동의생리병리학회지제 22 권 1 호 Korean J. Oriental Physiology & Pathology 22(1):162 170, 2008 加味順氣活血湯이 DOCA-salt 로유발된高血壓흰쥐에미치는작용기전 이영헌 전상윤 홍석 조국령 김남욱 정종안 * 강성인 1 동신대학교한의과대학내과학교실, 1 : 방사선학교실 Studies on The Action of Kamisungihwalhyul-tang on DOCA-salt Hypertensive Rat Young Hun Lee, Sang Yun Jun, Seok Hong, Gook Ryung Cho, Nam Uk Kim, Jong An Jung*, Seong In Kang 1 Department of Internal Medicine, 1:Department of Radiology, College of Oriental Medicine, Dongshin University Kamisungihwalhyul-tang(KSHT) has been used for many years as a therapeutic agent for cerebrovascular disease and hypertension in Oriental Medicine. But the effect of KSHT on hypertension and reactive oxygen is not well-known. This study was examined to investigate the effect of KSHT on hypertension and reactive oxygen. After administering KSHT extract to Sprague- Dawley Rat forinjected subcutaneous with deoxycorticosterone acetate(doca) 8 weeks, changes in blood pressure, pulse rate, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, reactive oxygen species, angiotensin converting enzyme, aldosterone, catecholamine levels, electrolyte, uric acid, BUN, creatinine in plasma were examined, and immunohistochemical changes and scanning electron microscopic changes were observed. 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) scavenging activity was increased, reactive oxygen species(ros) was decreased in a KSHT concentration-dependent. Angiotensin converting enzyme(ace) inhibitory activity was increased in a concentration-dependent by KSHT. KSHT significantly decreased the blood pressure and heart rate in DOCA-salt hypertensive rat. KSHT significantly decreased the levels of aldosterone in DOCA-salt hypertensive rat. KSHT significantly decreased the level of dopamine, norepinephrine, epinephrine in DOCA-salt hypertensive rat. Na +, K + and Cl - were decreased significantly, Ca 2+ was increased significantly by KSHT. KSHT significantly decreased uric acid, BUN, creatinine. Key words : Kamisungihwalhyul-tang( 加味順氣活血湯 ), hypertension, DOCA-salt, antioxidant effect, catecholamine, electrocytes, plasma hormone 서론 고혈압은성인병중에서가장기본이되는원인질환으로우리나라성인의약 15% 이상이이환율을보이고있는만성순환기질환의하나이다 1). 수축기동맥압이 120 mmhg 이하, 이완기동맥압이 80 mmhg 이하가혈압의정상범위로, 그이상상승된상태를고혈압이고한다 2). 고혈압은자각증상이거의없어혈압을측정하지않으면진단되지않고, 증상이없더라도지속적 * 교신저자 : 정종안, 광주시남구월산동 377-12 동신대광주한방병원 E-mail : y8428@naver.com, Tel : 062-350-7282, 016-649-8428 접수 : 2007/11/19 채택 : 2007/12/03 으로혈관을손상시켜뇌졸중, 심근경색등의심혈관계질환뿐만아니라신장질환, 말초혈관질환, 안저병변등의다양한합병증을유발할수있기때문에적극적인관리및치료가요구된다 3). 한의학에서는고혈압이란병명은없으나頭痛, 眩暈, 項强, 耳鳴, 心悸, 動悸, 胸悶, 呼吸困難, 疲勞, 面紅, 煩燥, 視力混濁, 四肢痲痺, 手足痹感등의증상으로미루어보아中風, 頭痛, 眩暈, 心火亢炎, 肝陽上亢의범주에해당된다고볼수있으며그원인으로心火暴盛, 肝風內動, 陰陽兩虛, 痰濕壅盛등을들수있다 4,5). 본실험에사용된加味順氣活血湯은 晴崗醫鑑 6) 에順氣 活血 導痰의效能으로中風治療에多用된順氣活血湯에고혈압과관상동맥경화로인한심장질환을치료한다고보고되어진防風 7), 石菖蒲 8), 竹茹 9,10), 丹蔘 11), 牛膝 12,13), 山査肉 14), 龍骨, 牡蠣 - 162 -
加味順氣活血湯이 DOCA-salt 로유발된高血壓흰쥐에미치는작용기전 15-17), 釣鉤藤 18), 豨簽 19) ( 酒蒸 ) 을加味한처방이다. 최근고혈압에대한실험적연구로는한 20) 의肝陽上亢方, 신 21) 의加味導赤散, 유 22) 의加味鷄血藤湯, 김 23) 의地黃飮子, 이 24) 의瀉心湯, 남 25) 의凉膈散火湯, 임 26) 의滲濕湯등이있으며, 임상에서다용되는고혈압처방에대한기전적연구와더불어이를바탕으로새로운치료처방을개발하려는노력이이루어지고있다. 현재보고되어진順氣活血湯에대한실험적연구로는박 27) 瘀血病態模型에미치는영향을, 손 28) 骨折癒合에미치는영향을, 이 29) 高脂血症病態모델에미치는영향을, 정 30) 腦虛血抑制效果에대한효과를보고하였으나고혈압에대한연구는아직보고가없었다. 이에저자는加味順氣活血湯 (Kamisungihwalhyul-tang, KSHT) 이고혈압에미치는효과를실험적으로규명하고자 DOCA-salt를투여하여고혈압을유발시킨흰쥐에게加味順氣活血湯추출물을경구투여하여세포독성및간에대한독성검사를통한안정성을검증한뒤항산화활성에미치는영향과 ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 저해능에미치는영향, 혈압및심박수의변화, Aldosterone, Catecholamine, 전해질변화에미치는영향및 Uric acid, BUN, Creatinine 등신장에미치는영향등을관찰하여유의한결과를얻었기에보고하는바이다. 1. 재료 1) 약재 재료및방법 본실험에사용한加味順氣活血湯 (Kamisungihwalhyul-tang, 이하 KSHT) 의구성약물은동신대학교부속한방병원에서구입후정선하여사용하였다. 약물구성은다음과같다 (Table 1). Table 1. The Composition of Kamisungihwalhyul-tang (KSHT) 韓藥名 學 名 用量 (g) 蒼 朮 Atractylodes japonica 8 香附子 Cyperus rotundus 8 陳 皮 Citrus unshiu 6 半 夏 Pinellia ternata 6 赤茯苓 Poria 6 枳 殼 Aurantii Fructus 4 烏 藥 Lindera strychnifolia 4 桔 梗 Platycodi Radix 4 防 風 Saposhnikovia divaricata 4 白 芷 Angelica dahurica 2.8 木 香 Aucklandiae Radix 2.8 甘 草 Glycyrrhizae Radix 2 石菖蒲 Acori Framinei Rhizoma 4 竹 茹 Bambusae Caulis in Liqamen 4 丹 蔘 Salviae miltiorrhizae Radix 6 牛 膝 Achyranthis Bidentatae Radix 6 山査肉 Crataegii Fructus 6 龍 骨 Fossilia Ossis Mastodi 4 牡 蠣 Ostreae Concha 4 釣鉤藤 Uncariae ramulus et Uncus 6 豨簽 ( 酒蒸 ) Siegesbeckiae Herba 8 總 量 105.6 2) 시약 Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS-A; Sigma Co., U.S.A.), Normal saline ( 중외제약, Korea), RPMI 1640 (Sigma Co., U.S.A), Penicillin (Sigma. Co., U.S.A.), Streptomycin (Sigma. Co., U.S.A.), Deoxycorticosterone Acetate (DOCA; Sigma., U.S.A), Amphotericin B (Sigma. Co., U.S.A.), Trypsin (invitrogen., U.S.A), Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA; Sigma., U.S.A), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT; Sigma., U.S.A), Dimethyl sulfoxide (DMSO; Sowa chemical., Japan), 3.8% Sodium citrate (Sigma Co., U.S.A), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH; Sigma Co., U.S.A), Angiotensin converting enzyme (ACE, Sigma Co., U.S.A), Hippuryl-his-leu acetate (Sigma Co., U.S.A), 5-(and-6)-choromethyl-2',7'-dichloro dihydrofluorescein diacetate acetylester (CM- H2DCFDA; invitrogen Co., U.S.A), H 2O 2 (Dongyang Chem., Korea), Ethylacrtate (Junsei., Japan), [1-14C] oleoyl-coa (invitrogen., U.S.A), Potassium Phosphate Monobasic (KH 2PO 4; Yakuri., Japan), Bovine serum albumin (BSA; Sigma, U.S.A), 등을사용하였고, 이밖에일반시약은특급시약을사용하였다. 3) 동물본실험에사용된실험용쥐는 7주령, 체중 200-220 g의雄性 SD (Sprague- Dawley Rat, 대한바이오링크, 충주, Korea) 은실험당일까지고형사료 ( 슈퍼피드, 강원도, Korea) 를자유식이하면서물을충분히공급하였다. 실온 22 ± 2, 상대습도 50 ± 10%, 조명시간 12시간 (07:00 ~ 19:00), 조도 150 ~ 300 Lux로설정하여 2주일간실험실환경에적응시킨후체중변화가일정하고건강한쥐만을선별하여실험에사용하였다. 사료조성내용과분량은다음과같다 (Table 2). Table 2. Composition of Basal Diet 조단백질 22.1% 이상조지방 3.5% 이상조섬유 5.0% 이하조회분 8.0% 이하칼슘 0.6% 이상인 0.4% 이상 2. 기기본연구에사용된기기는 Accoutered GC (Roche, Germany), Ice-maker (Vision, Korea), Serum separator ( 녹십자, Korea), Minos-ST (Cobas Co., France), Centrifuge (Beckman Co., U.S.A.), Rotary vaccum evaporator (Büchi 461, Switzerland), Deep freezer (Sanyo Co., Japan), Freeze dryer (Eyela Co., Japan), Autoclave (Hirayama, Japan), Ultrasonic cleaner (Branson Ultrasonics Co., U.S.A.), ELISA reader (Molecular Divice., U.S.A), Roller Mixer (Gowon scientific technology Co., Korea), 한약유출기 (DWP-1800T, 웅진, Korea), Spectrophotometer (UV-2450, Shimazu, Japan), Fluorescence activated cell sorter (FACS, Beckman Co., U.S.A.), Non invasive blood pressure system (CODA6, Kent, U.S.A), Balance - 163 -
이영헌 전상윤 홍석 조국령 김남욱 정종안 강성인 (Cass, korea), 생화학기기 (AU400, Olimpus, U.S.A), 전해질측정기 (NOVA5, Japan), 감마카운터기 (WIZARD 1470, Finland) 등을사용하였다. 3. 방법 1) 약물추출 시료추출방법은 KSHT 5첩을한약약탕기 (DWP-1800T, 대웅 ) 에넣고, 정제수 ( 동원샘물 ) 1500 ml와같이혼합하여 3시간열탕하여추출한후흡입여과하였다. 이를 rotary vacuum evaporator (Büchi 461, EYELA) 에서감압농축하여 KSHT를분리한후, 다시동결건조기 (EYELA, FDU-540, Japan) 에서 24시간동결건조하여분말 35 g을얻었으며, 얻어진분말은초저온냉동고 (-80 ) 에서보관하면서, 실험에따라필요한농도로증류수에희석하여사용하였다. 2) In vitro (1) Human fibroblast cells (hfcs) 배양 피부조직을 cool D-PBS로 3회세척한후작은조각으로절단한다음, conical tube (15 ml) 에넣어 1,400 rpm에서 5분간원심분리하였다. 이 tube에 RPMI 1640 {containing collagenase A (5 mg/ml, BM, Indianapoilis, IN, USA) 와 DNase type Ⅰ (0.15 mg/ml, Sigma. Co., U.S.A.), antibiotics (penicillinm 10 4 U/ml, streptomycin 10 mg/ml, amphotericin B 25 μg /ml)} 를넣고 3 7 CO 2 배양기에서 hfcs를 2 시간동안배양하였다. 여기에 0.5% trypsin-0.2% EDTA를첨가하여 30 분간배양하고, 인산완충생리식염수 (PBS) 로약 2회 1,500 rpm에서원심분리한후 RPMI 1640-10% FBS로 1주일동안배양하였다. 이를다시 0.5% trypsin-0.2% EDTA로분리하였으며, 이를연속으로 1주일씩 3회반복한후살아있는부착세포를 RPMI 1640-10% FBS 배양액에서배양하였다. (2) Cell viability 측정 세포독성측정은 MTT assay로하였다. 배양한 human fibroblast cells를 96 well plate에 2 10 4 cell 씩분주한후배양하고, 24시간후 KSHT를 500, 250, 125, 62.5, 31.25 μg /ml 농도로투여하였다. 다시 48시간배양후부유액을제거하고, 각 well에 MTT solution (0.5 mg/ml) 100 μl씩첨가하여 4시간동안배양하였다. 배양후부유액을제거하고각 well에 100 μl의 DMSO 를첨가하여 37 CO 2 배양기에서 30분동안반응시킨후 ELISA reader를사용하여 wave length 540 nm에서흡광도를측정하였다. (3) 항산화활성측정 1 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 31) 소거능측정 150 mm DPPH/EtOH 450 에 KSHT를 1000, 500, 250, 125, 62.5 μg /ml 농도로희석하여 50 μl씩첨가한후 37 에서 30분간반응시켰다. 이를흡광도 517 nm에서측정하여아래의방법으로계산하였다. DPPH 소거능 (%) = ( 대조군의흡광도 -KSHT 투여군의흡광도 ) x 100 대조군의흡광도 2 Reactive Oxygen Species (ROS) 32) 측정 Bovine endothelial cells (CPEA) 내에서생성된 ROS를측정하기위하여 24 well plate의각 well에 5 x 10 5 cells씩을분주하고, 50 um의 H 2O 2 를처리한후 KSHT 100, 50 μg /ml을처리하고, 37, CO 2 배양기에서 48시간동안배양하였다. 배양종료후 5-(and-6)-choromethyl-2',7'-dichloro dihydrofluorescein diacetate, acetylester (CM- H2DCFDA) 50 mm을처리하여 5 분간배양한후, 2회수세하였다. 이를유세포형광분석기로세포내형광 ROS 를측정하였으며, 대조군은 H 2O 2 만처리하였다. (4) Angiotensin converting enzyme (ACE) 저해능측정 Cushman & Cheung 의방법 33) 으로측정하였다. 각농도 (1000, 500, 250, 125, 62.5 μg /ml) 의 KSHT 10 μl, 기질 Hip-His-Leu 110 μl, 그리고 ACE 용액 30 μl을혼합하여 37 에서 60분동안반응시킨후 1N HCl 110 μl를넣어반응을정지시켰다. 이반응액에 1 ml의 ethyl acetate를넣고교반후 3,000 rpm에서 10분간원심분리하여얻은상층액 750 μl를 95 에서 10분동안건조하여용매를완전히제거하고, 1 ml의증류수로용해시켜 228 nm에서흡광도를측정하였다. 대조군은시료대신증류수를혼합시켰다. ACE inhibition activity (%) = KSHT 투여군의흡광도 ( 1 - ) x 100 대조군의흡광도 3) In vivo (1) DOCA-salt에의한고혈압유발 Sprague-Dawley (SD) rat 을무작위로 6마리씩나누어정상군 (Normal), 대조군 (Control) 그리고실험군 (KSHT) 으로설정하였다. 대조군과 KSHT 투여군은 deoxycorticosterone acetate (DOCA) 25 mg/kg을주 3회씩 8주간피하주사와함께 1% NaCl을식수로제공하였고, 실험군은 KSHT를성인기준하루두첩분량 (145 mg/kg) 으로매일투여하였다. (2) 체중및장기무게측정 1 체중측정 몸무게는실험종료하루전에전자저울 (CAS, Korea) 을이용하여측정하였다. 2 심장과신장무게측정 심장과신장은 ether로마취후채혈한다음에적출하여지방과다른조직들을제거하였다. 그리고 10% 포르말린에넣어서 3시간정도방치후무게를측정하여몸무게에대한무게를나타내었다. (3) 혈압및심박수측정 혈압과심박수는혈압측정기 (CODA6, Kent, U.S.A) 를사용하여측정하였다. 동물들의안정을위해측정전에 3회이상홀더에적응을시켰고, 혈압과심박수는 10회이상측정하여평균을결과로사용하였다. (4) 채혈및혈장분리 KSHT의투여종료후 12시간절식후 ether로마취시킨다음심장에서 12 ml이상의혈액을취하여 5 ml을 15 ml conical - 164 -
加味順氣活血湯이 DOCA-salt 로유발된高血壓흰쥐에미치는작용기전 tube에넣어 6,500 rpm에 15분간원심분리시켜혈청을분리하였다. 나머지 6 ml의혈액을 EDTA 첨가튜브에넣어혈장을분리하였다. (5) 혈청및혈장성분의측정분리한혈청은생화학기기 (AU400, Olimpus, U.S.A) 를이용하여 GOT, GPT, BUN, creatinine, uric acid를측정하였고, Na +, Ca 2+, K +, Cl - 의측정은전해질측정기 (NOVA5, Japan) 를이용하였다. 혈장성분은감마카운터기 (WIZARD 1470, Finland) 를이용하여핵의학적방법으로 aldosterone, dopamine, norepinephrine, epinephrine을측정하였다. 4) 통계처리본실험에서얻은결과를 ANOVA multi t-test (JAVA, Bonferroni Ver 1.1) 로분석하여 p값을구하였다. 각대조군을정상군과, 실험군을대조군과비교하여 p<0.05 일때유의성이있는것으로판정하였다. Table 5. Scavenging activity of KSHT on DPPH free radical KSHT 1000 500 250 125 62.5 Dose( μg / ml ) DPPH 소거능 (%) 70.7±1.7, 64.1±1.5, 59.4±1.0, 50.9±1.3, 43.9±1.9 The results are the mean ± SD of three independent experiments. 4. ROS에미치는영향 Bovine 혈관내피세포에서 KSHT에의한 ROS의감소효과를측정한결과, 대조군에비하여 KSHT 투여군에서 ROS의생성량이감소하는효과를나타내었다 (Fig. 1). KSHT100 KSHT50 Normal Control 결 과 1. Cell viability에미치는영향 hfcs에대한세포독성을관찰한결과, 대조군의세포생존율이 100±2.4% 인데비하여, KSHT 투여군 500, 250, 125, 62.5, 31.25 μg /ml의농도에서는각각 88.5±9.2, 95.3±8.2, 95.4±11.8, 93.5±5.8, 97.7±4.4% 로나타났다 (Table 3). Table 3. Cytotoxicity of KSHT on Human Fibroblast Cells (hfcs) KSHT 0 500 250 125 62.5 31.25 Dose( μg / ml ) Cell viability 100±2.4 88.5±9.2 95.3±8.2 95.4±11.8 93.5±5.8, 97.7±4.4 Human fibroblast cells (hfcs) were treated with various concentration (31.25, 62.5, 125, 250, 500 μg /ml) of the KSHT extract. 2. 간기능에미치는영향 간기능측정의지표성분인 GOT는대조군이 101.8±6.95 I.U/l, 정상군이 88.2± 1.92 I.U/l로나타나정상군에비하여대조군에서유의성있는 (* : P <0.05) 증가를나타냈다. KSHT 투여군에서는 94.3±5.5 I.U/l로감소하였으나유의성은없었다. GPT 측정에서는, 정상군, 대조군, KSHT 투여군에서각각 48.0±6.2 I.U/l, 57.0±12.8 I.U/l, 51.2±8.9 I.U/l로큰차이가없었다. 결과적으로 KSHT 투여군은 GOT와 GPT의수치가정상범위로나타나약물에의한간독성은발견되지않았다 (Table 4). Table 4. Effect of KSHT on the GOT and GPT in DOCA-salt hypertensive rat. GOT(I.U/l) 101.8±6.95 88.2± 1.92* 94.3±5.5 GPT(I.U/l) 48.0±6.2 57.0±12.8 51.2±8.9 Values represent the means ± SD of 6 rats. * : P <0.05 compared to normal group. 3. DPPH 소거능에미치는영향 DPPH의소거활성은 1000, 500, 250, 125, 62.5 μg /ml 농도에서각각 70.7±1.7, 64.1±1.5, 59.4±1.0, 50.9±1.3, 43.9±1.9% 의소거활성효과를나타내었다 (Table 5). Increase of ROS production Fig. 1. The inhibitory effect of KSHT on Reactive Oxygen Species. Normal: CPEA cells, Control: CPEA cells and H 2O 2, KSHT100: CPEA cells and H 2O 2 and KSHT 100 μg /ml, KSHT50: CPEA cells and H 2O 2 and KSHT 50 μg /ml. 5. ACE 저해능에미치는영향 ACE 저해능을측정한결과, 1000, 500, 250, 125, 62.5 μg /ml 농도에서각각 65.2±3.6, 55.0±0.9, 34.6±6.4, 26.3±3.8, -2.2±1.7% 의저해효과를나타내었다 (Table 6). Table 6. The inhibitory effect of KSHT on ACE KSHT 1000 500 250 125 62.5 Dose( μg / ml ) Inhibitory effect (%) 65.2±3.6, 55.0±0.9, 34.6±6.4, 26.3±3.8, -2.2±1.7 Inhibitory activity on angiotensin converting enzyme of KSHT at final concentration 62.5, 125, 250, 500, 1000 μg /ml. The results are the mean ± SD of three independent experiments. 6. 체중및장기무게에미치는영향 DOCA-salt 고혈압쥐의몸무게에미치는영향을측정한결과, 대조군은 420.8±27.9 g, 정상군은 488.3±12.1 g으로나타나, 정상군에비하여대조군에서유의성있는 (*** : P <0.001) 감소를나타내었다. KSHT 투여군은 476.0±25.2 g으로나타나대조군에비하여유의성있게 (++ : P <0.01) 증가하여정상군에가까운몸무게를유지하였다. DOCA-salt 고혈압쥐의심장과신장의무게에미치는영향을측정한결과, 심장은대조군이 4.1±0.2/Body Weight (mg/g), 정상군은 3.5±0.2/BW (mg/g) 으로나타났으나유의성은없었고, KSHT 투여군은 3.7±0.2/BW (mg/g) 으로나타나이역시유의성있는차이를나타내지않았다. 신장의무게는대조군이 4.7±0.3/BW (mg/g), 정상군이 3.2±0.1/BW (mg/g) 으로나타나정상군에비하여대조군에서유의성있는 (*** : P <0.001) 증가를나타내었다. 반면 KSHT 투여군은 3.7±0.2/BW (mg/g) 으로나타나대조군에비하여유의성있게 (++ : P <0.01) - 165 -
이영헌 전상윤 홍석 조국령 김남욱 정종안 강성인 감소하여, 정상군에가까운신장무게를유지하였다 (Table 7). Table 7. Effect of KSHT on the body weight and the heart and kidney weight in DOCA-salt hypertensive rat. Body weight(g) 420.8±27.9 488.3±12.1*** 476.0±25.2 ++ Heart weight/bw(mg/g) 3.5±0.2 4.1±0.2 3.7±0.2 Kidney weight/bw(mg/g) 3.2±0.1 4.7±0.3*** 3.7±0.2 ++ The control group were injected subcutaneous with DOCA for 8 weeks (three times a week. 25 mg/kg). The treatment group were injected subcutaneous with DOCA and orally administered with KSHT extract for 8 weeks (once a day. 145 mg/kg/ 200 μl ). Normal : Normal SD rat. Control : DOCA-Salt, KSHT : DOCA-Salt and KSHT. Values represent the means ± SD of 6 rats. *** : P <0.001 compared to normal group. ++ : P <0.01 compared to control group. 7. 혈압과심박수에미치는영향 DOCA-salt 고혈압쥐의혈압에미치는영향을측정한결과, 대조군은 175.2±5.4 mmhg, 정상군은 129.1±1.2 mmhg로나타나정상군에비하여대조군에서유의성있는 (*** : P <0.001) 증가를나타내었다. KSHT 투여군은 147.0±7.0 mmhg로나타나대조군에비하여유의성있는 (+++ : P <0.001) 강압효과를나타내었다. DOCA-salt 고혈압쥐의심박수에미치는영향을측정한결과, 대조군은 419.8±36.3 times/min, 정상군은 336.1±7.1 times/min로나타나정상군에비하여대조군이유의성있는 (* : P <0.05) 증가를나타내었다. KSHT 투여군은 354.6±40.2 times/min로나타나대조군에비하여유의성있는 (+ : P <0.05) 감소효과를나타내었다 (Table 8). Table 8. Effect of KSHT on the blood pressure and heart rate in DOCA-salt hypertensive rat. Blood pressure(mmhg) 129.1±1.2 175.2±5.4*** 147.0±7.0+++ Heart rate(times/min) 336.1±7.1 419.8±36.3* 354.6±40.2+ Values represent the means ± SD of 6 rats. *** : P <0.001 compared to normal group. * : P <0.05 compared to normal group, +++ : P <0.001 compared to control group. + : P <0.05 compared to control group. 8. Aldosterone과 Catecholamine 농도변화에미치는영향 DOCA-salt 고혈압쥐의 plasma aldosterone에미치는영향을측정한결과, 대조군은 117.2±24.2 pg/ml, 정상군은 44.1±9.9 pg/ml로나타나정상군에비하여대조군에서유의성있는 (*** : P <0.001) 증가를나타내었다. KSHT 투여군은 71.9±15.7 (pg/ml) 로나타나대조군에비하여유의성있는 (+ : P <0.05) 감소효과를나타내었다. DOCA-salt 고혈압쥐의 plasma dopamine에미치는영향을측정한결과, 대조군은 165.2±29.2 pg/ml, 정상군은 102.5±0.9 pg/ml로나타나정상군에비하여대조군에서유의성있는 (* : P <0.05) 증가를나타내었다. KSHT 투여군은 116.9±20.2 pg/ml로나타나대조군에비하여유의성있는 (+ : P <0.05) 감소효과를나타내었다. DOCA-salt 고혈압쥐의 plasma norepinephrine에미치는영향을측정한결과, 대조군은 511.2±32.9 pg/ml, 정상군은 415.8±2.5 pg/ml로나타나정상군에비하여대조군에서유의성있는 (** : P <0.01) 증가를나타내었다. KSHT 투여군은 433.4±21.1 pg/ml으로나타나대조군에비하여유의성있는 (++ : P <0.01) 감소를나타내었다. DOCA-salt 고혈압쥐의 plasma epinephrine에미치는영향을측정한결과, 대조군은 4772.2± 267.5 pg/ml, 정상군은 2640.5±159.5 pg/ml로나타나정상군에비하여대조군에서유의성있는 (** : P <0.01) 증가를나타내었다. KSHT 투여군은 3464.9±746.5 pg/ml로나타나대조군에비하여유의성있는 (+ : P <0.05) 감소효과를나타내었다 (Table 9). Table 9. Effect of KSHT on the plasma aldosterone, dopamine, norepinephrine, epinephrine in DOCA-salt hypertensive rat. Aldosterone(pq/ml) 44.1±9.9 117.2±24.2*** 71.9±15.7+ Dopamine(pq/ml) 102.5±0.9 165.2±29.2* 116.9±20.2+ Norepinephrine(pq/ml) 415.8±2.5 511.2±32.9** 433.4±21.1++ Epinephrine(pq/ml) 2640.5±159.5 4772.2±267.5** 3464.9±746.5+ Values represent the means ± SD of 6 rats. *** : P <0.001 compared to normal group. ** : P <0.01 compared to normal group. * : P <0.05 compared to normal group, ++ : P <0.01 compared to control group. + : P <0.05 compared to control group. 9. 전해질변화에미치는영향 DOCA-salt 고혈압쥐의혈청중의 sodium (Na+) 의농도에미치는영향을측정한결과, 대조군은 150.1±1.0 meq/l, 정상군은 140.1±0.8 meq/l로나타나정상군에비하여대조군에서유의성있는 (* : P <0.05) 증가를나타내었다. KSHT 투여군은 144.5±3.0 meq/l로나타나대조군에유의성있게 (+ : P <0.05) 감소하였다. 혈청중의 potassium (K+) 농도를측정한결과, 대조군은 5.8±0.2 meq/l, 정상군은 4.9±0.3 meq/l로나타나정상군에비하여대조군에서유의성있는 (** : P <0.01) 증가를나타내었다. KSHT 투여군은 5.3±0.3 meq/l로나타나대조군에비하여유의성있는 (+ : P <0.05) 감소효과를나타내었다. 혈청중의 Chloride (Cl ) 농도를측정한결과, 대조군은 104.3±0.5 meq/l, 정상군은 95.6±1.1 meq/l로나타나정상군에비하여대조군에서유의성있는 (** : P <0.01) 증가를나타내었다. KSHT 투여군은 101.1±0.9 meq/l로나타나대조군에비하여유의성있는 (+ : P<0.05) 감소효과를나타내었다. 혈청중의 Calcium (Ca 2+ ) 농도를측정한결과, 대조군은 0.99±0.11 meq/l, 정상군은 1.33±0.02 meq/l로나타나정상군에비하여대조군에서유의성있는 (** : P <0.01) 감소를나타내었다. KSHT 투여군은 1.29±0.03 meq/l로나타나대조군에비하여유의성있는 (++ : P <0.01) 증가효과를나타내었다 (Table 10). Table 10. Effect of KSHT on the sodium (Na+), potassium(k+), chloride (Cl ) in DOCA-salt hypertensive rat. Sodium(mEq/l) 140.1±0.8 150.1±1.0* 144.5±3.0+ Potassium(mEq/l) 4.9±0.3 5.8±0.2** 5.3±0.3+ Chloride(mEq/l) 95.6±1.1 104.3±0.5** 101.1±0.9+ Calcium 1.33±0.02 0.99±0.11** 1.29±0.03++ Values represent the means ± SD of 6 rats. ** : P <0.01 compared to normal group. * : P <0.05 compared to normal group. ++ : P <0.01 compared to normal group. + : P <0.05 compared to control group. 10. 신장기능인자변화에미치는영향 혈청중의 uric acid의농도를측정한결과, 대조군은 3.5±0.7 mg/dl, 정상군은 1.5±0.3 mg/dl로나타나정상군에비하여대조군에서유의성있는 (** : P <0.01) 증가를나타내었다. KSHT 투 - 166 -
加味順氣活血湯이 DOCA-salt 로유발된高血壓흰쥐에미치는작용기전 여군은 1.5±0.6 mg/dl로나타나대조군에비하여유의성있는 (++ : P <0.01) 감소효과를나타내었다. 혈청중의 BUN 농도를측정한결과, 대조군은 31.4±2.4 mg/dl, 정상군은 17.9±4.1 mg/dl로나타나정상군에비하여대조군에서유의성있는 (** : P <0.01) 증가를나타내었다. KSHT 투여군은 25.8±4.5 mg/dl로나타나대조군에비하여유의성있는 (+ : P <0.05) 감소효과를나타내었다. 혈청중의 creatinine 농도를측정한결과, 대조군은 0.76±0.05 mg/dl, 정상군은 0.62±0.04 mg/dl로나타나정상군에비하여대조군에서유의성있는 (** : P <0.01) 증가를나타내었다. KSHT 투여군은 0.68±0.04 mg/dl로나타나대조군에비하여유의성있게 (* : P <0.05) 감소하였다 (Table 11). Table 11. Effect of KSHT on the uric acid, BUN and creatinine in DOCA-salt hypertensive rat. Uric acid(mg/dl) 1.5±0.3 3.5±0.7** 1.5±0.6++ BUN(mg/dl) 17.9±4.1 31.4±2.4** 25.8±4.5+ Creatine(mg/dl) 0.62±0.04 0.76±0.05** 0.68±0.04+ Values represent the means ± SD of 6 rats. ** : P <0.01 compared to normal group. ++ : P <0.01 compared to normal group. + : P <0.05 compared to control group. 고 찰 고혈압이란 18세이상의성인에게서수축기혈압이 135 mmhg 이상이거나이완기혈압이 85 mmhg 이상인상태로 2), 원인에따라크게본태성고혈압과속발성고혈압으로구분할수있다. 본태성고혈압은전체고혈압의 90% 이상을차지하고있으나아직그발생기전이완전히규명되지않은실정이며, 속발성고혈압은신장질환, 내분비이상, 각종약제및임신등으로인해이차적으로발생되며, 전체고혈압의 10% 이내를차지하고있다 5,34). 대부분의고혈압은증상이없으나합병증에따라두통, 두중, 이명, 현기증, 피로감, 심계항진등이있으며, 고혈압으로가장흔히침범되는장기로는뇌혈관, 심장, 신장, 안저, 말초혈관등이있다 34). 고혈압을유발하는위험인자로연령, 비만, 염분, 스트레스, 유전, 혈청지질, 흡연, 알콜등을들수있으며, renin-angiotensin 계의활성에의한혈관수축과이에따른 aldosterone 분비에의한혈장량증가, 교감신경계활성도증가에의한심박수및심박출량증가등이발병기전으로밝혀져있다 35). 혈압조절은각각특정한작용을하는신경성조절기전과체액성조절기전이서로연관되어이루어진다. 신경성혈압조절기전은매우강력하고, 신체의상황에따라신속하게전신에분포되어있는혈관을축소또는확장시켜혈관의저항을변화시키고, 심장의박출량에도영향을미쳐혈압을조절한다. 혈압을조절하는중추는연수에있는심장중추와혈관운동중추이다. 심장조절중추의원심신경에는교감신경과부교감신경이있고, 이들은서로길항작용에의해심장기능을조절한다. 혈관운동중추에들어오는자극은대동맥궁과경동맥궁에있는압력수용기 (baroreceptor) 에서시작되는데혈압이높아지면경동맥동및대동맥의혈관벽이늘어남으로써압력수용기가자극받고, 이는혈 관운동중추에전달되어다시심장과혈관에작용하여혈압을떨어트린다 36). 신장또는부신피질에서분비되는호르몬에의하여혈압이조절되는것을체액성조절이라고한다. 신장의혈류량이감소되면신장의세뇨관부분에서 renin이라는호르몬이혈관내로분비된다. renin은혈장내의 angiotensinogen과결합하여 angiotensin Ⅰ을형성하고, 이는다시 angiotensin converting enzyme(ace) 에의하여 angiotensin Ⅱ로전환된다. Angiotensin Ⅱ는혈관수축작용이있어혈압을상승시키며부신피질에도작용하여 aldosterone의분비를촉진한다. Aldosterone은신장의원위세뇨관에서 Na + 의재흡수와 K + 의분비를촉진한다. 그결과 Na + 의축적으로삼투농도가높아져소변의양은감소하고혈액량은증가하여혈압을상승시킨다 37,38). 현재사용되고있는고혈압치료제에는교감신경수용체차단제, 혈관확장제, 전환효소억제제, 칼슘통로차단제및이뇨제등이있으나혈압을높이는제반요인들을개선하는비약물요법즉규칙적인운동, 금연, 저염식, 식이요법에의한체중감소, 과다한음주의제한, 명상등을이용한이완요법이강조되고있다 5). 한의학에서는고혈압이란명칭은없으나이에준하는증후로中風, 頭痛, 眩暈, 心火亢炎, 肝風內動등을들수있으며, 특히中風의原因은고혈압과밀접한관계가있다 39). 본실험에서사용한加味順氣活血湯은中風의前兆證, 卒中證, 後遺症에사용되는順氣活血湯에고혈압과관상동맥경화로인한심장질환을치료한다고보고되어진防風 7), 石菖蒲 8), 竹茹 9,10), 丹蔘 11), 牛膝 12,13), 山査肉 14), 龍骨, 牡蠣 15-17), 釣鉤藤 18) 19), 豨簽 6) ( 酒蒸 ) 을加味하였다. 順氣活血湯처방의構成藥物에대한效能을살펴보면, 香附子는理氣解鬱, 止痛調經하고, 烏藥은順氣開鬱, 散寒止痛하며, 橘皮는理氣調中, 燥濕化痰하고, 半夏는燥濕化痰, 降逆止嘔, 消痞散結하며, 赤茯苓은行水, 泄利濕熱하고, 蒼朮은燥濕健脾, 祛風散寒하며, 桔梗은宣肺利咽, 祛痰排膿하며, 枳殼은理氣行痰, 消積하고, 白芷는祛風除濕, 通竅止痛, 消腫排膿하며, 木香은行氣止痛, 溫中和胃하며, 生薑은解表散寒, 溫中止嘔, 化痰止咳하고, 甘草는諸藥을調和하는작용이있다 40). 이에저자는加味順氣活血湯이고혈압에미치는효과를실험적으로규명하고자 DOCA-salt를투여하여고혈압을유발시킨흰쥐에게加味順氣活血湯추출물을경구투여하여세포독성및간에대한독성검사를통한안정성을검증한뒤체중과혈압및심박수의변화, 혈중 aldosterone과 catecholamine 함량및전해질함량의변화, 신장기능의변화를측정하여유의한결과를얻었기에보고하는바이다. KSHT의안전성검증을위하여정상군과대조군및 KSHT 를투여한실험군의 hfcs의세포생존율과간기능측정지표인 GOT와 GPT를측정한결과, 세포생존율에서투여군의 500 μg / ml농도에서만 88.5 ± 9.2% 로측정되고나머지농도에서는 90% 이상의수치가측정되었으며, GOT, GPT의수치에서도정상범위의수치로나타나약물에의한간독성은발견되지않았다. 활성산소는짧은시간이나마일정시간동안혼자독립적으로존재할수있는능력이있는물질이며반응성이강한물질이다. - 167 -
이영헌 전상윤 홍석 조국령 김남욱 정종안 강성인 특히산소는생명활동을위해서호흡을통해흡수되어그중 95% 는영양소를산화시켜 ATP로만들어에너지로사용하며생명활동에쓰이지만, 나머지 5% 는활성산소로서변환되어유전자, 효소, 세포막등을파손하는유해성을보인다. 활성산소는생체세포를공격하여지질과단백질핵산 (DNA, RNA) 을파괴하고, 여러가지효소기능들을저해하여질병 ( 암과노화 ) 을촉진한다 41,42). 활성산소종 (reactive oxygen spices, ROS) 은일반적으로정상적인호기성대사과정부산물로서산소의부분적인환원에의해서생성될뿐만아니라리간드-수용체에매개되는신호전달과정에의해서도생성된다고알려져있는데, 이것에노출되어나타나는산화스트레스는모든생물체에서심각한기능손상이나질병을유발시킨다 43). DPPH는그자체가매우안정한 free radical로서 517 nm에서특징적인광흡수성을나타내는보라색화합물이다. 이 radical은알콜등의유기용매에서매우안정하며, 특히여러가지항산화기작중 proton-radical scavenger에의하여탈색되기때문에항산화활성을육안으로도쉽게관찰할수있는장점이있다 44). 활성산소는그자체로혈관내피세포를파괴하거나 LDL-콜레스테롤을공격해서산화시키는등의기전으로혈관협착을야기하고, Ca 2+ 의유입을증가시켜고혈압을유발한다 41,42). KSHT의항산화활성에미치는영향과 ACE 저해능에대해알아보고자 DPPH 소거능과 ROS의감소효과, ACE 저해활성을측정한결과, DPPH의소거활성효과가농도의존적으로증가함을확인하였고, ROS의감소효과를측정한결과대조군에비하여 KSHT 투여군에서 ROS의생성량이감소하는효과를나타내었다. 또한 ACE 저해능에서도농도의존적으로저해효과가증가함을확인하였다. 이는 KSHT가활성산소의항산화활성을저해하고활성산소와 ACE에의한고혈압유발기전에영향을미칠것으로사료된다. DOCA-salt 고혈압유발흰쥐의체중및장기에미치는영향을측정한결과, 체중은정상군에비하여대조군에서 420.8±27.9 g으로나타나유의성있는감소를보였으나 KSHT 투여군에서는 476.0±25.2 g으로나타나대조군에비해유의성있게증가하여정상군에가까운체중을나타내었다. 심장과신장의무게를측정한결과심장의무게에서는정상군, 대조군 KSHT 투여군에서유의성있는변화를보이지않았으나, 신장의무게는대조군에서유의성있는증가를보인반면 KSHT 투여군에서는대조군에비해유의성있게감소하여정상군에가까운신장무게를유지하였다. 또한정상군과대조군, KSHT 투여군의혈압및심박수를측정하였는데혈압은대조군이 175.2±5.4 mmhg인데비하여 KSHT 투여군이 147.0±7.0 mmhg으로나타나유의성있는강압효과를보였으며, 심박수는대조군은 419.8±36.3 times/min으로나타난반면 KSHT 투여군은 336.1±7.1 times/min으로나타나대조군에비하여유의성있는감소효과를나타내었다. 이처럼 KSHT 투여군이체중과심장과신장의무게를정상군에가깝게유지하면서도심박수를저하시키고혈압을하강시키는작용에있어대조군에비하여유의성있는효과를보인것으로미루어보아加味順氣活血湯이부분적으로혈압 조절기전에영향을미칠것으로사료된다. Aldosterone은신의원위세뇨관과집합관에작용하여 Na + 재흡수와 K + 배설을촉진함으로서세포외액과혈장량을적절하게유지하는역할을하고있다. 따라서 aldosterone의과잉은 Na + 유지, K + 소실, 세포밖액체부피의팽창및고혈압을일으키는원인이된다 38,45). Renin-aldosterone system에관련된혈압상승억제에관련된효과를알아보기위하여 plasma aldosterone에미치는영향을측정한결과, KSHT 투여군에서대조군에비하여유의성있는감소효과를나타내었다. 이는加味順氣活血湯이신성 hormone 에의한혈압조절체계에작용하여혈압상승을억제하는것에관련된것으로사료된다. Dopamine, norepinephrine, epinephrine과같은 catecholamine은주로교감신경, 부신수질, 중추신경계에분비되어중추신경계및말초신경계의신경전달물질로작용한다. Catecholamine은주로심혈관계에작용하여체액량과전해질의조절작용을하고혈관수축을촉진하고, renin 분비에간접적으로관여하며, 심박출량을증가시키고긴장성혈관수축을유발하여혈압을상승시키는것으로보고되고있다 35,36,46). Dopamine은뇌에서분비되는 catecholamine으로저혈압상태에서직접적으로심근의 β-수용체에대한작용과교감신경말단에서간접적으로 norepinephrine을유리하여심근수축력상승효과를나타낸다 35). 부신수질에서분비되는 norepinephrine과 epinephrine은직접적으로아드레날린성수용체를자극하여혈압을상승하고혈류량을조절하여혈액순환을유지한다 45). KSHT의신경성혈압조절에대한작용을알아보기위해혈장내의 catecholamine 중 dopamine, norepinephrine, epinephrine의농도를측정하였다. 혈장분석결과대조군에서는각각의 catecholamine이정상군에비해유의성있는증가를보였고 KSHT 투여군에서는대조군에비하여유의성있는감소를보여주었다. 이는加味順氣活血湯이자율신경계를안정시키면서심근의 β-수용체의흥분을억제하여심근수축을억제하고아드레날린성수용체를억제하여혈압을하강하는효과를보이는것으로사료된다. 세포막에는 sodium 펌프외에도, sodium/calcium 교환기전이존재한다. 이교환은세포내의어느방향으로도이루어질수있는데, sodium pump의억제에의하여세포내 sodium 농도가증가하면, 전기화학적경사에의해서 sodium이세포외로배출되고, calcium이세포내로유입되는교환이활발해지면서세포내 calcium 농도가상승한다 46). 이는 calcium-calmodulin 결합체를생성하며혈관을수축시키고, 신경세포내의 calcium 농도가상승하면 norepinephrine의분비가증가되며분비된 catecholamine의재흡수가억제된다. 따라서결과적으로교감신경의항진으로나타나게되고혈압은상승하게된다. 이로인해혈압의상승을억제하기위해항고혈압약물 (Ca 통로차단제 ) 을사용하여 Ca 2+ 의세포내유입을억제하면혈중 Ca 2+ 의수치는증가하지만혈압은하강하는것으로알려져있다 47,48). 대조군과 KSHT 투여군과의전해질변화를비교한결과, - 168 -
加味順氣活血湯이 DOCA-salt 로유발된高血壓흰쥐에미치는작용기전 sodium의농도는대조군의경우 150.1±1.0 meq/l, KSHT 투여군 144.5±3.0 meq/l로, potassium의농도는대조군 5.8±0.2 meq/l, KSHT 투여군 5.3±0.3 meq/l로, chloride의경우대조군 104.3±0.5 meq/l, KSHT 투여군 101.1±0.9 meq/l로각각대조군에비하여유의성있게감소하였으며 calcium의경우대조군 0.99±0.11 meq/l, KSHT 투여군 1.29±0.03 meq/l로대조군에비하여유의성있는증가를보였다. 이는加味順氣活血湯이고혈압기전과관련된전해질의작용에반응하는것으로생각되며, 또한, 혈중 Ca 2+ 의농도가상승했다는것은 Ca 2+ 의세포내유입이차단되어혈압상승이억제되었다는사실을나타내는근거가되는것으로사료된다. 간에의해독성 purine에서전환된혈청중, uric acid는신장에서사구체여과와세뇨관에서의재흡수에의해조절되며, 통풍, 신장질환, 백혈병, 임신중독증등의질병에의해증가된다 37). Blood urea nitrogen(bun) 은혈중에존재하는 urea 내질소를표현한것으로신장질환과관계가깊은질소대사산물로신장기능의대표적지표이고, creatinine은신장의배설기능에관련이있기때문에신혈류량감소, 신사구체여과율이감소할경우에증가되는데신장질환과의상관성이높아혈청 creatinine 농도는간단한신장기능의지표로서중요시되고있다 49,50). 본실험에서 KSHT의신장기능에미치는영향을알아보고자혈청중 uric acid, BUN 및 creatinine의농도를측정한결과, KSHT 투여군에서는모든항목에서대조군에비하여유의성있는감소효과를나타내어지속적인 DOCA-salt의투여로인한신장기능장애를부분적으로막을수있는것으로사료된다. 이상의결과들을종합해보면, 加味順氣活血湯은농도의존적인 DPPH 소거능증가와 ROS 감소및 ACE 저해효과를나타내었고, aldosterone 및 catecholamine 함량을유의하게감소시켰다. 전해질대사에있어서도 Na +, K +, Cl - 를감소시키고 Ca 2+ 를증가시킴으로서혈압강하효과가있는것으로파악되었고, 또한 uric acid 및 BUN, creatinine 또한유의하게감소시켜신장기능회복에도효과가있는것으로파악되었다. 따라서加味順氣活血湯은고혈압의치료및예방에유용하게활용될수있을것으로사료되며, 향후보다심도있고지속적인연구가필요하리라생각된다. 결론 加味順氣活血湯이고혈압에미치는영향을알아보기위하여 DOCA-salt를투여하여고혈압을유발시킨흰쥐에게加味順氣活血湯추출물을경구투여한후혈압및심박수의변화, 혈장내 aldosterone과 catecholamine 함량의변화, 전해질변화와신장기능의변화를측정하여다음과같은결론을얻었다. 加味順氣活血湯에의해 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 소거능은농도의존적으로증가하였고, Reactive Oxygen Species (ROS) 생성량은농도의존적으로감소하여항산화활성효과를나타내었다. 加味順氣活血湯에의해 ACE 저해능은농도의존적으로증가하였다. 加味順氣活血湯은 DOCA-salt 유발고혈압백서에서유의성있는혈압강하와심박동수감소효과를나타내었 다. 加味順氣活血湯은부신피질 hormone 중 aldosterone의함량을유의성있게감소시켰다. 加味順氣活血湯은 catecholamine 중 dopamine 및 norepinephrine, epinephrine 함량을유의성있게감소시켰다. 加味順氣活血湯은혈중 Na +, K +, Cl - 의농도는유의성있게감소시켰으며, Ca 2+ 는유의성있는증가효과를보였다. 加味順氣活血湯은혈중 uric acid 및 BUN, creatinine 함량을유의하게감소시켰다. 이상의결과로미루어보아加味順氣活血湯은여러기전에의해혈압강하효과가있어임상에서고혈압의예방과치료에응용될수있으리라사료된다. 참고문헌 1. 김기훈, 문재우. 공중보건학. 서울, 정문각, pp 337-347, 1999. 2. A.V. chobanion, G.L. Bakris, H.R. Black, W.C. Cushman, L.A. Green, J.L. Izzo, D.W. Jones, B.J. Materson, S. Oparil, J.T. Wtight, E.J. Roccella and National High Blood Pressure Education Coordinating Committee. The Seventh Report of the Joint National Committee on Prevention, Direction, Evaluation and Treatment of High Blood Pressure. JAMA. 289: 2560-2571, 2003. 3. 의학교육연수원편. 가정의학 3판. 서울, 서울대학교출판부, pp 414-425, 2001. 4. 굴송백외. 실용중의심혈관병학. 북경, 과학기술문헌출판사, pp 347-354, 1993. 5. 전국한의과대학심계내과학교실편. 심계내과학. 서울, 서원당, pp 189-199, 1999. 6. 김영훈. 청강의감. 서울, 성보사, pp 224-225, 2001. 7. 盧昇奎姜成吉. 防風水鍼이高血壓및高脂血症에미치는影響. 慶熙韓醫大論文集 8: 157-170, 1985. 8. 김재환. 石菖蒲의心筋細胞 calcium-overload 억제에미치는영향. 경희대학교대학원, 2006. 9. 강태운. 竹茹竹葉및竹瀝이高脂血症에미치는影響. 대전대학교대학원, 1995. 10. 문경숙. 太白 神門및大敦 湧泉에시술한竹茹藥鍼이 2K1C 고혈압白鼠의혈압에미치는영향. 동신대학교대학원, 2006. 11. 유장현. 丹蔘의高血壓白鼠血壓에미치는影響. 원광대학교대학원, 2001. 12. 정옥미. 우슬의특이적인진통작용에관한연구. 전남대학교대학원, 1998. 13. 김정일. 國産牛膝의 ecdysterone 抽出과그生理活性에관한硏究. 서울대학교대학원, 1983. 14. 채종구. 내피세포 Nitric Oxide 유리를통한山사의혈관이완작용. 東國大學校大學院, 2002. 15. 김태중, 임희용, 관민아, 변준석, 서정철, 한상원. 小建中湯加龍骨, 牡蠣의항산화효과, 세포활성및유전자발현에미치는영향. 大韓本草學會誌 18(2):1-12, 2003. 16. 김상수. 桂枝加龍骨牡蠣湯의效能에관한實驗的연구. 경희 - 169 -
이영헌 전상윤 홍석 조국령 김남욱 정종안 강성인 대학교대학원, 1994. 17. 우병철. 시호가용골모려탕가감방이고혈압및고지혈증에작용하는효과. 경희대학교대학원, 1997. 18. 강형원, 박진성, 류영수, 이건목. 釣鉤藤이酸素自由基에의하여損傷된培量脊髓感覺神經節細胞에미치는影響에關한硏究. 동의신경정신과학회지 11(1):1-18, 2000. 19. 조현모. 豨簽이血壓과血糖에미치는影響. 대전대학교대학원, 1998. 20. 韓德熙. 肝陽上亢方이高血壓에미치는影響. 大田大學校大學院, 2005. 21. 申皇秀. 加味導赤散이高血壓에미치는影響. 大田大學校大學院, 2004. 22. 유병찬, 오영선, 김윤식, 설인찬. 加味鷄血藤湯이高血壓에미치는影響. 대한한방내과학회지 25(4):52-64, 2004. 23. 金鍾仁. 地黃飮子가腦損傷및高血壓에미치는影響. 大田大學校大學院, 2001. 24. 이기상외. 瀉心湯이白鼠의血壓및局所腦血流量에미치는影響. 대한한의학회지 21(3):417-424, 2001. 25. 南昌圭. 凉膈散火湯이高血壓및高脂血症에미치는影響. 大田大學校大學院韓醫學科碩博論考 2: 226-228, 1999. 26. 林俊植. 滲濕湯이高血壓및高脂血症에미치는影響. 大田大學校大學院韓醫學科碩博論考 21(3):417-424, 2000. 27. 박창국. 順氣活血湯및加味順氣活血湯이瘀血病態模型에미치는영향. 東西醫學, 23(2):1-15, 1998. 28. 손원택. 順氣活血湯이흰쥐의骨折癒合에미치는影響. 大田大學校大學院, 2002. 29. 이기서. 順氣活血湯이高脂血症病態모델에미치는影響. 大田大學校大學院, 2005. 30. 정영득. 順氣活血湯의腦虛血抑制效果에관한實驗的硏究. 동신대학교대학원, 2005. 31. The use of the stable free radical diphenylpicryl- hydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Philip Molyneux. Songklanakarin Journal. 36(2):211-219, 2004. 32. Reactive oxygen species: role in the development of cancer and various chronic conditions. Gulam Waris and Haseeb Ahsan. Journal of Carcinogenesis. 14(5):1-8, 2006. 33. Cushman, D.W., Cheung, H.S., Sabo, E.F., Ondetti, M.A. Development and design of specific inhibitors of angiotensin-converting enzyme. Am J Cardiol. 49(6):1390-1394, 1982. 34. 이영우외. 고혈압. 서울, 고려의학, pp 11-33, 112-115, 167-195, 2000. 35. Kurt, J. Isselbacher. 해리슨내과학. 서울, 정담출판사, pp 446-455, 1202-1207, 1997. 36. 김종규. 생리학. 서울, 정문각, pp 46, 300-301, 1998. 37. Stuart Ira Fox. 생리학. 서울, 라이프사이언스, p 305, 405, 2004. 38. 성호경, 김기환. 생리학. 서울, 의학문화사, pp 374-376, 1996. 39. Ignarro, L.J., Kadowitz, P.J. The pharmacological and physiological role of cyclic GMP in vascular smooth muscle relaxation. Annu Rev Pharmacol toxicol. 25: 171-191, 1985. 40. 전국한의과대학본초학교실. 본초학. 서울, 영림사, pp 130, 193-195, 276-277, 290, 302-306, 369-370, 409, 419-420, 427-428, 491-462, 503-504, 513-514, 537-538, 580-581, 626-627, 1999. 41. Gulam Waris, Haseeb Ahsan. Reactive oxygen species: role in the development of cancer and various chronic conditions. Journal of Carcinogenesis 5(14):1-8, 2006. 42. 대한병리학회. 병리학. 서울, 고문사, p 995, 1998. 43. 장호희, 김선영, 이상열. 산화스트레스에의존한식물및진핵세포 2-시스테인퍼록시레독신의기능조절. 식물생명공학회지 33(1):1-9, 2006. 44. Blois, M.S. Antioxidant determination by the use of stable free radical. Nature. 181: 1199-2000, 1958. 45. 대한내분비학회. 내분비학. 서울, 고려의학, pp 532-545, 1999. 46. GianPaolo Rossi, Alberto Rossi, Alfredo Sacchetto, Edoardo Pavan, and Achille C. Pessina. Hypertensive Cerebrovascular Disease and the Renin-Angiotensin System. Stroke 26: 1700-1706, 1995. 47. S.M. Eleff, Y. Maruki, L.H. Monsein, R.J. Traystman, R.N. Bryan, R.C. Koehler. Sodium, ATP, and intracellular ph transients during reversible complete ischemia of dog cerebrum. Stroke 22: 233-241, 1991. 48. 曺奉鉉. 加味四物湯이高血壓에미치는影響. 大田大學校大學院, 2005. 49. 이귀녕, 권오헌. 임상병리파일. 서울의학문화사, pp 95-98, 102-105, 373-374, 2000. 50. 대한임상의학연구소. 알기쉬운건강진단해설. 서울, 의학문화사, pp 38-39, 103-104, 1994. - 170 -