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1 이 보고서는 산업안전보건연구원의 화학물질의 유해 위험성 평가사업 에 의한 것임 보건분야-연구자료 연구원 화학물질의 유해 위험성 평가사업 수행을 위한 급성독성, 피부자극, 소핵시험 (3) 1-Methy-1-propanethiol 한국산업안전공단 산업안전보건연구원

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3 제 출 문 산업안전보건연구원장 귀하 본 보고서를 2006년도 산업안전보건연구원 연구용 역 ( 화학물질의 유 해 위험성 평가사업 수행을 위한 급성독성, 피부자극, 소핵시험 - 3)의 최종보고서로 제출합니다 연 구 기 관 한국화학시험연구원 연구 책임자 센터장 성 하 정 공 동 연구원 : 한국화학시험연구원 팀 장 맹은호 팀 장 이준연 책임연구원 박상욱 선임연구원 박학수 선임연구원 고상범 선임연구원 홍정섭 연구보조원 : 책임연구원 홍 승 국 선임연구원 이종윤 선임연구원 서동석 선임연구원 문지영 주임연구원 성낙원 주임연구원 장동혁 주임연구원 권 민 연구원 서무엽 연구원 조희금 연구원 조영민 연구원 이진희 연구원 김정헌 연구원 이지선

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5 1-Methy-1-propanethiol

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7 <목 차> 요약문 ⅵ Summary ⅶ Ⅰ. 서 론 1 Ⅱ. 연구내용 및 결과 1. 연구내용 2 2. 연구결과 4 급성 경구 독성시험 가. 시험물질 4 (1) 시험물질 및 부형제 4 (2) 시험물질 조제 4 (3) 시험물질 분석 4 나. 재료 및 방법 5 (1) 시험동물 5 (2) 사육환경 5 (3) 군분리 및 개체식별 6 (4) 시험물질의 투여 7 (5) 관찰 및 검사항목 7 ( 6 ) 통 계 처 리 8 다. 한계시험 결과 8 (1) 치사동물 및 반수치사약량(LD 50 ) 8 (2) 일반증상관찰결과 8 (3) 체중측정결과 8 ( 4 ) 부 검 결과소 견 8 라. 추가시험 결과 8 (1) 치사동물 및 반수치사약량(LD 50 ) 8 (2) 일반증상관찰결과 8 (3) 체중측정결과 9 ( 4 ) 부 검 결과소 견 9 마. 고 찰 9 - i -

8 피부자극시험 가. 연구방 법 2 8 (1) 시험물질 2 8 (2) 시험물질의 조제 2 8 (3) 시험물질 분석 2 8 ( 4 ) 시 험 계 2 9 (5) 사육환경 및 관리 2 9 (6) 시험방법 3 0 (7) 관찰 및 검사 항목 3 1 (8) 피부반응의 평가 및 자극성의 판정 3 2 나. 결과 3 2 (1) 일반증상 및 사망률 3 2 (2) 체중변화 3 2 (3) 적용부위 관찰 3 3 다. 고 찰 3 3 소핵시험 가. 연구방 법 3 8 (1) 시험물질 및 대조물질 3 8 나. 재 료 및 방 법 3 9 ( 1) 시 험 계 3 9 (2) 군분리 및 개체식별 3 9 (3) 사육환경 4 0 (4) 시험방법 4 1 다. 시 험 결과 4 2 (1) 사육관리 4 2 (2) 시험물질의 투여 4 3 (3) 소핵관찰 결과 4 3 라. 고 찰 4 3 Ⅲ. 결 론 급성 경구 독성시험 4 7 피부자극시험 4 7 소핵시험 4 7 참고 문 헌 ii -

9 <표 목 차> 급성 경구 독성시험 Table 1. Mortality of limit test.( Group s ummary) 10 Table 2. C linical sig ns of limit test.( Group s ummary) 10 Table 3. C hang es of the mean bod y weig hts in limit test.(group summary) 11 Table 4. N ecropsy f inding s of limit tes t. ( Group summary) 11 Table 5. Mortality of add itional test.( Group s ummary) 12 Table 6. C linical sig ns of add itional test.( Group s ummary) 12 Table 7. C hang es of the mean bod y weig hts in ad ditional test. (Group summary) 13 Table 8. N ecropsy f inding s of additional tes t. ( Group summary) 13 피부자극시험 Table 1. 피부반응평가표 32 T ab le 2. Mortality and clinic al s ig ns 34 Table 3. Body weights 34 Table 4. Results of s kin reaction 35 소핵시험 Table 1. Micronucleus tes t of 1-Methy-1-propanethiol 44 in ICR mice(group summary) Table 2. Body weig hts of animals (Group summary) iii -

10 <그 림 목 차> 피부자극시험 Figure 1. 피부처치부위 31 Figure 2. Skin after topical application at 24 hr 36 Figure 3. Skin after topical application at 72 hr 36 - iv -

11 <Append ix> 급성 경구 독성시험 Append ix 1.1. C linical s ig ns of male in limit tes t.( I nd iv idual) 14 Append ix 1.2. C linical sig ns of female in limit test. (I ndividual) 15 Append ix 2.1. B od y weig hts of male in limit tes t( I nd iv idual) 16 Append ix 2.2. B od y weig hts of f emale in limit test.( I nd iv idual) 17 Appendix 3.1. Necropsy findings of male in limit test.(individua) 18 Append ix 3.2. N ecrops y f inding s of f emale in limit tes t.( I nd iv idual) 19 Append ix 4.1. C linical s ig ns of male in add itional tes t.( I nd iv idual) 20 Append ix 4.2. C linical sig ns of female in ad ditional test. (I ndividual) 21 Append ix 5.1. B od y weights of male in additional tes t. ( I ndiv id ual) 22 Append ix 5.2. B od y weights of f emale in add itional test.( Ind iv idual) 23 Appendix 6.1. Necropsy findings of male in additional test.(indiv id ual) 24 Append ix 6.2. N ecropsy f indings of f emale in add itional test.( Ind iv idual) 25 소핵시험 Append ix 1. Micronucleus test of 1-Methy-1-propanethiol in ICR mice.(individual) 45 Append ix 2. Body weig hts of animals. (I ndividual) 46 - v -

12 요약문 본 연구에서는 1-Methy-1-propanethiol에 대해 급성경구독성시험, 피부자극시 험, 소핵시험을 수행하여 유해성을 규명하고 시험물질이 생체에 미치는 영향을 관 찰 조사 하였다. 1-Methy-1-propanethiol를 투여량 2,000 mg/kg B.W.과 5,000 mg/kg B.W로 설정하여 급성 경구 독성 시험을 수행 한 결과 2,000 mg/kg B.W. 사망동물은 관 찰되지 않았으며, 시험물질 투여군에서 활동력 저하(decreased locomotor activity) 증상이 관찰되었다. 체중변화에 있어서는 대조군에 비해 유의성 있는 변화는 인정 되지 않았으며, 부검결과 시험물질 투여와 관련된 어떠한 이상 소견도 관찰되지 않았다. 시험물질 5,000 mg/kg B.W.를 추가시험 실시한 결과 수컷은 사망동물이 관찰되지 않았고, 암컷은 2마리의 사망동물이 관찰되어 1-Methy-1-propanethiol 에 대한 LD 50 은 암 수 모두 5,000mg/kg B.W.이상으로 판단된다. 그러므로 본 시 험물질은 화학물질 분류 및 표지에 관한 세계조화시스템(Globally Harmonization System of classification and Labeling of chemicals, GHS)의 분류기준에 따라 unclassified로 분류되었다. New Zealand White계 토끼에 있어서 1-Methy-1-propanethiol의 피부적용은 시험물질 노출 종료 후 1, 24, 48 및 72시간째 적용부위에서 약간 심한 홍반과, 가 벼운 부종이 관찰되어 중등도 자극성(P.I.I. "3.08") 물질인 것으로 판단되었다. 시험물질 1-Methy-1-propanethiol 의 투여군에 있어서 다염성 적혈구중 소핵을 갖는 적혈구의 출현빈도를 용매대조군과 비교하여 볼 때, 통계적으로 유의하게 증 가하는 투여 농도군은 확인되지 않았다. 따라서 1-Methy-1- propanethiol은 본 시험조건에서 마우스 골수세포에 대해 소핵을 유발하지 않는 것으로 판단된다. - vi -

13 Summary Acute oral toxicity, skin irritation tes t and micronuleus tests for 1-Methy -1- propanethiol w ere tes ted in Sprag ue-daw ley rats, N ew Z ealand White rabbits and ICR mice. The test article was orally adminis tered once by g av ag e to male and female rats at dose levels of 2,000 and 5,000 mg/kg body weight for acute oral toxicity test. Af ter orally s ing le administration, mortality, clinic al s ig ns, b od y weights and necropsy findings were observed for 14 days. The decreased locomotor activity were observed at dose levels of 2,000 and 5,000 mg/kg B.W. Two females in the 5,000 mg/kg group were observed found dead from day 1 on test. The median lethal dose(ld 50 ) of 1-Methy -1- propanethiol was considered to be higher than 5,000 mg/kg body weight in rat. Therefore, the 1-Methy -1- propanethiol w as ev aluated to b e GH S ( Glob ally H armoniz ation System of classification and labeling of chemicals) unclassified in this study. In the skin irritation test, 0.5 ml of 1-Methy-1-propanethiol was applied to the back skin of rabbits for 4 hours. As a result of the skin irritation tes t f or 1-Methy-1-propanethiol, moderate erythema and slig ht oedema were ob s erv ed. The primary irritation index in accordance with the Draize evaluation of topical reaction was calculated to be " ", which meant mod erately irritating. Micronucleus test results showed that any g roup treated with the test article, 1-Methy-1-propanethiol, was not chang ed s ig nif icantly in the inc id ence of MNP CEs compared to the neg ativ e control g roup. Therefore, 1-Methy-1- propanethiol was considered not to induce micronuclei in bone marrow cells of male I CR mice under the present experimental conditions. - vii -

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15 I. 서 론 생활수준의 향상에 따라 편리함을 추구하는 인간의 욕구는 지속적으로 증대되 고 있으며, 이러한 욕구의 충족을 위하여 새로운 용도의 화학물질이 끊임없이 개 발 생산되고 있다. 현재 전 세계적으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 10만종에 이르며, 국내에서도 3만8천여종의 화학물질이 사용되고 있다. 또한 전 세계적으로 매년 2천여종의 새로운 화학물질이 개발되어 상품화되고, 국내에서도 매년 400여 종의 새로운 화학물질이 국내시장에서 사용되고 있으며 화학물질의 유통량도 증 가하고 있는 것으로 조사되고 있다.(환경부, 2005) 이러한 화학물질의 사용량 증대 와 더불어 유해 위험성 미확인 화학물질에 대한 유해 위험성 시험을 통하여 생 체에 미치는 농도와 영향 등의 자료 확보 및 유해 위험성 예측을 통한 화학물질 의 관리체계 확립하고 화학물질의 유해 위험성에 대한 산업안전보건법 및 화학 물질 분류 및 표지에 관한 세계조화시스템(Globally Harmonization System of classification and Labeling of chemicals, GHS)제도에 유해 위험성 분류 근거 자료를 제공하고 화학물질의 물리화학적 특성 및 독성을 중심으로 한 MSDS 유 해 위험성 자료를 제공하고자 본 연구를 수행 하였다. 1-Methy-1-propanethiol는 C H 3 CH 2 CH(SH)CH 3 의 구조식을 가지는 분자량 90.19의 투명하고 비중이 (17 )인 무색의 액체로, 천연가스 등에서 스컹 크 향의 불쾌하며 자극적인 냄새를 가지고 있다. 물에는 거의 불용이고 알콜이나 Ether 에는 매우 잘 섞이며, 인화점 -10 (-23 )으로 인화성이 강한 물질이고 끓는점은 84~85, 증기압은 25 에서 mm Hg, 증기밀도는 3.11 (Air = 1), 옥탄올/물 분배계수 log Kow = 2.18 (est), 어는점은 의 성질을 가지고 있다 (O'Neil, M.J. (ed.). Merck Index, 2001., Lewis, R.J. Sr, 2001., US EPA, 2003,. Quincy, MA., 1997). 동물실험 결과의 자료로는 랫드에 경구 노출시킨 후 증상을 관찰한 결과, 운동 실조와 몸무게 감소를 보였고, 토끼 눈에 점적 주입시킨 결과, 2일간 격렬한 통증 과 염증을 일으키며 (Bingham, E. 2001), 급성 신경독성은 콜린에스테라아제 억제 에 영향을 주었다는 보고 (O'Donoghue, J.L. 1985) 가 있다. 랫드에서 LD 50 근처의 농도에서 중추 신경 계통에 영향을 주는 것이 관찰되고, 콜린에스테라아제 억제가 일어난다는 보고도 있다 (Clayton, G. D. and F. E

16 Clayton (eds.) ) 본 시험물질은 장기간 취급할 경우 부주의로 인해 노 출될 수 있으며 건강장해를 일으킬 수도 있다. 따라서 1-Methy-1-propanethiol를 급성경구독성시험, 피부자극시험, 소핵시험을 수행하여 유해성을 규명하고 시험물 질이 생체에 미치는 영향을 관찰 조사 하였다. Ⅱ. 연구내용 및 결과 1. 연구내용 시험내용으로는 급성경구독성시험, 피부자극시험 및 소핵시험이며, 본 시험을 수행 함에 있어 시험결과의 신뢰성을 확보하기 위해 국내 외의 GLP (Good Laboratory Practice) 독성시험 규정과 OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development, 1996) 독성시험 기준에 준하여 수행하였다. 급성 경구독성시험의 경우 반수치사량(LD 50 )을 확인하고 피부 자극 시험의 경우 시험물질이 피부자극에 미치는 일반증상과 체중, 피부자극성의 변화를 관찰하였다. 또한 소핵시험을 수행하여 본 시험물질에 대해 마우스를 이용하여 음성대조, 양성대 조 및 시험물질 투여군 3군으로 구성하여 다염성적혈구에서의 소핵 유발성을 관찰하 였다

17 급 성 경 구 독 성 시 험 1-Methyl-1-propanethiol - 3 -

18 2. 연구결과 가. 시 험 물 질 ( 1) 시 험 물 질 및 부 형 제 1) 명 칭 : 1-Methyl-1-propanethiol 분자식 : CH 3 CH 2 CH(SH)CH 3 분자량 : CAS No. : 공급원 : 산업안전보건연구원 화 학물질 안전보건센터 제조사 : TOKYO KASEI Lot No.: XX249 입수일 : 2006년 5월 3일 입수량 : 500mL 순 도 : 자료없음 녹는점 : 자료없음 보관조건 : 실온 보관장소 : GLP 시약조제실 성 상 : 무채색 액체 안정성 : 상온 상압에서 안정함 취급 시 주의사항 : 열, 화염, 스파크 및 기타 점화원을 피할 것. 용기가 열에 노출되면 파열되거나 폭발할 수도 있음. 상수도 및 하수도에서 떨어 진 곳에 둘 것 유효기간 : 자료없음 2) 부 형 제 : Corn oil ( 2 ) 시 험 물 질 조 제 시험물질은 Corn oil에 2,000 mg/10 ml 및 5,000 mg/10 ml의 농도로 희석 하여 조제하였다. ( 3 ) 시 험 물 질 분 석 시험의뢰자가 제공한 시험물질 정보에 기초하여 별도로 실시하지 않았고, 조 제된 시험물질에 대한 안정성 및 균질성 분석도 별도로 실시하지 않았다 - 4 -

19 나. 재 료 및 방 법 ( 1) 시 험 동 물 1) 동물종(계통) CrjBgi:CD(SD)-IGS(Rat), SPF 2) 공급원 명 칭 : 오리엔트 주 소 : 경기도 가평군 북면 목동리 ) 구입 동물 수(성별), 주령 및 체중범위 - 한계시험 : 11마리 (수컷) 5주령, g / 11마리 (암컷) 5주령, g - 추가시험 : 11마리 (수컷) 5주령, g / 11마리 (암컷) 5주령, g 4) 투여 시 동물 수(성별), 주령 및 체중범위 - 한계시험 : 10마리 (수컷) 6주령, g 10마리 (암컷) 6주령, g - 추가시험 : 10마리 (수컷) 6주령, g 10마리 (암컷) 6주령, g 5) 시험계의 선택사유 본시험에 사용된 랫드는 설치류에서 단회 및 반복투여독성시험 등의 안전 성 시험에 널리 사용되고 있으며, 비교할 많은 기초자료가 축적 되어 있어 선택하였다. 6) 순화 및 검역 동물을 구입한 후 7일 동안 안전성평가센터의 동물사육실의 환경 하에 서 검역 및 순화시키면서 일반 건강상태를 관찰한 후 건강한 개체를 선별하 여 시험에 사용하였다. ( 2 ) 사 육 환 경 1) 환경 본 시험의 환경은 온도 , 상대습도 %, 환기횟수 10 15회/hr, 조명시간 12시간 (오전8시 오후8시), 조도 Lux의 동물사육실에서 사료와 음용수를 급여하여 순화 및 시험기간 동안 격리 - 5 -

20 사육하였다. 2) 사육환경 모니터링 시험기간 중 동물실의 온 습도는 자동 측정기에 의하여 매 30분마다 측정 되었으며, 조도 등의 환경조건은 정기적으로 측정되었다. 동물실의 환경 측정결과 시험에 영향을 미칠 것으로 사료되는 변동은 없었다. 3) 사육조건 순화 및 시험기간 중 wire cage(500Ⅹ300Ⅹ200 mm, 대종기기)에 5마리씩 넣어 사육하였다. 시험기간 중 사료와 음용수는 자유 급식시켰다. 4) 사료 및 음용수 사료는 방사선(2.0 Mrad)멸균 된 실험동물용 쥐사료{(주)퓨리나코리아 (경 기도 평택시 장당동 85-1)}를, 물은 자외선 살균처리 된 음용수를 자유섭 취 시켰다. 음용수에 대하여 본 한국화학시험연구원에서 오염물질의 검사 를 실시한 결과 시험에 영향을 미치는 요인은 발견되지 않았다. ( 3 ) 군 분 리 및 개 체 식 별 검역 및 순화기간을 거친 후 체중감소 및 일반증상에 이상이 없는 건강한 동 물만 선별한 후 투여 1일전의 체중을 기초로 하여 무작위법으로 각 군의 평 균체중이 가능한 균등하도록 군을 구성하였다. 1) 시험군의 구성 (한계시험) 군 시험물질 성 동물번호 Male G1 corn oil Female 투여량 (mg/kg B.W.) 투여액량 (ml/kg B.W.) 0 10 G2 1-Methyl-1 Male propanethiol Female ,

21 2) 시험군의 구성 (추가시험) 군 시험물질 성 동물번호 Male G1 corn oil Female 투여량 (mg/kg B.W.) 투여액량 (ml/kg B.W.) 0 10 G2 1-Methyl-1 -propanethiol Male Female , ) 개체식별 개체식별은 꼬리에 유성매직을 사용하여 일련번호로 표시하였으며, 사육상 자에는 시험번호, 성별, 군번호, 개체번호, 투여량, 시험기간 및 시험책임자 를 기재한 개체식별카드를 부착하였다. ( 4 ) 시 험 물 질 의 투 여 1) 사료의 절식 투여 12시간 전부터 사료를 공급하지 않았고, 음수는 공급하였다. 2) 투여방법 랫드용 경구 투여 주사기를 이용하여 위 내에 1회 강제 투여 하였다. ( 5 ) 관 찰 및 검 사 항 목 1) 일반증상 관찰 전 동물에 대하여 매일 1회 이상 증상관찰을 실시하였다. 단 투여 당일에 는 투여 후 6시간까지는 매 시간마다 관찰하였다. 일반 증상관찰은 투여 후 14일까지 실시하였다. 2) 체중 및 사료/음수량 측정 체중은 입수시, 군분리 시, 시험물질투여 개시 직전, 투여 개시 후 7일과 14일째에 측정하였다. 사료 및 음수량은 측정하지 않았다. 3) 부검 시 육안적 소견 투여 후 14일째 모든 생존동물의 외관 검사를 실시한 다음 부검하여 육안 적으로 장기를 검사하였다

22 ( 6 ) 통 계 처 리 본 시험에서의 체중데이터에 대한 투여군과 대조군간 분석은 SPSS 10.1의 통계프로그램을 이용하여 분산의 동질성을 확인하기 위해 Levene 검정을 실 시한 결과 분산의 동질성이 인정되어 Student의 t검정을 실시하였다. 다. 한 계 시 험 결과 ( 1) 치 사 동 물 및 반 수 치 사 약량 ( L D 5 0 ) ( T ab le 1) 한계시험 결과 암 수 모두 최고 투여 용량인 2,000 mg/kg B.W.에서 사망동 물이 관찰되지 않아 반수치사약량(LD 50 ) 산출은 불가능 하였다. ( 2 ) 일 반 증 상 관 찰 결과 ( T ab le 2 ) 시험물질 투여에 의한 일반증상으로 활동력 저하(decreased locomotor activity)가 관찰되었다. ( 3 ) 체 중 측 정 결과 ( T ab le 3 ) 시험기간 중 생존동물에 대한 체중변화에 있어서는 대조군과 비교하였을 때 유의성 있는 체중변화는 관찰되지 않았다. ( 4 ) 부 검 결과소 견 ( T ab le 4 ) 생존동물의 부검은 시험 종료 후 에테르로 마취하여 각 주요장기에 대한 육 안적 관찰을 실시한 결과, 암 수 모든 동물에서 투여에 의한 특이할만한 소견 은 인정되지 않았다. 라. 추 가 시 험 결과 ( 1) 치 사 동 물 및 반 수 치 사 약량 ( L D 5 0 ) ( T ab le 5 ) 추가시험 결과 투여 용량인 5,000 mg/kg B.W.에서 수컷은 사망동물이 관찰 되지 않았고, 암컷은 2마리의 동물이 사망하였다. ( 2 ) 일 반 증 상 관 찰 결과 ( T ab le 6 ) 시험물질 투여에 의한 일반증상으로 투여 직후 모든 시험물질 투여 동물에서 - 8 -

23 활동력 저하(decreased locomotor activity)가 관찰되었으나 24시간이내에서 생존한 모든 동물이 정상으로 회복되었다. ( 3 ) 체 중 측 정 결과 ( T ab le 7 ) 시험기간 중 생존동물에 대한 체중변화에 있어서는 대조군과 비교하였을 때 유의성 있는 체중변화는 관찰되지 않았다. ( 4 ) 부 검 결과 소 견 ( T ab le 8 ) 생존동물의 부검은 시험 종료 후 에테르로 마취하여 각 주요장기에 대한 육 안적 관찰을 실시한 결과, 암 수 모든 동물에서 투여에 의한 특이할만한 소견 은 인정되지 않았다. 마. 고 찰 시험물질인 1-Methyl-1-propanethiol를 SD Rat의 2,000 mg/kg B.W.로 암 수 각각 5마리로 하여 용량 수준당 10마리를 사용하여 기초시험을 실시한 결과 사망 동물은 관찰되지 않았다. 본 시험물질 2,000 mg/kg B.W.를 암 수 각각 5마리로 하여 용량 수준당 10마리 를 사용하여 기초시험을 실시한 결과 사망동물은 관찰되지 않았다. 일반증상은 모 든 시험물질 투여군에서 활동력 저하(decreased locomotor activity) 증상이 투여 후 6시간 동안 관찰 되었으나 24시간 이내에 모두 정상으로 회복되었다. 시험기간 중 체중변화에 있어서는 대조군에 비해 유의성 있는 변화는 인정되지 않았으며, 부검결과 시험물질 투여와 관련된 어떠한 이상 소견도 관찰되지 않았다. 시험물질 5,000 mg/kg B.W.를 암 수 각각 5마리로 하여 용량 수준당 10마리를 사용하여 추가시험을 실시한 결과 수컷은 사망동물이 관찰되지 않았고, 암컷은 2마리의 사 망동물이 관찰되었다. 이상의 결과로 보아 1-Methyl-1-propanethiol를 투여량 2,000 mg/kg B.W와 5,000 mg/kg B.W.로 단회투여(경구) 독성 시험을 한 결과 1-Methyl-1- propanethiol에 대한 LD50은 암 수 모두 5,000mg/kg B.W.이상으로 판단되어 본 시 험물질 은 화학 물질 분류 및 표지 에 관한 세계 조화시 스템( Glob ally H armonization System of classif ic ation and Lab eli ng of c hemic als, G H S) 의 분 류기준에 따라 unclassified로 분류되었다

24 T ab le 1. Mortality of limit tes t. ( G roup s ummary) G roup D os e ( mg / k g ) Male Mortality ( d ead / total) F emale G1 0 0 % 0 % (0 / 5) a (0 / 5) a 0 % G2 2,000 (0 / 5) : No. of dead animals/n o. of tested animals 0 % (0 / 5) T ab le 2. C linic al s ig ns of limit tes t. ( G roup s ummary) G roup D os e ( mg / k g ) G1 0 G2 2,000 Sex N umb er of animal C linic al Sig ns Male 5 No Abnormality D etected Female 5 No Abnormality D etected Male 5 Decreased Locomotor Activ ity Female 5 Decreased Locomotor Activ ity

25 T ab le 3. C hang es of the mean b od y w eig hts in limit tes t. ( G roup s ummary) G roup D os e ( mg / k g ) G1 0 G2 2,000 Sex N umb er of animal Male 5 Female 5 Male 5 Female 5 D ay( s ) af ter 5 treatment ±4.09 ±6.30 ± ±6.15 ±10.28 ± ±5.97 ±9.20 ± ±6.44 ±8.71 ±8.84 T ab le 4. N ec rops y f ind ing s of limit tes t. ( G roup s ummary) F ind ing s N o. of E xamined G 1 G 2 ( 0 mg / k g ) ( 2, mg / k g ) Male F emale Male F emale No. of Gross Findings

26 T ab le 5. Mortality of ad d itional tes t. ( G roup s ummary) G roup D os e ( mg / k g ) Male Mortality ( d ead / total) F emale G1 0 0 % 0 % (0 / 5) a (0 / 5) G2 5,000 0 % (0 / 5) 40 % (2 / 5) a : No. of dead animals/n o. of tested animals T ab le 6. C linic al s ig ns of ad d itional tes t. ( G roup s ummary) G roup D os e ( mg / k g ) G1 0 Sex N umb er animal Male 5 Female 5 of No No C linic al Sig ns Abnormality D etected Abnormality D etected G2 5,000 Male 5 Female 5 Decreased Locomotor Activ ity Decreased Locomotor Activ ity

27 T ab le 7. C hang es of the mean b od y w eig hts in ad d itional tes t. ( G roup s ummary) G roup D os e ( mg / k g ) G1 0 G2 5,000 Sex N umb er of animal Male 5 Female 5 Male 5 Female 5 D ay( s ) af ter treatment ±8.46 ± ± ±7.04 ±8.16 ± ±7.46 ±12.42 ± ±4.82 ±7.29 ±4.92 T ab le 8. N ec rops y f ind ing s of ad d itional tes t. ( G roup s ummary) F ind ing s N o. of E xamined G 1 G 2 ( 0 mg / k g ) ( 5, mg / k g ) Male F emale Male F emale No. of Gross Findings

28 Append ix C linic al s ig ns of male in limit tes t. ( I nd iv id ual) G roup D os e Animal ( mg / k g ) N umb er d ay( s ) af ter ad minis tration 1hr 2 hr 3 hr 4 hr 5 hr 6 hr Male NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1102 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD G NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1104 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1105 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1201 DLA DLA DLA DLA DLA DLA NAD NAD NAD NAD N AD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD N AD G2 2, DLA DLA DLA DLA DLA DLA NAD NAD NAD NAD N AD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD N AD N AD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD N AD ( continued) G roup D os e ( mg / k g ) Animal N umb er d ay( s ) af ter ad minis tration NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1102 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD G NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1104 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1105 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1201 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1202 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD G2 2, NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1204 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1205 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD N AD : No Abnormality D etected DLA : Decreased Locomotor Activity (End)

29 Append ix C linic al s ig ns of f emale in limit tes t. ( I nd iv id ual) D os e G roup ( mg / k g ) Animal N umb er d ay( s ) af ter ad minis tration Female 1hr 2 hr 3 hr 4 hr 5 hr 6 hr NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2102 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD G NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2104 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2105 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2201 DLA DLA DLA DLA DLA DLA NAD NAD NAD NAD 2202 DLA DLA DLA DLA DLA DLA NAD NAD NAD NAD G2 2, NAD NAD NAD NAD N AD N AD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD N AD N AD NAD NAD NAD NAD 2205 DLA DLA DLA DLA DLA DLA NAD NAD NAD NAD G roup D os e Animal ( mg / k g ) N umb er (continued) d ay( s ) af ter ad minis tration NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2102 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD G NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2104 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2105 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2201 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2202 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD G2 2, NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2204 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2205 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD N AD : No Abnormality D etected DLA : Decreased Locomotor Activity (End)

30 Append ix B od y w eig hts of male in limit tes t. ( I nd iv id ual) Male G roup D os e ( mg / k g ) N o. d ay( s ) af ter ad minis tration G Mean S.D G2 2, Mean S.D

31 Append ix B od y w eig hts of f emale in limit tes t. ( I nd iv id ual) Female G roup D os e ( mg / k g ) N o. d ay( s ) af ter ad minis tration G Mean S.D G2 2, Mean S.D

32 Append ix N ec rops y f ind ing s of male in limit tes t. ( I nd iv id ual) Animal N o G roup : G 1 Dos e : 0 mg / kg Terminal Sac rif ice Animal N o G roup : G 1 Dos e : 0 mg / kg Terminal Sac rif ice Animal N o G roup : G 1 Dos e : 0 mg / kg Terminal Sac rif ice Animal N o G roup : G 1 Dos e : 0 mg / kg Terminal Sac rif ice Animal N o G roup : G 1 Dos e : 0 mg / kg Terminal Sac rif ice Animal N o G roup : G 2 Dos e : 2,00 0 mg / kg Terminal Sac rif ice Animal N o G roup : G 2 Dos e : 2,00 0 mg / kg Terminal Sac rif ice Animal N o G roup : G 2 Dos e : 2,00 0 mg / kg Terminal Sac rif ice Animal N o G roup : G 2 Dos e : 2,00 0 mg / kg Terminal Sac rif ice Animal N o G roup : G 2 Dos e : 2,00 0 mg / kg Terminal Sac rif ice Male

33 Append ix N ec rops y f ind ing s of f emale in limit tes t. ( I nd iv id ual) Animal N o G roup : G 1 D ose : 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Animal N o G roup : G 1 D ose : 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Animal N o G roup : G 1 D ose : 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Animal N o G roup : G 1 D ose : 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Animal N o G roup : G 1 D ose : 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Animal N o G roup : G 2 D ose : 2,00 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Animal N o G roup : G 2 D ose : 2,00 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Animal N o G roup : G 2 D ose : 2,00 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Animal N o G roup : G 2 D ose : 2,00 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Animal N o G roup : G 2 D ose : 2,00 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Female

34 Append ix C linic al s ig ns of male in ad d itional tes t. ( I nd iv id ual) G roup D os e Animal ( mg / k g ) N umb er d ay( s ) af ter ad minis tration 1hr 2 hr 3 hr 4 hr 5 hr 6 hr Male NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1102 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD G NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1104 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1105 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1201 DLA DLA DLA DLA DLA DLA NAD NAD NAD NAD 1202 DLA DLA DLA DLA DLA DLA NAD NAD NAD NAD G2 5, DLA DLA DLA DLA DLA DLA NAD NAD NAD NAD 1204 DLA DLA DLA DLA DLA DLA NAD NAD NAD NAD 1205 DLA DLA DLA DLA DLA DLA NAD NAD NAD NAD ( continued) G roup D os e ( mg / k g ) Animal N umb er d ay( s ) af ter ad minis tration NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1102 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD G NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1104 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1105 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1201 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1202 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD G2 5, NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1204 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 1205 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD N AD : No Abnormality D etected DLA : Decreased Locomotor Activity (End)

35 Append ix C linic al s ig ns of f emale in ad d itional tes t. ( I nd iv id ual) Female G roup D os e ( mg / k g ) Animal N umb er d ay( s ) af ter ad minis tration 1hr 2 hr 3 hr 4 hr 5 hr 6 hr NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2102 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD G NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2104 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2105 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2201 DLA DLA DLA DLA DLA DLA NAD NAD NAD NAD 2202 DLA DLA DLA DLA DLA DLA NAD NAD NAD NAD G2 5, DLA DLA DLA DLA DLA DLA DLA DLA DLA DLA DLA DLA DLA DLA DLA DLA DLA DLA NAD NAD NAD NAD (continued) G roup D os e ( mg / k g ) Animal N umb er d ay( s ) af ter ad minis tration NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2102 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD G NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2104 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2105 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2201 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 2202 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD G2 5, NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD N AD : No Abnormality D etected DLA : Decreased Locomotor Activity (End)

36 Append ix B od y w eig hts of male in ad d itional tes t. ( I nd iv id ual) Male G roup D os e ( mg / k g ) N o. d ay( s ) af ter ad minis tration G Mean S.D G2 5, Mean S.D

37 Append ix B od y w eig hts of f emale in ad d itional tes t. ( I nd iv id ual) Female G roup D os e ( mg / k g ) N o. d ay( s ) af ter ad minis tration G Mean S.D Death Death G2 5, Death Death Mean S.D

38 Append ix N ec rops y f ind ing s of male in ad d itional al tes t. ( I nd iv id ual) Animal N o G roup : G 1 D ose : 0 mg/k g Terminal Sac rif ic e Animal N o G roup : G 1 D ose : 0 mg/k g Terminal Sac rif ic e Animal N o G roup : G 1 D ose : 0 mg/k g Terminal Sac rif ic e Animal N o G roup : G 1 D ose : 0 mg/k g Terminal Sac rif ic e Animal N o G roup : G 1 D ose : 0 mg/k g Terminal Sac rif ic e Animal N o G roup : G 2 D ose : 5, 000 mg/k g Terminal Sac rif ic e Animal N o G roup : G 2 D ose : 5, 000 mg/k g Terminal Sac rif ic e Animal N o G roup : G 2 D ose : 5, 000 mg/k g Terminal Sac rif ic e Animal N o G roup : G 2 D ose : 5, 000 mg/k g Terminal Sac rif ic e Animal N o G roup : G 2 D ose : 5, 000 mg/k g Terminal Sac rif ic e Male

39 Append ix N ec rops y f ind ing s of f emale in ad d itional tes t. ( I nd iv id ual) Animal N o G roup : G 1 D ose : 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Animal N o G roup : G 1 D ose : 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Animal N o G roup : G 1 D ose : 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Animal N o G roup : G 1 D ose : 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Animal N o G roup : G 1 D ose : 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Animal N o G roup : G 2 D ose : 5,00 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Animal N o G roup : G 2 D ose : 5,00 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Animal N o G roup : G 2 D ose : 5,00 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Animal N o G roup : G 2 D ose : 5,00 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Animal N o G roup : G 2 D ose : 5,00 0 mg/ kg Terminal Sacrific e Female : Day 1 : Day

40

41 피 부 자 극 시 험 1-Methyl-1-propanethiol

42 가. 연구방 법 ( 1) 시 험 물 질 1) 명 칭 : 1-Methyl-1-propanethiol 분자식 : CH 3 CH 2 CH(SH)CH 3 분자량 : CAS No. : 공급원 : 산업안전보건연구원 화 학물질 안전보건센터 제조사 : TOKYO KASEI Lot No.: XX249 입수일 : 2006년 5월 3일 입수량 : 500mL 순 도 : 자료없음 녹는점 : 자료없음 보관조건 : 실온 보관장소 : GLP 시약조제실 성 상 : 무채색 액체 안정성 : 상온 상압에서 안정함 취급시 주의사항 : 열, 화염, 스파크 및 기타 점화원을 피할 것. 용기가 열 에 노출되면 파열되거나 폭발할 수도 있음. 상수도 및 하수도에서 떨어진 곳에 둘것 유효기간 : 자료없음 ( 2 ) 시 험 물 질 조 제 시험물질은 액상으로 별도의 조제를 실시하지 않고, 공급된 원액 상태 그대로 사용하였다. ( 3 ) 시 험 물 질 분 석 시험의뢰자가 제공한 시험물질 정보에 기초하여 별도로 실시하지 않았고, 조 제된 시험물질에 대한 안정성 및 균질성 분석도 별도로 실시하지 않았다

43 ( 4 ) 시 험 계 1) 동물종(계통) 동물종 : 암컷, New Zealand White Rabbit 2) 공급원 명 칭 : 샘타코 바이오 코리아 주 소 : 경기도 오산시 서랑동 ) 구입동물수(성별), 주령 및 체중범위 4마리 (암컷) 3 5개월령, kg 4) 투여시 동물수(성별), 주령 및 체중범위 3마리 (암컷) 3 5개월령, kg 5) 시험계 선택이유 본 시험에 사용된 토끼는 피부자극 시험에 일반적으로 많이 사용되는 종 으로서 본 계통에 관해서는 비교적 풍부한 시험기초자료가 있어 시험결과 의 해석및 평가가 용이하여 선택하였다. 6) 순화 및 검역 입수일로부터 7일간의 순화기간 중 매일 일반증상을 관찰하여 건강한 동 물만을 선발한 후 경배부의 털을 제모하여 피부에 이상이 없는 동물만을 시험에 이용하였다. 6) 개체식별 사육상자에는 시험번호, 시험물질, 성별, 개체번호, 시험번호 및 시험책임 자를 기재한 개체식별카드를 부착하였다. ( 5 ) 사 육 환 경 및 관 리 1) 환경 본 시험의 환경은 온도 22 24, 상대습도 %, 환기횟수 회/hr, 조명시간 12시간 (오전 8시 오후 8시), 조도 Lux의 동물 사육실에서 사료와 음용수를 급여하여 순화 및 시험기간 동안 격리 사육 하였다. 2) 사육환경 모니터링 시험기간 중 동물실의 온 습도는 자동 측정기에 의하여 매 30분 마다 측정 되었으며, 조도 등의 환경조건은 정기적으로 측정되었다. 동물실의 환경

44 측정 결과 시험에 영향을 미칠 것으로 사료되는 변동은 없었다. 3) 사육조건 순화, 검역 및 시험기간동안 3단 3열의 사육상자대에 배열된 스테인레스제 사육상자( mm, 정도산업 제작)에 개체별로 수용하였다. 4) 사료 및 음용수 사료는 실험동물용 토끼사료{(주)퓨리나코리아(경기도 평택시 장당동 85-1)}를, 물은 음용수를 자유 섭취시켰다 ( 6 ) 시 험 방 법 1) 시험물질의 투여 공급된 원제 상태 그대로 토끼 피부에 적용하였다. 2) 시험군의 구성 건강한 암컷동물 3마리를 이용하여 시험하였으며, 각 동물의 배부에 약 2.5cm 2.5cm 정도의 크기로 척추를 중심으로 좌우 각각 2개소를 설정하 여, 상부의 찰과부위 1개소와 비찰과부위 1개소는 시험물질을 도포하는 처 치구획으로, 하부의 2개소는 무처치 대조구획으로 정하여 시험하였다. 3) 투여방법 시험물질의 적용은 24시간 전에 제모를 실시하여 다음과 같이 처치구획 및 대조구획으로 구분하였다. 시험물질은 시험동물 당 찰과부위 2개소 (Figure 1. (a), (d))와 비찰과부위 2개소(Figure 1. (b), (c))로 하여 상부의 찰과부위 1개소와 비찰과부위 1개소에 상기 1)번 항의 조제법에 의해 시험 물질을 적용하였으며, 무처치 대조구획에는 멸균 생리식염수를 0.5 ml을 적용하였다. 적용 후 처치구획과 대조구획은 거어즈로 덮은 후 비자극성인 테가덤(Tegaderm, 3M)을 이용하여 잘 고정하고 코반(Corban, 3M)으로 완 벽하게 고정하여 4시간 동안 노출시켰다. 시험물질 적용 후 미온수를 이용 해 적용부위를 부드럽게 세정해 주었다. 시험물질의 적용은 아래와 같이 처치구획 및 대조구획으로 구분하였다

45 Figure 1. 피부처치부위 2.5 cm <H ead> 2.5 cm (a) Test site (b) (c) Control site (d) <T ail> ( a) : 시료 (Test s ite), 정상 피부( Intact skin), (b) : 시료(Test site), 상처피부(Abraded skin), (c) : 대조군(Control site), 상처피부(Abraded skin) (d) : 대조군(Control site), 정상피부(Intact skin) ( 7 ) 관 찰 및 검 사 항 목 1) 일반증상관찰 시험물질 적용 후 72시간까지 일반증상의 변화, 중독증상 및 사망동물의 유무를 관찰하였다. 2) 체중측정 시험물질 적용직전, 적용 후 24시간 및 72시간째에 개체별 체중을 측정 하였다. 3) 적용부위관찰 시험물질 도포종료 후 적용부위의 패취를 제거하여 1, 24, 48 및 72시간째 에 홍반, 가피형성 및 부종 등의 자극성 유무를 관찰하였다

46 ( 8 ) 피 부 반 응 의 평 가 및 자 극 성 의 판 정 피부반응의 평가는 피부반응의 평가표에 준하여 실시하였다. (Table 1.) 1. 홍반과 가피형성 ( T ab le 1. ) 피 부 반 응 평 가 표 o 홍 반 이 전혀 없 음 0 o 아 주 가 벼 운 홍 반 ( 육 안으 로 겨 우 식 별 할 정 도 ) 1 o 분 명 한 홍 반 2 o 약간 심 한 홍 반 3 o 심한 홍반(홍당무색의 발적)과 가벼운 정도의 가피 4 * 총 가 능 한 홍 반 점 수 4 2. 부종형성 o 부 종 이 전혀 없 음 0 o 아 주 가 벼 운 부 종 ( 육 안으 로 겨 우 식 별 할 정 도 ) 1 o 가벼운 부종(뚜렷하게 부어 올라서 변연부가 분명히 구분 될 경 우 ) 2 o 보통 의 부 종 ( 약 1mm 정 도 부 어 올 랐 을 경 우 ) 3 o 심한 부종(1mm이상 부어오르고 노출부위 밖에 까지 확 장된 상 태 ) 4 * 총 가 능 한 부 종 점 수 4 나. 결 과 ( 1) 일 반 증 상 및 사 망 률 ( T ab le 2 ) 모든 처치동물에 있어서 어떠한 임상증상이나 빈사 및 폐사 동물은 관찰되지 않았다. ( 2 ) 체 중 변 화 ( T ab le 3 ) 시험물질 적용직전, 적용 후 24시간과 72시간째에 개체별 체중을 측정한 결 과, 특이할 만한 체중의 변화는 관찰되지 않았다

47 ( 3 ) 적 용 부 위 관 찰 ( T ab le 4 ) 시험물질 노출 종료 후 1, 24, 48시간과 72시간째에 적용부의 국소자극성을 관찰한 결과, 시험물질 처치부위에 약간 심한 홍반과 가벼운 부종이 관찰되었 다. 다. 고 찰 1-Methyl-1-propanethiol에 대한 피부자극성을 조사하기 위하여 3마리의 New Zealand White계 암컷토끼에 시험물질을 4시간 도포한 후 72시 간 동안의 사망 률, 일반증상, 체중변화 및 국소피부자극성을 평가하였다. 본 시험기간 중 일반증상 및 체중변화에 있어서 시험물질 적용직전, 적용 후 1, 24, 48시간과 72시간째에 개체별 체중을 측정한 결과, 일반적인 체중 증체 변화 외에 특이한 이상은 관찰되지 않았다. 시험물질 노출 종료 후 1, 24, 48 및 72시간째 적용부위에서 약간 심한 홍반과, 가벼운 부종이 관찰되었다. 이상의 결과로 보아 New Zealand White계 토끼에 있어서 1-Methyl-1- propanethiol의 피부적용은 약간 심한 홍반과 가벼운 부종이 관찰되어 중등도 자 극성 물질(P.I.I. "3.08")인 것으로 판단되었다

48 T ab le 2. Mortality and c linic al s ig ns Animal N o. D ays af ter applic ation D ay 1 D ay 2 D ay 3 Mortality /3 a : Normal a : No. of dead animals/no. of tested animals- T ab le 3. B od y w eig hts Animal N o. D ay( s ) af ter applic ation ( g ) D ay 0 D ay 1 D ay Mean S. D

49 T ab le 4. R es ults of s k in reac tion C hang e P has e 1 ( hr) Animal N o. C ontrol Sites Erythema & Eschar O ed ema I ntac t Ab rad ed I ntac t Ab rad ed Total Mean Sum of means at 24 and 72hr 0 P.I.I. a 0 C hang e P has e 1 ( hr) Animal N o. T es t Sites Erythema & Eschar O ed ema I ntac t Ab rad ed I ntac t Ab rad ed Total Mean Sum of means at 24 and 72hr P.I.I. a : T ime af ter topical applic ation a : Primary irritation index : the sum of means in erythema & eschar and ed ema/4-35 -

50 F ig ure 2. Sk in af ter topic al applic ation at 2 4 hr F ig ure 3. Sk in af ter topic al applic ation at 7 2 hr

51 소 핵 시 험 1-Methyl-1-propanethiol

52 가. 연구방 법 ( 1) 시 험 물 질 및 대 조 물 질 1) 시험물질 명 칭 : 1-Methyl-1-propanethiol 분자식 : CH 3 CH 2 CH(SH)CH 3 분자량 : CAS No. : 공급원 : 산업안전보건연구원 화 학물질 안전보건센터 제조사 : TOKYO KASEI Lot No.: XX249 입수일 : 2006년 5월 3일 입수량 : 500mL 순 도 : 자료없음 녹는점 : 자료없음 보관조건 : 실온 보관장소 : GLP 시약조제실 성 상 : 무채색 액체 안정성 : 상온 상압에서 안정함 취급시 주의사항 : 열, 화염, 스파크 및 기타 점화원을 피할 것. 용기가 열 에 노출되면 파열되거나 폭발할 수도 있음. 상수도 및 하수도에서 떨어진 곳에 둘것 유효기간 : 자료없음 2) 음성대조물질 : Corn oil CAS No. : 입수처 : Sigma Chemical Co. Lot No. : 074K0025 보관조건 : 실온 3) 양성대조물질 : Cyclophosphamide (CPA) CAS No. : 입수처 : Sigma Chemical Co

53 Lot No. : 075K1661 순도 : 98 % 보관조건 : 냉장 4) 용매 및 양성대조물질 선택이유 시험물질은 난용성이기 때문에 Corn oil을 부형제로 선택하고 시험물질의 희석에 사용한다. 양성대조물질은 OECD 가이드라인에 예시되어 있는 물 질을 선택한다. 5) 시험물질의 분석 시험물질 및 양성/음성, 용매 시험 물질의 분석 및 안정성 분석은 실시하 지 않았다. 나. 재 료 및 방 법 ( 1) 시 험 계 1) 종 및 계통 : CrjBgi:CD1(ICR)-IGS(Mouse), SPF 2) 공급원 명 칭 : 오리엔트 소재지 : 경기도 가평군 북면 목동리 ) 입수 시 동물수 및 체중범위 : 수컷 6주령, 35마리수컷 21.90~27.80 g 4) 시험계의 선정이유 소핵시험에 널리 사용되고 있으며 소핵시험에 대해 축적된 기초자료가 많 으므로 선택하였다. ( 2 ) 군 분 리 및 개 체 식 별 검역 및 순화기간을 거친 후 체중감소 및 일반증상에 이상이 없는 건강한 동 물만 선별한 후 투여 1일전의 체중을 기초로 하여 무작위법으로 각 군의 평 균체중이 가능한 균등하도록 군을 구성하였다

54 1) 시험군의 구성(본시험) 성 군번호 투 여 군 사 용 동 물 수(동물번호) Male GM 0 용매대조군 GM mg/kg GM 2 1,000 mg/kg GM 3 2,000 mg/kg GM 4 양성대조군(CPA) 6 마리 (1001, 1002, 1003, 1004, 1005, 1006) 6 마리 (110 1, 110 2, 110 3, 110 4, 110 5, ) 6 마리 (1201, 1202, 1203, 1204, 1205, 1206) 6 마리 (1301, 1302, 1303, 1304, 1305, 1306) 6 마리 (1401, 1402, 1403, 1404, 1405, 1406) 2) 개체식별 - 검역, 순화기간 : 검역은 동물 도입 시에 행하며 순화기간은 7일로 하였 으며, 동물개체는 꼬리 부분에 검은색 유성 펜으로 색칠하여 식별하고 케 이지에도 개체식별번호를 붙였다. - 투여기간 : 동물개체에 붉은색 유성 펜으로 동물 꼬리 부분에 표시하여 식별하였다. ( 3 ) 사 육 환 경 1) 환경 본 시험의 환경은 온도 , 상대습도 %, 환기횟수 10 15회/hr, 조명시간 12시간 (오전8시 오후8시), 조도 Lux의 동물사육실에서 사료와 음용수를 급여하여 순화 및 시험기간 동안 격리 사육하였다. 2) 사육환경 모니터링 시험기간 중 동물실의 온 습도는 자동 측정기에 의하여 매 30분 마다 측정 되었으며, 조도 등의 환경조건은 정기적으로 측정되었다. 동물실의 환경 측정결과 시험에 영향을 미칠 것으로 사료되는 변동은 없었다. 3) 사육조건 순화 및 시험기간 중 Polysulfone cage(500Ⅹ300Ⅹ200 mm, Three shine) 에 6마리씩 넣어 사육하였다. 시험기간 중 사료와 음용수는 자유 급식시켰 다. 4) 사료 및 음용수

55 사료는 방사선(2.0 Mrad)멸균 된 실험동물용 쥐사료{(주)퓨리나코리아 (경 기도 평택시 장당동 85-1)}를, 물은 자외선 살균처리 된 음용수를 자유섭 취 시켰다. 음용수에 대하여 본 한국화학시험연구원에서 오염물질의 검사 를 실시한 결과 시험에 영향을 미치는 요인은 발견되지 않았다. ( 4 ) 시 험 방 법 1) 순서 투여농도를 결정하여 1회 시험물질을 복강 투여하고, 24시간 후에 도살하 여 대퇴골을 절취한 후, Fetal bovine serum (FBS, GIBCO)을 사용하여 대퇴골에서 골수세포를 추출하여 세포의 도말표본을 만들어 고정 염색하 였다. 현미경을 사용하여 표본을 관찰하여 다염성 적혈구중의 소핵출현빈도 및 전체 적혈구중의 다염성 적혈구의 비율을 구하였다. 2) 표본 제작 시기 표본 제작 시기는 시험물질투여 후 24시간 후로 하였다. 3) 표본의 제작 부검실로 동물을 옮긴 후 경추 탈골하여 되도록 혈액이 묻지 않게 하여 대퇴골을 적출한 후, FBS를 사용하여 골수세포를 원심 관에 씻어 모은 후 1000 rpm에서 5분간 원심 분리시켜 상등액을 버리고 소량의 혈청으로 세 포를 현탁 시킨 다음 세포현탁액을 도말하여 실온에서 건조시킨 후 메탄 올로 5분간 고정하였다. 4) 표본의 염색 메탄올로 고정된 표본을 acridine orange액 40 μg/ml로 점적하고 cover glass를 덮어서 형광 염색하였다. 5) 표본의 관찰 표본의 관찰은 맹검법 (blind method) 으로 하되 400배 이상 배율에서 형 광현미경으로 관찰하였다. 6) 소핵의 판정기준 - 다염성 적혈구의 구별 관찰 시야에서 핵이 없이 적색 형광 빛을 보이는 것을 다염성 적혈구로 하였다. - 정염성 적혈구의 구별

56 관찰시야에서 다염성 적혈구의 크기로 형광 빛을 전혀 나타내지 않고 음영으로만 구분되는 것으로 구별하였다. - 소핵의 판정기준 크 기 : 제일 큰 것은 적혈구 직경의 1/2로, 제일 작은 것은 식별이 가능한 것까지로 하였다. 형 태 : 주로 원형이나 기타 도너츠형, 반원형 등의 형태의 것을 포 함시겼다. 색 깔 : 근접한 유핵세포의 핵과 동일하게 녹색 형광빛을 띠는 것으 로 하였다. - 표본의 관찰 세포도말상태가 좋은 곳을 선택하여 다염성적혈구 (PCE) 2000개에서 소 핵을 갖는 세포를 계수한다. 또 전체 적혈구 (다염성적혈구 및 정염성 적 혈구) 200개를 관찰하여 그 중 다염성 적혈구의 비율을 계측하였다. 7) 통계처리 용매대조군에 대한 시험물질의 투여군의 소핵출현빈도의 유의차 검정은 5 % 유의 수준 에서 실시하였다. 다. 시 험 결과 ( 1) 사 육 관 리 7일간의 검역 및 순화를 행하고 건강한 동물 수컷 30마리에 대해 군구성을 실시하였다. 군구성 시 모든 동물의 체중의 범위는 ~ g이었다. 군구성에 의해 구성된 각 군의 평균체중은 표와 같았다. 성 군 번 호 투여군 사용 동물수 평균체중 (mean ± S.D., g) GM 0 용매대조군 6 마리 ± 1.01 GM mg/kg 6 마리 ± 0.92 Male GM mg/kg 6 마리 ± 0.89 GM mg/kg 6 마리 ± 0.99 GM 4 양성대조군(CPA) 6 마리 ±

57 ( 2 ) 시 험 물 질 의 투 여 1-Methyl-1-propanethiol은 corn-oil에 용해하여 체중 kg당 10 ml을 투여량 으로 하였다. ( 3 ) 소 핵 관 찰 결과 소핵시험의 결과는 다음의 표(Table 1, Appendix 1)와 같았다. 음성대조군의 다염성 적혈구중 소핵을 갖는 적혈구의 출현빈도는 0.05 ± 0.03 (%)이었으며, 500 mg/kg 투여군의 소핵출현빈도는 0.06 ± 0.03 (%), 1000 mg/kg 투여군의 빈도는 0.09 ± 0.04 (%), 2000 mg/kg 투여군의 빈도는 0.11 ± 0.04 (%), 양성 대조군의 빈도는 3.82 ± 0.29 (%)의 빈도를 나타내었다. 즉 시험물질을 투여 한 각 군에 있어서 다염성 적혈구중 소핵을 갖는 적혈구의 출현빈도는 음성 대조군에 비해 모든 투여군에서 소핵출현빈도는 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다. 한편 양성대조군에서는 소핵 빈도에서 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의하며 현저한 증가가 나타났다(P<0.01). 세포독성의 지표인 PCE/(PCE+NCE) 비율은 위와 같은 순서로 평균 50.84, 51.23, 50.96, 및 49.53이었으며, 음성대조군에 비해 모든 투여군에서 통계학적인 차이는 없 었다. 모든 시험군에서 부검 당일까지 사망 동물은 없었으며, 투여시와 부검시의 체 중을 비교한 결과 어느 투여군에서도 음성대조군에 비해 통계학적인 유의성 은 없었다(Table 2, Appendix 2). 라. 고 찰 시험물질 1-Methyl-1-propanethiol에 대한 개체상태에서의 염색체 변이를 확인 하기 위하여 마우스의 복강에 단회 투여하여 소핵의 발생유무를 확인하여 보았다. 시험구성은 음성대조, 양성대조 및 시험물질 투여군 3군으로 구성하여 용매, 양성 대조 및 시험 물질을 투여하였다. 음성대조군에 비하여 소핵의 발생빈도는 큰 차 이를 보이지 않았다

58 T ab le 1. Mic ronuc leus tes t of 1-Methyl-1-propanethiol in I C R mic e ( G roup s ummary) Sex Chemical Treated Dose (mg/kg) No. of Animal MNPCE/2000PCE's (Mean±S.D., %) PCE/(PCE+NCE) (Mean±S.D., %) Vehicle ± ± 0.94 Test items ± ± 0.72 Male Test items ± ± 0.74 Test items ± ± 1.20 CPA ± 0.29 * ± 0.74 * Significantly different from the control at P<0.01 Vehicle : Corn oil MNPCE : PCE with one or more micronuclei PCE : Polychromatic erythrocyte NCE : Normochromatic erythrocyte CPA : Cyclophosphamide (positive control) T ab le 2. B od y w eig hts of animals ( G roup s ummary) Sex Chemicla Treated Dose (mg/kg) Body weights (mean±s.d. g) at the time of Adiministration (No. of animal) Sacrifice(No. of animal) Vehicle ± 1.01 (6) ± 1.05 (6) Test item ± 0.92 (6) ± 0.74 (6) Male Test item ± 0.89 (6) ± 1.14 (6) Test item ± 0.99 (6) ± 1.47 (6) CPA ± 0.95 (6) ± 1.45 (6) CPA : Cyclophosphamide (positive control)

59 Append ix 1. Mic ronuc leus tes t of 1-Methyl-1-propanethiol in I C R mic e ( I nd iv id ual d ata) chemical Treated Dose (mg/kg) Animal No. PCE's MNPCE frequency of MNPCE (%) No. of PCE/NCE PCE/ (PCE+NCE) / / Vehicle / / / / / / Test item / / / / / / Test item / / / / / / Test item / / / / / / CPA / / / / Vehicle : Corn oil MNPCE : PCE with one or more micronuclei PCE : Polychromatic erythrocyte NCE : Normochromatic erythrocyte CPA : Cyclophosphamide (positive control)

60 Append ix 2. B od y w eig hts of animals ( I nd iv id ual d ata) Chemicla Dose Animal Body weights (g) at the time of Treated (mg/kg) No. Adiministration Sacrifice Vehicle Test item Test item Test item CPA CPA : Cyclophosphamide (positive control)

61 Ⅲ. 결 론 급 성 경 구 독 성 시 험 1-Methy-1-propanethiol를 투여량 2,000 mg/kg B.W.과 mg/kg B.W로 설정하여 급성 경구 독성 시험을 수행 한 결과 2,000 mg/kg B.W. 사망동물은 관 찰되지 않았으며, 시험물질 투여군에서 활동력 저하(decreased locomotor activity) 증상이 관찰되었다. 체중변화에 있어서는 대조군에 비해 유의성 있는 변화는 인정 되지 않았으며, 부검결과 시험물질 투여와 관련된 어떠한 이상 소견도 관찰되지 않았다. 시험물질 5,000 mg/kg B.W.를 추가시험 실시한 결과 수컷은 사망동물이 관찰되지 않았고, 암컷은 2마리의 사망동물이 관찰되어 1-Methy-1-propanethiol 에 대한 LD 50 은 암 수 모두 5,000mg/kg B.W.이상으로 판단된다. 그러므로 본 시 험물질은 화학물질 분류 및 표지에 관한 세계조화시스템(Globally Harmonization System of classification and Labeling of chemicals, GHS)의 분류기준에 따라 unclassified로 분류되었다. 피 부 자 극 시 험 N ew Z ealand White계 토끼에 있어서 1-Methyl-1-propanethiol의 피부 적용은 시험물질 노출 종료 후 1, 24, 48 및 72시간째 적용부위에서 약간 심한 홍반과 가 벼운 부종이 관찰되어 중등도 자극성 물질(P.I.I. "3.08")인 것으로 판단되었다. 소 핵 시 험 시험물질 1-Methyl-1-propanethiol 의 투여군에 있어서 다염성 적혈구중 소핵 을 갖는 적혈구의 출현빈도를 용매대조군과 비교하여 볼 때, 통계적으로 유의하게 증가하는 투여 농도군은 확인되지 않았다. 따라서 1-Methyl-1-propanethiol은 본 시험조건에서 마우스 골수세포에 대해 소핵을 유발하지 않는 것으로 판단된다

62 참고 문 헌 국립환경연구원 (1998): 화학물질유해성시험연구기관의지정등에관한규정. 국립환경 연구원고시 제 호. 한국화학시험연구원 표준작업지시서, 2006 식품의약품안전청 (2005): 의약품등의 독성시험기준, 식품의약품안전청 고시 호. 한국산업안전공단, MSDS (2004) Draize JH, Woodard G and Calvery HO. (1944): Methods for the study of irritation and Toxicity of substance applied topically to the skin and mucous membranes. J Pharmacol Exp Ther, 82: Biolog ic al evaluation of medical d ev ice-part 10 : T ests f or irritation and sensitization. ISO : 1995(E) OECD Guidelines for testings of chemicals "404", Acute Dermal Irritation (Adopted : )

63 본 연구보고서에 기재된 내용은 연구책임자의 개인적 견해이며, 우리 공단의 공식견해가 아님 을 알려드립니다. 한국산업안전공단 이사장 화학물질의 유해 위험성 평가사업 수행을 위한 급성독성, 피부자극, 소핵시험연구 (3) (연구원 ) 발 행 일 : 2006년 12월 20일 발 행 인 : 산업안전보건연구원 원장 박 두 용 연구책임자 : 한국화학시험연구원 안전성평가센터 성하정 발 행 처 : 한국산업안전공단 산업안전보건연구원 주 소 : 경기도 김포시 월곶면 고막리 7-6 전 화 : (031) F A X : (031)