Original Article 1) 저칼륨혈증흰쥐신장에서 Nrf2 전사유전자의발현증가 전남대학교의과대학해부학교실, 전남대학교기초의과학연구센터 임진섭ㆍ안규윤 Potassium Depletion Upregulates Expression of Nrf2 Transcription Factor in Rat Kidney Jin Seob Lim, M.D., Ph.D. and Kyu Youn Ahn, M.D., Ph.D. Department of Anatomy, Chonnam National University Medical School Medical Research Center for Gene Regulation, Chonnam National University Purpose: The purpose of this study was to analyze the expression and localization of Nrf2 mrna in rats according to the changes of K-diet. Methods: Nrf2 gene was isolated using DNA chip microassay. Northern and Western blot analysis and in situ hybridization (ISH) were performed. Results: Northern analysis of normal rat demonstrated that Nrf2 mrna was abundantly expressed in stomach, moderately in testis, kidney, distal colon, duodenum, and adrenal gland, and weakly in brain, heart, spleen, salivary gland, liver, and lung. In the kidney of K-restricted groups, Nrf2 mrna and protein expressions were gradually increased in K-restricted kidney. By ISH, hybridization signal for Nrf2 gene of normal group was prominent in the S3 segment of proximal tubule, distal tubule, and cortical collecting duct, and weak in outer and inner medullary collecting duct. In K-restricted groups, the localization of hybridization signal was the same as in normal group. Signal intensity of K-restricted groups was markedly increased in outer and inner medullary collecting ducts compared with normal group. But, that of the distal tubule and cortical collecting duct was decreased. mrna for Nrf2 gene of normal group was detected in the cells of the basal portion of intestinal gland of distal colon and stomach, spermatogonia and spermatocytes of seminiferous tubule of testis, small lymphocytes of germinal center of spleen, and adrenal medulla cells of adrenal gland. Conclusion: These results suggest that expression of Nrf2 is different in various tissues and increased expression of Nrf2 gene in outer and inner medullary collecting ducts of hypokalemic kidney could regulate the ion transporter genes by these segments. Key Words: Hypokalemia, NF-E2-related factor 2 (Nrf2), Transcription factor, In situ Hybridization 서 론 * 본연구는한국연구재단기초과학연구사업기초의과학연구센터지원비 ( 안규윤, R13-2002-013-03003) 지원에의해서수행되었으며지원에감사드립니다접수: 2011년 3월 3 일, 수정: 2011년 3월 15일승인: 2011년 3월 15일책임저자: 안규윤광주광역시동구제봉로 671 전남대학교의과대학해부학교실 Tel: 062)220-4204, Fax: 062)228-5834 E-mail: kyahn@jnu.ac.kr 칼륨결핍은흰쥐와사람에서대사성알칼리증을유발하고이러한대사성알칼리증의유지는 HCO - 3 재흡수증가에의해서이루어진다 1-3). 이와관련된기전은토리쪽세관첨부세포막 NHE-3 (Sodium Hydrogen Exchanger-3) 와기저외세포막 NBC-1 (Sodium Bicarbonate Cotransporter-1) 의증가에의한다고하였다 4-6). Ahn 7-9) 은저칼륨혈증신장에 - 239 -
서정상보다 HKα1 mrna 발현이신장겉질에서 2배이상증 가하나바깥속질및속속질에서는유의한차이가없었고, HKα2 mrna는바깥속질및속속질에서정상에비해 5배이상증가 되어발현되나겉질에서는두그룹간에유의한차이가없음을 보고하였으며, Na/K-ATPase isoform mrna는속속질에 서 2-3 배증가되어발현됨을보여주었다. HKα2a mrna에 관해서 Ahn 10) 은칼륨제한식이신장겉질에서는약 40% 정도 감소하였으나바깥속질과속속질에서는 2-4배로현저히증가 하였고, 칼륨제한식이후정상식이에서는정상식이군과유사 하게발현되었음을보고하여이들효소발현의변화로칼륨이온 재흡수가일어날것으로생각하였다. 이와같이저칼륨혈증에서 다양한효소발현의변화가있다는것은잘알려져있지만저칼 륨혈증에의한직접적인영향인지, 또는다른신호전달인자에의 한간접적인영향인지는알려져있지않다. 또한, 지금까지칼륨 제한시신장에서의대부분의연구는 H/K-ATPase, H- ATPase, Na/K-ATPase, NHE-3 inhibitor-sensitive 및 NBC-1에대한 이온수송혹은효소활성이나유전자의 발현에관한것뿐이었고, 이유전자들의발현을조절하는분자 적기전이나칼륨평형장애에대한유전자의특이한반응과조 절에관한연구는흔치않다. NF-E2-related factor 2 (Nrf2) 는 Cap-N-Collar (CNC) 계열의 basic region-leucine zipper (b-zip) 전 사조절인자로서, erythroid-derived CNC homology protein (ECH) 이라고불리기도한다 11, 12). Nrf2의 basic/leucine zipper region은 NF-E2-related factor family인 Nrf1, Nrf3 와상당히유사한것으로알려져있다 13). 최근의보고들 15) 에의하면 Nrf2는세포내활성산소종과친전자성물질에대 한방어효소또는 14, phase II에관련된해독화효소의발현조절 에관여하는전사인자로서정상적인조건에서는 kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1) 과결합된상태로세 포질내에존재한다. 세포가활성산소종이나친전자성물질에의 해자극을받게되면 Nrf2가활성화되어핵내로이동하고핵 내에존재하는 Maf 단백질과결합하여항산화효소의 promo- ter 부위에존재하는 antioxidant/ electrophile response element (ARE) 와결합함으로써 phase II 항산화 / 해독화효 소의발현을조절한다고한다. 저칼륨상태에서활성산소종의생 성이증가되고 16, 17), 증가된활성산소종은 Nrf2의방출과핵으 로의이동을촉진한다고보고 14, 18) 된바있어저칼륨혈증신장 에서 Nrf2의발현의변화가여러이온수송체와의관련성을구 명하는것도흥미로울것으로생각된다. 이에본연구는칼륨제한식이에따른흰쥐신장조직에서얻 어진 microarray data를바탕으로 Nrf2 전사인자를찾아내 고, 이유전자의발현및분포의변화를 Northern 및 Western 분석그리고 in situ Hybridization 조직화학방법으로관찰한 것이다. 대상및방법 본실험에사용된동물은체중 230 g 내외의성숙 Sprague- Dawley계숫컷흰쥐 50 마리로다섯군으로구분하였다. 제 1 군은정상식이 (150 meq K + /kg, TD88082, Harlan Teklad, U.S.A.) 를, 제 2 군은칼륨제한식이 (K-free diet, TD88081, Harlan Teklad, U.S.A.) 3 일, 제 3군은칼륨제 한식이 1 주, 제 4군은칼륨제한식이 2 주, 제 5군은칼륨제한 식이 3 주로식이적응을시켰다. 칼륨제한식이군은먹이섭취가 변화될것으로여겨져날마다적은양을먹은군의양으로먹이 를조절하였다. 1. 총 RNA 분리와 Northern 분석 RNA 는각조직으로부터추출하였다. RNA를정제하기위해 조직을 Tri-reagent (Molecular Research Center, U.S.A) 용액에서 polytron으로분쇄하여균질액을만든후 Molecular Research Center 방법에의해원심분리하였다. RNA는 260 nm에서 spectrophotometer 로정량화하였다. Northern 분석을위해 probe는 EcoR1-BamH1 제한분 절을 random primer 기법을통해 α 32 P-CTP로표지하였 다. Probe의활성은 2-3 10 9 cpm/ μg 정도였다. Northern 분석은 30 μg의총 RNA에 glyoxal을넣어변성시킨후 1.2% agarose gel에분획시키고 Genescreen (Dupont, U.S.A.) 에전이시켰다. Hybridization은 65 에서 4 SSC, 2 Denhardt 용액, 0.1% SDS와 1 mg/ml salmon sperm DNA가포함된 hybridization 용액에 20시간정도처리하고 2 SSC, 0.1% SDS 용액으로수세하였다. Signal은 intensi- fying screen 에 -70 에서 autoradiography 로관찰하였다. 모든실험에서 RNA의 integrity는 hybridization 전에 blot 의 UV shadowing에의해확인하고최종적으로는 GAPDH로 Northern 분석하여확인하였다. 2. 단백분리와 Western 분석 칼륨제한식이기간별로신장조직을적출하여액체질소에 - 240 -
Jin Seob Lim and Kyu Youn Ahn: K-Depletion Upregulates Expression of Nrf2 in Rat Kidney 담가급속동결시킨후, 조직의일부를 Nonidet P-40 buffer (150 mm NaCl, 1 mm benzamidine, 50 mm Tris ph 8.0, Trypsin inhibitor 1 μg/ml, 5 mm EDTA ph 8.0, 1 mm PMSF, NP-40 1%) 에넣고얼음속에서 homoge- nizer로분쇄하여균질액을만들어얼음속에 30분간방치하였 다. 균질액은 3,000 rpm으로 10분간원심시켜상층액을분리 한다음다시 15,000 rpm으로 30분간원심하고침전물을완 충액으로녹인다음 -70 에보관하였다. 단백농도는 bovine serum albumin을기준으로 spectrophotometer 로정량화 하였다. 추출한총단백 100 μg을 8% polyacrylamide gel 에전기영동한다음 nitrocellulose membrane 에 4 에서 20 ma로 12 시간전이하였다. Membrane은 TBS-T buffer (20 mm Tris, 150 mm NaCl, 1 M HCl, ph 7.6, 0.1% Tween 20) 에 5% skim milk가첨가된 blocking buffer에 실온에서 2시간동안처리한후 1차항체 Nrf2 polyclonal antibody (Santa Cruz, USA, 1:2,000) 에 4 에서 14시간 반응시켰다. 다시 TBS-T 로 10분씩 3번수세하고 peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG (Santa Cruz, USA 1: 2,000) 로부치하였다. TBS-T 로 3번수세하고발색제인 ECL 용액 (Amersham, USA) 에 5분간반응시킨후시간별로현 상하였다. 3. crna probe 제작과 in situ Hybridization 조직화학 Nrf2에특이한 sense 와 antisense probe는 T 3, T 7 RNA polymerase 와 digoxigenin-11-utp (Boeringer Mann- heim, U.S.A.) 를이용하여제작하였다. Wax (polyethylene glycol 400) 나파라핀에포매된조직표본제작과 in situ Hybridization 조직화학실험은 Ahn 8) 의방법을따랐다. 즉, 동물은 pentobarbital sodium (50 mg/kg, ip) 으로마취하 여복강을노출시킨후복부대동맥을통해 PBS (phosphate buffered saline; NaCl: 137 mm, KCl: 2.7 mm, Na2HPO4: 4.3 mm, KH2PO4: 1.4 mm) 와 periodate-lysine-para- formaldehyde) 고정액으로관류고정시켰다. 조직을절제한 후상기고정액에 3시간동안 4 에서고정한후 PBS로 3회 세척하고 ethanol로탈수과정을거친후 wax나파라핀에포매 하였다. 포매된조직은회전식절편기로 6 μm 두께의절편을 얻어 in situ Hybridization 조직화학실험에사용하였다. 절 편된조직은 50% formamide가포함된 hybridization 용액 에서 14-16시간동안 42 에서교잡시켰다. Hybridization signal 은 colorimetric 반응에서 anti-digoxigenin-alkaline phosphatase conjugate (Boeringer Mannheim, U.S.A.) 로검출하였다. 4. 실험성적분석 Northern blot autoradiogram 은 scanner로 scan하여 peak를 Image Pro Plus 4.1 software (Nicon, Japan) 로 처리, 정량분석하였다. 결 과 1. Northern 및 Western 분석소견 Nrf2 유전자의조직내발현유무를보기위해부신, 뇌, 원 위결장, 십이지장, 심장, 신장, 간, 폐, 침샘, 비장, 위, 및고환에 서총 RNA를추출하여 Northern 분석을시행하였다. 위에서 강한 signal 을관찰할수있었고고환, 신장, 원위결장, 십이지 장, 부신에서는중등도의발현을보였으며뇌, 심장, 비장, 침샘, 간및폐에서는미약하였다 (Fig. 1A). 칼륨제한식이군의 Nrf2 mrna 발현은 Northern 분석에서칼륨제한식이기간이길 어질수록점진적으로증가하였다 (Fig. 1B, 1C). Western 분 석소견에서도 Nrf2 단백발현은칼륨제한식이 1주군을제외하 고는제한식이가진행될수록 mrna 발현양상과동일하게증가 하였다 (Fig. 1D, 1E). 2. in situ Hybridization 조직화학소견 정상식이신장에서의 Nrf2 유전자는강한 hybridization signal이 S3 segment, 먼쪽곧은세관, 먼쪽곱슬세관및겉질 집합관에서관찰되어높은발현을보였고, 바깥속질집합관및속 속질집합관에서는 hybridization signal이낮아미약하게발현 되었다. 칼륨제한식이 3일군에서는 Nrf2 유전자발현이 S3 segment, 먼쪽곧은세관, 먼쪽곱슬세관및전집합관으로발현 부위와발현정도가정상식이군과유사하였다. 칼륨제한식이 1주군에서는 Nrf2 유전자발현이 S3 segment, 먼쪽곧은세관, 먼쪽곱슬세관및전집합관으로발현부위가정상식이군과유 사하였으나바깥속질집합관및속속질집합관에서 hybridization signal 이점차증가하기시작하였다. 칼륨제한식이 2주군에서 는 Nrf2 유전자발현이 S3 segment, 먼쪽곧은세관, 먼쪽곱슬 세관및전집합관으로발현부위가정상식이군과유사하였으 - 241 -
Fig. 1. Nrf2 mrna and protein expression. (A) Nrf2 mrna expression from various tissues of rat. It's expression is most prominent in stomach, moderate in testis, kidney, distal colon, duodenum, and adrenal gland, and weak in brain, heart, spleen, salivary gland, liver, and lung. (B) mrna expression of Nrf2 gene in normal and K-restricted rat kidney by Northern blot. It's expression is gradually increased in K-restricted rats. (C) Relative densitometric analysis of Northern blots. (D) Nrf2 protein expression in normal and K-restricted rat kidney by Western blot. It's expression is gradually increased in K-restricted rats except LK 1W. (E) Relative densitometric analysis of Western blots. N, normal diet for 2 weeks; LK 3D, K-free diet for 3 days; LK 1W, K-free diet for 1 week; LK 2W, K-free diet for 2 weeks; LK 3W, K-free diet for 3 weeks. 나발현정도는겉질의먼쪽곧은세관, 먼쪽곱슬세관및겉질집합 관에서는감소하였고, 대신바깥속질집합관및속속질집합관특 히개재세포에서 hybridization signal 이상당히증가하였다. 칼륨제한식이 3주군에서는 Nrf2 유전자발현이겉질에서는 2 주간과유사하였으나속질의바깥속질집합관및속속질집합관 특히개재세포에서 가장높게발현되었으며 (Fig. 2). hybridization signal이더욱더증가하여 Northern 분석소견과일치하였다 정상식이군의 in situ Hybridization 조직화학소견상위 (Fig. 3A) 와원위결장 (Fig. 3C) 에서는아래 1/2의장선에서 만관찰되었고고환 (Fig. 3B) 에서는정세관의기저부정조세 포와정모세포에서관찰되었다. 비장 (Figs. 3E, 3F) 에서는종 자중심의림프구에서발현되었다. 부신 (Figs. 3G, 3H) 에서는 속질세포에서만발현되었고겉질세포에서는발현되지않았다. 그러나폐 (Fig. 3D) 에서는거의발현이되지않았다. - 242 -
Jin Seob Lim and Kyu Youn Ahn: K-Depletion Upregulates Expression of Nrf2 in Rat Kidney Fig. 2. In situ hybridization localization of Nrf2 mrna in the kidney of normal (N) and K-restricted rats (LK3D, LK1W, LK2W, and LK3W). A digoxigeninlabeled antisense riboprobe specific for Nrf2 gene was hybridized under high stringency conditions to sections of the cortex (CTX), outer medulla (OM), and inner medulla (IM). Hybridization signal for Nrf2 gene of normal group is prominent in the S3 segment of proximal tubule, distal straight tubule, distal convoluted tubule, and cortical collecting duct and weak in outer and inner medullary collecting duct. In K-restricted groups, the localization of hybridization signal is the same as normal group. Signal intensity of K-restricted groups is markedly increased in outer and inner medullary collecting ducts compared with normal group. But, that of the distal straight tubule, distal convoluted tubule, and cortical collecting duct is decreased (Scale bar is 20 μm). N, normal diet for 2 weeks; LK 3D, K-free diet for 3 days; LK 1W, K-free diet for 1 week; LK 2W, K-free diet for 2 weeks; LK 3W, K-free diet for 3 weeks. 고 본연구는 DNA chip microassay 방법을이용하여 Nrf2 전사유전자를탐색하고저칼륨혈증에서이유전자의발현및분 찰 포를여러조직에서처음으로밝힌것이다. 강한 본연구의 Northern 분석소견에서 Nrf2 유전자는위에서 signal 을관찰할수있었고고환, 신장, 원위결장, 십이지 Fig. 3. In situ hybridization localization of Nrf2 mrna in the stomach (A), testis (B), distal colon (C), lung (D), spleen (E, F) and adrenal gland (G, H) of normal rat. A digoxigenin-labeled antisense riboprobe specific for Nrf2 gene was hybridized under high stringency conditions. mrna for Nrf2 gene is detected in the cells of the basal portion of intestinal gland of distal colon and stomach, spermatogonia and spermatocytes of seminiferous tubule of testis, small lymphocytes of germinal center of spleen, and adrenal medulla cells of adrenal gland. Nrf2 gene is not detected in the lung. 장, 부신에서는중등도의발현을보였으며뇌, 심장, 비장, 침샘, 간및폐에서는매우약하게발현되었지만거의대부분의조직 에서발현됨을알수있었다. 이는병아리의 Northern 분석소 견에서적혈구, 신장및장에서는상당량발현되고뇌, 간, 가로 무늬근육및심장에서는소량발현되었다는소견 11) 과유사하였 다. 또한, 칼륨제한식이군의 Nrf2 mrna와단백발현은칼륨 제한식이기간이길어질수록점진적으로증가하였다. 이와같은 소견은저칼륨상태에서활성산소종의생성이유도되고활성산 소종의과도생성은세포비대와세포분열에관여하는다양한유 - 243 -
전자들의발현을매개하는중요한신호전달기전이라는보고 14, 17-20) 를감안하면세포의비대와증가가일어나는저칼륨혈증 신장, 그리고세포증식과분열이왕성한위, 고환, 원위결장및 십이지장에서 Nrf2 발현이높게나타난다는사실을설명할수 있을것으로생각된다. 뿐만아니라본연구의정상식이군 in situ Hybridization 조직화학소견에서 Nrf2 발현이위, 고환 그리고원위결장기저부의세포에서만관찰되었는데이들부위 는형태학적으로증식과분화가활발하므로 Nrf2의기능이세 포방어, 분화, 증식및분열과정에관여하는유전자발현조절에 큰역할을할것으로추측하였다. 본연구의신장 in situ Hybridization 조직화학소견에서 정상식이군의 Nrf2 유전자의발현은 S3 segment, 먼쪽곧은 세관, 먼쪽곱슬세관및겉질집합관에서높은발현을보였고, 바 깥속질집합관및속속질집합관에서는 hybridization signal이 낮아미약하게발현되었다. 칼륨제한식이 2주군부터는 Nrf2 유전자발현이 S3 segment, 먼쪽곧은세관, 먼쪽곱슬세관및 전집합관으로발현부위가정상식이군과유사하였으나발현정 도는겉질의먼쪽곧은세관, 먼쪽곱슬세관및겉질집합관에서는 감소하였고, 대신바깥속질집합관및속속질집합관특히개재세 포에서 hybridization signal 이상당히증가하였다. 이와같은 소견은저칼륨혈증에서여러이온수송체의유전자가이들부위 에서증가한다는소견 7-10) 과일치하였는데이는 Nrf2가이들 유전자의전사기능을직접적으로항진시키거나, 또는 Nrf2가 직접이온수송에관여했을가능성도배제할수는없다. Nrf2 는세포내활성산소종과친전자성물질에대한방어효 소또는 phase II에관련된해독화효소의발현조절에관여하 는전사인자로서정상적인조건에서는 Keap1과결합된상태로 세포질내에존재하나세포가활성산소종이나친전자성물질에 의해자극을받게되면활성화되어핵내로이동하고핵내에 존재하는 Maf 단백질과결합하여항산화효소의 promoter 부 위에존재하는 ARE와결합함으로써 phase II 항산화 / 해독화 효소의발현을조절한다고한다 14, 15) 세포가. 어떻게외부신호 를받아들여 Nrf2를활성화하여항산화제나 phase II 해독화 효소의합성을유도하는지는명확히밝혀져있지않지만세포내 신호전달에있어중요한역할을하는 mitogen-activated protein kinases (ERK, p38 MAPK, JNK) 를비롯한 Akt 및 PKC 등과같은 kinase에의해 Nrf2의 Serine과 Thre- onine 잔기의인산화를통해 Nrf2가 Keap1으로부터분리되 어 Nrf2의핵내이동과 ARE 결합을용이하게한다는가능성 도제시되고있다. 또한 Nrf2의인산화와는별개로세포내산화 -환원시스템을교란함으로써산화- 환원시스템에민감한전 사인자들특히 Nrf2-Keap1 복합체에존재하는 Cysteine-SH 가산화됨으로써 이로인해 Nrf2-Keap1의구조적인변화가일어나고 Nrf2가분리되어항산화발현을유도할것으로보고 있다. Keap1의 Cysteine 잔기는세포내산화-환원상태의 분자센서로서세포가산화적손상에대한방어또는친전자성 독성물질의해독화에관여하는유전자들을필요시적절히발현 14, 15, 21, 될수있도록하는데중요한역할을할것으로생각된다 22) 와. Nrf2와여러이온수송체간의관계는추후 promotor 연구 DNA chip assay와같은분자생물학적인연구와생리학적 인연구를통하여밝혀질수있을것이라고생각한다. 이상의소견은 Nrf2 전사유전자발현이조직에따라다름을 보여주며, 저칼륨혈증신장의바깥속질및속속질집합관에서증 가하여이들부위에서이유전자가이온수송체유전자조절에 관여할것임을암시해주었다. 그러나 Nrf2 전사유전자가작용 하는표적유전자의 promotor 연구가필요하며또한저칼륨혈 증에서유전자발현변화가저칼륨에의한직접적인결과인지, 간 접적인결과인지는추후여러연구가필요할것으로생각되었다. 요 목적 : 본연구는흰쥐의다양한조직에서 Nrf2 전사유전자 약 의발현및분포를알아보고자하였다. 방법 : 칼륨제한식이에따른흰쥐신장조직에서얻어진 mi- croarray data를바탕으로 Nrf2 전사인자를찾아내고, 이유 전자의발현및분포를 Northern 및 Western 분석그리고 in situ Hybridization 조직화학방법으로관찰하였다. 결과 : Northern 분석을통한 Nrf2 mrna의조직내발현 은위에서강한 signal 을관찰할수있었고고환, 신장, 원위결 장, 십이지장, 부신에서는중등도의발현을보였으며뇌, 심장, 비장, 침샘, 간및폐에서는미약하였다. 칼륨제한식이기간에 따른흰쥐신장의 Nrf2 mrna와단백발현변화는칼륨제한 식이가진행될수록점진적으로증가하는것을알수있었다. in situ Hybridization 조직화학소견상정상식이신장에서의 Nrf2 유전자는 S3 segment, 먼쪽세관및겉질집합관에서높 게발현되었고, 바깥속질집합관및속속질집합관에서는낮게발 현되었다. 칼륨제한식이군에서 Nrf2 유전자발현부위는정상 식이군과일치하였으나발현정도는겉질의먼쪽세관및겉질집 합관에서는감소하였고, 대신바깥속질집합관및속속질집합관 에서는상당히증가하였다. 정상식이군의위와원위결장에서는 아래 1/2 의장선에서만관찰되었고, 고환에서는정세관의기저 부정조세포와정모세포에서관찰되었다. 비장에서는종자중심 - 244 -
Jin Seob Lim and Kyu Youn Ahn: K-Depletion Upregulates Expression of Nrf2 in Rat Kidney 의작은림파구와부신속질세포에서만발현되었고부신겉질에 서는발현되지않았다. 결론 : 이상의소견은 Nrf2 유전자발현이조직에따라다르 며, 저칼륨혈증신장의바깥속질및속속질집합관에서증가하여 이들부위에서이유전자가이온수송체유전자조절에관여할 것임을시사해주었다. 참고문헌 1) Capasso G, Jaeger P, Giebisch G, Guckian V, Malnic G: Renal bicarbonate reabsorption in the rat. II. Distal tubule load dependence and effect of hypokalemia. J Clin Invest 80:409-414, 1987 2) Hernandez RE, Schambelan M, Cogan MG, Colman J, Morris RC Jr, Sebastian A: Dietary NaCl determines severity of potassium depletion-induced metabolic alkalosis. Kidney Int 31:1356-1367, 1987 3) Jones JW, Sebastian A, Hulter HN, Schambelan M, Sutton JM, Biglieri EG: Systemic and renal acid-base effects of chronic dietary potassium depletion in humans. Kidney Int 21:402-410, 1982 4) Kim JH, Cho HJ, Bae MO, Park JJ, Ahn KY: Regulations of bicarbonate ions in hypokalemic rat kidney. Korean J Anat 37:337-345, 2004 5) Amlal H, Habo K, Soleimani M: Potassium deprivation upregulates expression of renal basolateral Na+-HCO3- cotransporter (NBC-1). Am J Physiol Renal Physiol 279:F532-F543, 2000 6) Soleimani M, Bergman JA, Hosford MA, McKinney TD: Potassium depletion increases luminal Na+/H+ exchange and basolateral Na+:CO3-: HCO3- cotransport in rat renal cortex. J Clin Invest 86:1076-1083, 1990 7) Ahn KY, Kim SC, Heo T, Moon BC, Kim KK: Effects of chronic hypokalemia on expression of Na+-K+- ATPase isoforms in rat renal medulla. (abstracts) Nephrology 3(Suppl 1):S210, 1997 8) Ahn KY, Turner PB, Madsen KM, Kone BC: Effects of chronic hypokalemia on renal expression of the "gastric" H+-K+-ATPase alpha-subunit gene. Am J Physiol 270:F557-F566, 1996 9) Ahn KY, Park KY, Kim KK, Kone BC: Chronic hypokalemia enhances expression of the H+-K+-ATPase alpha 2-subunit gene in renal medulla. Am J Physiol 271:F314-F321, 1996 10) Ahn KY, Kim BY, Lee SW, Kim KK, Park SS: Renal adaptive responses of HK alpha2 gene (HK alpha 2a, HK alpha 2b) to the changes of potassium(k) diet. Korean J Nephrol 18:672-682, 1999 11) Itoh K, Igarashi K, Hayashi N, Nishizawa M, Yamamoto M: Cloning and characterization of a novel erythroid cell-derived CNC family transcription factor heterodimerizing with the small Maf family proteins. Mol Cell Biol 15:4184 4193, 1995 12) Moi P, Chan K, Asunis I, Cao A, Kan YW: Isolation of NF-E2- related factor 2 (Nrf2), a NF-E2-like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF-E2/AP1 repeat of the beta-globin locus control region. Proc Natl Acad Sci USA 91:9926-9930, 1994 13) Kobayashi A, Ito E, Toki T, Kogame K, Takahashi S, Igarashi K, Hayashi N, Yamamoto M: Molecular cloning and functional characterization of a new Cap'n' collar family transcription factor Nrf3. J Biol Chem 274:6443-6452, 1999 14) Shen G, Jeong WS, Hu R, Kong AN: Regulation of Nrf2, NF-kappaB, and AP-1 signaling pathways by chemopreventive agents. Antioxid Redox Signal 7:1648-1663, 2005 15) Motohashi H, Yamamoto M: Nrf2-Keap1 defines a physiologically important stress response mechanism. Trends Mol Med 10:549-557, 2004 16) Babilonia E, Wei Y, Sterling H, Kaminski P, Wolin M, Wang WH: Superoxide anions are involved in mediating the effect of low K intake on c-src expression and renal K secretion in the cortical collecting duct. J Biol Chem 280:10790-10796, 2005 17) Zhou X, Yin W, Doi SQ, Robinson SW, Takeyasu K, Fan X: Stimulation of Na, K ATPase by low potassium requires reactive oxygen species. Am J Physiol Cell Physiol 285:C319-C326, 2003 18) Deplancke B, Gaskins HR: Redox control of the transsulfuration and glutathione biosynthesis pathways. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 5:85-92, 2002 19) Finkel T: Redox-dependent signal transduction. FEBS Lett 476:52-54, 2000 20) Bowen JW, McDonough A: Pretranslational regulation of Na-K- ATPase in cultured canine kidney cells by low K+. Am J Physiol 252:C179-C189, 1987 21) Osburn WO, Kensler TW: Nrf2 signaling: An adaptive response pathway for protection against environmental toxic insults. Mutat Res 659:31-39, 2008 22) Papaiahgari S, Kleeberger SR, Cho HY, Kalvakolanu DV, Reddy SP: NADPH oxidase and ERK signaling regulates hyperoxia-induced Nrf2-ARE transcriptional response in pulmonary epithelial cells. J Biol Chem 279:42302-42312, 2004-245 -