Journal of Bacteriology and Virology 2015. Vol. 45, No. 2 p.132 137 http://dx.doi.org/10.4167/jbv.2015.45.2.132 Original Article Molecular Epidemiology of Mumps Virus Circulated in Gwangju Sun Hee Kim 1, Mihee Seo 1, Jung Wook Park 1, Sun Ju Cho 1, Yi Deun Ha 1, Dong-Ryong Ha 1, Eun-Sun Kim 1, Hae Ji Kang 2, Sung Soon Kim 2, Kisoon Kim 2 and Jae Keun Chung 1 * 1 Health and Environment Institute of Gwangju, Gwangju; 2 National Institute of Health, Korea Centers for Disease Control and Prevection, Chungcheongbuk-do, Korea The recent mumps epidemic in South Korea has generated a large amount of public concern. This study has attempted to analyze molecular epidemiological changes of mumps virus circulating in Gwangju metropolitan area, South Korea. 953 throat swab samples were collected from patients with parotitis from May 2013 to July 2014. The majority (71.5%) of these cases have occurred in middle or high school students aged from 15 to 19 years. All samples were tested using a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) that targets the short hydrophobic (SH) gene of the virus. Mumps virus SH gene was detected in 39.2% (374/953) of samples. And 82 RT-PCR products were randomly selected for nucleotide sequencing analysis. All of these sequences were determined as genotype I by phylogenetic analysis and showed the highest nucleic acid similarity (99%) with Dg1062/Korea/98 (GenBank accession no. AY309060). These results suggested that appearance of new genotype or genetic variation at the nucleotide level could be ruled out to evaluate main cause of recent mumps outbreak in Gwangju metropolitan area. Key Words: Mumps, Parotitis, Short hydrophobic gene, Genotype I INTRODUCTION 유행성이하선염은국가예방접종사업의대상이되는제2군법정감염병의하나로유행성이하선염바이러스 (Mumps virus) 감염에의하여이하선부종이특징적으로나타나는급성바이러스성질병이다. 유행성이하선염바이러스의감염은타액의비말을통한직접적인접촉이나호흡기감염을통해주로전파되며, 감염후 16~18일의잠복기를거쳐이하선염증세와함께호흡기질환을동반하기도하지만 30~40% 는불현성감염으로증상이나타나지않을수도있다. 대부분의감염자는가벼운임상경과를보이며자연치유되지만뇌수막염, 췌장염등과 같은합병증이있을수있으며, 특히사춘기이후에감염된경우고환염, 부고환염또는난소염등이잘유발되는것으로알려져있다 (1). 사람이유일한숙주이자병원소로알려져있는유행성이하선염바이러스는분류학적으로 Paramyxoviridae 과, Paramyxovirinae 아속의 Rubulavirus 속에속하는바이러스로, 약 15.3 kb의단일가닥 (-) RNA를유전자로가지고있으며, 3' 말단으로부터 nucleocapsid associated protein (NP), phospho protein (P), matrix protein (M), fusion protein (F), small hydrophobic protein (SH), hemagglutinin-neuraminidase protein (HN), large protein (L) 순의배열로구성되어있다 (1). 이중 SH 단백질유전자는가장변이가심하여이유전자의변이정도에따라현재 A~N까지 12개의유전 Received: April 29, 2015/ Revised: May 28, 2015/ Accepted: June 2, 2015 * Corresponding author: Jae Keun Chung. Health and Environment Institute of Gwangju, 149 Hwajeong-ro, Seo-gu, Gwangju, 502-837, Korea. Phone: +82-62-613-7630, Fax: +82-63-613-7549, e-mail: jkchung@korea.kr ** This research was performed as part of the laboratory investigation of legal infectious disease which is managed by Health & Environment Institute of Gwangju Metropolitan city. CC This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/license/by-nc/3.0/). 132
Circulating Mumps virus in Gwangju 133 형이보고되고있지만, 혈청형은한가지로영구면역이가능한것으로알려져있다 (2). 우리나라에서는 1998년개정된표준예방접종지침에따라홍역-볼거리-풍진 (MMR) 예방접종을 12~15개월과 4~6세에 2회접종하는방식이도입되어현재까지유지되고있으나, 유행성이하선염환자발생은지속적으로증가하는추세를보여왔으며 2007년도이후로는보다급격한증가율을보이고있다. 또한유행성이하선염은일반적으로 5~10세사이의소아에서주로발생하는것으로알려져있었으나, 최근에는 15세이상연령층인중 고등학생들사이에서의발병률이급격히증가하는경향을보이고있다 (3). 이러한호발연령층의변화는학습에대한집중도가높은시기의중 고등학생들에게등교중지를통한격리조치가권장됨에따라사회적으로도큰부담이되고있다. 유행성이하선염발병연령층의변화는미국, 네덜란드등전세계적으로동일한양상을보이는것으로보고되고있으며 (4~6), 이에따라국내외적으로유행성이하선염발생에따른역학조사및원인규명에대한다양한분석이시도되었으나정확한원인은알려지지않은실정이다 (7~11). 특히, 유행성이하선염바이러스의혈청형은한가지이지만유전적인다양성분석에중요한 SH 유전자에의한분리주간의차이나유행주와백신주간의차이를규명하고자하는접근법이많이시도되고있다 (5, 9). 이에본연구에서는 2013년 5월부터 2014년 7월까지광주지역에서발생한유행성이하선염의심환자의인후도찰물을수집하여, 유전자검출법을통하여유행성이하선염바이러스감염여부를확인하고, 확인된바이러스의 SH 유전자의염기서열분석을통해지역내유행주의유전형을분석함으로써바이러스의유전적변이경향및해외유입여부를파악하고자하였다. MATERIALS AND METHODS 검체수집 2013년 5월부터 2014년 7월까지광주시내병 의원으로부터유행성이하선염의심환자의인후도말가검물 (throat swab) 953건을수집하였다. 환자로부터채취된가검물은바이러스수송용배지 (viral transport medium, Becton Dickinson, Italy) 에넣은후, 즉시혹은냉장보관하였다가 24시간이내에실험실로운반하였다. SH 유전자증폭 (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) 수집된가검물은진탕하여 3,000 rpm에서 5분간원심분리한후, 상층액을 viral RNA mini kit (QIAgen, Hilden, Germany) 를사용하여제조사에서제공된절차에따라 RNA를추출하였다. 추출된 RNA는바로 RT-PCR 을위한 template로사용하였다. 유행성이하선염바이러스 SH 유전자분석은 F1 (5'- GTAGCAGCCTTAGTTTTGAGCAT-3') 과 HN3 (5'-TGAA- GAGTTTTGAGGGCTCCAT-3') primer를 RT-PCR premix (Solgent, Korea) 에분주하여반응액으로사용하였다. 유전자증폭을위하여 PCR System 9700 (Applied Bio-system, USA) 를이용하여 50 에서 30분간 cdna를합성하고 94 에서 15분간전변성한후, 94 30초, 50 40초, 72 50초간 35회를반복한다음 72 에서 5분간연장하여 4 에정치하였다. 증폭한반응산물은 1.5% agarose gel (Cambrex, USA) 에서전기영동한후증폭유무를확인하였다. 염기서열분석 (Nucleotide sequencing) 검출된유행성이하선염바이러스의 SH 유전자에대한 PCR 반응산물 (629 bp) 은 QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen GmbH, Germany) 를이용하여제조사의방법에따라정제하고, ABI PRISM BigDye Terminator (Applied Biosystems, USA) 를사용하여 sequencing reaction을하였다. 반응산물은 BigDye XTerminator purification kit (Applied Biosystems, USA) 로정제한후 Automated DNA sequencer (ABI prism 3100, Applied Biosystems, USA) 로염기서열분석을하였다. 결정된유전자염기서열비교및계통수분석은 Lasergene software (DNASTER Inc. USA) 에포함된 Editseq 와 Seqman 프로그램을이용하여계통분석을실시하였으며, 진화적거리행렬은 Lasergene에포함된 MegAlign의 sequence distance를이용하여계산하였다. RESULTS 유행성이하선염바이러스검출 2013년 5월부터 2014년 7월까지수집된 953건을대상으로유행성이하선염바이러스 SH 유전자에대한 RT- PCR을실시하여 374건 (39.2%) 에서유전자증폭을확인하
134 SH Kim, et al. Table 1. Results of RT-PCR using the mumps SH gene stratified by age group Age in years Total <5 5~9 10~14 15~19 20~29 30 No. of tested cases 953 58 98 77 681 19 20 No. of RT-PCR positive cases 374 4 5 25 326 8 6 RT-PCR positive rate (%) 39.2 6.9 5.1 32.5 47.9 42.1 30.0 Figure 1. Number of mumps suspected cases and RT-PCR positive cases by monthly in an outbreak in Gwangju city, May 2013-July 2014 (n=953). 였다. 월별검체수집량에있어서는 2013년 11월과 2014 년 5월에각각총수집검체량의 14.8%(141건 ) 와 11.2% (107건) 을차지하여가장높은검체수집율을보였으나, SH 유전자에대한 RT-PCR 검출건수에서는 11월이전체검출건수의 20.6%(77건 ), 그리고 2014년 4월이 10.7%(40 건 ) 순으로높게나타났다 (Fig. 1). 수집된검체의연령별분포에있어서는, 15~19세연령군이 681건으로전체수집검체의 71.5% 를차지하였고, 5~9세연령군 (98건, 10.3%), 10~14세연령군 (77건, 8.1%), 5세미만연령군 (58건, 6.1%) 그리고 30세이상 (20건, 2.1%) 과 20~29세연령군 (19건, 2.0%) 순으로나타났다. 또한연령별유행성이하선염바이러스검출률에있어서는 15~ 19세연령군이 47.9% 로가장높게나타났으며, 20~29세연령군은 42.1%, 10~14세연령군은 32.5%, 30세이상연령군에서는 30.0%, 5세미만연령군과 5~9세연령군에서는각각 6.9% 와 5.1% 로확인되었다 (Table 1). 유행성이하선염바이러스 SH 유전자증폭이확인된검체 374건중연령별분포를살펴보면, 15~19세연령군에해당하는검 체가 326건으로양성검체의 87.2% 를차지하였으며, 성별에있어서는남성이 302건 (80.7%), 여성이 72건 (19.3%) 으로남성이여성의 4배이상인것으로확인되었다 (Fig. 2). SH 유전자염기서열분석유행성이하선염바이러스분리주에대한유전형을결정하고자선별된분리주 82건에대하여 SH 유전자염기서열분석을실시하고 GenBank에등록된분리주의염기서열과비교분석한결과, 국내분리주인 Dg1062/ Korea/98 (GenBank accession no. AY309060) 와는 99%, 일본에서보고된바있는 MP93-AK (GenBank accession no. AB003424) 와는 98% 의상동성을보여 83건모두유전형 I로확인되었다. 또한백신주인 Jeyl Lyhn 주와분리주와의유전적차이는 19.0% 로나타났다 (Fig. 3). DISCUSSION 최근국내유행성이하선염발생현황은 2006년에 2,089
Circulating Mumps virus in Gwangju 135 명, 이듬해인 2007년에는 4,557명, 2009년에는 6,399명, 2012년에는 17,024명그리고 2014년에는 25,696명으로크 Figure 2. Number of mumps RT-PCR positive cases by age and sex in an outbreak in Gwangju city, May 2013-July 2014 (n=374). 게증가되었음을질병관리본부감염병웹통계시스템 (http://is.cdc.go.kr/dstat/index.jsp) 을통해확인할수있다. 특히광주지역의경우, 2014년에 3,211명의환자발생신고가기록되었는데이는전년도인 2013년환자발생신고수치인 641명의 5배이상에해당한다 (3). 감염병웹통계시스템의수치는임상증상에근거한자료로환자와의사환자를모두포함하고있어, 유행성이하선염의유행규모를정확히파악하기위해서는실험실진단이병행되어야한다. 유행성이하선염의실험실진단에는혈청학적진단법, 바이러스분리법, 간접면역형광법및역전사중합효소연쇄반응을이용한유전자검출법이이용되고있으며 (7~ 11), 유전자검출법의 target인 SH 유전자는유전형결정에이용됨에따라유전자진단과동시유전형의변이를분석할수있어유용한진단법으로널리사용되고있다 (5, 9). 본연구에서는 2013년 5월부터 2014년 7월까지총 953건의유행성이하선염의사환자의인후도말가검물을수집하여 SH 유전자검출법을통해 374건 (39.2%) 의검체에서유행성이하선염바이러스 SH 유전자의증폭을 Figure 3. Phylogenetic tree of selected mumps virus strains in the study and in GenBank. The tree is based on SH gene sequence alignment (206 bp). Strains detected in the study are marked with full dots ( ). Capital letters denote mumps virus genotype.
136 SH Kim, et al. 확인할수있었다 (Table 1). 연령별검체수집분포에있어서 15~19세연령군의검체수집율이전체검체수집률의 71.5% 를차지하였는데이는중고등학교를중심으로교내집단발병에의한결과이며, 유전자검출률역시 47.9% 로가장높게나타났다. 반면, 9세이하연령군에서는집단발병보다는산발적발생사례의검체로구성되었으며, 유전자검출률은 5.1~6.9% 로평균검출률인 39.2% 보다도 6배이상낮은결과를보였다. 이와같은이하선염의산발적발생사례의경우에서는유행성이하선염바이러스외의이하선염유발바이러스즉, Epstein-Barr virus, human herpesvirus (HHV)-6, human parainfluenza virus (HPIV), human bocavirus 등에의한감염을고려해볼필요가있다. 이들바이러스는유행성이하선염바이러스와는달리집단유행규모로이하선염을유발하지는않는것으로보고되고있으며, 이미핀란드나미국등의연구에서이하선염산발적발생사례중이들바이러스가각각 14% 와 38% 를차지하는것으로보고된바있다 (10, 11). 유행성이하선염바이러스의혈청형은한가지이지만 SH (small hydrophobic) 단백질은변이가심한부위로이단백질의유전적상이성으로유전형이구분되어, 현재까지 A-N까지 12가지유전형이보고되고있다 (2). 이들유전형은특정지역에서만제한적으로유행하고있어유전자분석을통해유행성이하선염바이러스의해외유입여부등을추정할수있다. 유전형 C-E, G와 H는전형적으로유럽지역에서, 유전형 B, F 그리고 I는아시아지역에서주로유행하는것으로알려져있지만 (12), 1998-2001년국내에서분리된유행성이하선염바이러스유전형에대한조사에서는 H와 I 두가지유전형으로나타났다. 이때확인된유전형 H는유럽에서발생한바이러스의염기서열과같은유전형안에서도큰차이를보여유전형 H가국내에서토착화되었다는점과유전형 H가매년증가하여최근유행성이하선염환자의증가와의연관성이높을것이라는점을보고하였다 (13, 14). 그러나 2013-2014년에광주지역에서유행한유행성이하선염바이러스유전형에대한본연구의결과에서는집단유행뿐아니라산발발생을포함한대상검체모두유전형 I로나타났으며, 기존의국내에서보고된바있는 Dg1062/Korea/98 (GenBank accession no. AY309060) 형과 99% 의상동성을보이는것으로확인됨에따라유행성이하선염의재유행의원인으로새로운유전형의등장을고려하기는어려울것으로판단된다 (15, 16). 또한본연구에서실시한각유전형의표준주와백신주그리고분리주간의 SH 유전자에대한계통학적분석에있어서백신주인 A형의 Jeryl Lynn 주와분리주간의유전적차이가 19.0% 로가장큰차이를보이기는하였으나, 백신에의해유도된항체의분리주에대한중화능력분석이수반되지않은단계에서백신주와의유전적차이로인한재유행을설명하기에는한계점이있다. 그러나, 본연구에서도확인된바와같이청소년층을중심으로유행성이하선염환자가늘어나는것은우리나라뿐아니라전세계적으로공통된특징으로, 최근여러연구에서 MMR 백신접종후시간경과에따른면역원성연구가진행되었으며그결과시간이지남에따라항체가가감소함이확인되었다는보고는국내의경우에도고려해볼만하다고생각된다 (17, 18). 본연구의결과로 2013-2014년도광주지역에서발생한유행성이하선염의유행이새로운유전자형의유입이나유전자변이가아닌국내에토착화된 I 유전형에의한청소년층사이의재유행임을확인할수있었다. 향후유행성이하선염에대한관리를위해서는실험실진단을통한유전형분석은지속적으로수행되어야하며, 국내유행주에대한백신의면역원성평가와함께각연령층에대한항체가조사를통한면역도평가등다각적인연구가추가로필요할것으로판단된다. REFERENCES 1) Steven AR, Christian JS, Kathryn MC. Mumps Virus. In: Davis MK, Peter MH. Fields Virology 6th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2013. p.1024-41. 2) Jin L, Örvell C, Myers R, Rota PA, Nakayama T, Forcic D, et al. Genomic diversity of mumps virus and global distribution of the 12 genotypes. Rev Med Virol 2015;25:85-101. 3) Korea Centers for Disease Control and Prevention. Disease web statistics system. Available from: http://is.cdc.go.kr/nstat/ index.jsp 4) Barskey AE, Glasser JW, LeBaron CW. Mumps resurgences in the United States: A historical perspective on unexpected elements. Vaccine 2009;27:6186-95. 5) Kaaijk P, Van der Zeijst B, Boog M, Hoitink C. Increased mumps incidence in the Netherlands: review on the possible role of vaccine strain and genotype. Euro Surveill 2008;13. 6) Sane J, Gouma S, Koopmans M, de Melker H, Swaan C, van
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