 (0.5) 1 (0.5) 1 (0.5) 0 (0.0) 0 100 100 200 0 (0.0) 2 (1.0) 2 (1.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 100 100 200 0 (0.0) 1 (0.5) 2 (1.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 100 100 200 0 (0.0) 1 (0.5) 2 (1.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 100 Numbers and percents (%) of cells showing polyploid 24 0.05 100 0-0 0 0 0 0 0 0 Judgement - Gap g 0 1 1 1 1 0-0 - 0 1 10 8 Numbers and percent (%) o Chromatid type Chromosom 200 0 (0.0) 18 (9.0) 24 (12.0) 68 (34.0) 0 (0.0) 0 ctb 1 0 1 1 1 1 1 1 13 11 cte 1 0 0 0 0 0 0 0 32 csb 0 0 0 0 0 0 0 0 0 36 0 *p<0.01, g, gap; ctb, chromatid break; cte, chromatid exchange; csb, chromosome break; cse, chromosome exchange; CPA, cyclophospham ( ), average - 154 -

- 155 -

- 156 -

Sex Chemical Treated Dose (mg/kg B.W.) No. of Animal MNPCE/2000PCE's (Mean±S.D., %) PCE/(PCE+NCE) (Mean±S.D., %) Vehicle 0 5 0.07 ± 0.03 51.42 ± 0.47 Test items 62.5 5 0.10 ± 0.03 51.25 ± 1.38 Male Test items 125 5 0.11 ± 0.02 51.19 ± 1.04 Test items 250 5 0.09 ± 0.04 51.64 ± 0.75 CPA 70 5 4.49 ± 0.47 * 47.59 ± 0.60 * - 157 -

Sex Chemical Treated Dose (mg/kg B.W.) Clinical signs Mortality (dead / total) Vehicle 0 N 0 % (0/5) a Test Item 62.5 N 0 % (0/5) a Male Test Item 125 N 0 % (0/5) a Test Item 250 N 0 % (0/5) a CPA (Positive control) 70 N 0 % (0/5) a N : Normal, a : No. of dead animals/no. of tested animals Vehicle : distilled water, CPA : Cyclophosphamide monohydrate Sex Chemical Treated Dose (mg/ kg) Body weights (mean±s.d. g) at the time of Adiministration (No. of animal) 1st 2nd Sacrifice (No. of animal) Vehicle 0 31.67 ± 1.15 (5) 31.23 ± 1.57 (5) 31.72 ± 1.51 (5) Test item 62.5 31.59 ± 1.05 (5) 31.01 ± 1.06 (5) 31.25 ± 1.02 (5) Male Test item 125 31.65 ± 1.11 (5) 31.55 ± 0.83 (5) 31.14 ± 1.06 (5) Test item 250 31.29 ± 1.18 (5) 30.79 ± 1.19 (5) 30.76 ± 1.19 (5) CPA 70 31.20 ± 1.09 (5) 31.01 ± 1.14 (5) 30.38 ± 0.85 (5) - 158 -

μ μ - 159 -

표 4-5-11. 용량설정시험 ( 상대생존률 ) Test substance Water for injection SARPU 200KW Water for injection SARPU 200KW Water for injection SARPU 200KW Dose (μg/ml) 0.31-0.63-3 1.3 2.5 5.0 10 2.5 S9 mix - Time of exposure (hr) 0-3 - 0.31 + 50 81 96 1.6 0.46 1.16 57 71 96 1.6 0.56 0.84 66 77 96 1.6 0.73 1.01 62 69 96 1.6 0.65 0.79 64 73 96 1.6 0.69 0.89 3 108 60 62 96 1.6 0.61 0.65 3 3 3 3 3 0.63 + 3 1.3 5.0 10 0.31-24 0.63 1.3 2.5 5.0 10 - - 0 + 3 + + + + 3 3 3 3 0-24 - - - - - 24 24 24 24 24 P0 (wells/plate) P2 (wells/plate) Number of wells seeded Number of cells seeded per well PE0 66 74 96 1.6 0.73 0.92 61 73 96 1.6 0.63 0.89 71 79 96 1.6 0.84 1.08 67 86 96 1.6 0.75 1.41 69 59 96 1.6 0.79 0.60 60 67 96 1.6 0.61 0.75 65 66 96 1.6 0.71 0.73 56 62 96 1.6 0.55 0.65 42 62 96 1.6 0.36 0.65 49 76 96 1.6 0.45 0.98 43 73 96 1.6 0.37 0.89 51 62 96 1.6 0.47 0.65 58 76 96 1.6 0.58 0.98 54 74 96 1.6 0.52 0.92 68 77 96 1.6 0.77 1.01 68 69 96 1.6 0.77 0.79 60 63 96 1.6 0.61 0.67 67 67 96 1.6 0.75 0.75 60 79 96 1.6 0.61 1.08 68 73 96 1.6 0.77 0.89 69 76 96 1.6 0.79 0.98 66 73 96 1.6 0.73 0.89 64 81 96 1.6 0.69 1.16 68 74 96 1.6 0.77 0.92 75 73 96 1.6 0.95 0.89 75 73 96 1.6 0.95 0.89 66 72 96 1.6 0.73 0.87 61 65 96 1.6 0.63 0.71 65 59 96 1.6 0.71 0.60 64 58 96 1.6 0.69 0.58 79 69 96 1.6 1.08 0.79 68 65 96 1.6 0.77 0.71 73 63 96 1.6 0.89 0.67 68 64 96 1.6 0.77 0.69 62 74 96 1.6 0.65 0.92 58 69 96 1.6 0.58 0.79 66 73 96 1.6 0.73 0.89 67 66 96 1.6 0.75 0.73 49 70 96 1.6 0.45 0.82 44 75 96 1.6 0.38 0.95 13 40 96 1.6 0.09 0.34 16 34 96 1.6 0.11 0.27 PE2 RS (%) 100 113 133 117 105 67.2 100 159 140 143 157 150 196 100 135 121 89.3 107 60.3 14.9 P0 : The number of wells containing colonies per 96 well plate (0 day) P2 : The number of wells containing colonies per 96 well plate (2 day) PE0 : Plating efficiency (0 day) PE2 : Plating efficiency (2 day) RS : Relative survival PE : -ln(empty well/total well)/(cells plated/well) RS (%) : (PEtest/PEcontrol) 100-160 -

표 4-5-12 Relative Suspension Growth (RSG) and Relative Total Growth (RTG) ( 용량설정시험 ) Test substacne Dose (μg/ml) S9 mix Time of exposure (hr) Number of cells seeded (0 day) ( 10 5 /ml) Cell counts (1 day) ( 10 5 /ml) Number of cells seeded (1 day) ( 10 5 /ml) Cell counts (2 day) ( 10 5 /ml) DCG1 DCG2 RSG RTG (%) Water for injection SARPU 200KW Water for injection SARPU 200KW Water for injection SARPU 200KW 0-3 2.0 6.4 2.0 7.3 3.20 3.65 2.0 7.2 2.0 8.6 3.60 4.30 1.00 100 0.31-3 2.0 6.8 2.0 8.5 3.40 4.25 1.07 86.6 0.63-3 2.0 7.2 2.0 6.8 3.60 3.40 0.91 86.3 1.3-3 2.0 7.8 2.0 7.2 3.90 3.60 1.04 136 2.5-3 2.0 6.8 2.0 9.9 3.40 4.95 1.25 87.9 5.0-3 2.0 4.9 2.0 8.2 2.45 4.10 0.74 53.7 10-3 2.0 1.9 1.9 7.7 0.95 4.05 0.28 24.4 0 + 3 2.0 4.7 2.0 9.0 2.35 4.50 2.0 4.3 2.0 9.2 2.15 4.60 1.00 100 0.31 + 3 2.0 6.6 2.0 9.0 3.30 4.50 1.45 152 0.63 + 3 2.0 6.1 2.0 8.5 3.05 4.25 1.27 104 1.3 + 3 2.0 4.7 2.0 10.4 2.35 5.20 1.19 137 2.5 + 3 2.0 6.7 2.0 8.1 3.35 4.05 1.33 144 5.0 + 3 2.0 7.8 2.0 7.9 3.90 3.95 1.50 182 10 + 3 2.0 5.8 2.0 9.1 2.90 4.55 1.29 134 0-24 2.0 7.6 2.0 8.2 3.80 4.10 2.0 7.3 2.0 9.9 3.65 4.95 1.00 100 0.31-24 2.0 8.6 2.0 8.8 4.30 4.40 1.12 122 0.63-24 2.0 8.4 2.0 8.4 4.20 4.20 1.05 103 1.3-24 2.0 8.8 2.0 7.6 4.40 3.80 0.99 124 2.5-24 2.0 7.4 2.0 7.7 3.70 3.85 0.85 100 5.0-24 2.0 4.3 2.0 8.6 2.15 4.30 0.55 70.5 10-24 0.2 0.1 0.1 0.1 0.50 1.00 0.03 1.32 DCG1: Daily cell growth (1 day), DCG2 : Daily cell growth (2 day) RSG : Relative suspension cell growth, RV : Relative viability RTG : Relative total growth, DCG = cell concentration the next day/prepared cell concentration RSG = [(DCG1 DCG2)test]/ [(DCG1 DCG2)control], RV(%) = (PE2 test sbstance/pe2 negative control) 100 RTG(%)= RSG RV(%) - 161 -

표 4-5-13 본시험결과요약 Test substance Water for injection SARPU 200KW PE2 MF (%) SC (%) 0-3 100 100 0.62 66.6 59.9 0.078-3 147 132 0.94 62.1 36.6 0.16-3 136 113 0.94 79.7 35.9 0.31-3 106 102 0.74 83.3 52.3 0.63-3 81.9 79.2 0.84 103 37.1 1.3-3 49.7 55.2 0.68 120 60.4 2.5-3 52.9 38.4 0.61 122 54.2 5.0-3 100 43.6 0.75 171 49.8 10-3 43.4 0.55 0.33 - - MMS 10-3 228 52.1 0.52 560* 67.4 Water for injection SARPU 200KW 0 + 3 100 100 0.76 121 17.0 0.078 + 3 104 104 1.00 93.4 25.8 0.16 + 3 91.2 71.5 0.74 132 30.2 0.31 + 3 87.6 81.6 0.82 119 24.6 0.63 + 3 113 107 1.00 111 29.2 1.3 + 3 93.8 138 0.97 90.9 17.9 2.5 + 3 116 126 0.95 137 22.7 5.0 + 3 104 86.2 0.57 113 45.5 10 + 3 108 88.9 0.91 114 50.2 CPA 3 + 3 36.1 28.2 0.38 810* 52.7 Water for injection SARPU 200KW 0-24 100 100 0.62 133 15.0 0.037-24 77.3 91.9 1.03 76.2 23.6 0.074-24 94.2 97.4 0.71 107 24.5 0.15-24 71.1 66.3 0.66 88.4 27.2 0.30-24 66.6 71.9 0.81 121 24.6 0.59-24 77.1 89.4 0.78 63.2 26.7 1.2-24 57.8 83.3 0.66 74.8 43.2 2.4-24 69.6 92.1 0.56 111 30.2 4.8-24 55.5 87.1 1.05 102 19.8 9.5-24 25.2 28.3 0.75 101 24.5 MMS 5-24 48.0 37.1 0.37 818* 43.1 MF : Mutation frequency SC : The percent of small colonies mutant frequency to large colony mutant frequency RS : Relative survival RTG : Relative total growth PE2 : Plating efficiency (2 day) MMS: Methyl methanesulfonate CPA: Cyclophosphamide - : No data Dose (μg/ml) S9 mix Time of exposure (%) CYTOTOXICITY RS (%) Signification difference from negaitive control by Dunnett's t-test: * p<0.01 RTG MUTATATION - 162 -

표 4-5-14 상대생존율 ( 본시험결과 ) Test substance Water for injection SARPU 200KW MMS Water for injection SARPU 200KW CPA Water for injection SARPU 200KW MMS Dose (μg/ml) Time of exposure (hr) 0.078-3 0.16 0.31 0.63 S9 mix 0-3 0.078 + 3 P0 : The number of wells containing colonies per 96 well plate (0 day) P2 : The number of wells containing colonies per 96 well plate (2 day) PE0 : Plating efficiency (0 day), PE2 : Plating efficiency (2 day) RS : Relative survival, PE : -ln(empty well/total well)/(cells plated/well) RS (%) : (PEtest/PEcontrol) 100 MMS: Methyl methanesulfonate CPA: Cyclophosphamide 3 3 3 1.3-3 2.5 5.0-3 10 0.31 1.3 10 3 + 3 3 + 3 0.037 0.074 0.15 0.30 5 - - - - + + + 3 3 3 P0 (wells/plate) P2 (wells/plate) Number of wells seeded Number of cells seeded per well PE0 PE2 59 66 96 1.6 0.60 0.73 53 69 96 1.6 0.50 0.79 60 51 96 1.6 0.61 0.47 61 51 96 1.6 0.63 0.47 68 75 96 1.6 0.77 0.95 75 74 96 1.6 0.95 0.92 68 75 96 1.6 0.77 0.95 70 74 96 1.6 0.82 0.92 61 69 96 1.6 0.63 0.79 60 64 96 1.6 0.61 0.69 45 72 96 1.6 0.40 0.87 57 70 96 1.6 0.56 0.82 41 61 96 1.6 0.35 0.63 30 66 96 1.6 0.23 0.73 36 60 96 1.6 0.29 0.61 39 60 96 1.6 0.33 0.61 59 64 96 1.6 0.60 0.69 58 70 96 1.6 0.58 0.82 29 44 96 1.6 0.22 0.38 35 34 96 1.6 0.28 0.27 88 54 96 1.6 1.55 0.52 80 54 96 1.6 1.12 0.52 64 64 96 1.6 0.69 0.69 70 71 96 1.6 0.82 0.84 54 75 96 1.6 0.52 0.95 67 56 96 1.6 0.75 0.55 63 77 96 1.6 0.67 1.01 68 76 96 1.6 0.77 0.98 62 68 96 1.6 0.65 0.77 60 65 96 1.6 0.61 0.71 57 75 96 1.6 0.56 0.95 62 64 96 1.6 0.65 0.69 69 76 96 1.6 0.79 0.98 68 77 96 1.6 0.77 1.01 63 79 96 1.6 0.67 1.08 61 72 96 1.6 0.63 0.87 69 75 96 1.6 0.79 0.95 70 75 96 1.6 0.82 0.95 69 55 96 1.6 0.79 0.53 62 60 96 1.6 0.65 0.61 71 74 96 1.6 0.84 0.92 62 73 96 1.6 0.65 0.89 27 47 96 1.6 0.21 0.42 36 40 96 1.6 0.29 0.34 85 55 96 1.6 1.35 0.53 78 49 96 1.6 1.05 0.45 74 62 96 1.6 0.92 0.65 76 72 96 1.6 0.98 0.87 73 75 96 1.6 0.89 0.95 68 80 96 1.6 0.77 1.12 76 68 96 1.6 0.98 0.77 78 62 96 1.6 1.05 0.65 58 65 96 1.6 0.58 0.71 75 60 96 1.6 0.95 0.61 66 71 96 1.6 0.73 0.84 65 68 96 1.6 0.71 0.77 72 68 96 1.6 0.87 0.77 69 69 96 1.6 0.79 0.79 60 62 96 1.6 0.61 0.65 61 63 96 1.6 0.63 0.67 68 58 96 1.6 0.77 0.58 66 55 96 1.6 0.73 0.53 57 76 96 1.6 0.56 0.98 61 80 96 1.6 0.63 1.12 28 65 96 1.6 0.22 0.71 39 69 96 1.6 0.33 0.79 54 48 96 1.6 0.52 0.43 54 37 96 1.6 0.52 0.30-3 59.4 10-3 0-3 0.16 0.63 + 3 2.5 + 3 116 5.0 + 3 104 0-24 - - - - 24 24 24 24 RS (%) 24 66.6 0.59-24 77.1 1.2-24 57.8 2.4-24 69.6 4.8-24 55.5 9.5-24 25.2-100 147 136 106 81.9 42.7 106 51.6 204 100 104 91.2 87.6 113 93.8 108 36.1 100 77.3 94.2 71.1 48.0-163 -

표 4-5-15 Relative Suspension Growth (RSG) and Relative Total Growth (RTG) (Main Study) Test substacne Dose (μg/ml) S9 mix Time of exposure (hr) Number of cells seeded (0 day) ( 10 5 /ml) Cell counts (1 day) ( 10 5 /ml) Number of cells seeded (1 day) ( 10 5 /ml) Cell counts (2 day) ( 10 5 /ml) DCG1 DCG2 RSG RTG (%) Water for injection 0-3 2.0 8.0 2.0 9.6 4.00 4.80 2.0 7.2 2.0 10.7 3.60 5.35 1.00 100 SARPU 200KW 0.078-3 2.0 8.6 2.0 7.8 4.30 3.90 0.87 132 0.16-3 2.0 7.8 2.0 7.4 3.90 3.70 0.75 113 0.31-3 2.0 8.5 2.0 7.7 4.25 3.85 0.85 102 0.63-3 2.0 7.0 2.0 6.4 3.50 3.20 0.58 79.2 1.3-3 2.0 5.3 2.0 7.3 2.65 3.65 0.50 55.2 2.5-3 2.0 4.2 2.0 7.1 2.10 3.55 0.39 38.4 5.0-3 2.0 4.0 2.0 6.9 2.00 3.45 0.36 43.6 10-3 2.0 0.1 0.1 0.1 0.20 1.00 0.01 0.55 MMS 10-3 2.0 0.4 2.0 1.2 4.00 3.00 0.62 52.1 Water for injection 0 + 3 2.0 7.1 2.0 9.5 3.55 4.75 2.0 8.4 2.0 9.2 4.20 4.60 1.00 100 SARPU 200KW 0.078 + 3 2.0 9.4 2.0 6.1 4.70 3.05 0.79 104 0.16 + 3 2.0 5.2 2.0 10.2 2.60 5.10 0.73 71.5 0.31 + 3 2.0 7.1 2.0 7.7 3.55 3.85 0.75 81.6 0.63 + 3 2.0 6.6 2.0 8.9 3.30 4.45 0.81 107 1.3 + 3 2.0 7.9 2.0 9.8 3.95 4.90 1.07 138 2.5 + 3 2.0 7.4 2.0 9.8 3.70 4.90 1.00 126 5.0 + 3 2.0 7.3 2.0 11.3 3.65 5.65 1.14 86.2 10 + 3 2.0 6.8 2.0 7.9 3.40 3.95 0.74 88.9 CPA 3 + 3 2.0 4.8 2.0 8.5 2.40 4.25 0.56 28.2 Water for injection 0-24 2.0 9.9 2.0 13.4 4.95 6.70 2.0 12.1 2.0 7.0 6.05 3.50 1.00 100 SARPU 200KW 0.037-24 2.0 9.7 2.0 6.4 4.85 3.20 0.55 91.9 0.074-24 2.0 9.9 2.0 9.7 4.95 4.85 0.86 97.4 0.15-24 2.0 7.4 2.0 9.5 3.70 4.75 0.63 66.3 0.30-24 2.0 7.8 2.0 8.0 3.90 4.00 0.56 71.9 0.59-24 2.0 8.7 2.0 9.2 4.35 4.60 0.71 89.4 1.2-24 2.0 8.6 2.0 10.3 4.30 5.15 0.79 83.3 2.4-24 2.0 12.6 2.0 9.2 6.30 4.60 1.03 92.1 4.8-24 2.0 9.0 2.0 5.8 5.00 2.90 0.52 87.1 9.5-24 2.0 1.5 1.5 3.3 3.00 2.20 0.24 28.3 MMS 5-24 2.0 7.1 2.0 9.9 3.55 4.95 0.63 37.1 DCG1: Daily cell growth (1 day), DCG2 : Daily cell growth (2 day) DCG = cell concentration the next day/prepared cell concentration RSG : Relative suspension cell growth, RV : Relative viability RTG : Relative total growth RSG = [(DCG1 DCG2)test]/ [(DCG1 DCG2)control] RV (%) = (PE2 test substance / PE2 negative control) 100 RTG (%)= RSG RV (%) MMS: Methyl methanesulfonate CPA: Cyclophosphamide - 164 -

표 4-5-16 Mutant Frequency (MF) and Sizing for Small (S) and Large (L) Colonies (Main Study) Test substance Water for injection SARPU 200KW P Colony sizing Number Number of MF ( 10-6/mL) (wells/plate) SC LC SC+LC of wells cells seeded seeded per well A B A B A B A B A B Mean 13 8 6 5 7 3 0 0 192 2000 95.7 57.3 76.5 50.7 7 3 6 1 1 2 0 0 192 2000 79.9 33.5 56.7 69.1 0.078-3 8 13 4 4 4 9 0 0 192 2000 46.5 77.8 62.1 36.6 0.16-3 14 9 5 5 9 4 0 0 192 2000 107 52.6 79.7 35.9 0.31-3 7 15 5 7 2 8 0 0 192 2000 51.9 115 83.3 52.3 0.63-3 15 17 6 6 9 11 0 0 192 2000 90.8 116 103 37.1 1.3-3 13 19 6 12 7 7 0 0 192 2000 77.8 162 120 60.4 2.5-3 16 15 8 7 8 8 0 0 192 2000 106 139 122 54.2 5.0-3 24 19 12 11 12 8 0 0 192 2000 194 147 171 49.8 10 - MMS 10-3 44 52 27 34 17 17 0 1 192 2000 364 755 560* 67.4 Water for injection SARPU 200KW 16 13 3 1 13 12 0 0 192 2000 119 95.3 107 12.8 15 20 3 5 12 15 0 0 192 2000 113 156 135 21.1 0.078 + 3 23 9 8 1 15 8 0 0 192 2000 137 49.4 93.4 25.8 0.16 + 3 19 15 7 4 12 11 0 0 192 2000 149 115 132 30.2 0.31 + 3 16 18 2 7 14 11 0 0 192 2000 111 127 119 24.6 0.63 + 3 22 16 6 6 16 10 0 0 192 2000 131 91.5 111 29.2 1.3 + 3 19 12 4 2 15 10 0 0 192 2000 113 68.5 90.9 17.9 2.5 + 3 21 23 4 6 17 16 0 1 192 2000 130 144 137 22.7 5.0 + 3 6 17 3 8 3 9 0 0 192 2000 56.4 170 113 45.5 10 + 3 18 18 5 13 13 4 0 1 192 2000 114 114 114 50.2 CPA 3 + 3 43 45 23 30 20 15 0 0 192 2000 785 835 810* 52.7 Water for injection SARPU 200KW Dose ( μg/ml) 0 S9 mix Time of exposure (hr) 14 14 3 1 11 13 0 0 192 2000 161 161 161 13.4 18 10 4 1 14 9 0 0 192 2000 137 72.6 105 16.6 0.037-24 15 13 3 4 12 9 0 0 192 2000 82.1 70.3 76.2 23.6 0.074-24 14 13 5 2 9 11 0 0 192 2000 111 103 107 24.5 0.15-24 14 7 4 2 10 5 0 0 192 2000 119 57.4 88.4 27.2 0.3-24 18 16 3 6 15 10 0 0 192 2000 129 113 121 24.6 0.59-24 11 7 2 3 9 4 0 0 192 2000 77.9 48.4 63.2 26.7 1.2-24 9 9 5 3 4 6 0 0 192 2000 74.8 74.8 74.8 43.2 2.4-24 7 15 3 4 4 11 0 0 192 2000 68.1 153 111 30.2 4.8-24 15 22 5 3 10 19 0 0 192 2000 80.9 124 102 19.8 9.5-24 13 14 4 3 9 11 0 0 192 2000 97.1 105 101 24.5 MMS 5-24 43 44 22 21 21 22 0 1 192 2000 806 831 818* 43.1 P : The number of wells containing colonies SC : Small colony, LC : Large colony, SC+SL : Small colony + Large colony MF : Mutation frequency SC (%) : The percent of small colonies mutant frequency to large colony mutant frequency MF( 10-6 ) = [-ln(empty well/total well)/(cells plated/well)]/pe2 SC (%) = (S-MF / T-MF) 100 Signification difference from negaitive control by Dunnett's t-test: * p<0.01 Replicate value : A, B MMS: Methyl methanesulfonate CPA: Cyclophosphamide 3 0 + 3 0-24 - Toxic SC (%) - 165 -

4-6-1 시간 0min 5min 10min 30min 1h 2h 6h 12h 1day 대조군 0.008± 0.008± 0.001 0.001 고용량 0.007± 0.462± 0.420± 0.397± 0.306± 0.247± 0.248± 0.247± 0.233± (5mg/kg) 저용량 (0.5mg/kg) 혈청 (μg/ml) 대조군고용량 (5mg/kg) 저용량 (0.5mg/kg) 0.001 0.143 0.131 0.123 0.077 0.045 0.045 0.062 0.049 0.006± 0.312± 0.224± 0.082± 0.064± 0.072± 0.083± 0.085± 0.080± 0.001 0.080 0.065 0.018 0.008 0.017 0.016 0.012 0.009 2day 3day 4day 5day 6day 7day 14day 21day 28day 0.008± 0.006± 0.002 0.001 0.304± 0.261± 0.260± 0.207± 0.182± 0.164± 0.115± 0.066± 0.050± 0.074 0.043 0.055 0.038 0.037 0.037 0.029 0.015 0.009 0.063± 0.066± 0.055± 0.059± 0.045± 0.042± 0.024± 0.017± 0.013± 0.016 0.009 0.006 0.013 0.008 0.006 0.007 0.006 0.005 0.462±0.143 μg/ml ±0.045 μg/ml ( μ - 166 -

- 167 -

Serum 1.0 0.8 Control 5 mg/l 0.5 mg/l Concentration (mg/ml) 0.6 0.4 0.2 0.0 011 2 3 4 5 6 7 14 21 28 Time (day) 4-6-1 Fig. Changes in serum AgNPs level with time after a single intravenous injection. AgNPs were measured as total silver concentration by ICP-MS. Blood was obtained from venous (ear) at the designated time (5 min, 10 min, 30 min, 1h, 2h, 6h, 12h, 1d, 2d, 3d, 4d, 5d, 6d, 7d, 14d, 21d, and 28d, n=4) and serum was prepared. Blood from animals of control group were obtained at 0, 1da, 7d, and 28d, after vehicle treatment. - 168 -

Serum 1.0 0.8 5 mg/kg 0.5 mg/kg Concentration (mg/ml) 0.6 0.4 0.2 0.0 0.00.1 0.3 0.5 1.0 Time (day) 4-6-1 ( ) - 169 -

Serum 1.0 0.8 5mg/kg 0.5mg/kg Concentration (mg/ml) 0.6 0.4 0.2 0.0 000 1 1 2 6 Time (hour) (6 ) - 170 -

μ μ - 171 -

4-6-2 ( ) AUC (last) AUC (inf) C max T max T 1/2 (μg day/ml) (μg day/ml) (μg/ml) (min) (day) 고용량-1 4.18 5.21 0.65 5 12.0 고용량-2 2.69 3.47 0.49 30 13.3 고용량-3 3.66 4.32 0.43 30 10.3 고용량-4 4.06 4.93 0.46 10 11.1 평균 3.65±0.68 4.48±0.77 0.51±0.10 19±13 11.7±1.3 4-6-3 ( ) AUC (last) AUC (inf) C max T max T 1/2 (μg day/ml) (μg day/ml) (μg/ml) (min) (day) 저용량-1 1.12 1.61 0.31 5 17.5 저용량-2 0.90 1.24 0.28 5 17.4 저용량-3 0.73 1.01 0.27 10 18.4 저용량-4 0.84 0.99 0.42 5 12.0 평균 0.90±0.16 1.21±0.29 0.32±0.07 6±3 16.3±2.9-172 -

- 173 -

가슴샘 (μg/g) 고환 (μg/g) 비장 (μg/g) 신장 (μg/g) 폐 (μg/g) 간장 (μg/g) 뇌 (μg/g) 시간 1day 7day 28day 대조군 0.009±0.001 고용량 (5mg/kg) 0.228±0.089 0.146±0.064 0.406±0.179 저용량 (0.5mg/kg) 0.044±0.011 0.027±0.012 0.012±0.001 대조군 0.010±0.003 고용량 (5mg/kg) 0.579±0.201 0.452±0.104 0.385±0.156 저용량 (0.5mg/kg) 0.147±0.036 0.127±0.024 0.035±0.011 대조군 0.038±0.005 고용량 (5mg/kg) 0.631±0.026 0.937±0.239 0.670±0.086 저용량 (0.5mg/kg) 0.387±0.191 0.534±0.181 0.305±0.187 대조군 0.011±0.003 고용량 (5mg/kg) 0.555±0.221 0.662±0.250 0.622±0.113 저용량 (0.5mg/kg) 0.382±0.134 0.031±0.004 0.018±0.005 대조군 0.015±0.001 고용량 (5mg/kg) 0.333±0.157 0.351±0.149 0.398±0.190 저용량 (0.5mg/kg) 0.173±0.152 0.040±0.005 0.018±0.003 대조군 0.037±0.003 고용량 (5mg/kg) 1.017±0.170 1.241±0.680 1.1200.120 저용량 (0.5mg/kg) 0.771±0.250 1.102±0.214 0.5320.061 대조군 0.021±0.004 고용량 (5mg/kg) 0.130±0.040 0.405±0.292 0.222±0.055 저용량 (0.5mg/kg) 0.070±0.022 0.075±0.055 0.040±0.002-174 -

Kidney 2.0 1.5 5 mg/kg 0.5 mg/kg Control Concentration (mg/g) 1.0 0.5 0.0 1 7 28 Time (day) 4-6-4 Lung 2.0 1.5 5 mg/kg 0.5 mg/kg Control Concentration (mg/g) 1.0 0.5 0.0 1 7 28 Time (day) 4-6-5-175 -

Liver 2.0 1.5 5 mg/kg 0.5 mg/kg Control Concentration (mg/g) 1.0 0.5 0.0 1 7 28 Time (day) 4-6-6 Testis 2.0 1.5 5 mg/kg 0.5 mg/kg Control Concentration (mg/g) 1.0 0.5 0.0 1 7 28 Time (day) 4-6-7-176 -

Brain 2.0 1.5 5 mg/kg 0.5 mg/kg Control Concentration (mg/g) 1.0 0.5 0.0 1 7 28 Time (day) 4-6-8 Thymus 2.0 1.5 5 mg/kg 0.5 mg/kg Control Concentration (mg/g) 1.0 0.5 0.0 1 7 28 Time (day) 4-6-9-177 -

Spleen 2.0 5 mg/kg 0.5 mg/kg Control 1.5 Concentration (mg/g) 1.0 0.5 0.0 1 7 28 Time (day) 4-6-10-178 -

- 179 -

4-6-5 Urine 0.10 0.08 Control 5mg/kg 0.5mg/kg Concentration (mg/ml) 0.06 0.04 0.02 0.00 0 1 2 3 4 5 6 7 14 21 28 Time (day) 4-6-11-180 -

Cumulative Distribution of Urine 10 8 5 mg/kg 0.5 mg/kg 6 Ag (mg) 4 2 0 0 2 4 6 8 Time (day) 4-6-12 7-181 -

- 182 -

4-6-6 Feces 5 4 Control 5mg/kg 0.5mg/kg Concentration (mg/g) 3 2 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 14 21 28 Time (day) 4-6-13-183 -

Cumulative Distribution of Feces 1400 1200 5 mg/kg 0.5 mg/kg 1000 Ag (mg) 800 600 400 200 0 0 2 4 6 8 Time (day) 4-6-14 7-184 -

- 185 -

- 186 -

- 187 -

SARPU 200KW 600 550 500 Body weights 450 400 350 Administration 5~19day control G2_62.5 mg/kg G3_125 mg/kg G4_250 mg/kg 300 250 Administration : 1~9 weeks 1 주 2 주 3 주 4 주 5 주 6 주 7 주 8 주 9 주 Male SARPU 200KW 500 450 400 Body weights 350 300 250 Administration 5~19day control G2_62.5 mg/kg G3_125 mg/kg G4_250 mg/kg 200 150 Administration : 1~9 weeks 1 주 2 주 3 주 0 일 3 일 6 일 9 일 12 일 15 일 18 일 20 일 1 일 4 일 8 주 9 주 Female - 188 -

- 189 -

- 190 -

N. 15 15 15 15 15 15-191 -

( * ) : significantly different from values of control group at P < 0.05, ( * ) : at P < 0.01 with Dunnett's t-test. - 192 -

( * ) : significantly different from values of control group at P < 0.05, ( * ) : at P < 0.01 with Dunnett's t-test. - 193 -

( * ) : significantly different from values of control group at P < 0.05 with Dunnett's t-test. - 194 -

sex : Male ( * ) : significantly different from values of control group at P < 0.05 with Dunnett's t-test. - 195 -

( * ) : significantly different from values of control group at P < 0.05 with Dunnett's t-test. - 196 -

( * ) : significantly different from values of control group at P < 0.05 with Dunnett's t-test. - 197 -

Sex : Female - 198 -

- 199 -

- 200 -

- 201 -

- 202 -

- 203 -

(Continued) - 204 -

- 205 -

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a. 동물도입 및 개체표시 및 순화중 b. 군분리 - 212 -

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<<OECD 나노안전성보고서 >> 1. Silver 2. MWCNT 3. Titanium 4. Silica - 265 -

2009