동위원소검사학 강의록 7

동위원소검사학강의 6 7. 방사면역측정법 Radioimmunoassays(RIA) 8. 정도관리 (Quality Control ; QC) 1

7. 체외검사법 (In Vitro Test) 방사성동위원소를시험관내조작만으로 RI를 trace로사용하여혈액내의 Hormone, Drug 등의미량물질을측정하는검사법시작 : 1959. Rosalyn Yalow, Solomon Berson 혈중의 Insulin측정주로 γ선을방출하는핵종으로 125 I 사용 ( 혹 131 I를사용 ) 59 Fe, 57 Co 등특정물질의측정에사용 β선을사용하는핵종 3 H, 14 C milligram(10-3 g), microgram(10-6 g) 측정에서 nanogram(10-9 g), picogram(10-12 g) 측정가능 protein, hormone, vitamin, drug, tumor markers RI(Radioisotope) 를이용한체외검사법의종류경쟁적방사측정법 (competitive radioassay) 방사면역측정법 (Radioimmuniassay: RIA) 경쟁적단백결합측정법 (competitive protein binding assay: CPBA) 방사수용체측정법 (Radiorecepter assay: RRA) 비경쟁적방사측정법 (noncompetitive radioassay) 면역방사계측법 (immunoradiometric assay: IRMA) 직접포화분석법 (Direct saturated analysis: DSA) 2

1. 경쟁적방사측정법 (Competitive radioassay) 방사면역측정법 (Radioimmunoassay : RIA) : 방사성물질을표지시킨호르몬과검체중의비표지호르몬이항체에경쟁적으로결합하는것을이용한방법경쟁적단백결합측정법 (competitive protein binding assay : CPBA) : 항체대신에호르몬과특이적으로결합하는단백질을사용하는방법방사수용체측정법 (radiorecepter assay : RRA) 세포막등에있는수용체를이용한방법 3

1). 방사면역측정법 (Radioimmunoassay : RIA) (1). 원리항체에대한비표지항원과표지항원의사이에서일어나는경쟁반응 (competition) 1. 측정하는물질을항원으로하고항원에대한항체를미리동물을이용하여만들고항원에방사성동위원소를표지한표지항원 Ag 을만듦 2. 검체의항원과일정량의표지항원을일정량의항체와반응시켜항원. 항체 (Ag+Ab) 와표지항원. 항체 (Ag +Ab) 를만든다. 3. 결합형 (bound form :B) : 항체와결합한것유리형 (Free form ;F) : 항체와결합하지않은항원과표지항원표지항원과유리항원을어떤방법으로분리, 결합형의방사능측정 4. 항원의양에따라표지항원이항체와결합하는비는항원이많으면표지항원이항체와결합하는양은적어지고반대로항원의양이적으면표지항원은항체와많이결합한다. 방사면역측정법의기본원리 Ag( 방사성표지항원 + Ab( 특이항체 ) Ag Ab( 표지항원 - 항체결합체 ) + Ag( 비표지항원 AgAb

RIA procedure (example) 구분가나다라마바사아 No 항원 Ag 표지항원 Ag 항체 Ab 항원표지항원 Ag+ Ag 결합항원 AgAb AgAb 유리항원 Ag. Ag 결합형 B/T(%) AgAb 유리형 F/T(%) Ag 1 2 3 4 5 6 7 8 0 25 50 200 400 900 (500) 125 150 200 300 500 0 (600) 0 25 50 200 400 900 (500) 80 (/125) 67 (/150) 50 (/200) 33 (/300) 20 (/500) 10(/0) 17 (/600) 0 20 (25/125) 33 (50/150) 50 (/200) 67 (200/300) 80 (400/500) 90 (900/0) 83 (500/600) 가 : 항원의숫자, 1-7까지표준항원을넣고, 8에검체, 1에는넣지않음나 : 표지항원 (1-8) 동량표지항원 ( Ag) 의 F/T = 항원 F/T 다 : 항체의수, 1-8 동량표지항원 ( Ag) 의 B/T = 항원 B/T 라 : 항원과표지항원을더한전체의수마 : 항원과표지항원이항체와결합할수있는숫자바 : 유리항원의숫자사 : 표지항원이항원과비례하여항체에결합한결합형의숫자아 : 표지항원과비례하여항체에결합하지못한유리형의숫자 5

RIA 측정물질 구분적용측정물질 단백, Hormone 비단백 Hormone 이외물질 뇌하수체 칼슘대사 Pancrease 소화관 혈관 태반 Steroid Thyroid Drug Enzyme Virus Tumor Markers ACTH, ADH, FSH, LH, GH, Prolactin, TSH Calcitonin, PTH Insulin, C-peptide, Glucagon Gastrin, Secretin Angiotensin I, Angiotensin II HCG, hpl Aldosterone, Androsterone, Cortosol, DHEA, Estradiol, Testosterone T3, T4, free T4, TSI, Cyclosporin, Digoxin, Gentamycin, vancomycine Elastase, PAP, Pepsinogen I, Pepsinogen II HBsAg, HBsAb, HBeAg, HBeAb, AntiHBc, HDV Ab, HCVAb AFP, CEA, CA19-9, CA125, CA15-3, CYFRA21-1, NSE, SCC, CA72-4 단백질성분 IgE, RAST, TBG, B2-MG, Ferritin, Myoglobulin, Antibody 기타 anti-ds-dna, Vitamin B12, Folate 6

(2). 특성 1. 민감도 (Sensitivity) 표지항원이높은비방사능 (specific activity) 을지녀야한다비방사능 : 한분자내에몇개의방사성표지물이들어있는가를나타냄비방사능 많은방사선을내어서계측이쉽고낮은농도계측가능반응시간, 온도, 검체의양 2. 특이성 (Specificity) 항원항체결합의관계처럼특이하게다른물질을구별할수있는성질 3. 교차반응 (Cross reaction) 측정하려는물질과유사물질이간섭하는정도 4. 재현성 (Reproducibility) 다음의측정에도같은값을나타내는정도 5. 회수율 ((Recovery rate) 측정물질에어떤정확한함량을첨가하여측정그후첨가량이회수되는율 7

(3). RIA의조성 RIA를하기위한필요조건 a. 순수한항원을얻을수있을것 b. 항체를생산할수있을것 c. RI표지가가능한것 d. B. F 분리가정확하게이루어질것 1. 항체의생성 a. 면역항원의조건 RIA에사용하는항혈청은특이성이높고친화성이우수한항체를갖는것중요항원으로투여하는물질은표지항원과표준물질이순수하다면불순물에대한항체를만들었다하더라도측정에영향을주지않는다. b. 면역에사용하는동물, 주사및채혈방법몰모트, 토끼가흔히사용. 주사부위는피내, 피하, 복강내항원에 adjuvant를충분히혼화, 완전한 oil 유탁액을만들어 2-3주간격으로수회주사. 항혈청의채취는마지막주사 2주후에시행최근에는단클론성항체 (monochronal Ab) 를흔히사용. c. 항체가측정일정량의표지항원과다양한정도로희석한항혈청을가해서반응시키고얻어진 B/F의비가 1이되도록항혈청의희석배수를구하여이것을 항체가로한다. 대개이농도의항혈청이 RIA 에사용 8

2. 표지항원제작표지물질에요구조건 i). 표지에의해생화학적성질은변화해도좋으나항체와반응성은변화없어야한다. ii). 미량의항원을검출하기위해서는방사능이충분히높을것위와같은목적에가장적합한방사성동위원소 --- 125 I Iodine은단백을구성하는아미노산중 tyrosine, cysteine, tryptophan, 황화수소기 (sulpahydryl) 등과결합할수있다 Tyrosine기가없는경우에는화학적으로 tyrosine기를도입해서요오드화하던가또는미리요오드화한화합물을만들어펩티드호르몬의아미노기에결합시킨다 a. 방사요오드화 (radioiodination) 표지항원제작법현재 chloramin-t법이가장많이사용 Na- 125 I을 chloramine-t로산화시키고 125 I를유리시켜이것을 tyrosine기와결합시키는방법 b. 표지물질의정제위의방법으로방사성요오드를단백에반응시킨다음, 신속하게반응하지않은방사성요오드와변성단백을표지단백에서분리정제할필요가있다. 정제법으로는 gel여과법이흔히사용되고있다. 9

3. 결합형 (Bound form) 과유리형 (Free form) 의분리법 i). 결합형 (Bound form) 과유리형 (Free form) 을정확하게분리 ii). 방법이간단해야하고재현성이높아야한다 iii). 시간이적게걸리고특별한장치가필요하지않아야한다 iv). 다량의검체를쉽게처리할수있어야한다. B.F 분리법종류 염석법 (salt precipitation) 이중항체법 (double antibody method) PEG 법 (polyethylene glycol) 흡착법 (absorption method) 투석법 (dialysis) 고상법 (solid phase method) 효소법 (enzymatic method) 전기영동법 (electrophoresis) Chromatography법 Chromato 전기영동법 (chromato electrophoresis) Gel여과법 (gel filtration) 10

각종 B.F 분리법의장단점 방법장점단점제한 흡착법 빠르다 Dextran-charcoal 경제적이다 떨어진다 반응시간, 온도에영향 Silicate 편리하다 비특이적 이온교환수지 빠름. 싸고편리 유리항체의분리 분자량이용법경제적느리다적은분자에좋다 단백질변성법 ( 알코올,PGE) 경제적남는다적은분자에저항 이중항체법 특이하다 비경제적 시간낭비 고형상항체법편리비경제적적은분자에한계 11

a. 고형상법 (Solid Phase Method). 항체를고체표면에피복시키고항원 - 항체반응을일으키면 B/F 분리반응이일어나면서동시에이루어지게되므로고체와액체를분리하여쉽게측정할수있다. 용액속의방사성동위원소를씻어내면끝이다고체상 : 세파덱스, 플라스틱, 폴리에틸렌, 셀룰로스, 폴리아크로마이드등. bead, tube disc 등 항체를고상체의표면에피복시키고단순히표지항원, 비표지항원을여기에경합시키는방법 항원과항체를반응시킨다음방사성동위원소로표지된항체 (2nd Ab) 를반응시키는 Sandwich method 12

b. 이중항체법 (Double Antibody Method) 항원항체반응에이용된항체에대하여다시 2nd 항체를만들어반응 항원 - 항체 ( 제 1)-2nd 항체복합체가침전되도록하는방법 Ag AgAb AgAb 2nd Ab, 2nd Ab ( 상층제거 ) + Ab + 2nd Ab Ag AgAb AgAb 2nd Ab(bound form), 침전 AgAg(free form) 1st reaction Ag-Ab reaction Add 2nd Antibody 4 reaction 1,000g centrifuge 상층액제거 count 비교적간단, 다량처리에용이 2nd 항체가많이소모비싼편, 시간이많이걸림 13

c. 흡착법 (Absorption Method) 여러종류의흡착제를이용, 측정하려는물질의유리형 (F) 을흡착시킨다. 결합정도는형태, 흡착제의표면면적, 성질, 항원의크기, 전기적성질, 반응액의단백질농도, 이온농도,,pH에따라달라진다. Dextran, 단백질로피복한 active charcoal( 활성탄 ) 을가장많이사용한다. 실리카, 셀룰로스, 이온교환수지, 세파덱스, 겔등이이용 완전하고빠르며재현성이높고시행하기가쉽다. 유리형은바르게흡착되어다시떨어져나올가능성이적다. 단점은용액안의단백질농도와온도에민감하다. 14

d. 염석침전법 (Salt precipitation) 염 (Salt) 이나특수한용매 (polyethylene glycol : PEG) 를이용항체결합형을침전시키는방법황산암모늄 (NH 4 ) 2 SO 4 등의염을첨가하면고분자의항체결합체는침전되므로결합형과유리형을분리할수있다. PEG : 25% 차거운 PEG첨가, 4, 30mins 1,000g로 centriguge 후상청액버리고측정 (PEG: Polyethylene glycol). 이온농도, 온도등에영향 e. 전기영동법 (Electrophoresis) B/F 의분리를종이의흡착성의차이와 gamma globulin 의전기영동에의한이동성을이용 Ag-Ab complex 들은전기적힘과물의이동에의해끌려가서 B/F 가분리되며결합형은용매이동전단 (solvent front) 으로가게된다. Bromphenolblue 등의지시약으로전기영동시킨후방사능스캔으로위치를정한다음종이를잘라서계측하여 B/F 를알게된다. 최근에는특수한목적이외에는거의사용하지않는다. f. 복합분리체계두개의침전시약 ( 제 2 항체와 PEG) 을함께낮은농도로사용된다. 2nd Ab 의비싼가격과긴반응시간의단점을제거하고 PEG 의높은점성도문제를해결해주는보완방법 2nd Ab 에황산암모늄의혼합물을쓸수도있다. 15

(4). RIA 의장점과문제점 1. 장점 감도, 정밀도, 정확도및특이성이높으며최근에는측정방법의자동화로 다수의검체를신속히처리할수있다 2. 문제점 a. 생물활성과의해리 항원 - 항체반응을이용하는측정법이기때문에실제의생물활성을 반영하고있지않을가능성이있다. b. 측정물질에대한항체의영향 시료중에항체가함유되어있으면표지호르몬은 kit 에첨가되어있는항체뿐만아니라, 시료중의항체와도결합한다. 16

2). 경합적단백결합측정법 (competitive protein binding assays : CPBA) 호르몬등의특이결합단백을이용 1. 원리어떤종류의 Hormone, Vitamin 등은생체내에서특이적으로결합하는단백질과결합하고있어서이단백질을항체대신에사용해서표지물질과비표지물질을결합시키는반응 RIA 법과원리적으로는같으며측정시에는측정하고자하는목적물질과결합하고있는단백질을분리할필요가있다. 2. CPBA 법의성립조건 a. 측정하고자하는목적물질의특이단백질이존재할것 b. 측정하고자하는목적물질의추출정제를할수있을것 c. 표지가가능할것 d. 결합형과유리형의분리가가능할것 3. CPBA Method 로측정할수있는물질 측정물질 T4 T3 Cortisol Vitamin-B12 Serum Iron 특이결합단백 티록신결합단백 (TBG) T3 결합단백 (TBG) Corticorsteroid binding globulin(cbg) 내인자 (intrinsic factor) Transferrin 17

3). 방사수용체측정법 (Radioreceptor Assays : RRA) RIA 와동일하지만항체대신에 Hormone 혹은약제의수용체 (,receptor) 를특이결합물질로이용한다. Hormone + 수용체 (receptor) ==== Hormone- 수용체 (receptor) 조건 1. 수용체를안정한상태로얻어야한다 2. Hormone 이생물학적활성 ( 수용체와의결합력 ) 을가진상태로유지할수있어야한다 3. 수용체와 Hormone 이결합할때이결합반응이안정되어있어결합후변화하지않아야한다 4. RIA 와같이 B/F 를분리할수있는방법이있어야한다. 18

2. 비경쟁적방사측정법 (Non competitive radioassay) 1). 면역방사계측법 (Immunoradiometric assay: IRMA) 검체중의항원을고상화항체 (bead, tube) 와결합시키고이어표지항체를 가해서결합하고있는항원과결합시킨다음유리표지항체를제거하고 방사능을측정하는방법 sandwitch 법이라고도한다 RIA 법의고형상법과비슷하며항원의양이많아야측정이되는관계로검체의양이 RIA 보다많이필요하고특히항체와결합할수있는부분이항원에 2 개이상있는분자에만적용이가능하기때문에큰분자의단백질에이용하기쉽다. 장점 a. 넓은측정범위 b. 우수한재현성 c. 용이한표지항체의작성 d. 고감도 e. 간편한조작 19

(1). 원리항원대신에항체에방사성동위원소를표지시키는방법. 항원의양에비례하여항체에결합한다. 항체를고정화한 bead, plastic tube 에항원 ( 미지검체 ) 을가하고다시 RI 로표지한항체 (Ab ) 를참가하면결합형인 Ab-Ag- Ab 이생성 결합형 (B, bound form) 과유리형 (F, free form) 분리, 방사능측정 Ab + Ag Ab-Ag + Ab Ab : Free form 제거 Ab-Ag- Ab (complex) Bound form 방사능측정 20

(2). 측정의실제 a. One step method 고상화항체에미지의검체 ( 표준액 ) 와 125 I표지항체를동시에혼합일정시간후에내용액을흡인세척, 결합한방사능을측정 b. Two-step method 고상화항체와검체를일정시간반응후내용액을흡인세척 125 I표지항체를가하여일정시간 incubation 후에흡인세척측정 (3). 특징 IRMA method에서의문제점 a. Hook effect 과잉된항원이존재하면 125 I표지항체는유리된항원에도결합하고항원의농도가너무높으면결합률이오히려저하되는경우가발생하는현상. Hook effect, 후지대현상 (postzone phenomenon) Two-step보다는 One-step법에서발생하기쉽다. 21

2). 포화분석법 (Saturation Analysis : SA) 어떤종류의 Hormone 이나 Serum iron 등은혈액중에각각의특이결합단백과결합하여순환하고있다. 그포화부분은담체단백질의일부이고반드시남은불포화부분을가지고있다. 그불포화도는병태나생리적상태에따라다르게온다. 혈청외부에서표지한방사성물질을혼합해서불포화부분에섭취되는비를봄에따라간접적으로 Hormone 또는 Serum iron 등의양을알고기능상태를파악할수있다. 섭취율 (%) = 흡착제에흡착된방사능량 (cpm) 처음넣어준방사능량 (cpm) (%) 22

1. T 3 섭취율 (T 3 uptake : T 3 U) Thyroid hormone 은 T 3 와 T 4 가있으며 ( 대부분 T 4, T 3 는일부 ) 이들은혈중 TBG(Thyroxin binding globulin) 에결합한상태로있다. TBG 는완전히포화된상태가아닌미결합부위가있으며이 TBG 에 125 I-T 3 를가하면 125 I-T 3 는미결합부위에결합한다. 125 I-T 3 를과잉으로첨가하면나머지는흡착제로흡착한다. 흡착제를취하여방사능을측정. T 3 와 T 4 양을간접적으로알수있다. 일정량의시료와 125 I-T 3 및흡착제를시험관에넣고 incubation Washing, 측정 T 3 섭취율 = (A) CPM X% (B) CPM 2. 불포화철결합능측정 (Unsaturated Iron Binding Capacity: UIBC) Serum iron 은 gamma-globulin 중에 transferrin 과결합하고있다. 결합부분은 transferrin 이약 1/3 정도, 남은부분은혈청불포화철결합능이둘의합을혈청철결합능 (Total iron binding capacity: TIBC) 이라한다혈청에 59 Fe 를 mix 후일정시간반응시켜 transferrin 에결합시킨후나머지 59 Fe 를흡착제에흡착시킨다. UIBC(μg/dl) = 흡착제에흡착된방사능량 (cpm) 첨가한철의양 (μg/dl) 처음넣어준방사능량 (cpm) 23

3. 비방사면역측정법 (Nonradioisotope Immunoassay) 방사성동위원소를표지하는대신에효소, 형광물질등을사용하여표지물질의활성을측정하는방법 비방사성면역측정법의종류 측정법효소면역측정법 (Enzyme immunoassay, EIA) 형광면역측정법 (Fluoro immunoassay, FIA) 화학발광면역측정법 (Chemiluminescent immunoassay, CLA) 화학발광효소면역측정법 (Chemiluminescentenzyme immunoassay, CLEIA) tracer 효소, 기질, 보효소형광물질화학발광물질효소 24

4. RIA Laboratory 에필요한장비 1). 시설 1. 사용시설 : 실험실, 작업실, 계측실 2. 저장시설 : 동위원소저장 3. 폐기시설 : 폐기함, 3 단탱크,( 폐수처리 ), hood 시설, 세척실 4. 오염검사실 : 오염검사 2). 기기 1 방사선계측기 : 감마선계측기, 베타선계측기, 방사능측량계 2 원심분리기 : 일반, 냉장 (4 ) 3Water bath: 4, 37 45 60 4 냉장, 냉동고 ; 냉장고 (4, -20 ), 냉동고 (-20, -80 ) 5 흡입기 : 진공펌프 (vacuum pump), 흡입기 (aspirater) 6 진탕기 ; 혼합기, 자석교반기, 교반기, 다량교반기 7 건조 : 건조기 8Balance : 일반, Micro 9RDW 재증류기, ph Meter, 초음파세척기 3). 기구및재료 1. Test tube 2. Pipette 3. Dispenser 4. 유리기구 5. 기타 4). Reagent 1. 방사면역측적용각종 kit 2. Buffer ; phosphate buffer 3. B/F분리용시약 4. 추출시약 : ether, hexane, HCl, 빙초산 5. 액체섬광체제조시약 (Beta counter 용 ) 6. 초자기구세척제 25

8. 정도관리 (Quality Control ; QC) 26

1. 검사실내의정도관리 1950 년 Levey & Jenning 화학검사결과치의변동이각시설마다차이, 편차발생이증명 평균과표준편차의관리도를작성하는것환자로부터채혈한시점에서결과치보고때까지의실험과정을객관적으로파악하고가능한부분을표준화하는것이오차발생방지에중요 27

2. 검체의관리 1). 채혈감염관리. 공복시. 일내변동이심한종목은영향이가장적은시간에채혈 2). 검체의운반 Hormone 의경우채혈후얼음컵에보관검사실로운반. 3) 검체의보관방사성동위원소를사용하기때문에경제적인이유, 검체를모아서검사. 냉동보관. 재융해를반복하면단백질의변질을초래. 각각나누어서보관 4). 혈청의분리 1 시간이내 500g 10mins centrifuge. 바로검사가안될경우, 냉장혹은동결보관. 5). 검체의성상 Hemolysis, Turbidity Insulin 의경우용혈된검체는낮은결과를나타내기도한다. 28

3. 기구의관리 1). Pipette 정도관리 ( 월 1 회검사 ) 1. 미량천평을이용하여용액의무게를달아보는법 2. 색소를이용. photometer 로측정 3. 방사성동위원소를분주, 방사선계측기로방사선의양을측정하는법검정하고자하는피펫으로 20 회이상되풀이분주하여감마선계측기로계측하여계수의변이계수가 1% 이내임을확인한다. 2). Dispenser 정기적인정밀도검증 3). Test tube 보통 10x80mm 사용 4). 기구의세척방사성동위원소가사용된팁은반드시폐기해야한다 29

6. Beta Counter 1. 매측정전에블랭크를계측하여오염여부를확인한다. 2. 3 H 비소광표준시료를 5분씩또는최소10,000계수가되도록 10회이상되풀이측정하여계수변이계수를측정한다. : 1% 이내임을확인한다.( 매주1회 ) 3. 3 H 비소광표준시료의붕괴표로부터시료의붕괴율 (dpm) 을계산하여 10회되풀이측정한계수평균값 (cpm) 을계산된붕괴율로나누어계수효율 (counting dfficiency) 을측정한다. 4. 3 H 소광표준시료 ( 색소광에따라 10개의시료를회소 10,000계수씩측정하여소광계수 ( 검체채널비또는전환외부선원스펙트림의소광에따른계수효율과의관계를구한다. 5. 소광보정곡선을표준으로시료로부터측정한계수 (cpm) 에서붕괴율 (dpm) 을계산한다. 31

7. 시약의관리 1) Standard 2). Labeled Antigen 반드시유효날짜확인. 활성도의손상의원인 1. 옥소원자의표지에의한손상 ( 구조의차이에의한활성의저하 ) 2. 방사선에의한손상 3. 표지화에사용된시약에의한화학적손상 4. 반응액에존재하는불순물에의한화학적손상 3). Antibody 4). 분리시약 32

8. 측정조건의관리 1). 검체의양 : 10μl이상의검체 2). 반응시간 : end point법일경우는장시간, 현재는단축법을많이사용 3). 반응온도 : 온도가높으면짧은반응시간온도가낮으면긴반응시간 4). Dilution : 높은수치일경우, Graph를벗어나거나, hook effect 발생시 5). Recovery test : 6). Sensitivity 7). Cross reaction 8). 방해인자 : 용혈, 혼탁혈청 9). Precision 10). 상관계수첨가시료측정치 - 첨가전측정치회수율 (%)= 첨가한량 9. Control serum 1). Kit 내관리혈청 2). 시판관리혈청 3). 자가 Pool 혈청 33

10. Normal range 1). 정상범위정하는방법건강인의 95.44%(M±2SD) 를포함하는농도범위 2). 참고치 (Reference value) 평균과표준편차를구한후 SD 가 ±3SD 범위를벗어나는결과는버리고다시평균과표준편차를구해서평균에서 ±2SD 범위를참고치로한다. 각시설마다정상범위를구해야하며가끔재검사실시, 수정 3). 정상범위의변동요인 구분요인세부요인 기술적요인 생리적개인간변동 생리적개인내변동 고유오차개인오차과실오차유전생활환경시간시간습관생리 측정방법, 측정기구, 기기측정기술과숙련도기록, 보고개인차, 성별, 인종지역, 기후, 음식습관, 흡연, 직업연령일일내, 일일차, 계절 ( 온도 ) 음식, 습관, 체위성주기, 임신 34

11. 정도관리의실제 1). 정밀도 (Precision) : 반복측정해서어느정도일치하느냐와관계 2). 정확도 (Accuracy) : 참값 (true value) 과밀접한관계 3). 표준편차 (Standard Deviation : SD): 각데이터가평균과얼마나차이를가지느냐를알려주는분산의양의제곱근. 데이터의퍼짐정도 ( 표준오차는샘플링을여러번했을때각샘플들의평균이전체평균과얼마나차이를보이는가를알수있는통계량평균이얼마나정확한지알수있다 ) 4). 변이계수 (CV) : 표준편차가평균치에차지하는퍼센트 (%) 결과의표준편차가크면클수록변이계수가커지고방법의정밀도가나쁘다. CV SD = X δ 는표준편차, χ 는평균을의미한다 35

6). 내부정도관리 Blank 측정오염여부확인, 영구표준시료로계측, 변이계수측정 7). 외부정도관리각검사실간의검사값의비교, 저농도, 중간농도, 고농도의검사 8). 정도관리의관리도정도관리도의작성 9). 검사의실수검체, 시약, 실험조작, 계산, 기록및보고 36

. 오차의체계적인원인규명방법 제 1 단계 제 2 단계 제 3 단계 문제점의구분 관련된사람모두문제점토의 기능성원인목록작성 Reagent 환경측정기기 tracer antibody Standard sol. poor serum 분리시약 buffer temp. time ph 간섭물질 pipette 측정기기 calculation 냉장, 냉동고 centriguge mixer Test tube 제 4 단계오차가능성이발견된원인제거, 실험실내, 제조회사 제 5 단계 문제점해결 37

12. 검사의수행및관리 1). 검체의관리 1. 검체의채취와보관에서여러가지간섭물질들이오염되어예측치못한값을나타낼수있으므로검체의조건 (Hemolysis, 고지방혈, 고빌리루빈혈등 ) 을검사실에서도착즉시기록한다. 2. 호르몬을검사시일내변동과주기분비의특성때문에채혈시간을기록. 3. 채혈하여혈장은항응고제 (EDTA, 헤파린, 또는 ACD) 와혼합하여분리. 빈시험관에채혈, 실온또는 4 에서 30 분이상방치후원심분리하여혈청분리. 4. 항온수조온도, 냉장고나냉동고의온도계측기의안정성을매일기록과점검하여검사결과에미치는영향을감시한다. 5. 정도관리된파이펫을사용하여기구오차를최소화한다. 38

2). 키트 (Reagent) 의관리 1. 방사성의약품키트를수령하면즉시키트별로규격, 수량, 유효기간반드시확인 2. 키트내의표준액, 표지항원, 항혈청등시약병이파괴되지않았나확인하고이상이있으면따로보관한다. 3. 각키트들의보관, 저장방법을확인하여냉장실 (4 ) 또는냉동고 (-20 ) 에검사종목키트별로정리정돈한다. 4. 꼭유효기간순서대로사용하도록한다. 39

. 키트선택시고려할사항 1 정밀도와정확도를일차적으로고려한다. 2 검사에걸리는시간, 검체의준비, 검사과정의간편성, 필요한검체량, 특수과정의필요성, 계수시간, 키트공급원의신뢰도, 가격등을고려한다. 3 키트의평가는물질마다고, 중, 저농도범위에서측정한다 4 방사면역측정용키트내에함유된표지항원, 항혈청, 표준액, 항원유리혈청과또한분리방법으로이용되는제 2 항체단백질등은주의해서저장하지않으면파괴되기쉽다. 5 정상적으로키트의유효기간은표지항원의반감기에의해제한된다. 6 단백질시약 : 단백질시약은반복적으로얼리고녹이는것을피해야한다. 7 탈수된단백질시약 4 냉장이필요하며시약을복원한후일주일이내에사용해야한다. 8 얼린단백질시약키트를받는즉시시약병을 -20 에보관하고각각의검사를시작할때냉동고로부터꺼내사용한다. 9 PEG(polyethyleneglycol) 와 DCC PEG 는 4 에보관하고 DCC 는분말로구입하여복원시킨후엔반드시냉장

3). 검사수행 1. 검체및검사준비 ⅰ). 검체를냉장고나냉동고에서꺼내 30 분이상해동시킨다. ⅱ). 증류수를첨가하여검사시약을재구성하고해동한검사시약을 30 분이상실온에방치하여준비한다. ⅲ). 검사할계획표를작성하고시험관또는트레이에번호를기록한다. ⅳ). 표준액과시료중동결된상태에서해동한것은진탕후원심분리하여침전물을제거한상층액을사용한다. 2. 검사 ⅰ). 준비된시험관에표준액, 정도관리혈청, 검체를키트검사지시서에지시된일정량씩넣는다. ⅱ). 설명서에따라시약을넣는다. ⅲ). 지정된시간동안반응시킨다. ⅳ). 반응이끝나면결합형과유리형을분리한다. ⅴ). 계측기에서방사능을계측한다. 41

4). 측정 : 방사능계측기 (Beta, Gamma counter) 1 감마선계측기는시험관을바로계측한다. 2 베타선게측기는액체섬광계측기로서액체섬광체를사용한다. 3 액체섬광체는베타선의에너지를받아서빛으로바꾸는역할을하는물질이며이것은유기용매중에서여러가지의섬광물질을용질로용해시키는것이다. 4 액체섬광체는 ppo 5g popop 0.1g Triton X- 333ml Toluene 667ml 의비율로혼합하여만든다. 5 혼합된액체섬광체를 10ml씩측정용기에넣어진탕기에시료를넣고혼합후계측한다. 6 소광표준액으로부터얻은파라메터와계측효율의관계식으로부터시료의계측효율을정하고효율로나누어붕괴율즉방사능을구한다. 42

5). 검사방법은경합반응과비경합반응으로나눈다. 경합반응 : 방사면역측정법, 방사수용체측정법, TSH 결합억제면역글로불린측정법 비경합반응 : 면역방사계수측정법, 방사성알레르겐흡수검사법, 포화분석법이있다. 6). 방사면역측정법은표지항원을시료와항체와함께넣고반응시키는평형방법 (equilibrium method) 과표지항원을나중에넣는비평형방법 (disequilibrium method) 로나눈다. 7). 결합 / 유리형분리법 1 제2항체방법, 2 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol ; PEG) 3 황산암모늄으로침전후상층액을쏟거나 (decant) 흡인하는방법 4 고형상법으로셀룰로스 (cellulose) 미소구슬, polyacrylamide beads, polupropylene tube에 2nd Ab를부착하여쏟거나 (decant), Asp. 2nd Ab에철성분 (iron oxide) 를부착하여결합분획을시험관에바닥에부착된자석을이용하여분리하기도한다. 43

13. 검사자체의소요시간 1). 항원과항체및표지항원을함께넣은후반응시간은 37 에서 1 시간이상또는 4 에서 24 시간이표준이다. 2). 검사구성에따라반응시간과조건을달리하게된다. 3). 비평형방법의경우는항원과항체를먼저일정시간, 37 에서 1 시간이상또는 4 에서 24 시간방응시킨다. ( 일차반응 ) 4). 표지항원을첨가하고 2 차반응은 37 또는실온에서 1 시간에서 8 시간까지또는 4 에서 24 시간반응시킨다. 5). 이중항체를첨가하고실온또는 4 에서 1 시간이내반응시킨다. 6). 고형상법을쓴경우 10 분간원심분리후흡인또는버리기, 세척, 상층액버리기등의조작으로분리한다. 7). 검사자체의소요시간은각각의반응시간에피펫조작시험관조작등반응사이의과정에각각 10 분씩소요된다. 44

14. 데이터처리및보고 1) 표준액함량에따른계측값으로표준곡선을만든다. 2) 반복측정쌍의계측값을읽고계측변이계수를구한다. 3) 정밀도프로필을작도한다. 4) 평균뱃치변이계수나프로필자체를과거의정밀도프로필과비교하여검사자체의승인여부를정한다. 5) 정밀도프로필에서측정범위 (working range) 를정한다. 6) 표준곡선에서검체의값을찾는다. 반복쌍측정변이계수를과거의정밀도프로필에비추어해당검체의수용여부를정한다. 7) 희석하여측정범위를검사하고희석배수를곱하여검체값을정한다. 8) 검사결과를의뢰서에기록하여보고하고컴퓨터에입력한다.

15. 방사면역측정법의문제점및가능한원인 문제점 어떤시험관에서도결합형이없다 ( 모든시험관이비특이결합시험관과동일한계측값을갖는다 모든시험관에서의낮은결합률 표준액이 0 인시험관 (B0) 과같은 계측값을갖는다 높은비특이결합률 (NSB) 가능성한원인 항체가첨가되지않음 표지항원이나항체를잘못첨가 잘못된분리방법 (PEG 또는이중 항체법에서시험관에침전물이없음 ) 오래된표지항원의사용. 희석된표지항원이너무적거나혹은희석된항체가너무많거나, 그릇된완충액의 ph 첨가된표준액이없다. 표준액이잘못첨가됨 오래되거나손상된또는부적절히보관된표지항원의사용. 비특이결합시험관에항체첨가 ( 비특이결합시험관이표준액이 0 인시험관과동일 ) 46

표준곡선의완만한경사 사용된표준액을지나치게희석 표지항원과항체를과다하게사용 표준곡선의급격한경사표준액의희석률차이가많다. 표지항원과항체를너무적게사용 높은정도관리혈청의값낮은정도관리혈청의값이중항체법에서침전물이없슴이중실험의정확성미흡낮은총방사능계측값 (total cpm). 시험관에서의방사능계측값이없을때 지나치게희석된표준액보관하는동안혈청의수분의증발표준액의낮은희석보관하는동안변질된정도관리혈청정상혈청, 제2항체가첨가되지않음미흡한기술, 미흡한피펫지나치게희석된표지항원농축된표지항원액에방사능이없음표지항원이첨가되지않음방사능이없는표지항원의공급방사선계측기가작동하지않음 ( 전압조정불량등 ) 47

16. 외부정도관리 1). 월 1 회또는그이상의간격으로학회정도관리위원회의시료를받아검사에포함시켜측정한다. 2). 정도관리위원회의전체검사실에서추린평균값을바람직한검사값으로두고평균으로부터표준편차의 1,2,3 배범위내에위치하는횟수를기록해간다. 48

THE END 49