어젠다코드 4-16 - 56 구 분 과제완결 기술분야코드 V2 기술유형코드 P01 작목구분코드 LP-02-4130 과제종류 공동연구 세세부사업 국책기술개발 연구과제및세부과제 수행기간 과제책임자및세부책임자 설사방지및항원충성항생제대체물질개발 10~ 12 국립축산과학원 김동운 2) 항생제대체물질개발을위한식물자원탐색및공급체계확립 10~ 12 인삼약초연구소이광재 색인용어 돼지, 설사, 닭, 콕시듐, 항생제대체제 ABSTRACT The purpose of this study was to search plant resource for development of antibiotic alternative. we collected 150 kinds of plant extract and evaluated its antimicrobial activity against several pathogenic microbes including the genus salmonella, and antioxidative activity. Among them, 17 kinds of extract inhibited growth of salmonella species. Especially, extracts from Oenothera biennis, Erythronium japonicum and Geranium sibiricum strongly inhibited growth of S. choleraesuis, S. enteritidis and S. typhimurium known as major pathogen to cause enteritis in animal. In addition, we found that 8 kinds of plant extract including Ligularia stenocephala and Hemerocallis dumortieri had ABTS radical scavenging activity and superoxide dismutase-like activity. The extraction yield were different from the kind of solvent and solvent concentration. The extraction yield was higher in methanol extract than ethanol extract, and extraction yield of Oenothera biennis was highest in 50% concentration of methanol. we produced 5 kinds of plant extract on a large scale, and provided coworkers to evaluate the antimicrobial and anticoccidial effect for developing antibiotic alternative. 1. 연구목표우리나라에서사용되고있는가축용항생물질은전체항생제사용량의약 50% 정도를차지하고있으며, 2006년기준으로연간 1,400톤이상의항생제가가축의질병치료뿐만아니라질병예방및성장촉진의목적의사료첨가용으로과도하게사용되고있는실정이다. 2006 년배합사료제조용항생제의사용량은가축에사용되고있는항생제의 43% 이상인 627톤이상이었으며, 이중돼지에사용된양은 69% 를점하는것으로알려져있다. 항생제는잔류물질의위험성, 내성세균의증가, 슈퍼박테리아의출현등공중보건학적으로많은문제가야기되고있어사용제한이요구되고있으며, 가축에사용되고있는항생제가사람에게도영 4. 농식품연구소 423
향을주기때문에항생제사용에대한제한이지속적으로대두되어왔다. 이에따라, 배합사료제조시에사용가능하던항생제가 2005년부터대폭축소되어 2012년부터는일부를제외하고는사용이금지되었으며, 가축사료에사용되는항생제의대체물질개발이필요로되어다양한소재를이용한항생제대체물질들이개발되어왔으나기존의항생제들이가지고있던장점을모두포함하는대체물질의개발이필요한실정이다. 이와같이, 가축질병의예방과치료를위해사용되고있는항생제는잔류및안전성이문제되면서이를대체할수있는항생제대체물질의필요성이요구되고있으며, 이와더불어 2012년부터사료첨가용항생제의사용이전면금지됨에따라경제성있는사료첨가용항생제대체물질의개발이시급한실정이다. 2. 재료및방법가. 식물자원수집및추출물제조항생제대체물질개발을위한식물자원은 2009~2012년사이에강원도전역에서수집하였으며, 항균활성실험을위한추출물은식물체건조시료에 20배 (v/w) 의에탄올을넣고상온에서 24시간 2회추출한후동결건조하여 -20 의냉동고에보관하면서사용하였다. 나. 항균활성검정식물추출물의항균활성검정을위해사용한 S. choleraesuis, S. enteritidis, S. typhimurium, S. enterica 및 C. perfringens 균주는농촌진흥청농업유전자원정보센터에서분양받아사용하였으며, 항균활성은 paper disc diffusion법을이용하여확인하였다. 항균활성은 S. choleraesuis, S. enteritidis, S. typhimurium 및 S. enterica 등 salmonella속각균주를 broth에접종하여 37 에서 24시간배양한다음 NA (nutrient agar) 배지에 100 μl씩접종한후, 1 mg/ml 농도의추출물시료를 50 μl씩처리한 8 mm 직경의 paper disc를 NA 배지위에놓고 37 에서 48시간동안배양하여 disc 주위에형성된 clear zone의크기를측정하였다 [1,2]. 다. 항산화활성검정식물추출물의항산화활성은 ABTS radical 소거활성과 SOD 유사활성을측정하여검정하였다. ABTS radical 소거활성은 4 mm ABTS와 2.6 mm pottasium persulfate를혼합후실온암소에서 24시간동안방치하여 radical을형성시킨 ABTS 용액 950 μl에농도별추출물 50 μl를첨가하여실온에서 10분동안방치한다음, microplate reader를이용하여 734 nm에서흡광도를측정하였다 [3]. ABTS radical 소거활성은시료용액의첨가구와무첨가구사이의흡광도차이를백분율로나타냈으며, SOD 유사활성은각각의추출물시료 0.2 ml 과 Tris-HCl(pH 8.5) 3 ml 및 7.2 mm pyrogallol 0.2 ml을첨가하여실온에서 10분동안반응후 1N HCl 1 ml을가하여반응을정지시키고, UV/VIS spectrophotometer로 420 nm 에서흡광도를측정한후시료용액의첨가구와무첨가구사이의흡광도의차이를백분율로나타내었다 [4]. 424 Ⅲ. 시험연구결과
라. 추출수율분석식물자원의용매별추출수율분석을위해식물체건조시료에 20배 (v/w) 의에탄올및메탄올을넣고상온에서 24시간 2회추출한후동결건조한후동결건조시료의무게를측정하여추출수율을분석하였으며, 농도별추출수율분석은식물체건조시료에 20배 (v/w) 의 25%~100% 농도의메탄올을각각넣고상온에서 24시간 2회추출한후동결건조한다음추출하여추출수율을분석하였다. 마. 항생제대체물질개발을위한식물추출물대량제조및공급돼지설사예방및닭항콕시듐대체물질개발을위한식물추출물은달맞이꽃, 당귀지상부등 12종의식물자원및농산부산물을강원지역에서대량으로수집후에탄올로상온에서 24시간 2회추출하여제조하였으며, 항생제대체제로서의효능시험을위해각각의협동연구팀에공급하여효능평가를위한시료로사용하였다. 3. 결과및고찰가. 식물자원수집및부위별, 용매별식물추출물제조항생제대체물질개발을위해서덜취 (Saussurea grandifolia), 곤달비 (Ligularia stenocephala) 등의식물자원을수집하여부위별, 용매별추출물 150종을제조하였다 ( 그림 1, 표 1). Saussurea grandifolia Patrinia scabiosaefolia Pteridium aquilinum Aralia elata Mukdenia rossii Atractylodes ovata Staphylea bumalda 4. 농식품연구소 425
Securinega suffruticosa Patrinia villosa Angelica dahurica Codonopsis lanceolata 그림 1. 항균, 항산화활성식물자원선정및수집 표 1. 수집자원및추출물목록 식물명 학명 식물명 학명 서덜취 Saussurea grandifolia 기린초 Sedum kamtschaticum 곤달비 Ligularia stenocephala 멸가치 Adenocaulon himalaicum 왜우산풀 Pleurospermum camtschaticum 황기 Astragalus membranaceus 각시원추리 Hemerocallis dumortieri 참당귀 Angelica gigas 고사리 Pteridium aquilinum 큰수리취 Synurus excelsus 광대싸리 Securinega suffruticosa 국화수리취 Synurus plamatopinnatifidus 구릿대 Angelica dahurica 가래나무 Juglans mandshurica 기린초 Sedum kamtschaticum 국수나무 Stephanandra incisa 고추나무 Staphylea bumalda 느릅나무 Ulmus davidiana 큰까치수염 Lysimachia clethroides 밤나무 Castanea crenata 꿩의다리 Thalictrum aquilegifolium 병꽃나무 Weigela subsessilis 흰노랑민들레 Taraxacum coreanum. 뺑쑥 Artemisia feddei 노루오줌 Astilbe rubra 쥐손이풀 Geranium sibiricum 다래 Actinidia arguta 딱총나무 Sambucus williamsii 달맞이꽃 Oenothera biennis 개다래나무 Actinidia polygama 오가나무 Eleutherococcus sieboldianus 은행나무 Ginkgo biloba 더덕 Codonopsis lanceolata 참죽나무 Cedrela sinensis 돌나물 Sedum sarmentosum 야콘 Smallanthus sonchifolius 돌단풍 Mukdenia rossii 해당화 Rosa rugosa 두릅나무 Aralia elata 물푸레나무 Fraxinus rhynchophylla 땅두릅 Aralia cordata 헛개나무 Hovenia dulcis 뚝갈 Patrinia villosa 큰엉겅퀴 Cirsium japonicum 426 Ⅲ. 시험연구결과
식물명 학명 식물명 학명 마타리 Patrinia scabiosaefolia 싱아 Aconogonum polymorphum 만병초 Rhododendron brachycarpum 사위질빵 Clematis apiifolia 머위 Petasites japonicus 족제비싸리 Amorpha fruticosa 산미나리 Aegopodium podagraria 개머루 Ampelopsis brevipedunculata 삽주 Atractylodes ovata 붉나무 Rhus javanica 털부처꽃 Lythrum salicaria 사시나무 Populus davidiana 씀바귀 Ixeridium dentatum 산뽕나무 Morus bombycis 얼레지 Erythronium japonicum 산초나무 Zanthoxylum schinifolium 오갈피 Eleutherococcus sessiliflorus 오동나무 Paulownia coreana 으아리 Clematis terniflora 호랑버드나무 Salix caprea 지리산오갈피 Eleutherococcus divaricatus 파리풀 Phryma leptostachya 헛개나무 Hovenia dulcis 산초나무 Zanthoxylum schinifolium 소나무 Pinus densiflora 뺑쑥 Artemisia feddei 비타민나무 Hippophae rhamnoides L. 사데풀 Sonchus brachyotus 식방풍 Peucedanum japonicum 섬쑥부쟁이 Aster glehni 섬기린초 Sedum takesimense 비수리 Lespedeza cuneata 사철쑥 Artemisia capillaris 엉겅퀴 Cirsium japonicum var. 오동나무 Paulownia coreana 칡 Pueraria lobata (Willd.) 싱아 Aconogonon alpinum 사위질빵 Clematis apiifolia 생강나무 Lindera obtusiloba Blume 호랑버드나무 Salix caprea L. 사시나무 Populus davidiana 산쑥부쟁이 Aster lautureanus 사철쑥 Artemisia capillaris 참당귀 Angelica gigas Nakai 비타민나무 Hippophae rhamnoides 어수리 Heracleum moellendorffii 원방풍 Ledebouriella seseloides 수리취 Synurus deltoides 어수리 Heracleum moellendorffii 섬기린초 Sedum takesimense 애기기린초 Sedum middendorffianum 애기기린초 Sedum middendorffianum 짚신나물 Agrimonia pilosa 좁쌀풀 Lysimachia vulgaris var. 방풍 Saposhnikovia divaricata 참나물 Pimpinella brachycarpa 미국쑥부쟁이 Aster pilosus Wild. 참취 Aster scaber 느릅나무 Ulmus davidiana var. 초롱꽃 Campanula punctata 개나래나무 Actinidia polygama 도라지 Platycodon grandiflorum 배초향 Agastache rugosa 땅두릅 Aralia cordata 미나리 Oenanthe javanica 기린초 Sedum kamtschaticum 뱀무 Geum japonicum 수리취 Synurus excelsus 4. 농식품연구소 427
나. 항생제대체소재개발을위한항균활성스크리닝항생제대체소재개발을위한후보자원을선발하고자제조한식물추출물의항균활성을탐색하였다. 돼지설사원인균 (Salmonella cholersuis, S. typhimurium, S. enteritidis, C. perfringens) 에대한항균활성시험결과, 달맞이꽃등 Salmonella속병원균에대한항균활성을가지는식물자원 17종을선발하였다 ( 표 2, 그림 2) 표 2. 항균활성추출물종류및항균활성 Scientific name Solvent Strains S. choleraesuis S. enteritidis S. typhimurium C. perfringens Oenothera biennis E ++ +++ ND ND Mukdenia rossii E ND ++ ND ND Lythrum salicaria E ND +++ ND ND Erythronium japonicum E ++ +++ ++ ND Agrimonia pilosa E ND ++ ND ND Geranium sibiricum E +++ ++ + ND Geranium sibiricum W + ++ + ND Rosa rugosa E ND + + ND Aconogonon alpinum E + ND + NT Sedum middendorffianum E + + ++ NT Cirsium japonicum var. E + +++ ++ NT Sedum takesimense E + + + NT Sedum middendorffianum E + + + NT Saposhnikovia divaricata E ND + ND NT Oenanthe javanica E + + + NT Aralia cordata E ND ND ++ NT Sedum kamtschaticum E ND ND + NT * E : ethanol extract, W : water extract ** Concentration : 10mg/mL, *** +<1.0mm, 1.0mm<++<2.0mm, 2.0mm<+++ **** ND : not detected NT: not tested 그림 2. 식물추출물항균활성 (paper disc diffusion) 428 Ⅲ. 시험연구결과
다. 식물추출물항산화활성검정부위별, 용매별식물추출물의항산화활성검정을위해 ABTS radical 소거능및 SOD 유사활성능을측정한결과, 곤달비추출물등 36종추출물이 80% 이상의 ABTS radical 소거능을보였으며곤달비, 각시원추리등 8종은 ABTS radical 소거능과 SOD 유사활성능모두 80% 이상의우수한항산화활성을나타내었다 ( 표 3, 그림 3). 표 3. 부위별, 용매별식물추출물항산화활성 Scientific name Part Sovent Antioxidative activity (%) ABTS SOD Saussurea grandifolia SP E 97.9 21.3 Ligularia stenocephala ST E 97.1 34.5 Ligularia stenocephala R E 98.8 100 Pleurospermum L E 100 58.1 Hemerocallis dumortieri SP E 97.9 96.5 Pteridium aquilinum SP E 87.8 64.7 Pteridium aquilinum L E 100 0 Securinega suffruticosa SP E 100 0 Angelica dahurica SP E 100 90.2 Sedum kamtschaticum SP E 100 77.9 Staphylea bumalda SP E 100 87.4 Lysimachia clethroides L E 100 100 Thalictrum aquilegifolium SP W 100 10.3 Taraxacum coreanum SP W 92.9 68 Astilbe rubra L E 100 100 Actinidia arguta SP E 100 71.1 Oenothera biennis L E 100 83.2 Eleutherococcus sieboldianus ST E 100 63.4 Codonopsis lanceolata L W 100 72.4 Sedum sarmentosum L E 100 5.8 Mukdenia rossii SP E 100 69.7 Aralia elata SP W 53.6 47.1 Aralia cordata L W 86.3 100 Patrinia villosa L W 100 73.6 Patrinia villosa F W 98.1 49.8 Patrinia scabiosaefolia SP W 99.5 57.4 Rhododendron brachycarpum L W 100 28.3 Petasites japonicus ST E 28.3 23.1 4. 농식품연구소 429
Scientific name Part Sovent Antioxidative activity (%) ABTS SOD Aegopodium podagraria SP W 30.5 41.7 Atractylodes ovata SP W 78.7 78.2 Lythrum salicaria L E 100 75.7 Ixeridium dentatum R W 10.1 5.1 Erythronium japonicum SP E 18.0 17.5 Eleutherococcus sessiliflorus R E 100 16.9 Clematis terniflora SP E 73.3 40.3 Eleutherococcus divaricatus R E 100 15.6 Agrimonia pilosa R E 10.5 53.2 Agrimonia pilosa L W 100 63.0 Sedum kamtschaticum L E 100 43.4 Adenocaulon himalaicum L E 99.9 42.3 Astragalus membranaceus R E 16.9 36.0 Angelica gigas SP E 17.5 76.4 Synurus excelsus L E 97.2 2.8 Synurus excelsus L W 97.2 6.5 Synurus plamatopinnatifidus L E 97.0 0 Synurus plamatopinnatifidus L W 96.4 5.8 * E : ethanol extract, W : water extract ** SP: sprout, ST : stem, R : root, L : leaf, F : flower 430 Ⅲ. 시험연구결과
그림 3. 식물추출물항산화활성 라. 용매별, 용매농도별추출수율분석항생제대체소재로활용가능한유망식물자원의추출용매별, 용매농도별추출효율을분석하였다. 식물자원의용매별추출수율분석결과, 추출용매로메탄올을이용시에탄올에비해추출수율이식물자원종류에따라 1.4~4.2배높은것으로조사되었다 ( 그림 4). 메탄올농도를달리하여농도별추출수율을조사한결과, 달맞이꽃은 50% 농도의메탄올을이용하여추출시 100% 농도의메탄올에비해추출수율이 2.0배증가하였으며마늘대의경우 25% 농도의메탄올로추출시 100% 농도의메탄올에비해추출수율이 3.9배까지증가하는것으로분석되어추출용매의농도에따라추출수율이달라지는것을확인할수있었다 ( 그림 5, 6). 그림 4. 용매종류에따른소재별추출수율 4. 농식품연구소 431
그림 5. 용매농도별달맞이꽃추출수율 그림 6. 용매농도별마늘대추출수율 마. 항생제대체소재개발을위한시료제조및공급 돼지설사예방및닭항콕시듐대체물질개발을위해, 항균활성소재및유망후보자원을수집하여추출물을대량으로제조하였으며사양시험을위한시료로공급하였다.( 그림 7, 표 4) 그림 7. 항생제대체소재개발을위한시료제조및공급 432 Ⅲ. 시험연구결과
표 4. 효능검정을위한사양시험용시료공급 시험물질달맞이꽃당귀마늘부산물황기오갈피 공급량 8,200g 2,500g 520g 120g 120g 4. 적요 식물자원수집및추출물제조 (105종) 및항산화활성우수추출물선발 (8종) 돼지설사원인균에대한항균활성스크리닝및식물자원선발 : 12종 돼지설사예방대체물질스크리닝용시료제조및공급 : 달맞이꽃등 3종 닭에대한항콕시듐대체물질스크리닝용시료제조및공급 : 황기등 8종 추출효율분석 : 용매별 ( 에탄올, 메탄올 ), 용매농도별추출효율분석 돼지설사예방, 닭에대한항콕시듐대체물질스크리닝을위한시료제조및공급 : 달맞이꽃추출물등 5종, 11.4kg 5. 인용문헌 Kim, J. Y, Lee, J. A and Park, S. Y. (2007). Antibacterial Activities of Oenothera laciniata Extracts. J Food Sci Nutr. 36, 255-261. Paik, S. B., Chung, I. M. and Doh, E. S. 1998. Screening of Medicinal Plants with Antifungal Activity on Major Seedborne Disease. Kor J Med Crop Sci. 6, 277-285. Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M. and Rice-Evans, C. 1999. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic Biol Med 26, 1231-1237. Marklund, S. and Marklund, G. 1975. Involvement of superoxide anion radical in the oxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur J Biochem 47, 468-474. Jäntti, J., Seppälä, E., Vapaatalo, H. and Isomäki, H. 1989. Evening primrose oil and olive oil in treatment of rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 8: 238-244. Taniguchi, S., Imayoshi, Y., Yabu-uchi, R., Ito, H., Hatano, T. and Yoshida, T. 2002. A macrocyclic ellagitannin trimer, oenotherin T1, from Oenothera species. Phytochem. 59, 191-195. 4. 농식품연구소 433
6. 연구결과활용 연도 ( 연차 ) 활용구분제목 2010(1 년 ) 논문게재큰수리취국화수리취추출물의항산화활성 ( 비 SCI) 2011(2 년 ) 2012(3 년 ) 논문게재논문게재논문게재특허출원 Amino acid and fatty acid compositions of Agrocybe chaxingu, an edible mushroom(sci) Analysis of General Components, Mineral Contents and Dietary Fiber of Synurus deltoides( 비SCI) Effect of Oenothera odorata extract on Survival Rate in Eimeria-infected Broiler Chickens( 비SCI) 달맞이꽃추출물을포함하는콕시듐증예방및치료용조성물 7. 연구원편성 참여년도 구분 소속 직급 성명 수행업무 10 11 12 과제책임자 국립축산과학원 농업연구관 김동운 주관과제총괄 협동과제책임자 인삼약초연구소 농업연구사 이광재 협동과제총괄 공동연구자 농식품연구소 농업연구관 허남기 시험연구지원 공동연구자 농식품연구소 농업연구사 김희연 시험물질제조 공동연구자 농식품연구소 기능직 최병철 시험물질추출 공동연구자 농식품연구소 기능직 신재일 활성검정 434 Ⅲ. 시험연구결과