Polyplus-transfection in vivo / in vitro transfection reagent FAQ 코스모진텍학술지원팀
Polyplus in vitro / in vivo transfection reagent FAQ DNA transfection 을 serum 이포함된 media 에서할수있습니까? serum 이포함된 media 를사용할경우타사의 transfection reagent 와달리 JetPRIME 의 transfection 효율 이증가합니다. DNA/Reagent 복합체를 complete medium 내의세포에직접첨가할수있습니다. Transfection 과정에서 antibiotics 를사용할수있습니까? Polyplus 의 transfection reagent 전제품은 antibiotics 에의해 transfection 효율에영향을받지않습니다. 예를들어생산과정에서새로운 batch 에대한 jetprime 의 validation 프로토콜은항상 serum 과 antibiotics 가포함된 complete medium 조건에서진행됩니다. DNA transfection 을위한최적의 Cell density 가무엇입니까? Cell density 는 transfection 효율에영향을끼칩니다. jetprime 을사용하여최적의 transfection 효율을얻기위해 60%~80% 의 confluency 의 cell 에 transfection 할것을권장합니다. Culture plate 종류에따라권장하는 cell seeding 시의 cell 수는 jetprime transfection 프로토콜의 table 1 을참고해주시기바랍니다. 만약 cell 을오랫동안 culture 했다면 (20 passages 이상 ), 액체질소에보관중인새로운 cell 을 thawing 하여사용할것을권장합니다. 최적의 Transfection 을위한 cell passages 는어느정도가적당합니까? Cell 의 passage number 는 transfection 효율에많은영향을줍니다. 만약 cell 을오랫동안 culture 했다면 (20 passages 이상 ), transfection 효율이감소할것입니다. 그러므로액체질소에보관중인새로운 cell 을 thawing 하여사용할것을권장합니다. 또한 cell 을 thawing 한후 transfection 실험에사용하기전최소 2 회이상계대배양할것을권장합니다. Virus production 과같이여러종류의 plasmid 를 cotransfection 하고자할때어떻게진행해야합니까? 여러종류의 plasmid 를 cotransfection 하고자할경우, well 당총 DNA 양은프로토콜에표기된 DNA 양을초과해서는안됩니다. 각각의 plasmid 의비율은 plasmid 의 size, 종류및각각 plasmid 의예상발현수준에따라달라집니다. 각각의 plasmid 의양은 well 당총 DNA 양의최소 10 % 이상은되어야합니다. 약한 cell ( 예, primary fibroblasts) 의 cell viability 를향상시킬수있는방법은무엇입니까? Transfection 은 cell 에상당한물리적손상을주게됩니다. Cell viability 를향상시키기위해아래의몇가지방법을제안합니다. - Transfection 후 4 시간뒤에 media 를교체합니다. - DNA 의양을줄입니다. - jetprime reagent 의양을줄입니다. - complete medium 에서 transfection 을수행합니다. - Transfection 후 24 시간뒤에 (48 시간대신 ) transfection efficiency 을분석합니다. 1 코스모진텍학술지원팀 02-465-6217
- jetprime buffer 로 jetprime 과 DNA 을 dilution 했는지를확인합니다. - Plasmid 에 endotoxin 이포함되어있는지의여부를확인합니다. (endotoxin free) Virus production 을위해서는어떤종류의 transfection reagent 를사용해야합니까? jetprime 는 classical media 에서 virus 를생산하기위한최적의 reagent 입니다. 통상 virus 생산에사용되는 cells 즉, HEK-293 및 derivatives, CHO, VERO, WOP 과 BHK cell 에서 jetprime 을사용했을경우 transfection efficiency 가거의 90% 에달하므로높은 virus titer 를얻을수있습니다. (Dewannieux, M., Vernochet, C., Ribet, D., Bartosch, B., Cosset, F. L., Heidmann, T. (2011). The mouse IAPE endogenous retrovirus can infect cells through any of the five GPI-anchored Ephrin A proteins., PLoS Pathog 7, e1002). oligonucleotides (ODN) 의 transfection 을위해서는어떤제품을사용해야합니까? 일반적으로 oligonucleotides (ODN) 의크기에따라 INTERFERin 또는 jetpei 를추천합니다. jetprime 는 oligonucleotides (ODN) transfection 에는적합하지않습니다. oligonucleotides (ODN) transfection 을할경우에는 technical support 에게문의해주세요. sirna transfection 을위해서는어떤제품을사용해야합니까? INTERFERin 은 sirna transfection 를위한제품이며, 적은양 (1 nm) 의 sirna transfection 시에도효과적입니다. jetprime 또한 sirna transfection 에최적화되어있으며, sirna 최종농도를 10~50 nm 로사용하면됩니다. Suspension cells 의 DNA transfection 을위해서는어떤제품을사용해야합니까? T 및 B lymphocytes 등의 suspension cell 은어떤종류의 chemical 기반의 transfection reagent 를사용하더라도 DNA transfection 이잘되지않습니다. 그래서 suspension cells 에 nucleic acid delivery 를하고자할경우에는일반적으로 electroporation 또는 virus transduction 방법을사용할것을권장합니다. 식물세포의 DNA transfection 을위해서는어떤제품을사용해야합니까? 식물세포는셀룰로즈의함량이높은막구조를가지고있어서 jetprime /DNA 복합체가 cell 안으로들어가는것이차단됩니다. 심지어셀룰로즈세포벽이제거된 protoplast 단계에서도 jetprime /DNA 복합체는 cytoplasm 으로투과되지못합니다. HUVEC cells 에 transfection 할경우어떤제품을사용해야합니까? HUVEC cells 의 transfection 을위해특이적으로디자인한 jetpei -HUVEC 을사용할것을권장합니다. primary neurons 의 transfection 을위해서는어떤제품을사용해야합니까? neurons 은배양시세포분열을하지않기때문에 transfection 이매우어렵습니다. 그러나 jetpei 는 in vitro 조건에서 primary neurons 의 transfection 에성공적으로사용된사례가있습니다. Polyplus 는 primary 2 코스모진텍학술지원팀 02-465-6217
neurons 세포의 DNA transfection 을위한별도의 protocol 을가지고있습니다. 더자세한내용은 technical support 에게문의해주시기바랍니다. Macrophages 의 transfection 을위해서는어떤제품을사용해야합니까? jetprime 을사용하여 RAW 264.7 cell 에서성공적으로 DNA transfection 을수행할수있으며, standard condition 에서대략 50% 의 transfection 효율을보입니다. Primary macrophages 또는 monocyte/dendritic cell-derived macrophages 로 DNA transfection 을할경우에는 jetpei -macrophage 제품을선택하시면됩니다. 자세한정보는아래의링크에서확인하실수있습니다. (http://www.polyplus-transfection.com/products/jetpei-macrophage/) jetprime 은어떤유형의화합물입니까? jetprime 는 Polyplus-transfection 에서새로개발한고유의 cationic polymer-based molecule 입니다. jetprime 으로 transfection 할경우 plasmid 가어떻게세포내로전달됩니까? jetprime 은 DNA 와함께 positive charge 의복합체를형성합니다. 이복합체는 endocytosis 기전을통해세포내로들어오게됩니다. DNA 는 proton sponge mechanism 을통해 endosome 에서 cytosol 로이동합니다. Cytoplasm 내의 plasmid 는 nuclear envelope 이사라지는 mitosis 단계에서대부분 nucleus 에도달하게됩니다. jetprime 은어떻게보관해야합니까? jetprime 은매우안정적인분자입니다. jetprime 과 buffer 는상온으로납품되지만, 장기간안정한상태를 유지하기위해서는 4 에서보관해야합니다. jetprime 을받았는데 4 에서있지않고고온에있었습니다. 계속사용해도될까요? jetprime 은매우안정한분자입니다. 안정성테스트결과, jetprime 은 50 C 에서 48 시간보관후에도 4 에서보관하는경우와유사한 transfection efficiency 을나타냈습니다. 보관중인 jetprime vial 이의도치않게동결되었습니다. 어떻게해야합니까? jetprime 은의도치않은동결 / 해동과정에도 transfection efficiency 가거의변하지않습니다. 그러나장기 보관을위해서는제품의장기간안정성을보장하는 4 C 에서보관해야합니다. jetprime 은개봉후언제까지사용할수있습니까? 적절한상태로보관되었다면, jetprime cat#114-01 (0.1ml) 제품은 6 개월간안정합니다. 다른사이즈의 jetprime 제품은최소 1 년이상안정적으로사용할수있습니다. 3 코스모진텍학술지원팀 02-465-6217
DNA / jetprime 비율이무엇입니까? ratio 는 DNA 양 ( μg ) 에대해사용하는 jetprime 부피 ( μl ) 의비율입니다. 예를들어 1:2 DNA to jetprime ratio 는 1 µg 의 DNA 당 2 µl 의 jetprime 의비율로사용하는것을의미합니다. 어떻게하면 transfection efficiency 을향상시킬수있습니까? Transfection 효율을높이는최적화의첫번째과정은 DNA 양을 1.5 배까지증가시키는것입니다. 또한 DNA to jetprime ratio 를높이는것을권장합니다 (1 µg DNA 당 2~3 µl jetprime 비율 ). 또한 culture plate 를 210 X g 에서 5 분간 centrifugation 을진행할수도있습니다. 모든 cell line 에서동일한실험조건으로 transfection reagent 를사용할수있습니까? jetprime 은 A549, MCF7, U-2OS, NIH-3T3, B16-F10, Caco-2... 의다양한 cell line 에최적화된프로토콜을제공합니다. 그러나특정한 cell lines 의경우더높은 transfection 효율을얻기위한별도의프로토콜을보유하고있습니다. 이러한실험조건들은 Polyplus-transfection Database 에서확인할수있습니다. (http://www.polyplus-transfection.com/resources/cell-transfection-database/) jetprime 을 HEK-293 과 HeLa cell 에사용할경우특별한권장사항이있습니까? jetprime 은 HEK-293 과 HeLa cell 의 DNA transfection 에매우효율이높습니다. 그러므로 DNA 양을 줄이고 (6-well 기준 well 당 1 μg 을 0.5μg 으로 ), DNA to jetprime ratio 를 1:2 로진행할것을권장합니다. jetprime 으로 transfection 실험을 scale up 하려면어떻게해야합니까? 일반적으로, DNA 의양은세포의총수에비례해서증가해야합니다. 사용되는 culture dish 의크기에따라 필요한 jetprime 과 DNA 의양이 jetprime 프로토콜 (table 2) 에기재되어있습니다. jetprime /DNA 복합체를 stable 하게사용할수있는기간은얼마입니까? jetprime 을사용할경우에는형성된지 15~30 분정도의 jetprime /DNA 복합체에서최적의 transfection efficiency 를얻을수있습니다. 그러므로 incubation 시간이많이필요한 High Throughput Screening (HTS) 실험에적용할경우에는복합체형성후 4 시간까지안정한상태를유지할수있는 jetpei 를사용할것을권장합니다. jetprime 를사용하여 DNA transfection 을할경우 plasmid 크기에제한이있습니까? 이경우 plasmid 의크기에제한이없습니다. 하지만, 동일한양의 DNA 의경우에 size 가큰 plasmid 가 작은것보다 gene copy number 가더적다는것을염두에두고실험디자인을해야합니다. 특정 cell line 에대한별도의실험조건이있습니까? 홈페이지상의 Polyplus-transfection Database 에서검색을통해다수의 cell line 에대한별도의프로토콜을찾을수있습니다. (http://www.polyplus-transfection.com/resources/cell-transfection-database/) 4 코스모진텍학술지원팀 02-465-6217
INTERFERin 은무엇인가요? INTERFERin 은 cell culture 시 mammalian cell 에 sirna 를전달하기위해개발된새로운방식의 nonliposomal cationic amphiphile transfection reagent 입니다. INTERFERin 을사용하여 1 nm 의 sirna 에서 90 % 이상의 silencing efficiency 을얻을수있습니다.. INTERFERin 은어떤종류의 cell line 에서테스트되었습니까? INTERFERin 은 HeLa, HEK-293, A549, MDA-MB-231, BHK-21, CHO 및 OVCAR-3 등의다양한 adherent cell 및 non-adherent cell line 에서성공적으로테스트되었습니다. 또한 INTERFERin 은 primary human fibroblast 및 primary human hepatocytes 등의다양한 primary cells 에서도사용할수있습니다. 자세한내용은 Polyplus-transfection Database 에서확인할수있습니다. (http://www.polyplus-transfection.com/resources/cell-transfection-database/) mirna 의 transfection 을위해 INTERFERin 을사용할수있습니까? 다양한종류의분자들이 mirna 로부정확하게불려지고있습니다. mirna 를아래와같이구분할수있습니다. - mimic mirna : 이것은 sirna 와동일하지는않지만구조적으로매우유사하며, INTERFERin 으로 transfection 할수있습니다. - plasmid encoding for mirna: 이것은 DNA 이므로 jetprime 으로 transfection 할수있습니다. - antimir : 이것은세포내에존재하는 microrna 에특이적으로결합하여그기능을저해하도록디자인된 single-stranded nucleic acid 이며, INTERFERin 으로 transfection 할수있습니다. INTERFERin 을 in vivo 실험에사용할수있습니까? INTERFERin 은 in vitro transfection 전용 reagent 입니다. 동물에서 sirna delivery 실험을하고자한다면, 다양한종류의동물에 sirna 및 oligonucleotides 의 delivery 가가능한 in vivo-jetpei 를사용할것을권장합니다. 자세한정보는홈페이지를참고해주시기바랍니다. (http://www.polyplus-transfection.com/products/in-vivo-jetpei/) INTERFERin 은어떻게보관해야하나요? INTERFERin 은반드시 4 C 에서밀봉한채로보관해야합니다. 의도치않게 -20 에 INTERFERin vial 을두어얼어버렸습니다. 계속사용할수있나요? INTERFERin 은보관온도에따라효율에차이가발생하므로절대동결되면안됩니다. 만약동결되었다면 버리고, 새제품을사용해야합니다. INTERFERin 은개봉후얼마나사용할수있습니까? 적절한보관조건을유지하는경우, INTERFERin cat#409-01 (0.1ml) 은 6 개월간안정한상태를유지합니다. 다른사이즈의 INTERFERin 은최소 1 년이상안정한상태를유지합니다. 5 코스모진텍학술지원팀 02-465-6217
PULSin reagent 가무엇입니까? PULSin 은항체와펩타이드등의많은 protein 들과 positive charged coat 를갖는복합체를형성할수있는 cationic amphiphile molecule 을함유하고있습니다. 이러한 PULSin /proteins 복합체는실제모든세포막에존재하는 syndecans 에결합하여세포안으로들어가며, 이후 endosome 에서 cytoplasm 으로단백질이이동하게됩니다. PULSin 은어떤세포에서 protein delivery 에사용할수있습니까? HeLa 및 NIH-3T3 등의 established cell line 및 Jurkat 등의 suspension cells, 그리고 human keratinocytes 와같은 primary cell 등다양한 type 의 cell 에서 PULSin kit 의 positive control 단백질인 r-phycoerythrin 의 PULSin -mediated delivery 가성공적으로테스트되었습니다. 자세한내용은 Polyplus-transfection Database 에서확인할수있습니다. (http://www.polyplus-transfection.com/resources/cell-transfection-database/) PULSin 을사용하여어떠한 protein 을 delivery 할수있습니까? PULSin 을사용하여 40~250 kda 크기의생리학적 ph 에서 negative charge ( 단백질 pi 범위 : 0 ~ 7.4) 를갖는단백질을성공적으로 delivery 할수있습니다. 또한, anti-giantin, anti-vimentin, anti-tubulin 등세포구성성분을인식하는다양한 antibodies 를 delivery 한후에도계속 target 단백질을인식할수있음을확인하였습니다. Peptides 역시성공적으로 delivery 할수있으며, 보다자세한사항은홈페이지를참고해주시기바랍니다. (http://www.polyplus-transfection.com/transfection-reagents/protein-delivery-reagent-pulsin/) PULSin 은 antibody 또는 protein 을세포질로만운반합니까? PULSin 으로운반되는 antibodies, proteins 또는 peptides 는세포질로이동하여 PULSin /protein 복합체에서방출됩니다. 50 kda 이하의단백질의경우는 nucleus 로 diffusion 될수도있습니다. 큰 size 의단백질을 nuclear targeting 하려면단백질내에 nuclear localization signal (NLS) 을가지고있어야합니다. PULSin 을 -20 C 에서보관하여동결되었습니다. 이것을사용할수있습니까? PULSin 은보관온도에따라효율의차이가발생하므로절대동결되면안됩니다. 만약동결되었다면 버리고, 새제품을사용해야합니다. jetpei 와 in vivo-jetpei 의차이점은무엇입니까? jetpei (in vitro 전용 ) 와 in vivo-jetpei 는기본적으로동일한활성분자를기반으로하고있지만, 각각의적용목적에따라특이적으로개발되었습니다. 그러므로이들의조성, 농도, 순도및검증테스트방법에는서로차이가있습니다. (in vivo-jetpei 의경우 endotoxin-free 조건에서 mouse 에서의 in vivo gene delivery 에대해검증테스트를진행합니다.) 6 코스모진텍학술지원팀 02-465-6217
in vivo-jetpei 는어떻게보관해야하나요? In vivo-jetpei 은매우안정한화합물로상온상태로배송됩니다. 하지만장기보관을위해서는제품수령후 -20 C 에보관하는것을권장합니다. in vivo-jetpei 를사용하여어떤종류의 nucleic acid 의 in vivo delivery 가가능한가요? in vivo-jetpei 를사용하면 DNA, sirna, mirna mimic, antimir, oligonucleotides 등다양한종류의 nucleic acids 에대해 in vivo delivery 가가능합니다. 자세한내용은 Polyplus-transfection Database 에서확인할수있습니다. (http://www.polyplus-transfection.com/resources/cell-transfection-database/) In vivo-jetpei 를어떤동물에서사용할수있나요? In vivo-jetpei 는 mouse, rats, mosquitoes, shrimps, guinea pig, macaques 등다양한종의동물에서테스트되었습니다. 더자세한내용은 technical support 에게문의해주시기바랍니다. in vivo-jetpei 매개의 nucleic acids delivery 는어떤투여경로를사용할수있습니까? in vivo-jetpei 은전신또는국소부위로의 nucleic acid delivery 에모두적합합니다. tail vein ( 꼬리정맥 ) and retro-orbital ( 안와정맥 ) 등으로의 intravenous injection ( 정맥주사 ), intraperitoneal injection ( 복강주사 ), intratumoral injection ( 종양내주사 ), intracerebral injection ( 뇌내주사 ), intranasal instillation ( 비강내점적 ) 등다양한투여경로에대한테스트가성공적으로진행되었습니다. 자세한내용은 technical support 에게문의하시거나홈페이지내의 Application Note (Publications by Administration route) 를참고해주시기바랍니다. 폐를표적장기로실험하고자합니다. 어떤투여경로를사용하는것이가장좋을까요? in vivo-jetpei 은폐에 nucleic acid delivery 를하기에적합한제품입니다. 실제로폐는 in vivojetpei /nucleic acid 복합체가 systemic delivery 시가장많이 targeting 되는장기입니다. 특정장기를 target 으로정하여실험하고자할경우어떻게실험해야합니까? Delivery 과정은표적장기에따라매우상이할수있습니다. 어떤투여경로를선택하느냐에따라 in vivojetpei 매개의유전자발현이뇌, 간, 췌장, 비장, 신장, 심장, 방광, 피부, 망막등의장기에서각각다르게관찰될수있으므로, 자세한정보가필요한경우 technical support 에게문의해주시기바랍니다. 7 코스모진텍학술지원팀 02-465-6217
High-Throughput Screening (HTS) 을위해 DNA 를 transfection 하려면어떤제품이가장좋을까요? jetpei transfection reagent 는자동화또는수동의 HTS 를수행하는데가장최적화되어있으며, Reverse, Batch, Forward 세가지프로토콜을모두사용할수있습니다. jetpei reagent 로일관된반복실험결과를얻을수있으며, DNA/jetPEI 복합체는 4 시간까지안정한상태를유지합니다. 보다자세한내용은홈페이지를참고하시기바랍니다. (http://www.polyplus-transfection.com/products/jetpei/) High-Throughput Screening (HTS) 을위해 sirna 를 transfection 하려면어떤제품이가장좋을까요? INTERFERin -HTS 는 HTS 환경에서최대의 gene silencing 효율을얻을수있도록특별히개발된새로운개념의 sirna 전용 transfection reagent 로최고의재현성과소량의 reagent 를사용하므로향상된 cell viability 를유지할수있습니다. INTERFERin -HTS 는 serum 및 antibiotics 가포함된 media 에서사용이가능하며합리적인가격과취급용이성을가지고있습니다. 96-well 과 384-well plates 에서 forward 또는 reverse transfection 을진행할수있는실험프로토콜을제공합니다. 자세한내용은홈페이지를참고하시기바랍니다. (http://www.polyplus-transfection.com/products/interferin-hts/) jetpei 의분자량은얼마인가요? jetpei 는 linear polyethylenimine (PEI) 으로구성되어있으며, 분자량은 polyplus 의고유정보로공개할수없습니다. Polyplus 는 in vitro 조건에서가장세포독성이낮으면서최적의 DNA delivery 효율을갖는 linear PEI 를선택하기위해수많은최적화실험을진행하여 jetpei 를제품화했습니다. jetpei 을 HTS 이외의다른용도로도사용할수있습니까? jetpei 은 HTS 이외에 in vitro DNA transfection 등의용도로도사용할수있습니다. 또한 primary neuron 에 jetpei 매개의 DNA transfection 이가능한별도의프로토콜을개발했습니다. 자세한정보가필요한경우 technical support 에게문의해주시기바랍니다.. FectoPRO 를바이러스생산을위해사용할수있습니까? FectoPRO 은 suspension cell 에서의바이러스생산에완벽하게최적화되어있습니다. PEIpro 는 adherent cell 에서의바이러스생산에더적합합니다. 두제품모두치료용바이러스생산에적합하도록광범위한품질검증을거쳐생산됩니다. Bioproduction 에는어떤 transfection reagent 를사용해야합니까? FectoPRO 및 PEIpro 는모두 biomanufacturing 을위해사용할수있습니다. FectoPRO 는 suspension 상태로배양하는 CHO 또는 HEK-293 cell 에서매우높은단백질수율을달성하기에특히적합합니다. 그러나대용량또는초대용량의 scale 로실험을진행할경우에는, HEK-293 세포에서매우효율이높고상대적으로경제적인 PEIpro 를선택할수도있습니다. 8 코스모진텍학술지원팀 02-465-6217
FectoPRO booster 는 bioproduction 실험시반드시함께사용해야하나요?? FectoPRO 는 FectoPRO booster 없이도사용할수있지만, 더적은양의 DNA 를사용하여높은단백질 수율을달성하고자한다면, booster 를사용할것을권장합니다. FectoPRO 를실수로동결시켰습니다. 사용할수있습니까? FectoPRO 는예기치않은동결 / 해동과정에도 transfection efficiency 를유지할수있는안정적인 제품이지만, 오랜기간동안안정한상태를보장하기위해서는 4 에보관하는것을권장합니다. PEIpro 의분자량은얼마입니까? PEIpro 는 linear polyethylenimine (PEI) 으로구성되어있으며, 분자량은 polyplus 의고유정보로공개할수없습니다. Polyplus 는 in vitro 조건에서가장세포독성이낮으면서최적의 DNA delivery 효율을갖는 linear PEI 를선택하기위해수많은최적화실험을진행하여 PEIpro 를제품화했습니다. PEIpro 의 PEI 농도는얼마입니까? PEIpro 은 1 mg /ml 의높은순도와품질의 linear PEI 의수용액으로제공됩니다. PEIpro 를실수로동결시켰습니다. 사용할수있습니까? PEIpro 는예기치않은동결 / 해동과정에도 transfection efficiency 를유지할수있는안정적인 제품이지만, 오랜기간동안안정한상태를보장하기위해서는 4 에보관하는것을권장합니다. 9 코스모진텍학술지원팀 02-465-6217