[ 서식제 6-1 호 ] 최종보고서제출서 2008 년지역산업기술개발사업 ( 지역산업공통기술개발 ) 에의하여완료한제주자생생물유래다당류를이용한알코올성간질환완화및숙취해소음료개발에관한기술개발사업의최종보고서를별첨과같이제출합니다. ( 지역산업진흥사업관리지침따라최종보고서의산업계, 학계, 관련연구기관등으로의배포에동의합니다.) 첨부 : 1. 최종보고서 7부 2. 참여기업대표의기술개발성과확약서각1부 3. 완료과제에대한 [ 참여기업, 주관기관 ] 대표자의평가의견서각 1부 2008. 4. 30. 총괄책임자 : 박선홍 ( 인 ) 주관기관 : ( 주 ) 오엔씨박선홍 ( 인 ) 참여기업 : ( 주 ) 오엔씨박선홍 ( 인 ) 위탁기관 : 경북대학교부용출 ( 인 ) 지식경제부장관귀하
제출문 지식경제부장관 귀하 본보고서를 제주자생생물유래다당류를이용한알코올성간질환 완화및숙취해소음료개발 ( 개발기간 :2006. 5. 1~2008. 4. 30) 과 제의최종보고서로제출합니다. 2008. 4. 30. 주관기관 : ( 주 ) 오엔씨박선홍 ( 인 ) 참여기업 : ( 주 ) 오엔씨박선홍 ( 인 ) 위탁기관 : 경북대학교부용출 ( 인 ) 총괄책임자ː박선홍연구원ː부용출 " ː신규식 " ː양근혁 " ː고윤영 " ː김효정 " ː이상일지역산업진흥사업관리지침에따라보고서내용을관련기관에널리배포함에동의합니다.
지역산업기술개발사업최종보고서초록 ( 지역산업공통기술개발 ) 관리번호제주자생생물유래다당류를이용한알코올성간질환완화및과제명숙취해소음료개발키워드제주자생생물 / 간질환완화 / 숙취해소 / 간기능향상 / 기능성음료개발목표및내용 1. 최종목표 본과제의최종목표는제주자생생물자원으로부터추출한성분을 주성분으로하는알코올성간질환완화및숙취해소음료를개발하는 데있다. 2. 개발내용및결과제주자생생물자원중의추출원으로서또는알코올성간질환완화및숙취해소음료로서의활용성이높은원료소재를확보하고자하였다. 이를위하여알코올성간질환완화및숙취해소효능을평가할수있는배양세포및동물수준의평가법을확립하고알코올성간질환완화및숙취해소효능이있는성분및기타소재의추출및정제공정을개발하였다. 기술개발결과, 제주자생제주조릿대추출물을포함하는알코올성간질환완화및숙취해소용시제품을개발하였으며, 이에대한알코올성간질환완화및숙취해소와관련하여세포및동물수준평가법과인체호기실험및관능평가시험을적용함으로써효능을확인하고, 기호성을향상하여음료제품을제조하였다. 3. 기대효과 ( 기술적및경제적효과 ) 본과제를통해구축하게될생물자원활용기술및효능평가기술은향후대상다양한자원의개발및고기능제품의개발에유익한핵심기반기술로서기여할것이다. 또한제주도가관광지라는특성을고려할때, 신뢰성있는알코올성간질환완화및숙취해소효과음료의개발은관광객들에대한서비스차원및관광수입증대효과뿐만아니라제주지역의주류산업과도상생발전가능한효과를기대할수있다. 4. 적용분야 제주관광시장을목표로판매를개척할계획이며, 점차해외기능성 음료시장으로확대할계획이다.
목 차 제 1 장서론 8 제 1 절기술개발의현황및목적 8 1. 기술개발의현황 8 가. 생물자원활용제품개발현황 8 나. 알코올성간질환완화및숙취해소효과평가기술 9 다. 기능성물질및기능성음료제조 10 2. 기술개발의목적 11 제 2 절기술개발의목표및범위 12 1. 기술개발의목표 12 2. 기술개발의범위 14 제 3 절기술개발의기대효과 16 제 2 장기술개발내용및방법 17 제 1 절대상원료의확보 17 제 2 절추출정제공정의확립 21 1. 대상원료에대한추출시험 21 2. 최적화공정및수율 23 3. 경제성평가 23 제 3 절효능평가법의구축및활용 24 1. 세포수준의효능평가법의구축 24-3 -
가. 세포배양과처리 24 나. 세포독성평가 25 다. GGT 활성측정 25 라. GGT mrna 분석법 26 마. 염증탐색 26 바. 섬유화탐색 28 사. 세포내 GSH량측정 /ROS의발생측정 28 2. 동물실험을통한효능평가법의구축 29 가. 대상실험동물및시료채취 29 나. 혈액의생화학적분석 :AST,ALT,GGT의혈중유출 30 다. 지질과산화측정 : TBA-MDA adducts 생성측정 30 라. 간조직의분석 31 마. 혈중숙취관련지표분석 31 바. Glutathion 측정 31 사. 통계분석법 32 3. 효능평가법의활용 32 가. 제주특산해조류 13종에대한 GGT 분석 32 나. 약용, 해조류, 채소작물등 50종의 GGT 유출억제연구 32 다. 후보기능물질및제주특산시료에대한알코올독성경감효과평가 33 제 4 절효능평가를통한기능물질의선정 34 제 5 절음료시제품의제조및인체알코올호기시험 34 1. 음료시제품의제조 34-4 -
2. 관능평가 35 3. 인체알코올호기시험 35 제 3 장기술개발의결과 36 제 1 절대상원료의확보 36 제 2 절추출정제공정의개발 38 1. 추출정제공정의적용 38 가. 열수추출 38 나. 알코올추출 40 다. 가수분해추출 42 라. 다당체의추출 46 마. 식이섬유의추출 48 2. 최적화공정및추출수율결과 50 3. 경제성평가 55 제 3 절효능평가법의구축및활용 56 1. 세포수준의효능평가법의구축 56 가. 세포배양과처리방법 56 나. 세포독성평가법 58 다. GGT 활성측정법 58 라. GGT mrna 분석법 59 마. 염증탐색법 60 바. 세포내 GSH량측정 /ROS의발생측정 60 2. 동물실험을통한효능평가법의구축 62-5 -
가. 대상실험동물및시료채취 62 나. 혈액의생화학적분석 :AST,ALT,GGT의혈중유출 62 다. 지질과산화측정 : TBA-MDA adducts 생성측정 62 라. 간조직의분석 63 마. 혈중숙취관련지표분석 63 바. Glutathion 측정 64 3. 효능평가법의활용 65 가. 제주특산해조류 13종에대한 GGT 분석 65 나. 약용, 해조류, 채소작물등 50종의 GGT 유출억제연구 65 다. 후보기능물질및제주특산시료에대한알코올독성경감효과평가 67 라. 시제품에대한알코올간독성효능평가 69 제 4 절효능평가를통한기능물질의선정 75 1. 선정된기능물질의성분및효능 75 가. 제주조릿대, 복분자, 녹차, 밀크티슬 75 나. 갈고리가시우무 76 2. 기능물질시료의제조 78 제 5 절음료시제품의제조및인체알코올호기시험 79 1. 음료시제품의제조 79 2. 인체알코올호기시험 82 3. 관능시험 84 제 4 장결론 85-6 -
부 록 1. 선행기술조사결과보고서 2. 특허출원전략보고서 3. 특허명세서 4. 기술성. 사업성평가서 5. 발표논문 (Phytother. Res. 22. 669-674 (2008)) - 7 -
제 1 장서론 제 1 절기술개발의현황및목적 1. 기술개발의현황 본과제가개발하고자하는기술은제주자생생물자원을활용한알코올성간질환완화및숙취해소음료개발이다. 이기술은크게생물자원활용기술, 알코올성간질환완화및숙취해소효능평가기술, 기능성음료제조기술의세가지기술로구성된다. 가. 생물자원활용제품개발현황 경제가발전하고생활이윤택해지면서웰빙개념이활성화되고있는추세이다. 따라서, 성인병발생율이높아지고있고치료의방법이과거약물치료의방법에서생물자원에서추출하거나발견된천연치료에의한방법이선호되고있다. 최근몇년에걸쳐다시마와같은갈조류와달맞이꽃종자유등천연생물에서추출된생물자원을바탕으로원료화한기능성식품원료들이상품화되어소비자들에게호평을받고상당한매출효과를가져온사례를통해나타나듯이그가능성이매우높다할수있다. 이처럼생물자원을포함한생명자원의확보, 관리및활용의중요성이날로높아짐에따라고부가가치생명자원과관련한활용기술이매우중요해지고있다. 이와관련하여생명자원의발굴확대, 자원활용에관한기초연구및경제적부가가치를창출하기위한응용연구활성화의필요성이대두되고있다. 지역적으로제주도는 8000여종의생물자원과다른지역보다월등한청정환경을보유하고있으며, 이러한자원에함유된특이한성분들이피부질환을비롯한다양한질환치료제로각광받고있다. 지난해한벤처기업이제주도자생소나무에서염증을억제하는신물질을추출하는등성과 - 8 -
를보이고, 동백씨에서아토피치료물질을추출할수있다는연구결과도나온데다제주바이오사이언스파크와같은 BT 개발환경인프라까지제공하고있다. 또한생물자원으로부터추출한물질의유효성분을분리하고임상시험등을통한규격화 표준화등약효평가등에대한기술이개발되고있다. 나. 알코올성간질환완화및숙취해소효과평가기술 알코올성간질환은우리나라만성간질환의약 10% 를차지하는중요한질환이다. 술소비량의증가, 음주에대한관대한태도등으로우리나라에서알코올에의한간질환의비중이당분간증가할것으로예측된다. 숙취는술을무리하게마셔간이알코올의해독작용을제대로못하게되고, 분해되지못한알코올은체내에남아있게되어그로인해머리가어지럽고구토증세가생기며, 다음날까지술기운이남아있게되는것을말한다. 따라서, 알코올성간질환완화및숙취효과평가기술은국민건강에기여한다는측면과, 시장성측면에서매우중요하다고하겠다. 또한, 보다과학적인연구개발을통한신뢰성있는제품개발을위해서는이러한효과를평가하는효능평가기술의구축이필요하다. 이와관련하여현재기능성시품산업의경우, 과거의소비자신뢰를확보하기위하여기능성개별인증제라는정책을펴고있는추세이다. 즉소비자의신뢰확보측면과수출을위하여그기능성확인이보다과학적으로증명되어야한다. 이에따라매우많은비용이소용이될것으로예상되어지나현재소비자의인식이마케팅에있어서매우중요한영향을미치기때문에, 본사업의개발대상기술인효능평가기술은궁극적으로시장을확대하는데있어긍정적인역할을할수있을것이다. - 9 -
다. 기능성물질및기능성음료제조 기능성물질이란생체방어, 생체리듬의조절, 질병의방지와회복등생체조절기능을가진물질로정의할수있다. 최근에는주로약용식물에서인간에게유리하게작용할수있는우수한기능성물질이속속밝혀짐에따라서이들물질의효능을밝힘과동시에기능성식품, 화장품및의약품의신소재개발에관한연구들이활발한상태이다. 한편기능성음료는건강음료, 건강보조음료라고도하며, 여러가지생리활성물질을함유하는생체조절기능을나타냄으로써일반적인음료의기능인영양공급, 감각충족, 갈증해소이외에예방의학적으로건강증진효과가기대되는음료를총칭한다. 최근음료는생활수준의향상으로건강을생각하는음료로의질적전환을이루고있다. 이러한시장의변화에따라음료시장은기능성음료가주도하고있으며최근들어기능성음료시장규모가높은신장세를보이고있고, 또한새로운음료소재의개발및이에대한다각적인기능규명이시도될것으로보이며, 첨단생명공학기술을활용한기능성음료개발이한층더가속화될것으로전망되고있다 1). 1) 박상희, 한국보건산업진흥원, 최근국내기능성음료특허동향, 보건산업기술동향, 2003. 봄 - 10 -
2. 기술개발의목적 최근생물자원을포함한생명자원의확보, 관리및활용의중요성이높아지고있다. 더불어고부가가치생명자원과관련한활용기술이매우중요해지고있으며, 특히제주도의경우지역전략산업으로추구하고있는바이오산업의개념이제주자원의활용을통한고부가가치건강식품의개발을포함하고있다. 반면, 알코올성간질환의경우에는우리나라만성간질환의약 10% 를차지하는중요한질환이다. 이를고려할때, 알코올성간질환완화및숙취효과평가기술에있어보다신뢰성있는기술의개발이필요하다고할수있다. 따라서본기술개발에서는, 제주자생생물로부터유래하는다당류를이용하여알코올성간질환완화및숙취를해소하는기능성음료를개발하고자하였다. 특히자원활용기술및효능평가기술의개발에중점을두었다. - 11 -
제 2 절기술개발의목표및범위 1. 기술개발의목표 본연구는제주자생생물자원으로부터추출한성분을주성분으로하는알코올성간질환완화및숙취해소음료를개발하고자하였다. 또한이와관련한자원활용기술및효능평가기술을개발하는데중점을두었으며, 이를달성하기위한구체적인세부목표는다음과같다. - 제주자생생물자원의추출원으로서또는알코올성간질환완화및 숙취해소음료로서의활용성이높은원료소재를확보 - 알코올성간질환완화및숙취해소효능을평가할수있는배양세 포및동물수준의평가법을확립하고이를활용하여유망기능소 재를발굴 - 알코올성간질환완화및숙취해소효능이있는성분및기타소재 의추출및정제공정을확립하고이를활용하여소재를개발 - 최종적으로제주자생생물자원으로부터추출한성분을주성분으로 하는알코올성간질환완화및숙취해소시제품및음료제품을개 발 - 12 -
평가항목 ( 주요성능 Spec) 1. 원료의확보 2. 기능소재의발굴 단위 원료검토건수 소재발굴건수 3. 효능평가측정법의구축항목및활용 : 세건수포시험 4. 동물시험 측정항목건수 측정 5. 임상시험항목건수 6. 추출정제제품공정의확립순도 7. 시제품 ( 원료 ) 개발 8. 시제품 ( 음료 ) 개발 개발제품건수 개발제품건수 전체항목에서차지하는비중 (%) 세계최고수준, 보유국 / 보유기업 ( 일본 / 일본발효 ( 주 )) 연구개발전국내수준 성능수준성능수준 1 차년도 개발목표치평가방법 2차년도 다당류, 채 10 100% 50% 30건 - 소류, 약용작물중검토건수 소재 10 100% 50% 3건 3건 개발 건수 세포특성 10 100% 40% 4건 - GGT 변화염증 섬유화 혈액생화학 적분석지 10 100% 40% - 4건 질과산화간조직분석 혈중숙취관 련지표분석 임상시험 ( 기 10 100% 40% - 1건 호도, 숙취 해소도등 ) 순도순도순도율 20 100% 30% 50% 90% 측정 15 100% 70% 시제품1건 - 원료개발건수 15 100% 70% - 제품 1 건 음료건수 개발 - 13 -
2. 기술개발의범위 본기술개발은크게음료소재로서활용성이높은원료의확보, 알코올 성간질환완화및숙취효능평가관련기술, 추출및정제공정관련 기술, 간질환완화및숙취해소음료의개발로구성되어있다. 가. 탐색대상원료의확보 본연구는제주자생생물을그원료로하여알코올성간질환완화및숙취해소용음료를개발하고자하였으므로, 기능성물질탐색을위한대상원료의확보와관련하여서는우선적으로는제주자생해조류 10종및채소류 10종, 약용작물 10종을그대상으로선정하였다. 이를대량수급의가능성및생리활성성분함유량등을고려하여원료로서의이용가능성여부및원료의추가선정등을고려하였다. 나. 추출정제공정의개발 본기술개발은제주자생생물로부터의기능성성분을추출정제하는공정의개발을그기술요소로서포함하였으며, 특정소재에맞도록그공정을개선구축함을그개발범위로하였다. 이러한추출정제공정최적화에있어서는유용성산물분리, 추출, 여과, 건조공정의개발을그내용으로하였으며, 이에대한경제성평가를포함하는것으로하였다. 다. 효능평가법의구축 알코올성간질환완화및숙취해소효과기능물질에대한효능평가에있어, 세포수준에서의효능검색법과동물효능평가법을구축하는것을본기술개발내용으로하였다. 효능평가법과관련한실험은대학에위탁하여수행하도록하였다. - 14 -
효능평가법은크게세포수준의실험과동물실험으로구분하여수행하였다. 세포수준의실험은배양 HepG2 세포에서알코올독성에대한여러식물추출물들의영향을비교하기위하여, GGT를세포독성마커로하여실험을수행하였다. 그리고동물실험을통한효능평가의경우에는혈청효소분석, 조직병리학적분석, 지질과산화물측정, Glutathione 측정등으로구성하고실험을수행함으로써효능평가법을구축하고자하였다. 라. 기능물질의탐색 구축된세포수준의효능평가법을활용하여제주자생약용작물, 해조류, 제주특산과채류등을대상으로기능물질을탐색하였다. 대학에위탁하여수행된실험을통해얻은결과로부터개발대상소재를도출하고자하였다. 마. 시제품의제조및인체관능시험 연구대상원료들에대한효능탐색결과및공정개발을통하여기능물질함유식물들을선정하고, 그선정된식물들의추출물을주성분으로함유시킨음료시제품 ( 원료 ) 을제조하였다. 제조된음료시제품의효과를평가하기위해서인체를대상으로관능실험및알코올호기실험을수행하였다. - 15 -
제 3 절기술개발의기대효과 제주도가지역전략산업으로추구하고있는바이오산업의개념은제주자원활용을통한고부가가치건강식품의개발을포함하고있다. 따라서본사업에서개발하고자하는기술이제주자생생물유래의성분을이용한기능성음료는원료의수급, 가공, 판매등의과정에서제주지역산업에이바지하는바가클것으로기대된다. 또한본개발사업은현지화에따른지역사업으로제주도의관광산업과매우밀접한연관을가지고있다고판단된다. 따라서, 제주도자생생물자원에서추출한기능성성분으로알코올성간질환완화및숙취해소에효과적인음료를개발하여상품화한다면지역특산품화를이룰수있어일거양득의효과를가져올수있다고판단된다. 본과제를통해구축하게될생물자원활용기술및효능평가기술은향후더많은대상자원의개발및더다양한고기능제품의개발에유익한핵심기반기술로서기여하게될것이다. 지역의조건을최대한활용한모범연구과제수행을통해지역의주류산업과도상생발전할수있는사업분야이다. - 16 -
제 2 장기술개발내용및방법 제 1 절대상원료의확보 제주자생해조류 10종및채소류 10종, 약용작물 10종의 30여종을선정하고확보하고자하였다. 이에있어, 원료의대량수급가능성여부와생리활성성분의함유량을고려하여선정하도록하였다. 원료확보의방법으로서우선제주도특산자원을포함한제주하이테크산업진흥원추출물은행에서제공받은해조류추출물 13종 < 표 1> 을선정하였다. 그러나, 해조류의대량수급에어려움이있어, 약물식물등대량수급이가능한자원으로그탐색대상을조정및확대하였다. 추가탐색대상으로선정한약용작물 ( 약용및채소, 해조류원료 ) 은총 50종에해당하였으며, 그세부사항은 < 표 2> 에나타내었다. 탐색대상으로선정된추출물은여러육상또는해양식물추출물을구입또는수용성에탄올로추출하여제조한것으로하였다. - 17 -
< 표 1> 제주특산해조류 분양번호 국명 학명 AC013 넓청각 Codium latum A AC014 몽우리청각 Codium contractum B AC019 2) C AC022 꼬챙이갈파래 Ulva fasciata D AP001 톳 Hizikia fusiformis E AP038 넓패 Ishige sinicola F AR001 꼬시래기 Gracilaria verrucossa G AR018 갈고리가시우무 Hypnea japonica H AR021 우뭇가사리 Gelidium amansii I AR032 참사슬풀 Champia parvula J AR042 참까막살 Carpopeltis affinis K AR074 여린가위손말 Galaxaura falcata L AR101 긴잎새발 Acanthopeltis longiramulosa M 2) 분양번호 AC019 의경우는분양번호만확인되고국명및학명은미확인됨 - 18 -
< 표 2> 약용및채소작물등시료목록 번호 명칭 제공회사 특이사항 1 산수유엑기스분말 오엔씨 황토색 2 울금추출분말 오엔씨 노란색 3 죽엽추출분말 오엔씨 아이보리색 4 모과엑기스분말 오엔씨 살구색 5 무화과추출분말 오엔씨 금빛색 6 오리나무추출분말 오엔씨 밝은갈색 7 천마추출분말 오엔씨 밝은갈색 8 씀바귀추출분말 오엔씨 밝은갈색 9 상엽추출분말 오엔씨 밝은갈색 10 미나리추출분말 오엔씨 밝은갈색 11 인동꽃추출분말 오엔씨 옅은갈색 12 맥아추출분말 오엔씨 밝은갈색 13 상지추출분말 오엔씨 밝은갈색 14 노루궁뎅이버섯추출분말 오엔씨 밝은갈색 15 속단추출분말 오엔씨 옅은갈색 16 백년초엑기스분말 오엔씨 분홍색 17 옥수수수염추출분말 오엔씨 옅은갈색 18 두릅추출분말 오엔씨 밝은갈색 19 가시오가피추출분말 오엔씨 옅은갈색 20 회향추출분말 오엔씨 옅은갈색 21 진피추출분말 오엔씨 밝은갈색 22 복분자추출분말 오엔씨 진한갈색 23 지구자추출분말 오엔씨 밝은갈색 24 어성초추출분말 오엔씨 진한갈색 25 차조기엽추출분말 오엔씨 옅은갈색 - 19 -
번호명칭제공회사특이사항 26 갈근추출분말 오엔씨 옅은갈색 27 상심자추출분말 오엔씨 흑갈색 28 산사자추출분말 오엔씨 살색 29 민들레추출분말 오엔씨 옅은갈색 30 삼백초추출분말 오엔씨 갈색 31 국화추출분말 오엔씨 밝은갈색 32 강황추출분말 오엔씨 연한노란색 33 오미자추출분말 오엔씨 적갈색 34 미슬토추출분말 ( 겨우살이 ) 오엔씨 진한갈색 35 녹차추출분말 ( 카데킨20%) 오엔씨 진한갈색, filter 잘되지않음 36 발효구아바추출분말 오엔씨 진한갈색, 침전물생김, filter 잘되지않음 37 Milk Thistle Ext PWD.( 미국산 ) 오엔씨 매우진한갈색 38 폴리만뉴로네이트 ( 실다시마추출분말 ) 오엔씨 회색, filter 잘되지않음 39 포피란 ( 김추출분말 -열수추출 ) 오엔씨 회색, filter 잘되지않음 40 톳추출분말 오엔씨 갈색 41 다시마추출분말 오엔씨 연한갈색 42 레드비트농축액 (70%) 오엔씨 적색 (1% 진한빨강 ), filter가잘되지않음 43 용과농축액 (60%) 오엔씨 적색 (1% 분홍색 ) filter가잘되지않음 44 녹차추출분말 ( 카데킨30%) 오엔씨 황색 45 포피란 ( 김추출분말 -가수분해 ) 오엔씨 구리색 46 김 ( 열수추출-100%) 오엔씨 연한황색 47 섬오가피건피 실험실 수율 : 9 % 연한황색 48 조릿대 실험실 수율 :3.08% 연한황색 49 조릿대잎 실험실 수율 :10.7% 연한황색 50 제주녹차건잎 실험실 수율 :17.7% 연한황색 - 20 -
제 2 절추출정제공정의개발 1. 대상원료에대한추출시험 본연구에서는포피란개발과정에서취득한다당류추출정제공정을기반으로하여특정소재에맞도록그공정을개선하여구축하고자하였다. 추출정제공정최적화를위해유용성산물분리, 추출, 여과, 건조공정을연구하고, 열수추출및산 가수분해추출법을비교하였다. 본연구의시료를제조함에있어, 이용되는추출방법으로는산업적으로많이사용되고있는추출방법을그대상으로하였다. 구체적으로열수추출, 알코올추출, 가수분해추출, 다당류추출, 식이섬유추출방법을시험하여, 이를각각비교하였다. 가. 열수추출시험 < 표 2> 에제시되어있는약용및채소, 해조류원료 10 kg을시험생산추출기에넣고물 40 kg을투입한후, 100 에서 3시간추출한후, 농축기에서 30 brix가될때까지농축하였다. 이농축물을동결건조기에서 3일동안건조한후그결과를분석하였다. 나. 알코올추출시험 < 표 2> 의약용작물 10 kg을시험생산추출기에넣고알코올 ( 주정 ) 을 40 L 투입한후, 80 에서 3시간추출한후, 농축기에서농축하였다. 농축물에물을넣고알코올 ( 주정 ) 이다증발할때까지농축한후동결건조기에서 3일동안건조하였다. - 21 -
다. 가수분해추출시험 < 표 2> 의약용작물 10 kg을시험생산추출기에넣고물을 40 kg 투입한후 NaOH를주입하되염기의농도를 0.01% (NaOH 4 g), 0.1% (NaOH 40 g), 1% (NaOH 400 g) 로달리조정하였다. 이를 100 에서 3 시간추출한후, 한외여과 (UF) 를이용하여여과하고잔여 NaOH를제거한다음, 농축기에서 30 brix가될때까지농축하였다. 그농축물을동결건조기에서 3일동안건조하였다. 라. 다당체의추출시험 < 표 2> 의약용작물의다당류를분리ㆍ정제하기위하여해조류 3 kg을 8배량의물로 8시간씩 3회추출하여물가용성추출물을얻어동결건조시켰다. 이에 3배량의에탄올을가하여에탄올가용물과에탄올비가용물로분리한후, 에탄올비가용물을셀룰로오스투석막을사용하여증류수로투석시켰다. 투석조건은 4 에서 12시간마다증류수를교환하였고 1 주에걸쳐실험하였으며, 투석막안쪽의것을모아동결건조하였다. 마. 식이섬유의추출시험 < 표 2> 의약용작물 10 kg을시험생산추출기에넣고물을 40 kg 투입한후 NaOH 400 g을넣고, 100 에서 1시간추출한후, 여과한다. 이와같은공정을 2회반복한후, 0.1 N 황산액을만들어 3회반복한후중화한후, 동결건조기에서 3일동안건조하였다. - 22 -
2. 최적화공정및수율 위에열거한열수추출, 알코올추출, 가수분해추출, 다당류추출, 식이섬유추출시험결과중가장효과적인추출법으로판단된추출공정을선정하고, 그에따른추출공정조건을변화시키면서최적화하고자하였다. 최적화추출공정조건은반응온도, 반응시간등을달리하여그에따른수율의변화를측정하였다. 3. 경제성평가 제주자생식물을이용하여숙취해소및간질환완화에효과가있는제품을만들기위해서는추출공정의최적화를통해가격경쟁력이있는제품을만드는것이가장중요한내용이될것이다. 따라서, 각원료시제품 4종의생산 ( 제조 ) 단가를산출하고기존시중유통가와의비교를통하여경제성평가를할것이다. - 23 -
제 3 장기술개발의결과 제 1 절대상원료의확보 1차선정된해조류추출물 13종에대하여기능물질을탐색한결과, 갈고리가시우무의경우알코올성간질환완화및숙취해소와관련하여우수한효능을보였으나, 해조류의대량수급은곤란한것으로판단됨에따라, 50종의약물식물등을추가로선정하였다. 이들총 63종의대상작물 ( 약용, 채소, 해조류 ) 중에서제주특산물위주로원료 16종을선별하였으며, 선별된원료는 < 표 3> 에나타내었다. 이들을대상으로기능소재를탐색한결과, 조릿대, 복분자, 녹차, 밀크티슬등 4종을기능소재로서발굴하였다. - 24 -
번호명칭제조회사특이사항 대조군 육-22 복분자추출분말 ( 국산 ) 오엔씨 진한갈색 육-37 Milk Thistle Ext PWD. ( 미국산 ) 오엔씨 매우진한갈색 육 -40 톳추출분말 ( 국산 ) 오엔씨갈색 육 -42 레드비트농축액 (70%) 오엔씨 육 -43 용과농축액 (60%) 오엔씨 적색 (1% 진한빨강 ), filter가잘되지않음적색 (1% 분홍색 ) filter가잘되지않음 대조군말토덱스트린 ( 부형제 ) 오엔씨백색 육 -36 발효구아바추출분말 오엔씨 육 -38 < 표 3> 제주특산여부위주로선별된원료 폴리만뉴로네이트 ( 다시마추출분말 ) 오엔씨 육 -39 포피란 ( 김추출분말 100%- 국산 ) 오엔씨 육 -44 녹차추출분말 ( 카데킨 30%) 오엔씨 육 -45 포피란 오엔씨 진한갈색, 침전물생김, filter잘되지않음회색, filter 잘되지않음회색, filter 잘되지않음 육 -41 다시마추출분말 오엔씨연한갈색 육 -47 섬오가피실험실수율 : 9.0% 연한황색 육 -48 조릿대실험실수율 : 3.08% 연한황색 육 -49 조릿대잎실험실수율 : 10.7% 연한황색 육 -50 제주녹차실험실수율 : 17.7% 연한황색 육 -46 김추출분말 오엔씨 - 25 -
제 2 절추출정제공정의개발 본기술개발을위한시료제조와관련하여, 5 종의추출정제공정을 적용하고각공정에따른추출수율을비교하였다. 1. 추출정제공정의적용 가. 열수추출 < 표 2> 에제시되어있는약용작물 10 Kg을대상으로하여열수추출시험을수행한결과를 < 그림 4-1>, < 그림 4-2> 에나타내었다. 50종의약용작물별로추출수율을살펴보았으며, 이중추출수율이상대적으로높게나타난약용작물은모과엑기스분말 (4번시료 ), 맥아추출분말 (12번시료 ), 회향추출분말 (20번시료 ), 차조기엽추출분말 (25번시료 ), 민들레추출분말 (29번시료 ), 밀크티슬 (37번시료 ) 이었다. 그러나추출수율은 3% 정도에불과하여, 공정을개선을통한추출수율의향상을연구할필요성이있는것으로사료된다. - 26 -
3.5 3 2.5 수율 (%) 2 1.5 1 0.5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 < 그림 4-1> 열수추출에의한수율 3.5 3 2.5 수율 (%) 2 1.5 1 0.5 0 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 < 그림 4-2> 열수추출에의한수율 - 27 -
나. 알코올추출 < 표 2> 에제시되어있는총 50종의약용작물을대상으로알코올추출시험을수행한결과를 < 그림 5-1>, < 그림 5-2> 에나타내었다. 이중상대적으로높은추출수율을보인약용작물은천마추출분말 (7번시료 ), 맥아추출분말 (12번시료 ), 가시오가피추출분말 (19번시료 ), 회향추출분말 (20 번시료 ), 갈근추출분말 (26번시료 ), 밀크티슬추출분말 (37번시료 ), 다시마추출분말 (41번시료 ), 조릿대 (48번시료 ) 등이었다. 특히맥아추출분말과다시마추출분말의추출수율이높게나타났다. - 28 -
8 7 6 5 수율 (%) 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 < 그림 5-1> 알코올추출에의한수율 8 7 6 5 수율 (%) 4 3 2 1 0 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 < 그림 5-2> 알코올추출에의한수율 - 29 -
다. 가수분해추출 염기의농도를 0.01%, 0.1%, 1% 로달리하여 < 표 2> 에제시되어있는약용작물을대상으로가수분해추출을시험한결과를 < 그림 6-1> ~ < 그림 6-6> 에나타내었다. 추출실험결과에서나타나듯이, 염기의농도가 0.01% 조건인경우에는추출수율이대개 2.5~3% 수준으로보여지고있다. 그리고염기의농도가 0.1% 조건에서는 5~7% 정도의추출수율을얻을수있었다. 또한염기농도가 1% 조건으로추출을수행한경우에는대상작물별추출수율의분포가다양하게나타났으나, 10.4% 수준의추출수율을보이는작물이있었다. 전체가수분해추출시험에있어서가장높은추출수율을나타낸약용작물은산수유엑기스분말 (1번시료 ), 울금추출분말 (2번시료 ), 속단추출분말 (15번시료 ), 백년초엑기스분말 (16번시료 ), 산사자추출분말 (28번시료 ), 민들레추출분말 (29번시료 ), 조릿대 (48번시료 ), 조릿대잎 (49번시료 ) 등이었다. 이중에서도특히산수유엑기스분말, 속단추출분말, 산사자추출분말, 조릿대에대한추출수율이높은것으로나타났다. - 30 -
3.5 3 2.5 수율 (%) 2 1.5 1 0.5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 < 그림 6-1> 가수분해추출에의한수율 (0.01%-1) 3.5 3 2.5 수율 (%) 2 1.5 1 0.5 0 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 < 그림 6-2> 가수분해추출에의한수율 (0.01%-2) - 31 -
7 6 5 수율 (%) 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 < 그림 6-3> 가수분해추출에의한수율 (0.1%-1) 7 6 5 수율 (%) 4 3 2 1 0 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 < 그림 6-4> 가수분해추출에의한수율 (0.1%-2) - 32 -
10.6 10.4 10.2 10 9.8 수율 (%) 9.6 9.4 9.2 9 8.8 8.6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 < 그림 6-5> 가수분해추출에의한수율 (1%-1) 10.6 10.4 10.2 10 9.8 수율 (%) 9.6 9.4 9.2 9 8.8 8.6 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 < 그림 6-6> 가수분해추출에의한수율 (1%-2) - 33 -
라. 다당체의추출 < 표 2> 에제시되어있는약용작물에대해서다당체의추출시험을수행하고그결과를 < 그림 7-1>, < 그림 7-2> 에나타내었다. 추출수율이비교적높게나타난작물은산수유엑기스분말 (1번시료 ), 천마추출분말 (7 번시료 ), 상지추출분말 (13번시료 ), 백년초엑기스분말 (16번시료 ), 민들레추출분말 (29번시료 ), 녹차추출분말 (35번시료 ), 톳추출분말 (40번시료 ), 김 (46번시료 ), 제주녹차건잎 (50번시료 ) 등이었다. 그중특히높은다당체추출수율을보인작물은산수유엑기스분말로추출수율은 1.7% 정도수준이었다. - 34 -
1.8 1.6 1.4 1.2 수율 (%) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 < 그림 7-1> 다당체추출시수율 ( 다당체 1) 1.6 1.4 1.2 1 수율 (%) 0.8 0.6 0.4 0.2 0 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 < 그림 7-2> 다당체추출시수율 ( 다당체 2) - 35 -
마. 식이섬유의추출 < 표 2> 에제시되어있는약용작물을대상으로하여식이섬유추출시험을수행한결과를 < 그림 8-1>, < 그림 8-2> 에나타내었다. 식이섬유추출수율이비교적높은것으로나타난작물은씀바귀추출분말 (8번시료 ), 회향추출분말 (20번시료 ), 국화추출분말 (31번시료 ), 포피란 (45번시료 ) 등이었으며, 이들작물은 10.5% 의추출수율을보였다. - 36 -
11 10.5 10 수율 (%) 9.5 9 8.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 < 그림 8-1> 식이섬유추출시수율 ( 식이 -1) 11 10.5 10 수율 (%) 9.5 9 8.5 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 < 그림 8-2> 식이섬유추출시수율 ( 식이 -2) - 37 -
2. 최적화공정및추출수율결과 위에서열거한바와같이, 5종의추출시험 ( 열수추출, 알코올추출, 가수분해추출, 다당류추출, 식이섬유추출시험 ) 을수행하고추출효율을측정한결과, 추출수율이낮아상업적적용이어려워새로운방법인효소 ( 멀티자임 ) 를이용하여기존의방법을보완할필요성이있다. 따라서, 최적화추출공정을선정하기위해서선정된 4가지원료 ( 조릿대, 복분자, 녹차, 밀크티슬 ) 를대상으로효소 ( 멀티자임 ) 의농도, 반응온도, 반응시간등의조건을달리하여효소분해를시킨후, 알코올추출을통하여얻어진수율의변화를측정하였다. 가. 조릿대추출물의효소분해조건에따른수율의변화 < 표 4-1> 반응온도에따른수율의변화 온도 ( ) 원료량 (Kg) 반응시간 (hr) 멀티자임 (%) 수율 (%) 20 10 3 1 8 30 10 3 1 15 40 10 3 1 11 50 10 3 1 9 < 표 4-2> 반응시간에따른수율의변화 온도 ( ) 원료량 (Kg) 반응시간 (hr) 멀티자임 (%) 수율 (%) 30 10 1 1 14.5 30 10 3 1 15 30 10 5 1 15.5 30 10 7 1 16-38 -
< 표 4-3> 멀티자임의농도에따른수율의변화 온도 ( ) 원료량 (Kg) 반응시간 (hr) 멀티자임 (%) 수율 (%) 30 10 1 0 7.3 30 10 1 0.01 8 30 10 1 0.1 10 30 10 1 1 14.5 나. 복분자추출물의효소분해조건에따른수율의변화 < 표 5-1> 반응온도에따른수율의변화 온도 ( ) 원료량 (Kg) 반응시간 (hr) 멀티자임 (%) 수율 (%) 20 10 3 1 10.3 30 10 3 1 17.2 40 10 3 1 13.5 50 10 3 1 11.2 < 표 5-2> 반응시간에따른수율의변화 온도 ( ) 원료량 (Kg) 반응시간 (hr) 멀티자임 (%) 수율 (%) 30 10 1 1 16.8 30 10 3 1 17.2 30 10 5 1 17.5 30 10 7 1 17.9 < 표 5-3> 멀티자임의농도에따른수율의변화 온도 ( ) 원료량 (Kg) 반응시간 (hr) 멀티자임 (%) 수율 (%) 30 10 1 0 8.0 30 10 1 0.01 10.3 30 10 1 0.1 12.9 30 10 1 1 16.8-39 -
다. 녹차추출물의효소분해조건에따른수율의변화 < 표 6-1> 반응온도에따른수율의변화 온도 ( ) 원료량 (Kg) 반응시간 (hr) 멀티자임 (%) 수율 (%) 20 10 3 1 12.1 30 10 3 1 15.9 40 10 3 1 13.6 50 10 3 1 11.2 < 표 6-2> 반응시간에따른수율의변화 온도 ( ) 원료량 (Kg) 반응시간 (hr) 멀티자임 (%) 수율 (%) 30 10 1 1 14.8 30 10 3 1 15.9 30 10 5 1 16.5 30 10 7 1 17.1 < 표 6-3> 멀티자임의농도에따른수율의변화 온도 ( ) 원료량 (Kg) 반응시간 (hr) 멀티자임 (%) 수율 (%) 30 10 1 0 7.2 30 10 1 0.01 10.7 30 10 1 0.1 11.3 30 10 1 1 14.8-40 -
라. 밀크티슬추출물의효소분해조건에따른수율의변화 < 표 7-1> 반응온도에따른수율의변화 온도 ( ) 원료량 (Kg) 반응시간 (hr) 멀티자임 (%) 수율 (%) 20 10 3 1 9.3 30 10 3 1 14.6 40 10 3 1 12.5 50 10 3 1 10.2 < 표 7-2> 반응시간에따른수율의변화 온도 ( ) 원료량 (Kg) 반응시간 (hr) 멀티자임 (%) 수율 (%) 30 10 1 1 16.0 30 10 3 1 14.6 30 10 5 1 15.1 30 10 7 1 15.4 < 표 7-3> 멀티자임의농도에따른수율의변화 온도 ( ) 원료량 (Kg) 반응시간 (hr) 멀티자임 (%) 수율 (%) 30 10 1 0 6.0 30 10 1 0.01 8.7 30 10 1 0.1 12.4 30 10 1 1 16.0-41 -
마. 최적화공정 위의표에서와같이선정된 4가지원료 ( 조릿대, 복분자, 녹차, 밀크티슬 ) 를대상으로효소 ( 멀티자임 ) 의농도, 반응온도, 반응시간등의조건을달리하여효소분해를시킨후, 알코올추출을통하여얻어진수율의변화를측정한결과, 반응온도 30, 반응시간 1시간, 멀티자임농도가 1% 의조건에서 4번의반복추출과정을통해상업적으로가장적합한수율인 60% 로나오는것을확인할수있었다. - 42 -
3. 경제성평가 제주자생식물을이용하여숙취해소및간질환완화에효과가있는제품을만들기위해서는추출공정의최적화를통하여가격경쟁력이있는제품을만드는것이가장중요한내용이될것이다. 당초최적추출수율목표를 90% 수율로하였으나, 90% 수율로추출시제조공정비용이 3배-6 배이상높아져상업적으로이용하기어려운단점이있다. 따라서본연구에서는최적화추출공정을통하여조릿대, 녹차, 복분자, 밀크티슬등을최적추출수율 60% 로하여추출하였다. 그결과, 조릿대추출물 10만원 /kg, 녹차추출물 8만원 /kg, 복분자추출물 3.5만원 /kg, 밀크티슬 15만원 /kg의시중유통가격이하로원료를제조할수있어기존에시장에출시되고있는제품에대한가격경쟁력을가질뿐만아니라, 효능도기존제품보다뛰어나므로저렴한가격에뛰어난효능을가지는제품을소비자에게공급할수있으리라고사료된다. - 43 -
제 3 절효능평가법의구축및활용 1. 세포수준효능평가법의구축 기술개발내용에제시되어있는방법에기초하여세포수준의효능 평가법을구축하였다. 구축된평가법의세부항목별실험결과및구축내용 은아래에항목별로설명하는바와같다. < 효능평가법의구축항목 > 평가항목 1. 세포생존율분석법세포수준의 2. GGT 활성측정법효능평가법 3. GGT mrna 분석법 4. 염증탐색법 1. 혈액의생화학적분석실험동물수 2. 지질과산화측정법준의효능 3. 간조직의분석법평가법 4. Glutathion 측정법 세부구축내용 MTT assay, 3시간세포배양, isopropanol 처리, 570nm 흡광도측정 primer3 software를이용한 primer 고안 가. 세포배양과처리방법 HepG 2 cell은에탄올에대한저항성이비교적강하여비교적고농도의에탄올즉약 1.0 M 농도에서일관성있는세포사멸을보였다. 에탄올처리시간은 48시간이적당한것으로나타났으며일관성있는데이터를제공해주었다. 에탄올처리시간에따른세포의생존율을 ( 그림 9A) 에나타내었다. - 44 -
Human hepatoma HepG 2 cell의배양에있어, American Type Culture Collection으로부터구입하고, 10% fetal bovine serum, 100 U/ml penicillin과 100 μg/ml streptomycin이함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium에서 CO 2 배양기를이용하여배양한다. 세포는 1 x 10 4 cells/cm 2 농도로 24-well plate에분주하고, 50~60% 정도가되도록 24시간동안성장배지 1 ml에서배양시킨다. 특별한언급이없는경우세포는시험물질로 1시간동안전처리하였고, 그다음으로 1.0 M 에탄올을처리한다. 처리된세포는 48시간동안배양하고, 배양액은 GGT 활성측정을위해수집한다. 또한 plate위의세포는생존률시험과세포내 GSH량측정을위해사용하도록한다. 그림 9. Ethanol induces GGT gene expression gene expression. The HepG 2 cells were treated with 0.25 M ethanol for the indicated time (A) or treated with various concentration of ethanol for 48hr (B). Total cellular RNA was extracted and subjected to RT-PCR analysis of tyrosinase and GAPDH mrna. Stained gels shown are representatives of at least 3 independent studies. M, size marker; NC, negative control without RNA sample. - 45 -
나. 세포독성평가법 ( 생존율실험 ) 세포생존율실험에서세포생존율평가방법의선택을위해 MTT assay와 Alama Blue assay를비교하였을때, MTT assay가천연물시료에의한영향을적게받는것으로나타났다. 따라서본기술개발에서의효능평가법으로는 MTT assay를적용하도록하였다. 세포생존율은 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 를이용하도록한다. 처리된세포는씻어내고배지의 1 ml 안에 0.75 mg MTT를첨가하고 3시간동안배양한다. 그리고난후배지는제거하고세포에 formazan를용해시키기위해 well당 isopropanol의 500 μl를처리한다. 그용액은 microtiter plate에옮기고색깔은 570 nm 에서흡광도를측정한다. 다. GGT 활성측정법 1) 실험결과배양세포에에탄올을농도별, 시간별로처리한후그배양액을얻어 GGT 효소의활성을측정하였다. 에탄올농도에따른배양액중 GGT 활성측정결과를 ( 그림 9B) 에나타내었다. 에탄올은농도의존적으로배양액중 GGT 활성을증가시켰으며, 본연구에서사용된 GGT 활성측정법은발색법으로서육안으로도그효과를확인할수있었다. 천연물시료들은그자체색상때문에발색법에영향을줄수있으므로활성측정반응액을둘로나누어하나에는기질을넣어주고다른쪽에는기질을넣지않고반응시킴으로써이러한요인을배제할수있었다. 2) 구축된 GGT 활성측정법 GGT 활성은인위적합성기질인 gamma-glutamyl-p-nitroanillide를사용함으로써 microtiter plate위에발색시켜측정한다. 간단히설명하면, 처리된세포배양액의 20 μl에 185 mm Tris-Cl (ph 8.2), 2 mm gamma-glutamyl-p-nitroanillide, 20 mm glycylglycine, 0.8-46 -
mm NaNO 2 and 3.2 mm naphthylethylene diamine이구성물질인측정혼합용액 180 μl를첨가한다. 측정은또한샘플자체에의한측정방해를보정하기위하여 gamma-glutamyl-p-nitroanillide 기질물질을제외한반응액에서도수행하도록한다. Plate를 37 에서 60분간배양후에 1.0 N HCl 40 μl를첨가하여반응을종료시킨다. 빨간색발색단의형성은 multi-well scanning spectrophotometer (ELISA) 를사용하여 520 nm에서측정하고, 기질물질없이측정된값으로보정을행한다. 또한배양세포에에탄올을농도별, 시간별로처리한후, 그배양액을얻어 GGT 효소의활성을측정하도록한다. 라. GGT mrna 분석법 GeneBank에보고된 human gamma-glutamyltransferase (GGT) 와 D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 의염기서열들을비교하여 strain에homology가있는부위에서 Primer3 software를이용하여각유전자를증폭시킬수있는 primer를다음과같이고안하였다. GGT (GeneBank accession number NM_013430), 5'-GGATTCTCCCAGAGATTGCC-3' (sense), 5'-GAAGGTCAAGGGAGGTTACC-3' (antisense); GAPDH (GeneBank accession number NM_002046), 5'-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3' (sense), 5'-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3' (antisense). RT-PCR을위하여세포내 total RNA를 TRIZOL Reagent를이용하여추출하였고 1 μg씩정량하여사용하였다. 45 30분, 94 5분의조건으로 cdna를합성한후, GGT는 94 45초, 48.7 1분, 72 에서 1 분, 50회, GAPDH는 94 1분, 58 1분, 72 에서 1분 30초, 33회의 PCR 증폭을수행하였으며, 최종 RT-PCR 산물은 1.2% agarose gel에서전기영동하여확인하였다 ( 그림 9). - 47 -
마. 염증탐색법 ( 그림 10) 은 NF-kB 활성과 AP-1 활성에있어서 ethanol 의농도별처 리는효과를보이지않으나, TNF-alpha 40 ng/ml 을처리한군에서는 NF-kB 활성을증가시킴을보여주고있다. 바. 세포내 GSH 량측정 /ROS 의발생측정 ROS(reactive oxygen species) 의생성에대한대상물질들의억제작용 을평가하기위하여몇가지방법을시도하였으나, 천연물시료의색상이 세포에침착되어신뢰성있는결과를얻는데에는실패하였다. - 48 -
그림 10. Effect of ethanol and TNF-alpha on the NF-kB and AP-1 activity in HepG2 cells. NFkB activity was determined by using a NFkB reporter, NFB-SEAP construct (CLONTECH Laboratories). This construct encodes a secreted form of placental alkaline phosphatase driven by four tandem copies of the NFB consensus sequence fused to a TATA-like promoter (PTAL) region from the herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) promoter. The enhancer-lacking ptal-seap vector (CLONTECH Laboratories) was used as a negative control to correct for the background signals. Cells transfected with a reporter construct were treated with 0-1000 mm EtOH (A) or 0-40 ng/ml TNF-alpha (B) for 12hr in a low serum-containing medium A (phenol red-free DMEM containing 0.5% FBS and 25 mm Hepes, ph 7.4). The conditioned media were harvested, centrifuged and heat treated at 65 C for 30 min (to inactivate endogenous alkaline phosphatase), followed by chemiluminescence detection of SEAP activity according to the manufacturer's instructions (CLONTECH Laboratories) using a plate fluorometer (Berthold, Bad Wildbach, Germany). - 49 -
2. 동물실험을통한효능평가법구축 알코올성간질환완화및숙취해소를위한실험동물수준의효능평 가법으로서혈청분석법, 지질과산화측정법, 간조직의분석법, Glutathion 측정법등 4 종의효능평가법을구축하였다. 가. 대상실험동물및시료채취 마우스는 9주령의암컷 C57BL/6 마우스 ( 체중 20~21 g) 로대한바이오링크 ( 충북음성 ) 에서구입하여사용하였고사육온도는 23 ± 1, 상대습도는 55 ± 5% 로유지시켰으며, 명암은 1일 12시간씩교대하였다. 3일간의적응기를거쳐사용하였고이기간동안고형사료및물은자유롭게섭취토록하였다. 실험군은복막자극없이알코올간독성을유도하기위해 30%(v/v) 로희석한에탄올수용액을 2.5 g/kg BW의농도로 12시간주기로 3회복강투여하였다. 시료에적량의물또는에탄올수용액를가하여고형분 2% (w/v), 에탄올의농도가 0 또는 30%(v/v) 가되게제조하여사용하였다. 마지막투여후, 3시간뒤에마우스를 isoflurane으로마취시키고, 혈액과간을채취하였다. 나. 혈액의생화학적분석 : AST,ALT,GGT 의혈중유출분석 채취한혈액은상온에서 30분간두고혈청분리튜브로옮긴뒤, 600 rpm에서 5분간원심분리하여혈청을분리하였다. Aspartate aminotransferase (AST) (EC 2.6.1.1.) 와 alanine aminotransferase (ALT) (EC 2.6.1.2.) 의효소활성은 Vitros 250 chemistry system (Johnson & Johnson, Rochester, NY) 을사용하여측정하였다. 다. 지질과산화측정 : TBA-MDA adducts 생성측정 간조직에서지질과산화물의생성정도를나타내는 2-thio barbituric acid-reactive substance (TBARS) 측정법으로항산화활성을측정하였다. - 50 -
간조직은 180 mm KCl, 10 mm EDTA, 50 mm Tris-Cl (ph 7.4) buffer 를부피의 9 배가하여 homogenizer로균질화시켰다. 조직균질물의 1.0 ml은 1.0% phosphoric acid 3.0 ml과 0.9% 2-thiobarbituric acid (TBA) 1.0 ml와혼합하고, 45분간수조상에서가열하였다. 상온에서식힌후에 BuOH 4.0 ml를첨가하고혼합물을 10,000 rpm에서 15분간원심분리하였다. 상층액은 532 nm의파장에서흡광도를측정하고 TBARS 농도는 1,1,3,3-tetra methoxypropane 표준물질을통해계산하였다. 라. 간조직의분석 간조직을이용해조직염색법및 immunohistochemistry를이용하여지방세포의분표섬유화의정도를탐색한다. 채취한간조직은 4% paraformaldehyde로고정시켰으며, 파라핀으로밀봉하였다. 6 μm의조직절편은 hematoxylin & eosin으로염색하였고, 현미경을이용해관찰하였다. 마. 혈중숙취관련지표분석 숙취와관련성이높은혈중에탄올및알데히드의함량, 항이뇨호르몬 의분비양상을조사한다. - 51 -
바. Glutathione 측정 간조직균질물로부터항산화력의지표로전체 glutathione의양을측정하였다. glutathione의추출을위해, 조직균질물은 10% metaphosphoric acid의동일량과함께혼합하고 10,000 rpm에서 15분간원심분리하였다. 그상층액은효소재순환방법을이용해서전체 glutathione ( 환원된형태와산화된형태 ) 의양을측정하였다. 측정은 microtiter plate 에서 143 mm sodium phosphate, 6.3 mm EDTA, 0.6 mm 5,5'-dithiobis [2-nitrobenzoic acid], 0.3 mm NADPH, 0.25 units/ml glutathione reductase 반응혼합물과 2.0 μl시료와함께혼합하고 37 에서 20분간방치하였다. 2-nitro-5-benzoic acid의형성은 415 nm의파장에서흡광도를측정하였고, 이미알고있는 glutathione의농도로그려진검량선을기준으로 glutathione의농도를계산하였다. 모든자료는평균 ± 표준편차로표시하였으며, 통계분석은 Sigma Stat 3.1 software program 을사용하여분석하였다. 각구간의통계적인유의성은 one-way ANOVA로측정하였고 p<0.05 이하에서 Duncan's multiple-range test로분석하였다. - 52 -
3. 효능평가법의활용 가. 제주특산해조류 13 종에대한 GGT 분석 1차적으로제주도특산자원을포함한제주하이테크산업진흥원추출물은행에서제공받은해조류추출물 13종 (< 표 1> 참조 ) 을대상으로하여알코올독성에대한식물추출물의영향을검토하였다. 그결과, 갈고리가시우무 (H시료) 등이 1 mg/ml의농도에서에탄올에의한 GGT 활성의증가를경감시키는작용이있었다 ( 그림 11). 그림 11. Effects of marine algae extracts on the ethanol-induced GGT release. HepG2 cells were pretreated with a test material at 1.0 mg/ml for 1 hr and then treated with 1.0 M ethanol for 48 hr. The culture media were used for GGT assay. The data are expressed as % of vehicle control and the bar graph represents mean ± S.D. (n=3). *, p<0.05 vs vehicle control. 나. 약용, 해조류, 채소작물등 50 종의 GGT 유출억제연구 2 차실험에서는 GGT 유출억제효과에대해약용작물, 해조류, 제주 특산과채류등 50 종의시료 (< 표 2> 참조 ) 를대상으로탐색하였다. 그결 과밀크티슬 (37 번 ), 녹차 (35, 44, 50 번 ), 복분자 (22 번 ) 등이특히에탄 - 53 -
올에의한 GGT 활성증가를현저히경감시켰다 ( 그림 12). 또한에탄올에노출된세포의생존율에미치는추출물들의영향을조사하였다. 그결과밀크티슬, 녹차추출물외에도다시마추출물, 조릿대추출물이우수한세포독성경감작용을보였다 ( 그림 13). 그림 12. Effects of herbal extracts on the ethanol-induced GGT release. HepG2 cells were pretreated with a test material at 1.0 mg/ml for 1 hr and then treated with 1.0 M ethanol for 48 hr. The culture media were used for GGT assay. The data are expressed as % of vehicle control and the bar graph represents mean ± S.D. (n=3). *, p<0.05 vs vehicle control. - 54 -
그림 13. Effects of herbal extracts on the ethanol-induced cytotoxicity. HepG2 cells were pretreated with samples at 1.0 mg/ml and then treated with 1.0 M ethanol for 48 hr. The data are expressed as % of vehicle control and the bar graph represents mean ± SEM (n=3). *, p<0.05 vs vehicle control. 다. 후보기능물질및제주특산시료에대한알코올독성경감 효과평가 덱스트린, 복분자, 녹차, 밀크티슬등 4종에대하여세포수준의효능평가법을적용한결과, 밀크티슬은물론제주녹차추출물도우수한세포독성경감작용을보였다. 그러나, 이들도에탄올에의한세포내 GSH 고갈을막아주지는못했다. ( 그림 14) 에서는제주조릿대추출물이에탄올에의해유도된간독성저해효과를다양한간손상에대한다양한지표를통해확인하였다. 혈청내 AST와 ALT의대조군과비교하였을때에탄올을투여한실험군에서현저히증가하였다 ( 그림 14A, B). 제주조릿대추출물 10~30 mg/kg BW 으로투여한군과대조군으로 silymarin 30 mg/kg BW을에탄올과함께 - 55 -
투여한군에서는 AST나 ALT 중단지하나의지표에만영향을준반면제주조릿대추출물 100 mg/kg BW을함께투여한군에서는그러한에탄올에의해증가된두지표모두를유의적으로감소시켰다 ( 그림 14A, B). 또한에탄올에의한간조직의지질과산화증가를조직내 TBARS를측정하여확인하였다. 마찬가지로제주조릿대추출물 100 mg/kg BW을함께투여한군에서는유의적으로감소시켰다 ( 그림 14C). 조직학적시험을통해서도에탄올을투여한마우스의간조직에서지방증과세포괴사가증가됨을확인하였고제주조릿대추출물 100 mg/kg BW을투여한실험군에서는이러한변화를완화시켰다 ( 그림 14D). 이러한결과들을통해제주조릿대추출물에서에탄올에의한간독성보호효과를확인하였다. 그림 14. 제주조릿대추출물의간독성저해효과 - 56 -
라. 시제품에대한알코올간독성효능평가 약용작물에대한세포실험연구를통해선정된제주조릿대, 녹차, 복분자, 밀크티슬의 4종의식물들의추출물을주성분으로함유시킨음료시제품을제조하고, 그간보호효과를에탄올을처리한 C57BL/6 마우스에서시험하였다. 시료에적량의물과에탄올을가하여고형분 2%(w/v), 에탄올의농도는 30%(v/v) 가되도록희석하여에탄올 1회투여량 2.5 g/kg BW, 시료 1회투여량 200 mg/kg BW씩 3회 12시간주기로복강투여하였다. 마지막투여 3시간후간독성을 aspartate aminotransferase(ast), alanine aminotransferase (ALT), 간조직내 thiobarbituric acid-reactive substances(tbars), glutathione 등의지표뿐아니라조직학적평가를통해시험하였다. 그결과, 음료시제품 A' 가에탄올에의한급성간독성을현저하게감소시키는것으로나타났다. 결론적으로, 제주조릿대, 녹차, 복분자, 밀크티슬의 4종의추출물을주성분으로함유시킨음료가알코올남용으로인한간질환을보호하는데유용할것으로사료된다. 1) 음료시제품과에탄올희석투여실험마우스동물모델에서음료시제품의알코올간독성에대한효과를시험하기위해, 시료를물또는에탄올수용액으로희석하여투여하였다. 에탄올 1회투여량 2.5 g/kg BW, 시료 1회투여량은고형분으로 200 mg/kg BW 씩 3회 12시간주기로복강투여하였다. 그리고투여시간에따른변수를줄이기위하여마지막투여후정확히 3시간째마우스를마취하여혈액과간을적출하였다. 먼저각시료및에탄올투여에의한체중변화및간조직무게의변화여부를조사하였다. ( 그림 15) 에보인바와같이마우스의체중과간조직의무게는음료시제품 A를투여한군, 시제품 B 또는대조액 C를투여한군, 그리고이시료들을에탄올과함께투여한군모두에서상호유의한차이를관찰할수없었다. - 57 -
그림 15. Effect of a drink preparation containing herbal extracts and/or ethanol on the body and live tissue weights in mice. Mice received 100 mg/kg BW of a drink preparation A or control solution B or C, with or without 2.5 g/kg BW of ethanol, three times at 12 hr intervals. At 3 hr after third administration, mice were anesthetized with isoflurane and euthanized. Values are mean ± S.D. (n=7~9). Columns not sharing the same letter are significantly different from each other (p<0.05). - 58 -
2) 간독성지표의활성측정다음으로혈청에서간독성의지표로서 aspartate aminptransferase (AST) 와 alanine aminotransferase (ALT) 의활성을측정하였다. 그결과를 ( 그림 16-I) 과 ( 그림 16-II) 에보였다. 에탄올없이시제품 A, 시제품 B 및대조액 C를투여한군은모두정상적인혈청 ALT, AST 수치를보였으며이는이들자체가매우안전하여간독성을전혀유발하지않음을시사한다. 반면이들을에탄올과함께투여한경우는서로다른결과들이나타났다. 대조액 C의경우혈청 ALT, AST 수치가공히 5배정도높아졌으나, 시제품 A를투여한경우는혈청 ALT, AST 수치의증가현상이현저히억제되었다. 한편시제품 B의경우에는 ALT, AST 수치증가의억제정도는미미하지만유의한억제작용을보였다. 본실험에서, 이처럼시제품 A가시제품 B에비해보다강력한간보호효과를보인것은시제품 A에포함된추출물들즉, 제주조릿대, 녹차, 밀크티슬, 복분자의 4종추출물들의간보호효과를보여주는것이라판단된다. 또한시제품 B가다소의간보호효과를나타내는것은주요 4종추출물이외의기타추출물들에기인한것으로해석된다. - 59 -
그림 16. Protective effect of a drink preparation containing herbal extracts on the ethanol-induced hepatotoxicity in mice. Mice received 100 mg/kg BW of a drink preparation A or control solution B or C (Table 3), with or without 2.5 g/kg BW of ethanol, three times at 12 hr intervals. At 3 hr after third administration, mice were anesthetized with isoflurane and euthanized to collect blood and liver samples. The samples were used for the analyses of serum activities of AST (I), and ALT (II), hepatic lipid peroxidation (III) and total glutathione content (IV). Values are mean ± S.D.(n=7~9). Columns not sharing the same letter are significantly different from each other (p<0.05). 3) 시제품의항산화작용효과실험제주조릿대, 녹차, 밀크티슬, 복분자추출물들을함유한시제품의간보호효과가산화적스트레스를경감하는항산화작용과관련이있는지알아보았다. 산화적스트레스는산화물의증가, 항산화제의소실등으로확인할수있다. 간조직의지질과산화정도를알아보기위하여 thiobarbituric acidreactive substances(tbars) 의함량을측정하였고대표적항산화제인 glutathione의함량을측정하였다. - 60 -
( 그림 16-III) 과 ( 그림 16-IV) 에보인바와같이대조액 C를알코올과함께투여한경우지질과산화가크게증가하고 glutathione이크게감소하였지만이러한변화가제주조릿대, 녹차, 밀크티슬, 복분자추출물들을함유한시제품 A를알코올과함께투여한군에서는현저히억제되었다. 대조액 B는 C에비해서는다소좋은효과가있었지만그차이는크지않았다. 4) 조직학적실험을통한시제품의간세포보호효과조직학적시험결과, 대조액 C를에탄올과함께투여한마우스의간조직에서지방증과세포괴사가증가됨을확인할수있었다. 반면이러한변화가시제품 A를알코올과함께투여한군에서는현저히억제되었다 ( 그림 17). 대조액 B의경우는대조액 C와큰차이를보이지않았다. 이러한결과로부터제주조릿대, 녹차, 밀크티슬, 복분자추출물들을함유한시제품 A의경우, 강력한간세포보호작용을하는것으로사료된다. - 61 -
그림 17. Effect of a drink preparation containing herbal extracts on the ethanol-induced histological changes of the liver in mice. Liver tissues were cut and fixed with 4% paraformaldehyde in phosphate-buffered saline. The fixed tissues were embedded in paraffin. Tissues sections of 6 μm were stained with hematoxylin and eosin. - 62 -
제 4 절효능평가를통한기능물질의선정 1. 선정된기능물질의성분및효능 가. 제주조릿대, 복분자, 녹차, 밀크티슬 제주조릿대는벼과에속하는대나무의일종으로제주도에넓게분포하는식물이다. 예부터제주조릿대의줄기와잎은간질환에대한전통적인약제로사용되어왔고, 또최근본과제의위탁기관에서는제주조릿대가 p-coumaric acid를포함한페놀성항산화제가풍부한식물임을밝힌바있다. 또한조릿대의부탄올분획, 특히그주성분인 p-coumaric acid의간보호작용을규명하였다. 대나무식물의다른종들에서항궤양성, 항암성, 항산화적효과가보고되고있다. 또한녹차에대해서항암효과, 노화억제, 성인병예방, 비만방지와다이어트, 중금속과니코틴해독작용, 피로회복과숙취제거, 변비치료, 충치예방, 염증과세균감염예방등다양한효과들이알려져있다. 특히알코올의독성에대한녹차의간보호효과를뒷받침하는것들이보고되었다. 그작용메커니즘과유효활성성분에대해서는여러견해가있으며본연구팀은최근의연구에서녹차의주성분인 (-)-epigallocatechin gallate(egcg) 의새로운간세포보호메커니즘을제시하였다. 복분자 (Raspberry tea) 는남자의정력에좋고혈액을맑게해주며간을보하고눈을맑게한다고알려져있다. 본연구에서양성대조물질로사용한실리마린은밀크티슬 (Milk Thistle, 큰엉겅퀴 ) 에서추출된물질이다. 밀크티슬은간기능강화, 피부청결, 영양소분해에효과가좋은것으로알려져있다. 이들 4가지식물들은공통적으로항산화작용이우수한페놀성화합물들을다량함유하고있다. 이러한항산화성분의작용으로음주로인해야기될수있는산화적스트레스를경감시켜간을보호해주는것으로사료된다. 이들식물추출물을함유한음료는따라서알코올성간질환의예방과치료에유익할것으로기대된다. - 63 -
나. 갈고리가시우무 제주해조류 13종중갈고리가시우무의경우, 에탄올에의한 GGT 활성의증가의경감작용이우수한것으로나타났다. 갈고리가시우무 (Hypnea japonica) 는홍조식물돌가사리목가시우무과의해조이다. 분포지역은한국의부산 거제도 제주 거문도일대와, 일본 타이완등지이며, 외양 ( 外洋 ) 에면한파도가심한간조선 ( 干潮線 ) 부근이하의바위위에나기도하나, 대개모자반류의가지에엉겨붙는다. 높이 7~20 cm, 지름 1.5~3 mm이다. 원기둥모양이며가지의군데군데에부착기를만들어서로붙어서큰덩어리를이룬다. 덩어리밖으로나온가지는깃모양비슷하게갈라지고, 길고짧은가지들은거의수평으로벌어진다. 가시는끝이굵게되어갈고리모양으로휘기도한다. 살아있는식물체는물속에서작은가지의밑동으로부터형광을내는데, 빛깔은뚜렷한붉은색또는갈색을띠는붉은색이다. 질은막질 ( 膜質 : 얇은종이처럼반투명한것 ) 또는연골질 ( 軟骨質 ) 이다. 또한, 갈고리가시우무는식용가능하다. - 64 -
< 표 8> 제주조릿대, 복분자, 녹차, 밀크티슬의주요성분과효능 식 물 성 분 효 능 제주조릿대 학명 : Sasa quelpaertensis 과명 : 벼과 비타민 C, 식이섬유, 폴리페놀, 플라보노이드, 다당류, 비타민 E 항궤양성, 항암성, 항산화 적효과 복분자 (Raspberry tea) 학명 : Rubus coreanu 과명 : 장미과 폴리페놀, 탄닌, 사포닌, 안토시아닌 시력향상, 항염, 항산화, 간보호효과, 강장효과 녹차 (Green Tea) 학명 : Camellia sinensis 과명 : 차나무과 카페인, 탄닌 ( 카테킨 ), 비타민 C, 유리아미노산 항암효과, 노화억제, 성인병예방, 비만방지와다이어트, 중금속과니코틴해독작용, 피로회복과숙취제거, 변비치료, 충치예방, 염증과세균감염예방 밀크티슬 (Milk thistle) ( 큰엉겅퀴 ) 학명 : Silybum marianum 과명 : 국화과 플라보노이드 ( 실리마린 ), 타라카스테린아세테이트, 스티그마스케롤, 알파-아말린, 간기능강화, 항산화적효과, 피부청결, 영양소분해, 에스트로겐호르몬조절작용 - 65 -
2. 기능물질시료의제조 위에서선정된총 4 종의원료를추출하여이후임상실험및음료의 제조가가능하도록시료를제조하였다. 제조된시료는 ( 그림 18) 에나타내 었다. 그림 18. 제조된기능물질시료 - 66 -
제 5 절음료시제품의제조및인체알코올호기 시험 1. 음료시제품의제조 제주조릿대, 녹차, 밀크티슬, 복분자추출물을알코올간독성완화효과를지닌후보물질로선정하였고, 이들 4종의추출물을주성분으로하는음료시제품 'A' 를제조하였다. 음료조성물을 < 표 9> 에나타내었다. 음료시제품 A 의비교목적으로 4종의추출물을제외한다른성분들은그대로함유하면서덱스트린으로고형분총량을보정한대조액 'B', 그리고덱스트린만을동일한고형분농도로함유한대조액 C' 를제조하였다. 또한, 제주해조류 13종중에탄올에의한 GGT 활성의증가의경감작용이우수한것으로나타난갈고리가시우무추출물을추가로선정하여제주조릿대추출물과병용한숙취해소용음료를제조하였다 < 표 10>. 음료시제품의기호성향상을위하여레드비트추출물, 갈근추출물, 갈화추출물및과라나추출물등을추가로포함하도록하였다. 그리고추출물은정제수를포함한물, 탄소수 1~4의저급알코올또는프로필렌글리콜, 에테르, 클로로포름중의용매로가용한추출물을포함하였다. - 67 -
성분명 조릿대농축액 (25:1) 복분자농축액 (10:1) 녹차추출분말 (15:1) 밀크티슬추출분말 (8:1) 제조원추출고형분방법 (%) < 표 9> 시제품의처방 성분비 (%)/ 실고형분 시제품 A 시제품 B 대조액 C 40 2.600/1.040 50 1.900/0.950 100 1.400/1.400 100 1.890/1.890 GMT 5L 5 2.000/0.100 2.000/0.100 과라나추출분말 (8:1) 100 1.100/1.100 1.100/1.100 레드비트농축액 (12:1) 갈근농축액 (1 5:1) 갈화농축액 (2 0:1) 천연아미노산펩타이드VS- PL(12:1) 70 1.540/1.078 1.540/1.078 50 1.150/0.575 1.150/0.575 65 1.460/0.949 1.460/0.949 100 1.200/1.200 1.200/1.200 타우린 100 0.300/0.300 0.300/0.300 덱스트린 100 5.280/5.280 10.582/ 10.582 정제수 83.460 85.970 89.418 합계 100/10.582 100/10.582 100/10.582-68 -
< 표 10> 갈고리가시우무추출물과제주조릿대추출물을유효성분으로 포함하는숙취해소용음료 ( 단위 : 중량 %) 구분 실시예 5 실시예 6 실시예 7 갈고리가시우무추출물 3 3 3 제주조릿대추출물 3 6 6 과라나추출물 1.1 1.1 0 레드비트추출물 1.5 1.5 0 갈근추출물 1.2 1.2 0 갈화추출물 1.5 1.5 0 타우린 0.3 0.3 0.3 덱스트린 0 0 5.3 정제수 88.4 85.4 85.4 합계 100 100 100 < 표 11> 제주조릿대추출물단독함유숙취해소용음료 조성비 ( 단위 : 중량 %) 구분 비교예 1 제주조릿대추출물 5 과라나추출물 1.1 레드비트추출물 1.5 갈근추출물 1.2 갈화추출물 1.5 타우린 0.3 덱스트린 0 정제수 89.4 합계 100-69 -
2. 인체알코올호기시험 제주자생생물자원을활용 ( 숙취해소조성물-가칭 : NC730) 하여인체대상음주후알코올농도를호기실험으로측정하여초기알코올흡수지연효과및일정시간경과후알코올분해효과를알아보았다. 시험대상은 25세 ~ 45세의남녀를무작위추출하여 10명을선정하였으며, 2008. 2. 27-2008. 2. 29에걸쳐실시되었다. 알코올측정기 ( 세주 ENG-B052L001) 로혈중알코올농도를측정함으로써평가하였다. 시험방법은공복시각시험군별로물과시판중인숙취해소음료 (D 社 M제품 ) 와 NC730을각각 100 ml씩섭취하게한뒤 (n=10, 100 ml/n), 30분경과후, 희석위스키 200 ml를각각섭취하게한다음시간대별 (30분, 60분, 90분 ) 호기에의한혈중알코올농도를측정하는방식으로하였다 < 표 12>. 혈중알코올농도는 10명의값을평균을내어나타내었다 ( 그림 19). 인체대상알코올호기시험결과, NC730 섭취후음주시대조군별로최대 47.54% ( 대조군물대비 ), 18.52% ( 대조군 D 社 M제품대비 ) 의혈중알코올농도가떨어지는것으로보아초기알코올흡수지연효과및일정시간경과후알코올분해에효과가있는것으로보였다. < 알콜호기실험평균 > 0.100 0.094 0.090 0.080 0.070 0.060 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 A B NC730 A B NC730 A B NC730 30 분경과수치 60 분경과수치 90 분경과수치 그림 19. 인체알코올호기실험결과평균 - 70 -
시험대상 < 표 12> 인체알코올호기실험결과 30 분경과수치 60 분경과수치 90 분경과수치 A B C A B C A B C 비고 양 **(n01) 0.073 0.050 0.048 0.055 0.045 0.044 0.043 0.031 0.024 양 **(n02) 0.065 0.055 0.038 0.058 0.050 0.032 0.047 0.040 0.026 양 **(n03) 0.102 0.067 0.057 0.085 0.061 0.052 0.055 0.045 0.038 지 **(n04) 0.092 0.058 0.064 0.074 0.050 0.053 0.066 0.045 0.041 김 **(n05) 0.085 0.060 0.069 0.078 0.050 0.055 0.059 0.040 0.038 박 **(n06) 0.095 0.068 0.052 0.068 0.050 0.037 0.049 0.039 0.029 고 **(n07) 0.081 0.072 0.064 0.063 0.055 0.048 0.049 0.042 0.039 문 **(n08) 0.120 0.090 0.091 0.105 0.054 0.039 0.069 0.048 0.028 양 **(n09) 0.131 0.083 0.071 0.119 0.059 0.039 0.087 0.039 0.029 박 **(n10) 0.100 0.071 0.055 0.100 0.065 0.042 0.087 0.047 0.030 평균 0.094 0.067 0.061 0.081 0.054 0.044 0.061 0.042 0.032 대조군 A : 물섭취 대조군 B : D 社 M 제품섭취 대조군 C : NC730 섭취 - 71 -
3. 관능시험 성인남녀 50명을대상으로 제주자생생물에서추출한성분함유 ( 숙취해소조성물-가칭 : NC730) 숙취해소음료 에대한시음후, 설문조사를실시하였다. 먼저 숙취해소음료하면생각나는제품 과 가장효과가있다고생각되는음료 를묻는질문에각각 34명 (68%), 28명 (56%) 이 CJ의 컨디션 이라고답하여브랜드인지도와효능면에서가장선호도가높았다. 술자리를가지는주요이유로대부분 직장내회식 을꼽았으며, 주로사용하는숙취예방 / 해소방법으로 해장국을먹는다 (22명, 44%), 약혹은기능성음료등을먹는다 (15명, 30%) 로나타났다. 숙취해소음료에대해 27명 (54%) 이 숙취해소용기능음료 라는이미지를가진다고응답했으며, 폭음할경우숙취해소음료를마신다고 32명 (64%) 이답하여숙취해소음료에대한이미지가많이인식화되어있으며, 주류시장의성장과함께숙취해소음료시장도커지리라예상된다. 숙취해소음료를음용하지않는이유는가격이비싸다는의견이많았는데, NC730의가격을 100 ml, 2500원정도로했을경우, 가격이적당하다는의견이 26명 (52%) 으로나타났다. 제주자생생물에서추출한성분함유숙취해소음료 (NC730) 를시음한결과, 쓴맛이난다는의견이다수였으며, 한약향이잘느껴진다고답하였다. 시제품을음용한결과캔이나드링크류로판매할경우 마시겠다 는의견이 31명 (62%) 이었으며, 파우치나분말제품일경우반대의견이 24명 (48%) 으로나타났는데, 이는숙취해소를위한음료로서의용도에중점을둔것으로파악된다. - 72 -
제 4 장결론 알코올성간질환완화및숙취해소를위한기능성물질을도출 하기위하여총 63 종의대상작물 ( 약용, 채소, 해조류 ) 을원료화 하였다. 상기의원료에대하여총 5 개의추출방법 ( 열수추출, 가수분해 추출, 알코올추출, 다당체추출, 식이섬유추출 ) 을적용하고, 양산 화를위하여추출공정을최적화하였다. 알코올성간질환완화및숙취해소와관련하여세포수준및동 물대상효능평가법을구축하였다. 구축된효능검색법을활용하여제주에서원료확보가가능한생 물들을대상으로효능을탐색하고개발대상소재 ( 조릿대, 복분 자, 녹차, 밀크티슬 ) 를도출하여추출시료를제조하였다. 4종의추출시료 ( 조릿대, 복분자, 녹차, 밀크티슬 ) 를주성분으로하는시제품에대해동물실험, 인체호기실험및관능시험을적용하여효능을평가한결과, 알코올성간독성억제효과가입증되었다. 갈고리가시우무추출물및제주조릿대추출물을병용하여알코 올성간질환완화및숙취해소효능이있는숙취해소음료제품 을개발하였다. - 73 -
제주자생생물에서추출한성분을포함하는 4 종의추출시료 ( 조릿대, 복분자, 녹차, 밀크티슬 ) 를주성분으로하여 100 ml, 드 링크류로제품화가가능한숙취해소음료를개발하였다. 4 종의추출시료 ( 조릿대, 복분자, 녹차, 밀크티슬 ) 를주성분으로 하는조성물을이용하여숙취해소음료뿐만아니라다른기능성 식품으로개발가능성을연구하였다. - 74 -
부록 1. 선행기술조사결과보고서 2. 특허출원전략보고서 3. 특허명세서 4. 기술성. 사업성평가서 5. 논문
주 의 1. 이보고서는지식경제부에서시행한지역산업기술개발사업 ( 지역 산업공통기술개발 ) 의기술개발보고서이다. 2. 이기술개발내용을대외적으로발표할때에는반드시지식경제부 에서시행한지역산업기술개발사업 ( 지역산업공통기술개발 ) 의기술개발 결과임을밝혀야한다.
[ 서식제 6-1 호첨부 2 ] 지역산업기술개발사업참여기업대표의 기술개발성과확약서 제주자생생물유래다당류를이용한알코올성간과제명질환완화및숙취해소음료개발주관기관 ( 주 ) 오엔씨 총괄책임자박선홍 위의기술개발과제수행결과에따라제출되는최종보고서상의 기술개발성과가사실과상이없으며이에따라지식경제부장관 및주관기관과체결한지역산업기술개발협약서, 지역산업진흥 사업운영요령및관리지침의해당규정에의하여결정된기술 료중기업부담분에대해주관기관에납부할것을확약합니다. 2008 년 4 월 30 일 ( 참여기업명 ) ( 대표자 ) ( 주 ) 오엔씨 박선홍 ( 인 ) ( 인 ) ( 인 ) ( 인 ) ( 인 )
[ 서식제 6-1 호첨부 3] 2008. 4. 30. 완료과제에대한 [ 주관기관, 참여기업 ] 대표자의평가의견서 ( 개발결과 ) 제주자생생물유래다당류를이용한알코올성간질환과제명완화및숙취해소음료개발주관기관 ( 주 ) 오엔씨총괄책임자박선홍 정액기술료납부의사 연구원인센티브지급의사 납부납부불가의견 : 지급지급불가의견 : 평가항목 ( 가중치 ) 평점점수평가의견 ( 구체적으로서술 ) 기술개발결과제주조릿대등 4종의식물추출물을 -목표달성도(30) 1 8 16 24 30 활용한숙취해소용음료시제품을 16 미흡 양호제조하였고숙취해소용음료에대한특허출원1편 ( 주관기관 ) 과녹차 1 5 10 15 20 -개발결과의 15 및제주조릿대의알코올독성억제미흡 양호질적수준 (20) 효능에관한논문2편 ( 위탁기관 ) 을발표하였다. 목표대비제주자생식 1 5 10 15 20 개발결과의 15 물활용및추출정제공정확립면에미흡 양호서는미흡한수준으로평가되나, 실용성 (20) 개발결과의질적수준은양호하다고보여진다. 개발결과의실용성은양 사업화가능성 1 8 16 24 30 16 호하나, 사업화와관련하여서는추 (30) 미흡 양호가적완제품개발및효능에관한기존제품과의차별성입증의필요합계 62점성이있다고판단된다. 종합평가의견 기술개발결과, 알코올성간질환완화및숙취해소음료의시제품을제조하였으나, 기능성물질발굴측면에서목표대비미흡한수준으로판단되며, 실용성및사업화와관련하여기존기능성음료와의차별성입증이필요하다. [ 주관기관명, 참여기업명 ] 대표자박선홍 ( 인 ) 주 ) 1. 종합평가의견점수가 60 점이상은 성공 으로평가하는것임 2. 평가점수는기술료징수등과관련성이있으므로신중히작성요망 ( 단, 기술료비징수과제로협약된과제는동내용을적용하지않음 ) 3. 주관기관이비영리기관인경우는주관기관및참여기업대표자의평가 의견서를각각제출하고영리기관인경우는주관기관대표자의평가의 견서만제출