Kor. J. Microbiol. Biotechnol. Vol. 35, No. 4, 316 324(2007) 제니스테인에의한노화된피부세포활성화와콜라겐생성효과 양은순 1 홍란희 2 강상모 1,3* 1 건국대학교대학원생물공학과, 2 중앙대학교의과대학예방의학교실, 3 건국대학교미생물공학과 The Effect of Genistein on the Proliferation and Type I pn Collagen Synthesis in Aged Normal Human Fibroblasts. Yang, Eun-Soon 1, Ran-Hi Hong 2, and Sang-Mo Kang 1,3. 1 Department of Bioengineering, graduate School at KonKuk University, 2 Department of Preventive Medicine, College of Medicine, ChungAng University, 3 Department of Microbial Engineering, KonKuk University We studied the effects of genistein obtained from glycolysis of genistin, a kind of phytoestrogen present in soybeans, on cell proliferation and type I pn collagen synthesis in normal human dermal fibroblasts(nhdf). Cell proliferation was increased significantly with genistein treatment at 54-year aged NHDF. Genistein increased cell proliferation more strongly in cells form old doner than young doner. The senescence-associated β-galatosidase activity was decreased in NHDF from 77-year old doner with genistein treatment. Type I pn collagen synthesis was increased with genistein treatement in UVA treated and non-treated NHDF. The increasement of collagen synthesis was more effective in aged cells than young cells. Type I pn collagen synthesis was also increased with genistein treatment in collagen matrix culture with NHDF from sun-exposed and non-exposed skin from 54-year old doner. Genistein treatment inhibited MMP-1 synthesis in old NHDF but not in young NHDF. In conclusion, genistein may be a useful agent for preventing intrinsic aging as well as photoaging. Key words: Genistein, collagen, aging, photoaging, fibroblast 서 피부의노화는자연노화와광노화로나눈다. 피부가노화가됨에따라여러가지대사활성이저하되며세포활성도떨어진다. 콜라겐합성과콜라겐의전사이후에일어나는과정도자연노화로감소한다 [24]. Transforming growth factorβ(tgf-β), epidermal growth factor, fibroblast growth factor와같은성장호르몬도노화에의해감소된다 [4]. 피부는노화됨에따라얇고, 건조해지며주름지게된다. 노화된피부에서는정상적인표피분화는일어나지만, 각질형성세포의분열감소로얇아지게된다. 진피또한결합조직의감소로얇아지게된다. 피부의결합조직은주로콜라겐과엘라스틴등에의해이루어진다. 진피섬유아세포는 matrix안에들어있다. 콜라겐과엘라스틴은피부에탄성과힘을주며이들이노화로약해지면피부는쉽게손상되고늙는다. 반복적인자외선노출로피부의 matrix metalloproteinases (MMPs) 가증가하며, 증가된 MMPs는피부의콜라겐을분해하게된다. 이런현상의반복은피부주름을형성시키게된다 [9]. 여성의경우, 폐경기이후에가속화되는피부의자연노화 론 *Corresponding author Tel: 82-2-450-3524, Fax: 82-2-3437-8360 E-mail: kangsm@konkuk.ac.kr 는에스트로겐과같은호르몬의결핍이주요한인자이다. 에스트로겐의결핍은자연노화뿐아니라, 자외선등환경에의한피부노화도가속화시킨다. 에스트로겐은콜라겐합성을촉진하며, 피부두께를유지시키고, 피부보습력을증가시키는등여러작용으로피부를개선시킨다. 따라서호르몬보충요법 (hormone replacement therapy) 를받는여성은그렇지않은여성에비해피부탄력이증가하고, 주름이개선되었다는보고 [27] 도있다. 한편, 광노화는조금다른과정을거친다. 광노화의주요한원인은자외선이며자외선에의해생성되는 tumor necrosis factor-α, tumor necrosis factor-γ, nitric oxide, 인터루킨등은피부에서콜라겐의합성을억제하며, 콜라겐을분해하는효소들의발현을증가시킨다. 이러한특징적인변화들은광노화를유도하며피부홍반, 거칠기, 주름및흑화를만들게된다 [10]. 피부의주요한구성성분은콜라겐이다. 콜라겐은진피건조중량의 70-80% 를차지한다. 사람의진피중 type I, III 콜라겐이주요한성분이며 type I 은총콜라겐의 80% 를, type III 는 15% 를차지한다. 피부의주름은콜라겐의합성과분해의불균형에기인한다. 보통피부에서 type I 콜라겐의합성과그분해효소인 MMP-1 이균형을이루고있다. 그러나광노화된피부에서는 type I, III 콜라겐의합성이저하되고, MMP-1 의활성이증가되어있다 [32]. 식물에서유래되고비스테로이드성이며약한에스트로겐
INHIBITORY EFFECTS OF GENISTEIN ON SKIN AGING 317 성활성을지닌물질을식물성에스트로겐 (phytoestrogen) 이라부른다. 자연계에는많은식물성에스트로겐이발견되는데주로향신료, 콩류, 곡류, 과일, 야채, 허브등에풍부하다. 화학적으로식물성에스트로겐은이소플라본 (isoflavone), 쿠메스탄 (coumestan), 리그난 (lignan) 으로구분된다 [16]. 식물성에스트로겐은구조적으로는여성호르몬인에스트로겐과비슷하여에스트로겐수용체와결합하며, 에스트로겐에대하여작용제 (agonist) 혹은길항제 (antogonist) 로서작용한다 [29]. 이소플라본은대두에서많이발견되는식물성에스트로겐으로대두의종류및대두가공품에따라차이는있지만건조무게 (g) 당 0.2-1.6 mg 이소플라본이함유되어있다. 대두의이소플라본은당이붙어있는배당체 (glycoside; genistin, daidzin, glycitin), acetylglucoside 및 malonylglucoside 의형태이며, 가공정도에따라당이떨어져나간비배당체 (algycone) 형태로바뀔수도있다. 대두제품섭취후당결합형태인이소플라본은장내의 β-glucosidase 에의해가수분해되어활성형의비배당체형태이소플라본으로흡수된다 [30]. 이러한비배당체로는주로제니스테인 (genistein), 다이드제인 (daidzein), 글리시테인 (glycitein) 등이있으며, 갱년기장애를위한기능성식품으로는시판되고있는이소플라본은배당체와비배당체모두사용되고있다. 또한이들이소플라본은피부두께증가효과 [28] 및히알루론산합성증가효과 [20] 가있어화장품에첨가하여사용하고있다. 대두배당체로부터얻을수있는제니스테인, 다이드제인과글리시테인은많은연구들이되어있다. 다이드제인은약한에스트로겐효과 [19], 섬유아세포증식효과 [33], 히알루론산생성촉진효과 [20] 가보고되어있으며, 글리시테인도약한에스트로겐효과 [31] 와항산화효과 [13] 가보고되어있다. 그러나이들 2 가지식물성에스트로겐은여러가지면에서기능적으로제니스테인만큼효과적이지못한것으로보인다. 제니스테인은주로콩, Ginkgo biloba extract, Greek oregano 그리고 Greek sage 등에도많이존재하는데피부에서항산화와항암효과를지니고있는것으로보고된바있으며 [1], 인체각질형성세포주인 NCTC 2544 에제니스테인을처리하였을때자외선에의해유도되는 activator protein-1(ap-1) 의결합을억제하여지질과산화를억제하고활성산소생성을차단하였다 [18]. 또한제니스테인은쥐와사람에서자외선에의한피부암과광손상을억제하는것으로나타났다 [36, 37]. 피부에서 MMPs 의합성을억제하고콜라겐의합성을촉진하여피부광노화를개선하거나억제하는것으로알려진비타민 A 는자연노화된피부에서도동일한효과를지니며이는노화가많이진행된경우더욱효과적이었다 [34]. Greenwel 등 [11] 은사람의정상섬유아세포에서제니스테인이 tyrosine kinase 와상호작용하여콜라겐합성을촉진함을보고한바있다. 본연구에서는화장품에첨가하여피부미용제로사용하고있는이소플라본중특히효과가가장크다고생각되는제니스테인에대하여피부미용효과특히비타민 A 와같은효과가있는지확인해보고자하였다. 따라서지금까지보고되지않은나이에따른피부세포특히노화된피부세포및이에자외선을조사하여제니스테인이세포의활성, type I pn 콜라겐의합성에어떤영향을미치는가와 MMP-1 의합성에미치는영향에대해서조사하여비타민 A 와같이자연노화를억제할수있는지에대해알아보았다. 재료및방법 세포배양 0세, 22세, 39세, 54세및 77세된여성의주로엉덩이피부에서섬유아세포를얻었다 ( 모든피험자에게는문서화된동의서를얻었다 ). 얻어진피부에서지방층을제거한후 2-4 mm 2-4 mm 크기의절편으로조각낸뒤, type I collagenase(0.1% W/V in phosphate buffered saline, Gibco BRL, USA) 용액을가하여 37 o C에서 12시간정치하였다. 이후 type I collagenase 용액을제거한뒤, 표피를제거한후진피를수술용칼로잘게조각낸후 Dulbecco's modified Eagle's medium(dmem, Gibco BRL, USA) 배지를넣고, 75 cm 2 티슈플라스크에정치하였다. 그리고조각난티슈에서세포가피부조직밖으로배출되어플라스크안에서자라면이를회수하여실험에사용하였다. 세포는 DMEM 배지에, 0.48 mg/ml glutamine, 100 IU/mL penicillin, 50 ug/ml streptomycin과 10% fetal bovine serum(fbs, Hyclon, USA) 를첨가한후 37 o C, 5% CO 2 조건하에서배양하였다. 실험은 4에서 10계대의섬유아세포를사용하였다. 단층배양과콜라겐매트릭스에서배양한세포를이용하여세포생장과콜라겐및 MMP-1의합성량을측정하였다 [5]. 세포의 β-galactosidase 염색노화로증가되는 β-galactosidase(senescence-associated β-galactosidase, SA-β-Gal) 활성은 senescent cell staining kit(sigma, USA) 를사용하여염색하였다. 35 mm culture dishes에섬유아세포를 1 10 5 cells를 seeding한후 2주간제니스테인을 10-7 M 농도로넣은 DMEM 배지로키웠다. 2주뒤에 phosphate buffered saline(pbs) 으로 wash한후, 0.2% glutaraldehyde와 2% formaldehyde로 7분간고정시킨후, 40 mm citric acid/phosphate(ph 6.0), 5 mm K 3 FeCN 6, 5 mm K 4 FeCN 6, 150 mm NaCl과 2 mm MgCl 2 에 1 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-d-galactopyranoside 이되도록녹인용액을 CO 2 가없는 37 o C에서 24시간둔후, 파란색으로염색된세포들을광학현미경으로관찰하고사진촬영을하였다.
318 YANG et al. 자외선조사실험에사용된자외선은 UVA 로서 15 J/cm 2 의자외선을 CUBE 401 lamp(uvatec, USA) 를사용하여조사하였다. 자외선을조사하기전에 international light radiometer(il 1700, Newburyport, MA, USA, calibrated against a spectroradiameter and standard lamp) 를이용하여자외선양을측정하였다. 자외선조사전섬유아세포의양은배양플레이트에 80-90% 로차도록키웠으며, DMEM 배지를제거후 PBS로 2회씻어주었다 [35]. 세포증식률세포증식은 Mosmann의방법 [22] 을사용하였다. 섬유아세포를 96-well plate에 well당 6 10 3 개로깔고 5% FBS를첨가한 DMEM 배지에 37 o C에서 18시간동안정치하였다. 세포가붙은이후, 제니스테인 (Sigma, USA) 을 10-7 M의농도로처리하고, 72시간배양한후에 MTT(3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma, U.S.A.) 용액을각 well에 50 µl씩첨가한후 (2 mg/ml) 4시간동안정치하였다. 이후원심분리하여상층액을제거하고, 150 ul의 dimethyl sulfoxide(dmso) 를첨가한후, 10 분간 shaking하여생성된 formazan을녹였다. 이후 DMSO에녹은 formazan을 multi-microplate reader(bio-tek EL310, Bulington, VT, USA) 를이용하여 570 nm에서흡광도를측정하였다. Type I pn 콜라겐합성량측정 Type I pn 콜라겐의합성량측정은 ELISA kit(takara, Japan) 를사용하여측정하였다. 섬유아세포를 24-well multi plate에 well당 5 10 4 개깔고, 10% FBS를첨가한 DMEM 배지에 24시간정치하였다 (ph 7.4). 이후 FBS를첨가하지않은 DMEM배지에제니스테인을 10-7 M 농도로첨가하여 48시간동안배양하고상층액을회수하였다. 그후회수된상층액을이용하여 kit에서제공된 96-well plate에 coating 하고, 4 o C에서 overnight방치한후, TPBS(0.1% Tween 20 in PBS) 로 3회세척하고, 3% bovine serum albumin(bsa in TBPS) 를넣고 2시간 blocking하였다. Primary antibody 인 anti-collagen antibody를 37 o C에서 90분간처리한후, TPBS로 3회세척하였다. Secondary antibody인 anti-mouse IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated) 를 90 분간반응시킨후 TPBS로 3회세척하였다. Alkaline phosphatease substrate solution(1 mg/ml p-nitrophenyl phosphate in diethanolamine buffer) 을상온에서 30분간반응시킨후 microplate reader로 405 nm에서흡광도를측정하였다 [5]. 콜라겐매트릭스내에서 type I pn 콜라겐합성량측정콜라겐매트릭스는 Coulomb B 의방법을변형하여제작하였다 [8]. 열배로농축된 DMEM 배지와 Ham's nutrient mixture F12 배지를 3:1 로혼합한 type I 콜라겐 gel 을 reconstitution buffer 와함께섞어서콜라겐기질을만든후배양한섬유아세포를 1 10 6 cell/well 의수만큼콜라겐기질과혼합하여 24-well plate 에 0.3 ml 씩넣어배양기안에넣고 24 시간방치하여, 섬유아세포에의해콜라겐이충분히응축되도록하였다. 이후 10% FBS 가첨가된 DMEM 배양액을각 well 당 0.5 ml 씩추가하여매트릭스를유지하였다. 제작된콜라겐매트릭스에제니스테인을 10-5 M 농도로 72 시간처리한후, 배양액을회수하여단층배양과동일한방법으로 Takara kit 을사용하여콜라겐합성량을측정하였다. MMP-1 측정 MMP-1 의합성은배양된세포의배양액을채취하여 ELISA kit(boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) 를사용하여측정하였다. 섬유아세포를 24-well multi plate 에 well 당 5 10 4 개넣고, 10% FBS 를첨가한 DMEM 배지에 24 시간정치하였다 (ph 7.4). 이후 FBS 를첨가하지않은 DMEM 배지에제니스테인을 10-7 M 농도로첨가하여 48 시간동안배양하고상층액을회수하였다. 그후회수된상층액을이용하여 kit 에서제공된 96-well plate 에 coating 하고, 4 o C 에서 12 시간정치한후, TPBS 로 3 회세척하고, 3% BSA 를넣고 2 시간 blocking 하였다. 이후 primary antibody 제조부터는전술의 type I pn 콜라겐합성측정법과동일하게하였다 [5]. 통계처리모든자료는 mean ± S.E. 로나타내었고 One-way ANOVA 를사용하여통계처리하여 p<0.05 수준에서유의성을검증하였다. 결과및고찰 제니스테인의노화된피부세포활성화제니스테인은 HepG2 간암세포에서 apoptosis 를유도하거나 [3], 신장암세포의생장을억제하는등여러암세포의생장을억제하는것으로보고된바 [26] 있으나정상인체피부섬유아세포의생장에미치는영향에대해서는보고된바없다. 제니스테인에의한노화된피부섬유아세포의증식효과는 Fig. 1 에나타내었고, 세포의노화를측정할수있는지표인 SA-β-Gal 활성도를 SA-β-Gal 측정 kit 로측정하여 Fig. 2 에나타내었다. Fig. 1 에서대조군으로서여러연령층에서분리된섬유아세포의세포성장을알아보기위해, 제니스테인을처리하지않고세포분열정도를측정하였다. 나이가증가됨에따라서 0 세를 100% 로하였을때, 22 세는 81%, 39 세는 75%, 54 세는 51% 로세포증식이유의적으로감소하였다 (p<0.05). 이들세포에제니스테인을처리하였을
INHIBITORY EFFECTS OF GENISTEIN ON SKIN AGING Fig. 1. The effect of genistein on cell proliferation in normal human dermal fibroblasts with age (n=10; +, p<0.05 vs. 0-yearage; *, p<0.05 vs. Non-treated). 때, 각각 나이의 비처리군과 비교하여 0세에서는 102%, 22 세에서는 107%, 39세에서 105%로 세포 증식이 큰 차이가 없었다. 그러나 54세의 경우 비처리군과 비교하여 제니스테 인 처리군이 140%로 유의적 증가를 보였다(p<0.05). 한편, 제니스테인이 노화에 의해 증가되는 SA-β-Gal에 어 떤 영향을 주는지 알아보기 위하여 77세 된 피부의 섬유아 세포를 배양 후 제니스테인을 10-7 M로 2주간 처리하였다. 이후 SA-β-Gal을 염색하여 세포 변화를 측정하였다. 제니스 테인을 처리하지 않은 경우는 Fig. 2의 (A)에서 파란색으로 염색되는 노화된 세포의 수가 매우 많음을 알 수 있었다. 반 면 제니스테인을 처리한 Fig. 2의 (B)에서는 파란색으로 염 색된 세포가 비처리군에 비해 현저하게 줄어 노화된 세포가 Fig. 2의 (A)에 비해 적음을 알 수 있었다. 항산화제에 의한 세포복제 노화(replicative senescence) 억 제에 대해, 최근 Han 등[12]은 항산화 효소의 하나인 peroxiredoxin II(Prx II)가 쥐의 배아 섬유아세포에서 세포 노 화를 억제한다는 것을 보고하였다. Prx II가 결핍된 세포에 Fig. 2. Photographs of the effect of genistein on SA-β-galactosidase activity in 77 year aged normal human dermal fibroblasts ( 400; A, control; B, 10-7 M genistein). 319 서는 SA-β-Gal 염색법으로 염색되는 세포가 정상에 비해 30% 많았으며, 항산화제인 N-acetyl-cystein 처리에 의해 SA-β-Gal 염색이 감소하였다고 하였다. 그리고 Kruk 등[15] 은 제니스테인이 라디칼 생성을 억제하는 것을 보고하였다. 이와 같이 세포가 노화되면서 SA-β-Gal 활성도가 높아지 나 Han 등[12]의 보고와 같이, 항산화제가 세포노화를 어느 정도 억제할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서 77세의 노화 된 섬유아세포에 항산화제인 제니스테인 처리로 세포노화가 어느 정도 억제되어 SA-β-Gal 활성도가 억제된 것으로 생 각되었다. 한편 Fig. 1에 관한 얘기로, Varani 등의 연구[34]에 의하 면 나이에 따라 진피에 존재하는 섬유아세포의 수가 줄어들 었으며, 이들 진피를 배양하였을 때, 18-29세의 경우 76%, 80세 이후 피부의 경우 38%로 배양되어 나오는 섬유아세포 의 수가 크게 줄었다. 또한 80세 이후의 피검자에게 1% 비 타민 A를 7일간 피부에 도포 후 생검하여 섬유아세포 수를 측정하였을 때, 세포증식이 3배 이상 유의적으로 증가되었 다. Ashcroft 등의 연구[2]에 의하면, 여성이 노화되면서 피 부의 상처치유 속도는 감소하며 이런 노화에 의한 변화는 호 르몬 보충요법에 의해 회복된다. 또한, 자궁을 적출한 어린 설치류에서 상처 치유가 매우 늦어지며 이것은 에스트로겐 국소도포로 개선된다고 하였다. 이러한 현상들은 에스트로 겐에 의해 섬유아세포에서 분비되는 TGF-β에 기인하는 것 으로 보고하였다. 본 실험에서 제니스테인 처리로 54세의 섬유아세포에서 제니스테인 비처리에 비해 세포 증식이 유의적으로 증가된 것을 볼 때, 제니스테인이 비타민 A와 유사하게 자연노화된 섬유아세포의 증식을 증가시킴을 알 수 있었으며 이런 경향 은 젊은 피부에서 추출된 세포에서보다 노화가 진행된 세포 에서 명확하게 나타남을 알 수 있었다. 이와 같이 제니스테 인이 노화된 세포에서 더욱 세포를 증식시키는 것은 Ashcroft 등의 연구[2]에서와 같이 에스트로겐 유사체로서 성장호르 몬 TGF-β분비를 촉진하여 나타난 것으로 보인다. 또한 노 화에 의해 생체 내에서 ROS 증가와 COX-2 증가[6], 노화 로 혈중에 malondialdehyde 같은 과산화물 축적[25] 그리고 활성산소제거제인 SOD가 감소되는 것[17]을 볼 때, 제니스 테인의 항산화활성이나 COX-2 억제에 의한 염증 억제작용 이 노화된 피부 섬유아세포의 대사에서 발생하는 이들 세포 증식 저해인자들을 억제함으로서도 세포증식을 촉진할 수 있었을 것으로 생각되었다. 제니스테인의 type I pn 콜라겐 합성(monolayer culture) 증진 효과 제니스테인이 섬유아세포의 콜라겐 합성에 미치는 영향을 알아보았다. 제니스테인에 의한 엉덩이 피부 섬유아세포의 type I pn 콜라겐 합성 정도는 Fig. 3과 같다. 대조군으로서 나이별로 배양된 세포의 콜라겐 합성을 측정한 결과, 나이가
320 YANG et al. Fig. 3. The effect of genistein on type I pn collagen synthesis in normal human dermal fibroblasts with age (n=8; +, p<0.05 vs. 0-year-age; *, p<0.05 vs. Non-treated). 증가함에따라서콜라겐의합성량은감소하였으며, 22 세, 39 세, 54 세의세포에서 0 세와비교하였을때각각 26%, 27%, 62% 의유의적감소를보였다. 나이에따른제니스테인의콜라겐합성능을측정하기위해, 제니스테인을 10-7 M 로처리하고 type I pn 콜라겐량을측정하였다. 각나이별세포에제니스테인을처리하였을때, 각각의비처리군과비교하여 0 세, 22 세에서는약간증가되는경향이보였으나통계적인유의차는없었다. 그러나 39 세, 54 세에서는 type I pn 콜라겐이각각의비처리군에비하여, 15%, 68% 의유의적증가를보였다 (p<0.05). Varani 등의보고에의하면 [34], 18-29 세와 80 세이후의피부의 type I pn 콜라겐합성량을비교했을때 80 세이후에서합성량이 52% 줄었다. 진피와표피사이에많이염색되는 procollagen 의양도 80 세이후에서는매우감소되었다. 80 세이후의피험자에비타민 A 를 7 일간도포한결과대조군에비하여 type I pn 콜라겐합성량이 65% 증가하였다. 그리고제니스테인은섬유아세포에서 kinase 와상호작용을하여 type I pn 콜라겐의전사활성을증가시키는것으로보고된바있다 [35]. 이보고에의하면, 콜라겐프로모터에는강력한 TGF-β1-responsive element 가존재하며, 여기에 TGF-β 가붙어콜라겐의전사를활성화한다. Tyrosine kinase 저해제인제니스테인은 TGF-β 결합을촉진하여콜라겐합성을유도하며, 반면 sodium orthovanadate 와같은 phosphatase 저해제는결합을억제하며콜라겐합성을억제한다. 한편, 제니스테인은 AP-1 을구성하는단백질인 cjun 의발현을억제하며이를통해 MMP-1 의합성을억제할가능성도있다 [14]. 따라서, Fig. 3 은동일단백질농도기준이므로세포수가같다고볼수있으므로, 지금까지보고되지않은나이에따른제니스테인의효과를잘설명해주고있다. 제니스테인의콜라겐합성촉진작용은 TGF-β 를통한직접적인작용일 수도있으며, 혹은콜라겐의분해효소인 MMP-1 의합성을억제하여콜라겐의분해를막는간접적인효과일수도있고또한이들의복합작용일수도있다. 그리고전술과같이, 제니스테인의항산화활성이나 COX-2 억제에의한염증억제작용이콜라겐합성을촉진할수있었을것으로생각되었다. 자외선에의한광손상과 hydrogen peroixide 에의한피부암발생신호전달을제니스테인이막는것으로보고된바있다 [18, 36]. 섬유아세포에 UVA 의조사로인해콜라겐합성이감소되는것을제니스테인이얼마나방어하는지알아보았다. 결과는 Fig. 4 와같다. UVA 를 15 J/cm 2 조사하였을때, type I pn 콜라겐합성이조사하지않은군에비해매우감소하였다. 즉, Fig. 3 과 Fig. 4 의 0 세의대조군들의콜라겐합성량을비교해보면흡광도가각각 6.4 ± 0.49/mg protein 및 0.75 ± 0.08/mg protein 으로 Fig. 4 의 UVA 를조사한군에서약 1/9 로감소되었고다른군도같은형태를보였다. UVA 를조사하지않은경우, Fig. 3 에서보면, 0 세에비하여 22 세, 39 세, 54 세의세포모두가 type I pn 콜라겐의합성이유의하게감소하였다. UVA 를조사한경우의 Fig. 4 를보면, 0 세와비교하여 22 세에는통계적유의차가없었으나, 39 세에서는 33%, 54 세에서는 62% 로콜라겐합성이유의하게감소하였다 (p<0.05). UVA 를조사한후제니스테인을처리하였을때인 Fig. 4 를보면, 모든세포에서콜라겐합성이증가하는경향을보였으나비처리군과비교하여 0 세, 22 세, 39 세에서는유의차가없었다. 그러나 54 세의세포에서제니스테인처리에의해 type I pn 콜라겐합성이 45% 나유의적으로증가하였다 (p<0.05). 피부에서자외선에의해직접혹은 ROS 등에의해간접적으로 DNA 가손상되면 cyclobutane-type thymine dimer 와같은 pyrimidine dimer 가생성되는데 [38], Moore 등 [21] Fig. 4. The effect of genistein on type I pn collagen synthesis in normal human dermal fibroblasts with UVA irradiation and age (n=8; +, p<0.05 vs. 0-year-age; *, p<0.05 vs. UVA treated).
INHIBITORY EFFECTS OF GENISTEIN ON SKIN AGING 321 은제니스테인이피부에서자외선에의해유도되는 pyrimidine dimer 의생성을억제하며이를통해피부암을예방할수있다고보고하였다. Wang 등 [35] 은제니스테인이성장인자수용체자리에서 kinase 를특이적으로저해함으로써 UVB 에의해유도되는전사인자인 AP-1 활성화신호전달과정을차단한다는보고를하였다. 이는제니스테인이 tyrosine kinase 를저해함으로써콜라겐합성을유도할수있는가능성이있음을나타낸것이다. 이상의결과에서보고된바와같이, 제니스테인이섬유아세포에서 type I pn 콜라겐의합성을촉진하는것을알수있었다. 또한 UVA 에의해콜라겐합성이매우억제된상황에서도합성증가효과가있었으며, 자연노화가많이진행된세포에서더욱효과적임을알수있었다. 이것은제니스테인의 tyrosine kinase 의저해효과도있겠으나무엇보다자외선으로생성되는 pyrimidine dimer 의생성을광보호효과로방지하였기때문으로생각되었다. Type I pn 콜라겐합성 (collagen matrix culture) 증진효과콜라겐매트릭스를이용한 3 차원배양은진피와유사한상태를 in vitro system 으로만든것으로단층배양에서간과될수있는효능을재검증하고, 인체와의상관성을높이게된다. 제니스테인의콜라겐합성효과를단층배양을통해알아보았으나 (Fig. 3, 4), 좀더 in vivo 와유사한상황에서알아보기위해 [5], 콜라겐매트릭스를활용하여 3 차원배양조건에서콜라겐합성을측정하였고결과는 Fig. 5 와같다. 0 세와 54 세의여성에게서얻은얼굴 ( 광노출부위 ) 과엉덩이 ( 비노출부위 ) 의피부섬유아세포를사용하여콜라겐매트릭스를제작하였다. 대조군으로서 54 세에서얻은세포와 0 세에서얻은세포의콜라겐합성을비교해보면 54 세의세포는 0 세에비해기본적으로 type I pn 콜라겐의합성이유의하게적었다. 즉, 54 세의엉덩이에서얻은세포는 0 세에비해 type I pn 콜라겐합성량이 25%, 54 세의얼굴에서얻은세포는 0 세에비해 39% 유의적으로감소하였다 (p<0.05). 54 세의얼굴과엉덩이두부위를비교하면, 얼굴부위의세포를사용한매트릭스에서엉덩이의세포를사용한매트릭스에비해기본적인 type I pn 콜라겐의합성량이 18% 적어유의적인차이를보였다. 제니스테인을 10-5 M 로 72 시간처리하였을때, 엉덩이세포는비처리군에비해서 type I pn 콜라겐의합성이 21%, 얼굴세포는비처리군에비해 14% 의유의적증가를보였다 (p<0.05). 그리고얼굴에서얻은세포의 type I pn 콜라겐합성량이엉덩이에서얻은세포에비해 31% 로유의적으로적었다. 그러나 0 세에서얻은세포에서는제니스테인처리에의해 type I pn 콜라겐의합성이변화되지않았다. 그리고 Fig. 5 에서보면제니스테인은콜라겐매트릭스를이용한 3 차원배양에서도 Fig. 4 의단층배양과같이콜라겐합성을증진시켰다. Chung 등 [7] 은매트릭스배양에서섬유아세포의기본적인콜라겐합성량이광노화된피부와자연노화된피부에서차이가나는반면, 단층배양에서는동일함을보고하였다. 이결과는매트릭스배양이단층배양보다는더욱정밀하게인체와유사한상태의결과를반영한다고볼수있다. 본결과에서태양을거의받지않은엉덩이피부가얼굴피부보다 type I 콜라겐합성량이많은것은평소햇볕에의한활성산소생성 [6] 과 pyrimidine dimer[21] 생성이적어세포 DNA 의변이가적었기때문으로생각되었다. 그리고 54 세의광노출부위인얼굴과비노출부위인엉덩이피부에서얻은모두의세포에서콜라겐생성이대조군들보다증가된것은제니스테인이광노화및자연노화에모두효과적인것으로추측할수있으며, Fig. 4 에서와같이나이에따라더욱효과적인것으로생각되었다. Fig. 5. The effect of genistein on type I pn collagen synthesis in collagen gel with sun-protected and sun-exposed skin derived normal human dermal fibroblasts {n=8; +, p<0.05 vs. 0-yearage; *, p<0.05 vs. Non-treated; #, p<0.05 vs. Buttock nontreated (54-year);, p<0.05 vs. Buttock genistein-treated (54- year)}. 제니스테인이 MMP-1 합성에미치는영향제니스테인은전사인자인 cjun 의발현을억제하여, 콜라겐분해효소인 MMP-1 의합성을억제하는것으로알려져있다 [14]. 본실험에서는연령별로제니스테인이 MMP-1 의합성에어떤영향을미치는지알아보고자하였으며그결과는 Fig. 6 에나타내었다. 0 세, 22 세, 39 세및 54 세의여성엉덩이피부섬유아세포에서 MMP-1 의합성량을비교하여보면, 0 세와 22 세의세포에서 MMP-1 의합성은 39 세, 54 세에비해매우낮은수준이었다. 22 세는 0 세에비해약 40% 정도증가되었으나통계적인유의차는없었다. 반면, 39 세는 0 세에비해약 6 배, 54 세에서는약 8 배이상증가되어노화됨에따
322 YANG et al. 민 A 와유사한 30-40% 수준 [34] 이었다. 이상의결과에서제니스테인은젊은피부에서 MMP-1 의합성에는큰영향이없으나, 노화된피부에서매우증가되는 MMP-1 의합성을억제하여피부노화를방지할가능성이있음을알수있었다. 그러므로제니스테인의처리가노화에의해유도되는 MMP-1 의합성을억제하는것 (Fig. 6) 과또한제니스테인이자외선에의한 pyrimidine dimer 의생성을억제한다는보고 [21] 를볼때, 제니스테인은사람의피부세포증식 (Fig. 1) 과콜라겐합성촉진효과 (Fig. 3, 5) 뿐만아니라피부의광노화억제 (Fig. 4) 에도매우효과적인물질이라고생각되었다. Fig. 6. The effect of genistein on MMP-1 synthesis in normal human dermal fibroblasts with age (n=8; +, p<0.05 vs. 0-yearage; *, p<0.05 vs. Non-treated). 라 MMP-1 의합성량이매우증가됨을알수있었다 (p<0.05). 그리고본섬유아세포들에제니스테인을처리하였을때 0 세, 22 세에서는 MMP-1 의합성량에차이가거의없었으나 39 세와 54 세의세포에서는 MMP-1 이비처리군에비해각 42%, 36% 로유의적으로감소되었다 (p<0.05). Varani 등 [34] 에의하면, 80 세이상의그룹에서 MMPs 의합성량을측정한결과 MMP-1 뿐만아니라, MMP-2 및 MMP-9 의양도나이에따라유의하게증가되었다. 18-29 세에비하여 80 세이상에서는 MMP-1 은 40%, MMP-2 는 82%, MMP-9 은 52% 증가되었다. 80 세이후피험자에게 1% 의비타민 A 를 7 일간도포하였을때, 증가된 MMP-1 및 MMP-9 가다시 18-29 세의수준으로 40% 정도감소되었다. Kang 등 [14] 에의하면피부에 2 minimal erythema dose 의자외선을조사하였을때, 10 분뒤에는 2 배, 20 분뒤에는 3 배의 H 2 O 2 가발생하였다. 또한 MMP-1 의 mrna 양도 7 배이상증가하였다. 제니스테인 1% 를미리발라준후, 자외선을조사하였을때자외선에의해유도되는 MMP-1 mrna 의양이 50% 이상감소되었다고보고하였다. 본실험에서는섬유아세포에서 MMP-1 의합성이연령별로증가되며, 0 세와비교할때 39 세, 54 세에서매우큰차이로유의적증가를보였다. 따라서지금까지나이에따른제니스테인의 MMP-1 증가억제효과는보고되지않았으며 Fig. 6 은그의효과를잘설명해주고있다. MMP-1 은 SOD 유도능 [23] 이노화되면서급격히떨어지는것과반대로급격히증가되는모양을보이는데이포물선모양의증가를볼때나이에따른 MMP-1 증가도 SOD 유도능과같이노화와깊은관계가있는것으로생각되었다. 그런데이러한나이에따른 MMP-1 의증가도제니스테인의처리에의해 39 세와 54 세에서와같이유의적으로감소하였으며그감소정도는 in vivo 에서실험된비타 요 콩류에다량존재하는제니스틴으로부터얻을수있는제니스테인이노화된피부섬유아세포의활성과피부의주성분인콜라겐의합성및이의주요한분해효소인 MMP-1 의합성에어떤영향을미치는지알아보고자하였다. 제니스테인은 54 세의섬유아세포증식을유의하게증가시켰으며, 이러한세포증식효과는비타민 A 와유사하게자연노화가많이진행된세포에서뚜렷하였다. 아울러 77 세의섬유아세포에서제니스테인처리에의해세포노화의지표인 SA-β Gal 염색이감소된것을확인하였다. 그리고제니스테인은섬유아세포에서 type I pn 콜라겐의합성을촉진하였고, UVA 에의해콜라겐합성이매우억제된상황에서도합성증가효과를보였는데이러한현상은자연노화가많이진행된세포에서더욱효과적이었다. 콜라겐매트릭스를이용한콜라겐생합성결과에서제니스테인은광노출부나비노출부위에서얻은모두의세포에서콜라겐합성을증가시킴을알수있었으며, 이를통해제니스테인이광노화및자연노화에모두효과적인것으로추측할수있다. 제니스테인은젊은피부의세포에서 MMP-1 의합성에는큰영향을미치지않았으나, 노화된피부의세포에서매우증가되어있는 MMP-1 의합성을억제하였다. 이상의결과에서제니스테인은광노화뿐아니라, 자연노화에의한피부주름을예방하는데유용한물질이될것으로사료된다. 약 REFERENCES 1. Afaq, F. and H. Mukhtar. 2006. Botanical antioxidants in the prevention of photocarcinogenesis and photoaging. Exp. Dermatol. 15: 678-684. 2. Ashcroft, G. S., J. Dodsworth, E. van Boxtel, R. W. Tarnuzzer, M. A. Horan, G. S. Schultz, and M. W. Ferguson. 1997. Estrogen accelerates cutaneous wound healing associated with an increase in TGF-beta1 levels. Nat. Med. 11: 1209-1215. 3. Chodon, D., N. Ramamurty, and D. Sakthisekaran. 2007.
INHIBITORY EFFECTS OF GENISTEIN ON SKIN AGING 323 Preliminary studies on induction of apoptosis by genistein on HepG2 cell line. Toxicol. In Vitro. 21: 887-891. 4. Choi, S. W. 1998. Signal transduction in aged skin cells. Korean J. Invest. Dermatol. 5: 16-20. 5. Cho, Y. K., Y. H. Byeon, B. K. Sun, J. S. Hwang, B. S. Lee, and J. I. Kim. 1996. 3-Amino Propane Phosphoric Acid (3- APPA) : A Novel Anti-Aging Substance. Proceedings of the SCSK Conference. 55: 52-67. 6. Chung, H. Y., H. J. Kim, K. H. Shim, and K. W. Kim. 1999. Dietary modulation of prostanoid synthesis in the aging process: role of cyclooxygenase-2. Mech. Aging Dev. 111: 97-106. 7. Chung, J. H., S. H. Youn, O. S. Kwon, K. H. Cho, J. I. Youn, H. C. Eun. 1997. Regulations of collagen synthesis by ascorbic acid, transforming growth factor-beta and interferon-gamma in human dermal fibroblasts cultured in three-dimensional collagen gel are photoaging- and agingindependent. J. Dermatol Sci. 15: 188-200. 8. Coulomb, B., L. Dubertet, C. Merrill, R. Touraine, E. Bell. 1984. The collagen lattice: a model for studying the physiology, biosynthetic function and pharmacology of the skin. Br. J. Dermatol. Suppl 27: 83-87. 9. Fisher, G. J., S. Kang, J. Varani, Z. Bata-Csorgo, Y. Wan, S. Datta, and J. J. Voorhees. 2002. Mechanisms of photoaging and chronological skin aging. Arch. Dermatol. 138: 1462-1470. 10. Fisher, G. J., Z. Q. Wang, S. C. Datta, J. Varani, S. Kang, and J. J. Voorhees, 1997. Pathophysiology of premature skin aging induced by ultraviolet light. N. Engl. J. Med. 337: 1419-1428. 11. Greenwel, P., W. Hu, R. A. Kohanski, and F. Ramirez. 1995. Tyrosine dephosphorylation of nuclear proteins mimics transforming growth factor beta 1 stimulation of alpha 2(I) collagen gene expression. Mol. Cell Biol. 15: 6813-6819. 12 Han, Y. H., H. S. Kim, J. M. Kim, S. K. Kim, D. Y. Yu, and E. Y. Moon. 2005. Inhibitory role of peroxiredoxin II (Prx II) on cellular senescence. FEBS Lett. 579: 4897-4902. 13. Kang, K. A., R. Zhang, M. J. Piao, K. H. Lee, B. J. Kim, S. Y. Kim, H. S. Kim, D. H. Kim, H. J. You, and J. W. Hyun. 2007. Inhibitory effects of glycitein on hydrogen peroxide induced cell damage by scavenging reactive oxygen species and inhibiting c-jun N-terminal kinase. Free Radic. Res. 41: 720-729. 14. Kang, S., J. H. Chung, J. H. Lee, G. J. Fisher, Y. S. Wan, E. A. Duell, and J. J. Voorhees. 2003. Topical N-acetyl cysteine and genistein prevent ultraviolet-light-induced signaling that leads to photoaging in human skin in vivo. J. Invest. Dermatol. 120: 835-841. 15. Kruk, I., H. Y. Aboul-Enein, T. Michalska, K. Lichszteld, A. Kladna. 2005. Scavenging of reactive oxygen species by the plant phenols genistein and oleuropein. Luminescence. 20: 81-89. 16. Kurzer, M. S. and X. Xu. 1997. Dietary phytoestrogens. Annu. Rev. Nutr. 17: 353-381. 17. Lopez-Torres, M., R. Perez-Campo, and G. Barja de Quiroga. 1991. Effect of natural aeing and antioxidant inhibition on liver antioxidant enzymes, glutathione system, peroxidation, and oxygen consumption in Rana perezi. J Comp. Physiol. [B]. 160: 655-661. 18. Mazire, C., F. Dantin, F. Dubois, R. Santus, and J. Mazire. 2006. Biphasic effect of UVA radiation on STAT1 activity and tyrosine phosphorylation in cultured human keratinocytes. Free. Radic Biol. Med. 28: 1430-1437. 19. Miyazaki, K. 2004. Novel approach for evaluation of estrogenic and anti-estrogenic activities of genistein and daidzein using B16 melanoma cells and dendricity assay. Pigment. Cell Res. 17: 407-412. 20. Miyazaki, K., T. Hanamizu, R. Iizuka, and K. Chiba. 2002. Genistein and daidzein stimulate hyaluronic acid production in transformed human keratinocyte culture and hairless mouse skin. Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol. 15: 175-183. 21. Moore, J. O., Y. Wang, W. G. Stebbins, D. Gao, X. Zhou, R. Phelps, M. Lebwohl, and H. Wei. 2006. Photoprotective effect of isoflavone genistein on ultraviolet B-induced pyrimidine dimer formation and PCNA expression in human reconstituted skin and its implications in dermatology and prevention of cutaneous carcinogenesis. Carcinogenesis. 27: 1627-1635. 22. Mosmann, T. 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 65: 5563. 23. Niwa, Y., K. Ishimoto, and T. Kanoh. 1990. Induction of superoxide dismutase in leukocytes by paraquat: Correlation with age and possible predictor of longevity. Blood, 76: 836-841. 24. Parrado, J., M. Bougria, A. Ayala, A. Castano, and A. Machado. 1999. Effects of aging on the various steps of protein synthesis: fragmentation of elongation factors 2. Free Radical Biology & Medicine 26: 362-370. 25. Rodriguez-Martinez, M. A., E.C. Garcia-Cohen, A. Briones, A. B. Baena, E. Marin. 1999. Salaices M, Marin J. Changes in plasma oxidative state with age and their influence on contractions elicited by noradrenaline in the rat tail artery. Life Sci. 65: 915-924. 26. Sasamura, H., A. Takahashi, J. Yuan, H. Kitamura, N. Masumori, N. Miyao, N. Itoh, and T. Tsukamoto. 2004. Antiproliferative and antiangiogenic activities of genistein in human renal cell carcinoma. Urology. 64: 389-393. 27. Sator, P. G., J. B. Schmidt, T. Rabe, and C. C. Zouboulis. 2004. Skin aging and sex hormones in women-clinical perspectives for intervention by hormone replacement therapy. Exp. Dermatol. 13: Suppl. 4. 36-40. 28. Schmid, D. and F. Zulli. 2002. Topically applied soy isoflavones increase skin thickness. Cosmet. Toil. Mag. 117: 45-50. 29. Setchell, K. D. 1998. Phytoestrogens: the biochemistry, physiology, and implications for human health of soy isoflavones. Am. J. Clin. Nutr. 68: 333S-346S. 30. Setchell, K. D. 2000. Absorption and metabolism of soy
324 YANG et al. isoflavones-from food to dietary supplements and adults to infants. J. Nutr. 130: 654S-655S. 31. Song, T. T., S. Hendrich, and P. A. Murphy. 2002. Estrogenic activity of glycitein, a soy isoflavone. J. Agric. Food Chem. 50: 2470. 32. Talwar, J. S., C. E. M. Griffiths, G. J. Fisher, T. A. Hamilton, and J. J. Vorhees. 1995. Reduced type I and type III procollagens in photodamaged adult human skin. J. Invest. Dermatol. 105: 285-290. 33. Tomaszewski, J., A. Adamiak, P. Skorupski, W. Rzeski, and T. Rechberger. 2003. Effect of 17 beta-estradiol and phytoestrogen daidzein on the proliferation of pubocervical fascia and skin fibroblasts derived from women suffering from stress urinary incontinence. Ginekol Pol. 74: 1410-1414. 34. Varani, J., R. L. Warner, M. Gharaee-Kermani, S. H. Phan, S. Kang, J. H. Chung, Z. Q. Wang, S. C. Datta, G. J. Fisher, and J. J. Voorhees. 2000. Vitamin A antagonizes decreased cell growth and elevated collagen-degrading matrix metalloproteinases and stimulates collagen accumulation in naturally aged human skin. J. Invest. Dermatol. 114: 480-486. 35. Wang, Y., X. Zhang, M. Lebwohl, V. DeLeo, and H. Wei. 1998. Inhibition of ultraviolet B (UVB)-induced c-fos and c- jun expression in vivo by a tyrosine kinase inhibitor genistein. Carcinogenesis. 19: 649-654. 36. Wei, H., L. Wei, K. Frenkel, R. Bowen, and S. Barnes. 1993. Inhibition of tumor promoter-induced hydrogen peroxide formation in vitro and in vivo by genistein. Nutr. Cancer. 20: 1-12. 37. Wei, H., X. Zhang, Y. Wang, and M. Lebwohl. 2002. Inhibition of ultraviolet light-induced oxidative events in the skin and internal organs of hairless mice by isoflavone genistein. Cancer Lett. 185: 21-29. 38. Yamada, M., M. U. Udono, M. Hori, R. Hirose, S. Sato, T. Mori, and O. Nikaido. 2006. Aged human skin removes UVB-induced pyrimidine dimers from the epidermis more slowly than younger adult skin in vivo. Arch. Dermatol. Res. 297: 294-302. (Received Sep. 29, 2007/Accepted Nov. 6, 2007)