연구논문현장과학교육 1(2) pp81~91 (2007 년 11 월 ) 식물로부터유전물질을추출하는방법에관한연구 - 브로콜리, 키위및바나나를이용하여 - 박기석, 정극일, 전상학 * 서울대학교, 서울특별시 151-742 How to Extract Genetic Materials from Plants - Using Broccoli, Kiwi and Banana - Ki-Seok Park, Keuk Il Jung and Sang-Hak Jeon* Department of Biology Education, Seoul National University, Seoul 151-742, Korea 요약 DNA 는 1897 년미셔 (Miescher) 에의해서처음으로발견되었지만, DNA 가유전물질이라는것은 1928 년그리피스 (Griffith) 의형질전환실험, 1944 년에이베리 (Avery) 등의형질전환물질에대한생화학적인연구, 그리고 1952 년허쉬 (Hershey) 와체이스 (Chase) 의방사성동위원소를이용한바이러스의유전연구를통해서규명되었다. 1953 년에왓슨 (Watson) 과크릭 (Crick) 에의한 DNA 이중나선구조의규명은분자생물학의발달과 DNA 재조합시대를여는계기가되었다. DNA 기술은사람을포함하는많은생물의유전체연구의완성을가져왔고, 형질전환동식물의생산, 사람의질병예방과치료, DNA 지문을이용한과학적수사, 친자확인등우리실생활과매우밀접한연관성을갖게되었다. 따라서 DNA 를교육현장에서학생들이직접뽑아서눈으로확인하는것은매우중요한의미가있다고생각된다. 본연구에서는구입이쉽고저렴한재료인브로콜리, 키위및바나나를이용하여 DNA 를추출하는과정을연구하였다. 전통적인복잡한방법대신에세제와에탄올만으로도눈으로확인할수있을만큼많은양의 DNA 를나무젓가락으로감아올릴수있었다. 추출된 DNA 의양은키위에서실험재료의단위무게당가장많은양의 DNA 가추출되지만추출액의색깔이 DNA 덩어리와비슷하여관찰이용이하지않았으며, 반면에상대적으로적은양이추출되는브로콜리는색깔의대비로 DNA 가뚜렷하게관찰되었다. 추출된 DNA 를페놀로처리하였을때단백질이검출되었기때문에추출된 DNA 는단백질도일부포함하고있는것으로생각된다. 추출된 DNA 는발암성물질인에씨디옴브로마이드 (Ethidium Bromide, EtBr) 뿐만아니라교육현장에서이용되는염색약인메틸렌블루용액및아세트올세인용액으로도염색되었다. 따라서본연구결과는 DNA 추출및확인실험이중등교육현장에서도탐구활동으로활용가능하며, 향후새로운교과과정개편에서분자생물학실험으로이용될수있을것으로생각된다. 주제어 : DNA 추출, 유전물질, 전기영동 1) 서론 유전현상에대한관심은역사시대이전에도인식을하고있었다는것을벽화를보면알수있다. 기원전 9세기의아시리안벽화에는식물을인공수분시키는과정이나오는데이는인위적인수정과정을통해좀더나은자손을수확할수있었다 * 교신저자 : jeonsh@snu.ac.kr. Tel.: 02-880-1409. Fax: 02-886-2117. CP: 010-8754-1409 * 이논문은초청논문임. 는것을추론해볼수있게한다 (Hartwell et al., 2000). 유전현상에대하여학문적인측면에서체계적으로정립한사람은멘델 (Mendel) 이다. 멘델은 1865년에 9년간의연구결과를 식물잡종에관한연구 라는발표를통해유전의원리를발표하였다 (Mendel, 1865). 비록멘델의연구결과는 1900년대에재발견되기까지빛을보지못하였지만멘델은자손에게전달되는물질을라틴어로원소라는의미를가지는 elementum 이라고명명하였으며, 유전물질의존재를구체적으로명시하기에이르
현장과학교육 1(2) 렀다. 1900년대전반부는유전물질의정체를확인하고자하는많은연구들이진행되었다. 1910년쯤에모건은초파리연구를통해유전물질이염색체에있다는유전자설을증명하였다. 1928 년에그리피스 (Griffith) 는두종류의폐렴쌍구균을쥐에감염시키는실험을통해비감염성세균이감염성세균으로형질전환이된다는것을보여주었다. 이러한그리피스의실험은형질전환에관여하는물질을생화학적으로규명할수있는길을열어주었다. 1944년에이버리 (Avery), 마크레오드 (MacLeod), 맥카티 (MacCarty) 는그리피스의실험에서형질전환에대한물질이탄수화물, 지질, 단백질, DNA 중에서 DNA 분해효소를처리하여 DNA를파괴하였을때에만형질전환이일어나지않는것을보고 DNA가유전물질임을주장하였다. 이들의주장을믿지못하는사람들은단백질이미량으로들어가형질전환과정에관여했을것이라는것과생명체의다양성을담당할수있는물질은단백질밖에없다는주장을굽히지않았기때문에 DNA가유전물질이라는확고한증거를제시하는실험이필요하였다. 1952년에허쉬 (Hershey) 와체이스 (Chase) 는바이러스를각각 DNA에들어있는인산 (P) 을방사선동위원소 ( 32 P) 로치환하거나혹은단백질에만들어있는황 ( 35 S) 을방사선동위원소로치환하여박테리아에감염시킨후다음세대박테리아에인산의방사성동위원소가나타나는것을확인함으로써 DNA가유전물질이라는것을증명하여유전물질에대한논란에종지부를찍었다 (Hartwell et al., 2000). 그렇다면실제핵산물질은언제쯤순수분리되었을까? 핵산은 DNA가유전물질이라는것이규명되기훨씬전인 1897년미셔에의해서처음으로순수분리되었다. 미셔는고름에서얻은백혈구의핵에인과질소를포함하는물질이있는것을발견하였다. 그는이것을단백질과산성을나타내는물질로분리하고산성의물질을핵산 (nucleic acid) 이라고명명하였다. 중등교육현장에서 DNA 추출과같은분자생물학실험을수행하는것은매우어려운것으로생각되어왔다. 50분이라는짧은시간내에실험을수행하여야하고, 기구이용이쉽고비용이저렴하게들어야하는데분자생물학실험은그렇지못한경향이크다. 현행 7차교과서 7종을분석해보면분자생물학분야에서실험탐구수업은없다. 하지만유전영역은현대생물학의핵심영역이면서미래생명과학산업의근간을이루기때문에실험탐구수업을통해분자생물학을배울수있는기회를제공하는것이매우중요하다고생각된다. 다행스럽게도최근에는실험실에서연구용으로핵산을분리 하는것뿐만아니라교육현장에서도핵산을분리하는실험을수행하려는시도들이많이나타났다. 서울과학전시관에서는교사연수과정에돼지난소세포를이용하여 DNA 를추출하는실험이진행되었으며 ( 서울특별시과학전시관실험연수교재, 2007), 다른교육현장에서는사람의구강세포나동물의간세포를이용하여 DNA를추출하는실험도진행되었다. 이실험을수행한교사나학생들로부터많은질문들이제기되었기때문에본논문에서는 DNA 추출과정에대한좀더상세한연구결과를발표하여야할필요성을갖게되었다. 본연구에서는브로콜리, 키위혹은바나나같은좀더쉬운재료를이용하여 DNA를대량으로얻는방법을구체적으로연구함으로써중등교육현장에서분자생물학실험이가능하도록하였다. 본실험은 2007년도생물학의해 국제생물공학전및 DNA 돌연변이전 서사용되어큰반향을불러일으켰다. 선행연구에서는 DNA 추출만으로끝나는경우가많아서학생들이직접추출한것이 DNA가맞는지에대한의문을가지게되었는데, 본실험에서는 DNA가정말맞는지확인하는과정을학생들이직접할수있게하여학생들이과학적인근거를들어서사고하는능력을키워줄수있도록하였다. 본실험을중학교 2학년을대상으로적용하였을때큰흥미를불러일으킴으로써교육현장에서실험탐구활동으로적절하게활용할수있다는것을확인하였다. 연구재료및방법시약, 기구및실험재료본연구는 DNA를추출하는실험과추출한 DNA를확인하는심화실험까지포함하고있다. 따라서재료및방법을현장에서의실험수행을고려하여두부분으로구분하여표시하였다. (1) DNA 추출과정 DNA를뽑는데이용한재료로는주변에서구입하기쉽고보관이쉬운브로콜리, 키위혹은바나나를이용하였다. 이들재료는가능하면신선한것을이용하였으며, 키위나브로콜리는신선도를유지하기위하여사용전까지냉장보관하기도하였다. 이들재료를막자사발에넣은다음갈아주고 DNA 추출을도와주는소금-세제액을넣어주었다. 소금-세제액은소금 2g에세제 7ml를넣고물을 150ml 부어서만든것이다. 이용액은실험시작전에바로만들어놓고다음단계의실험들을진행하였다. 세제는주방용으로쓰이는일반적인세제면어떤것이 82
식물로부터유전물질을추출하는방법에관한연구 시약, 기구및실험재료 <DNA 추출 > 브로콜리 ( 바나나, 혹은키위 ), 100% 에탄올, 주방용세제, 막자사발, 가위 ( 혹은칼 ), 나무젓가락, 100ml 비이커, 소금 (NaCl), 구멍이작은주방용체, 돋보기, 붓, 종이, 증류수 ( 혹은수돗물 ), 붓, 페트리접시. < 전기영동을통한 DNA 확인실험 > 전기영동장치, Agarose, TAE buffer(40mm Tris-acetate, 1mM EDTA), 전원공급장치, 1% 메틸렌블루 ( 생물나라 ), 1% 아세트올세인 ( 생물나라 ), 염색통 ( 작은주방용유리용기 ), 마이크로피펫, 거름종이. 든상관없이잘작용한다. 여기서소금-세제액의역할은세제의경우계면활성제의역할을함으로써세포막의주성분인인지질을녹이는데도움을준다. 그리고소금의경우는알콜을넣어줬을때 DNA가잘뭉치게도와주며무색인 DNA가 Na + 이온과결합하여흰색을띄게된다. (2) DNA 확인실험 : 전기영동실험 DNA 확인실험을하기위해서는전기영동실험이필요하다. 0.8 ~ 1% 정도의아가로즈겔 (agarose gel) 을 TAE 완충용액 (buffer) 에넣고전자레인지에서녹여액체를만든후겔을만드는판에부어굳게만든다. 겔판에는 DNA를넣을공간이필요하기때문에겔판에콤 (comb) 을넣고녹은아가로즈용액을붓는다. 전기영동장치에굳은겔을올려놓고완충용액을부은후물에잠긴작은구멍에마이크로피펫을이용하여 DNA 를넣는다. 다음에전기를흘려주어 DNA를이동시켜야하므로전원장치 ( 파워서플라이 ) 가필요하다. DNA는 - 이온을띠고있기때문에 DNA가 - 에서 + 방향으로이동하도록전원을걸어준다. 전기영동이끝나면메틸렌블루 ( 혹은아세트올세인 ) 에넣어염색하여 DNA를확인한다. 전기영동장치는많은회사들이취급하고있는품목으로구입이비교적쉽다. 교육현장에서필요한것은매우규모가작은것이면충분하다. 전기영동과정은복잡하기때문에교육현장에서아주간단하게확인할수있는방법을고안하였다. DNA를거름종이에찍고아세트올세인으로염색하면비교적 DNA가잘보이는데, 메틸렌블루는거름종이에너무흡착이잘되어좋은결과를주지못하였다. 실험방법 (1) DNA 추출과정 1 브로콜리, 키위, 바나나를각각 50g씩막자사발안에넣고칼혹은가위로잘게자른다. 키위나바나나는껍질을벗긴후안부분만을이용하여잘게자른다. ( 대략적으로 50g은키위반개, 바나나반개, 주먹만한브로콜리절반 ) 2 작은조각의샘플을막자사발에넣고막자로아주잘게간다. 3 실험전에바로만든소금- 세제액 100ml를막자사발에넣고약 10분동안조심스럽게섞으면서갈아준다. 4 구멍이작은체를이용하여용액을걸러찌꺼기를제거한다. 5 나무젓가락을비커벽에대고조심하면서에탄올이나무젓가락을타고내려가게하면서조심스럽게에탄올을비이커에넣는다. ( 에탄올은세포추출액부피의 2배를넣어준다.) 6 흰색의가는선모양의물질이생기면먼저돋보기로관찰한후나무젓가락으로여러번휘감아올린다. 흰색깔의물질이 DNA가엉켜서생긴것이다. 7 추출한 DNA를 1ml 증류수혹은수돗물에녹인다. (1.5ml의작은튜브 (e-tube) 를사용하면편하다.) 8 붓으로이용액의일부를묻힌후거름종이에 DNA라고글씨를쓰고잘말린뒤 0.2% 아세트올세인염색약 (1% 원액을 5배희석 ) 에 15분정도넣어둔후열탕에서 5분간여분의아세트올세인용액을제거한다. 탈색후유전물질을색깔을통해확인한다. (2) DNA 확인과정 : 전기영동장치의이용 ( 그림 7 참조 ) 1 추출한 DNA 를 1.5ml 튜브에들어있는증류수에녹인다. 이때손으로튜브를잡고흔들어주면서 DNA가증류수에잘녹도록한다. 2 0.8% 가되게아가로즈를 TAE 완충용액에넣고전자레인지에서녹인후콤이꽂아진겔틀에붓고겔이굳을때까지기다린다. 3 굳은겔을전기영동장치에넣고겔의홈이잠길때까지완충용액을붓는다. 4 전원을꼽고 DNA 를 - 에서 + 방향으로이동하도록한다. 5 약 30분정도지나면전원을끄고, 겔을전기영동장치에서빼내염색통에넣고염색을한다. 6 염색약으로는 EtBr, 메틸렌블루, 아세트올세인을이용하 83
현장과학교육 1(2) 여 DNA를염색한다. EtBr은약 5분동안염색을하며, 메틸렌블루는약 5분정도, 아세트올세인은약 10분정도염색을한후 2 ~ 3시간동안탈색한다. DNA가염색되어있고겔의나머지부분의염색부분이사라진다. 7 EtBr로염색한겔은자외선을쪼여주면서관찰하며, 메틸렌블루나아세트올세인으로염색한겔은밝은빛위에올려놓고관찰한다. 실험상의주의점소금-세제액은실험전에만들어써야효과가더좋으며, 또한실험재료는반드시신선하게유지해야유전물질의파괴를막을수있다. 잘게부순브로콜리용액에나무젓가락을비스듬하게세운뒤에탄올을막대를따라서천천히넣는것이매우중요하다. 에탄올을한꺼번에붓게되면긴사슬의 DNA를보기어렵고약간뿌옇게보이는경향이있다. 100% 에탄올은휘발성이면서발화성이있기때문에원액은학생들이접근할수없도록보관한다. 만약 EtBr 을이용하는경우에는강력한돌연변이유발물질이기때문에특별한관리가필요하다. 전기영동기구를사용할때높은전압이걸리므로전기안전에유의한다. 가쉽지않다. 본연구과정에서는바나나, 키위, 브로콜리모두를이용하여 DNA를뽑아보았는데어느재료든지쉽게그리고풍부한양의 DNA를얻을수있었다. 바나나및키위는껍질을제거하고안의내용물만으로 DNA를추출하였다. 세가지재료를이용하여 DNA를뽑는과정은큰차이가없기때문에여기에서는브로콜리를재료로하여 DNA를뽑는과정에대한연구결과를보이고자한다. 브로콜리를이용하여 DNA를뽑는일반적인절차는 재료및방법 부분에서이미설명하였다 ( 그림 1). 실험과정에서몇가지중요한점을소개하면다음과같다. 첫째, 브로콜리는가능하면작은크기로잘라막자사발에넣는것이좋은데, 이것은브로콜리를잘게부수는데크게도움이되었기때문이다 ( 그림 1A). 둘째, 소금-세제액을함께넣고브로콜리를부수는것이브로콜리만넣고부수는것보다더많은 DNA를추출할수있었다. 셋째, 브로콜리가부수어진용액에나무젓가 연구결과및논의 소금 - 세제액및에탄올을이용한 DNA 의추출 교육현장에서 DNA를추출하는실험을수행하기위해서는실험과정이 50분안에끝날수있어야하기때문에대학실험실에서처럼복잡한화학약품을이용한정교한실험을할수없다. 교육현장에서의실험은시간의제약을고려해야할뿐만아니라재료를쉽게구입할수있고, 위험한약품을줄이며, 비용이저렴해야한다. 본연구에서이용한바나나, 키위, 브로콜리는시장에서쉽게구입할수있고, 키위및브로콜리는냉장보관을통해상당한기간동안보관이가능하여학교현장에이용하기에편리하다. 이러한재료는박테리아를키워서 DNA를추출하는실험이라든가입안을헹궈 DNA를뽑아내는것보다훨씬쉽고다량의 DNA를추출할수있다. 박테리아를이용하는경우배지를만들어야하는불편함이있고, 교사연수과정에서종종이용되는입안을헹궈구강세포를얻는과정은위생상으로좋지않으며 DNA 함량이생각보다부족하여나무젓가락으로걷어올리기 그림 1. 브로콜리를이용한 DNA 추출시필요한정보. (A) 브로콜리를잘게부수는과정. 재료를잘게자를수록막자사발로가는것이쉽다. (B) 막자사발에서잘게부수는과정. 재료만넣어서가는것이아니라소금-세제액을넣고천천히갈아줌으로써 DNA를얻을수있는효율을높일수있다. (C) 에탄올에의한 DNA 침전. 에탄올을첨가하면 DNA가하얗게침전된다. (D) 침전중인 DNA. DNA는에탄올에의해침전되면서하얀실타래모양으로엉키면서눈으로관찰이가능해진다. (E~F) DNA 걷어올리기. 침전중인 DNA를나무젓가락으로여러번감아올린다. 84
식물로부터유전물질을추출하는방법에관한연구 락을비스듬하게세운뒤에탄올을막대를따라서천천히넣는것이매우중요하다 ( 그림 1C). 넷째, 1차적으로풀어논실타래와같은모습으로나타나는 DNA를돋보기로관찰한후나무젓가락으로휘감아올린다 ( 그림 1E). 그림1D의화살표는 DNA가들어있는액체에에탄올을붓게되면 DNA가침전을하면서그과정중에실타래의모습으로얽혀있는것을보여준다. 에탄올을제거한침전된 DNA는증류수나완충용액 ( 예 : TE buffer) 을넣으면녹는다. 그림 2는다양한재료에서추출한 DNA의모습을보여주고있다. 모든재료에서 DNA가추출된것을알수있으며그중브로콜리의경우세포추출액이녹색이어서흰색과대비가되어서관찰이가장용이하였다 ( 그림 2A). 키위의경우는가장많은양의 DNA가생겼으나그구분이용이하지않는단점이있었다. 하지만옆에서관찰하면모두에탄올층에서흰실타래모양의 DNA가뭉친것을관찰할수있다 ( 그림 2D~F). 각각의재료를 50g씩이용하여 DNA를추출하였으며, 0.001g 까지측정할수있는저울을이용하여 DNA 양을측정하였다. 먼저 1.5ml 튜브를저울에올려놓고영점조정을하였으며, 이튜브에젓가락으로걷어올린흰색의 DNA를튜브에넣고질량을측정한후차이질량을추출한 DNA 질량으로결정하였다. 이 DNA에는단백질이완전히제거된것이아닐수있기때문에순수하게 DNA 질량이라고볼수는없지만상대적인 질량을비교하는데큰어려움이없다고생각된다. 이방법을이용하여얻은 DNA의양은브로콜리는 50mg, 바나나는 350mg, 키위는 850mg이다. 따라서질량으로만보면키위로부터단위량당가장많은 DNA를얻을수있다. 이수치는재료를곱게갈수록많은양이생기는경향이있기때문에절대적인값이될수없다. 추출한 DNA 50mg 에는증류수 50ul 을, 350mg 에는 350ul, 850mg 에는 850ul 를넣어최종적으로 1mg/ul 의농도를가지는용액을만들어전기영동을할때이용하였다. 거름종이와아세트올세인 (aceto-orcein) 염색약을이용한 DNA의확인본실험을학교현장에서할때여러제약조건을생각하면최종적으로나무젓가락으로휘감아올리는과정까지만하여도충분하다고생각된다. 하지만본실험을중학교 1학년을대상으로수행하였을때나왔던질문중의하나가나무젓가락에붙어있는것이 DNA인지어떻게알수있냐는것이었다. 따라서심화실험도필요하기때문에 DNA 확인실험을수행하였다. DNA를확인할수있는가장간단한방법은아세트올세인염색약을이용하는것이다. DNA는수용성이므로나무젓가락에붙어있는 DNA를증류수에녹인후붓으로이액체를묻혀거름종이위에점을찍고메틸렌블루로염색을하였다. 이때 그림 2. 다양한샘플에서응축된 DNA의모습. (A) 브로콜리, (B) 키위, (C) 바나나. 세포추출액의색깔은재료에따라다르게나타나는것을알수있으며관찰을할때에는브로콜리가가장선명하게보였다. 85
현장과학교육 1(2) DNA뿐만아니라주변의거름종이도염색이되기때문에끓는물속에거름종이를넣어탈색을하였다 ( 그림 3A). DNA 용액을묻힌부분에서진하게염색되는것이관찰되었다 ( 그림 3B, C). 거름종이에찍고말리는과정을반복하면더욱선명한 DNA를볼수있었다 ( 그림 3D). 염색약의농도에따라염색시간을조절하여야하며, 1% 아세트올세인용액 ( 생물나라 ) 을 1/5 로증류수에희석시켜서사용할경우에는 15분간염색하고끓는물에서 5분간탈색하면쉽게관찰할수있었다. 탈색하는과정에서 DNA를찍은곳이외의지역에서염색약이없어지는지중간중간확인하면서관찰이용이할정도로탈색이되면중단시킨다. 반면에메틸렌블루용액은거름종이에착색이심하게되어염색된 DNA를관찰하기어려웠다. 그림 3B에서보이는것처럼거름종이위에 DNA 글씨를쓰는것은많은양의 DNA 를필요로하기때문에어려움이있는반면에점을찍어확인하는것은학생들과쉽게실험할수있었다. 그러나가장많은 DNA 덩어리가나왔던키위의경우같은 농도에서브로콜리나바나나보다염색이약한것이확인되었다. 이에의문을가지고 DNA 용액에다른물질이섞여있는지확인하는실험을수행하였다. 단백질과지질은페놀과만나면뭉쳐져서덩어리지는성질을이용하여페놀-클로로포름용액을 DNA 용액과 1:1로넣고고속으로원심분리시켜보았다. 그결과는아래 ( 그림 4) 와같이 DNA는상층에녹아있어보이지않는데비해, 단백질을포함한다른물질들은중간에덩어리져있다. 따라서 DNA라고생각되었던물질은모두 DNA뿐만아니라단백질등의다른물질도포함하고있다는것을알수있었다 ( 그림 4D). EtBr과 UV 조사를통한 DNA의확인방법위의실험에서나무젓가락을걷어올린것에 DNA 이외의물질이있다는것을보여주었는데하지만 DNA가있다는것을보여준것이아니다. 그렇다면 DNA도있다는것을어떻게보 그림 3. 종이와아세트올세인염색약을이용한 DNA 확인실험. (A) 끓는물에서염색된거름종이를탈색시키는과정. 탈색정도는눈으로보면서결정한다. (B) DNA 글자를이용한 DNA 확인하기. DNA 용액을이용하여글자를쓰면글씨부분이진하게염색된다. (C) 점을찍어 DNA 확인하기. 브로콜리, 키위및바나나의 DNA 용액을이용하여거름종이에묻힌후염색하면모두 DNA 용액을묻힌곳에서진하게염색되는것을볼수있다. 브로콜리와바나나가키위에비해더진하게나타나는것을알수있다. (D) 농도차이에의한 DNA 확인하기. DNA를녹인증류수와 DNA 용액을묻히는횟수를달리하여실험해본결과묻힌횟수가많을수록염색이더욱진해지는것을알수있으며 3회, 4회, 5회는크게차이가없는것을알수있다. 그러나 DNA를녹인증류수만을묻힌곳에서는아무런반응이없었다. 86
식물로부터유전물질을추출하는방법에관한연구 그림 4. 키위 DNA 용액에서단백질분리. (A) 알코올층에서얻은 DNA 덩어리. (B) 거름종이에서충분히말린상태의 DNA 덩어리를 E-tube에넣는다. (C) 증류수를이용하여 DNA덩어리가모두녹을때까지 E-tube를흔들어준다. (D) 페놀을이용한 DNA 분리. 페놀-클로로포름용액과 DNA 용액을 1:1로섞고고속원심분리기에서 15분간돌려주면상층은 DNA 용액, 중간층의화살표가가리키는곳에서는단백질을포함한다른물질이분리되어나타난다. 여줄수있을까? DNA를확인하는가장좋은방법은아가로즈겔전기영동법 (agarose gel electrophoresis) 을이용하여전기영동을하고, DNA를 EtBr 염색약으로염색한후자외선 (UV) 을쪼여확인하는것이다 (Sambrook and Russell, 2001). EtBr은 DNA 이중나선에끼여들어가는특징이있기때문에분자생물학을하는실험실에서는빈번하게이용하는방법이다. EtBr이끼여들어간 DNA는자외선을쪼이면강한빛을낸다. 하지만 EtBr은 DNA 구조에이상을유발하는강력한돌연변이유발물질로알려져있다. 따라서교육현장에서는 EtBr 을이용하기어려울것으로생각된다. 본연구에서는먼저 DNA를전기영동법에의해분리하고이를 EtBr 로염색하여우리가얻은것이 DNA라는것을확인하였다. 그림 5A는 EtBr 로염색한겔로 UV를조사하여촬영한것이다. 그림 5A의 1번줄 (Lane 1) 은표준 DNA 마커 (standard DNA marker) 로가장작은것이 100bp( 화살표머리 ), 가장큰것이 10,000bp(10kbp)( 화살표 ) 가된다. 작은크기의 DNA는겔사이를좀더빨리이동하기때문에아래에놓이게되며, 크기가큰것은이동이어려워위쪽에있다. 그림 4A의 2번줄 (Lane 2) 은브로콜리로부터추출한 DNA로화살표는브로콜리 DNA를, 화살표머리는 RNA를나타낸다. DNA가 10kbp 보다더위쪽에있기때문에브로콜리유전체 DNA는 10kbp 보다크다는것을알수있는데이것에해당하는표준값이없으므로실제 DNA 크기를알수없을뿐만아니라지금보이는 DNA도긴 DNA가끊어진조각들일가능성도배제할수없다. 그림 5A 의 2번줄은 5mg DNA를, 3번줄 (Lane 3) 은 10mg DNA를넣어전기영동한것으로 10mg을넣었을때매우뚜렷한밴드를보여준다. 본정량방법은위에서설명한것처럼현장에서할수있도록아주단순한방법을통해서이루어진것이다. 그림 87
현장과학교육 1(2) 그림 5. 브로컬리 DNA 전기영동사진. (A-C) 첫번째줄 (Lane 1) 은 DNA 크기를측정하기위한표준크기마커 (size marker) 이며, 2번줄 (Lane 2) 에는 DNA 5mg을, 3번줄 (Lane 3) 에는 10mg을넣은것이다. (A) EtBr 염색을통한 DNA의확인. DNA 농도를달리하여전기영동하고 EtBR에염색후사진촬영한것이다. 브로콜리의 DNA가위쪽에서진하게잘보이는것이관찰된다 ( 화살표 ). 아래의밴드는 RNA로생각된다 ( 화살표머리 ). (B) 메틸렌블루염색에의한 DNA의확인. 브로컬리의 DNA를전기영동한후메틸렌블루염색약으로염색한것이다. 전기영동결과와같은결과가나오는것을확인할수있다. (C) 아세트올세인염색에의한 DNA 확인. 브로컬리 DNA를전기영동한후아세트올세인으로염색한결과이다. 마찬가지로 EtBr 염색결과와유사한양상을보여준다. B와 C에서유전체 DNA가더아래로내려온것은 DNA가조각으로나누어진것으로생각된다. 5B는브로콜리 DNA를그림 5A처럼전기영동하였지만메틸렌블루로, 그림 5C는아세트올세인으로염색한것이다. 그림 5의 A, B, C가매우유사한것으로보아그림 5B와 C에서각각메틸렌블루와아세트올세인으로염색한것이 DNA임을알수있다. 그림 5B와 C에서 DNA가 10kbp 보다약간아래쪽에있는것으로보아 DNA가파괴되어작은크기가된것으로생각된다. 전기영동을하기위해서는전기영동장치 (electrophoresis device), 아가로오즈 (agarose), 겔을만들기위한틀, 전기영동시사용할완충용액 (TAE buffer) 이필요하다. DNA가클수록아가로즈농도는묽은것을이용하여 DNA의이동을원활하게할필요가있다. DNA는음전하를가지고있기때문에전기영동시 (+) 극에서 (-) 극으로이동한다. 겔을메틸렌블루나아세트올세인으로염색한후에는배경색깔을없애는탈색과정을거쳐야한다. 염색은약 5분정도하며, 염색이끝난후겔을 1 ~ 2시간정도증류수에넣어서 DNA 이외지역에있는메틸 렌블루를탈색시켰다. 이때증류수를 15분에한번씩갈아주었다. 하지만한번탈색해놓고증류수에넣어보관을하면오랜시간동안관찰할수있어서교사가미리만들어놓고학생들에게관찰만하도록해도충분히효과가있을것으로생각된다. 에탄올에의한 DNA 침전및염색약의염색원리 DNA는인산에의해 이온을띠고있는데물은극성을띠고있어 DNA 분자와결합할수있기때문에물에녹는다 ( 그림 6A). 에탄올은핵산주변의수막 (hydration shell) 을제거하여음전하를띄는인산기를외부로노출시킨다. 음전하를띠고있는작용기그룹에 Na + 와같은양전하가붙으면폴리뉴클레오티드사이의반발력이줄어들고침전되기쉬운형태로변하게된다 (Sambrook and Russell, 2001). 에탄올을제거한침전된 DNA는증류수나완충용액 ( 예 : TE buffer) 을넣으면녹는다. 따라서나무젓가락에감겨진 DNA를증류수가들어있는곳에넣 88
식물로부터유전물질을추출하는방법에관한연구 그림 6. DNA, 메틸렌블루및아세트올세인의화학적구조. (A) DNA 이중나선구조. 편의상나선을풀어서보여주고있다. (B) 아세트올세인의구조. (C) 메틸렌블루의구조. 으면증류수에녹아보이지않는다. 아세트올세인이나메틸렌블루는염기성염색약으로산성물질에이온결합을통해서결합하는것으로알려져있으며, 아세트올세인은붉은색을, 메틸렌블루는푸른색을나타낸다 (Kiernan, 1999; Ruzin, 1999). DNA 이중나선은그림 6A에서보이는것처럼인산기가음이온을띠고있어염기성물질과화학결합할수있다. 올세인은다양한화학구조식을갖는것이발견되는데그림 6B는그중의하나를보여준다. 올세인은 orcinol이활성화될때만들어지는산물들이며, 염색과정에아민 (amine) 이나수산화기 (hydroxyl group) 가관여하는것으로알려져있다. 메틸렌블루의화학식은 C 16H 18N 3SCl 3H 20로, 용매에녹으면이온화되어 C 16 H 18 N 3 S + 와 Cl - 로분리된다 ( 그림 6C). 중학교 2학년을대상으로한실험활동에대한반응본실험은서울대학교과학영재교육원 2학년학생들을대상으로적용해보았다 ( 그림 7). 참여학생들은 DNA가유전물질이라는것을알고있었지만, DNA를직접관찰한학생은거의없었다. 본실험을적용해본결과중학생도 DNA 추출에서전기영동실험까지가능하다는것을알수있었다. 학생들은직 접 DNA를추출하는것에큰흥미를보여주었으며, 특히주변에서흔히관찰할수있는식물과과일에서 DNA를뽑는것을신기해하며적극적으로실험에참여하였다. 결론및제언본연구에서는정규교과과정에는없지만많은교사들이관심을가지고시도를하고있는 DNA 추출과정을체계적으로정리하였고, 심화과정을첨부하여현장교육에서널리이용될수있도록하였다. 실험을통해서우리는다음과같은결론을얻었다. 첫째, 브로콜리, 키위, 바나나는 DNA 추출실험에대한훌륭한재료로쓸수있다. 이들재료는우리주변에서구입이쉽고, 저렴할뿐만아니라풍부한양의 DNA를제공해준다. 둘째, 브로콜리, 키위, 바나나중같은중량에서가장많은 DNA를제공해주는것은키위이지만누런색깔의용액때문에 DNA 구별이약간어려운점이있는반면에브로콜리는녹색바탕에흰색깔의 DNA가선명하게나타나구별이쉬운점이있다. 하지만추출된 DNA에는단백질을포함하는다른물질도있어추출된 DNA 양을절대적으로비교하기는어렵다. 셋째, DNA를추출하여전기영동을하였을때키위와바나나는겔상 89
현장과학교육 1(2) 여수업을하고자할때는단지 DNA를추출하는실험만수행하는것이적절하다고생각된다. 생물반이나영재수업에서이용하고자한다면 DNA 추출실험 전기영동을통한 DNA 확인실험 DNA 이중나선구조모형만들어보기와같은실험을순서적으로수행한다면더심도있고, 의미있는실험이될수있을것이다. ABSTRACT 그림 7. 전기영동실험을수행하는학생들의실험활동. (A) DNA 추출에필요한기구및재료들. (B) DNA 확인을위한전기영동장치및관련시약. (C) DNA를추출하고있는학생들. (D) 추출한 DNA를증류수에녹임. 1.5ml 튜브에추출한 DNA를넣고가볍게섞어준다 (vortexing). (E~F) DNA를전기영동겔의작은구멍 ( 홈 ) 속에넣기. (G) 메틸렌블루로 DNA 염색하기. 메틸렌블루는 DNA와결합하기때문에 DNA가있는지역은푸른색을나타낸다. (H) 염색된겔속의 DNA 확인과정. 밝은불빛위에겔을놓으면 DNA 밴드는강한푸른색깔의띠 ( 밴드 ) 로나타난다. 에서뜨는경향이있는반면에브로콜리는겔상에서정상적으로이동하면서밴드를보여주어전기영동단계까지고려한다면브로콜리가실험재료로가장적합하다고생각된다. 분자생물학에대한실험은일반적으로복잡한기구와비용이많이들어가는것으로생각되어중등교육현장에서는생각지도못하는실험이되었다. 하지만연수과정이나과학행사등에서 DNA 추출실험이수행되는것을보면학교현장의정규수업에서도충분히 DNA 추출실험이가능할수있다는것을보여준다. 따라서새로운교과과정의분자생물학부분에서는 DNA 추출실험을실험탐구수업으로넣어도실험이가능할것으로생각된다. 그리고본연구에서는 DNA 추출후전기영동을통해확인하는작업까지보여주었지만현장에서 1시간을이용하 DNA was first discovered by Miescher in 1897, but it was later recognized as genetic material from transformation experiment by F. Griffith in 1928, from biochemical analysis on transformation material by O. Avery in 1944, and finally from study of virus genetics using isotope by A.D. Hershey and M. Chase. J. Watson and F. Crick discovered DNA double helix structure, which opened the era of molecular biology and the DNA recombinant technology. DNA technology has been widely used in producing genetically transformed plant and animals, prevention and treatment of human disease, forensic medicine, paternity test, etc. In this study, we studied the way to extract the genetic materials from broccoli, kiwi and banana. Instead of complex and dangerous traditional way, DNA was extracted just with detergent and ethanol, and then wound up with wood chopsticks. Kiwi gave the most plenty of amount of DNA, but DNA was not able to be easily recognized due to background color. On the while, although brocoli gave the least amount of DNA, but the genetic materals were easily recognized from the green background. Phenol treatment showed that the extracted DNA actually contained protein as well. The extracted DNA was stained with ethidium bromide(etbr) as well as methylene blue and aceto-orcein dyes. The later two dyes are not harmful. Taken together, we suggest that DNA extraction experiment can be carried out in the secondary school and included in the next version of science textbook. Key words : DNA extraction, genetic materials, electrophoresis 참고문헌 2007년도중 고등학교과학교사실험연수 (2007) 서울특별시과학전시관. Hartwell LH, Hood L, Goldberg ML, Reynolds AE, Silver LM and Veres RC (2000) GENETICS from Genes to Genomes. The McGraw Hill. p13. 90
식물로부터유전물질을추출하는방법에관한연구 Benjamin A. PIERCE (2006) GENETICS 2nd edition. FREEMAN. Kiernan JA (1999) Histological and histochemical methods. Arnold. Mendel G (1865) EXPERIMENTS IN PLANT HYBRIDI- ZATION. Read at the February 8th, and March 8th, 1865, meetings of the Brünn Natural History Society. Sambrook J and Russell DW (2001) Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 5.14 ~ 5.17 & A8.12. Ruzin SE (1999) Plant microtechnique and microscopy. Oxford University Press. 91