박성민.fm

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1 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 28(2): (2013) 연구논문 콜라겐합성과 MMP-1 발현에대한생물전환지실추출물의효과 이계원 a, 박성민 1,a, 유영춘 2, 조영호 * Effect of Ponciri Fructus Extracts Fermented with Ganoderma lucidum on the Collagen Synthesis and Expression of Matrix Metalloproteinase-1 Gye Won Lee a, Sung Min Park 1,a, Yung Choon Yoo 2, and Young Ho Cho* 접수 : 2013 년 2 월 13 일 / 게재승인 : 2013 년 4 월 21 일 2013 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: Ponciri fructus, the unripe fruits of Poncirus trifoliata, are widely used in oriental traditional medicine as a remedy for inflammation, gastritis, emesis, digestive ulcers, allergy, and dysentery. To study the anti-wrinkle effects of Ponciri fructus extract (PFE) containing flavanone glycosides, PFE was fermented with Ganoderma lucidum mycelia and its biological activities were investigated. In Ponciri fructus extracts fermented with G. lucidum (G-PFE), polyphenol content was 1,021.00±0.50 µg/ml and flavonoid content was ±0.21 µg/ml. G-PFE was found to scavenge 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radicals and superoxide anion radical by a dose dependent manner, respectively. G-PFE showed higher antioxidant activity than that of PFE. In addition, the photoprotective properties of G-PFE was tested in human dermal fibroblasts (HDF) exposed to UVA radiation. G-PFE inhibited the activity of matrix metalloproteinase-1 건양대학교제약생명공학과 Department of Pharmaceutics & Biotechnology, College of Medical Engineering, Konyang University, Nonsan , Korea Tel: , Fax: micael@konyang.ac.kr 1 ( 주 ) 코씨드바이오팜기술연구소 1 R&D Center, CoSeedBioPharm Co., Chungbuk , Korea 2 건양대학교의학과 2 Department of Microbiology, College of Medicine, Konyang University, Daejeon , Korea a These authors contributed equally to this work as the first author. (MMP-1) and showed a dose dependent decrease in the expression level of MMP-1. G-PFE also increased collagen biosynthesis in HDF. These results demonstrate that G-PFE could be useful as a potential cosmetic ingredient for anti-wrinkle. Keywords: Ponciri Fructus, Ganoderma lucidum, Collagen Biosynthesis, Matrix Metalloproteinase-1, Anti-wrinkle 1. 서론 피부노화는나이가들어감에따라발생하는내인성노화와자외선과같은외부인자에의해발생하는외인성노화로구분되며, 특히, 자외선에의한노화를광노화 (photoaging) 라고한다 [1]. 자외선 (ultraviolet) 은피부세포내에유해한활성산소종 (reactive oxygen species) 을생성시켜여러가지신호전달체계를활성화함으로써피부세포를구성하는불포화지방산, 단백질, DNA 등의고분자물질과반응하여피부결합조직인콜라겐, 엘라스틴등과같은세포외기질단백질의합성을줄이고, 구조를변형시켜탄력을감소시키는것으로알려져있다 [2,3]. 콜라겐은섬유아세포에서합성되어진피의대부분을차지하는세포외기질의주요성분으로금속단백질분해효소 (matrix metalloproteinases, MMPs) 에의해분해되는주요기질단백질이다 [4]. MMPs 는피부의각질형성세포, 섬유아세포를비롯한많은세포들로부터분비되며, 현재까지약 20 여종이상의종류가있는것으로알려져있다. 이중 MMP-1 은 collagenase 1 으로알려져있으며, 콜라겐 type I 과 III 를기질

2 콜라겐합성과 MMP-1 발현에대한생물전환지실추출물의효과 107 로하고있다 [5]. Brenneisen 등 [6] 의연구에의하면자외선조사와활성산소종에의해피부내의 MMPs 활성이증가되어진피층내의콜라겐등과같은세포외기질들의붕괴에영향을미치며, MMPs 가광노화에매우중요한역할을하고있는것으로알려져있다. 지실 (Ponciri fructus) 은운향과 (Rutaceae) 에속하는상록소교목인탱자나무 (Poncirus trifoliata Rafinesque) 의미숙과로 5~6 월에 1~2 cm 의어린열매를채취하여쪼개서음건한것을사용하며, 우리나라중부이남의각지에서재배된다 [7]. 한의학에서지실은가슴과복부팽만, 수종, 소화불량, 변비등의증상을완화시켜주는목적으로사용되었다 [8]. 최근연구보고에따르면지실은항알러지작용 [9], 항균작용 [10], 항암작용 [11] 및멜라닌생성억제작용 [12] 등이있는것으로알려져있다. 지실에는 flavonoids 성분으로 poncirin, naringin, hesperidin, 정유성분으로 limonen, linalool, camphene, alkaloid 성분으로 skimmianine 등이함유되어있는것으로보고되어있다 [13-15]. Poncirin 은 Citrus 속식물에서흔히발견되는주요성분으로 flavanone 류에속하며주로페놀성수산기와함께배당체 (glycosides) 형태로존재한다. 유사물질로는 naringin, hesperidin 등이있고그들의비배당체 (aglycone) 형태로 isosakuranetin, naringenin, hesperetin 등이가능하다. Marotti 등의연구에따르면생물전환을통해배당체를비배당체로전환하면생물활성이증가되는것으로알려져있다 [16-18]. 따라서본연구에서는항암작용, 항산화작용, 면역조절작용등이뛰어난민주름버섯목불로초과에속하는식용버섯인영지버섯 (Ganoderma lucidum) 균사체 [19] 를발효균주로사용하여생물전환지실추출물을제조하였다. 제조된생물전환지실추출물로부터유효성분의확인, 항산화활성, 콜라겐생합성촉진효과, MMP-1 활성저해효과및 MMP-1 발현저해효과를측정하여주름개선소재로서의가능성을검토하였다. 2. 재료및방법 2.1. 공시균주, 세포배양및시약본실험에사용된공시균주는영지버섯 (Ganoderma lucidum KCTC 6729) 균사체로한국생명공학연구원생명자원센터 (Daejeon, Korea) 에서분양받아사용하였다. 신생아의포피조직에서분리한사람피부섬유아세포는 Modern Tissue Technology사 (Seoul, Korea) 로부터구입하였다. 구입한사람피부섬유아세포를 DMEM/F12 (3:1) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin을첨가하여 37 o C, 5% CO 2 조건하에서배양하고계대배양한뒤 6~10 세대세포를실험에이용하였다. 콜라겐정량을위해 Procollagen Type I C-Peptide EIA kit (MK101, Takara Biomedical Inc., Shiga, Japan) 를구입하여사용하였다. MMP-1 정량을위해 MMP-1 Biotrak TM ELISA system (Amersham, Buckinghamshire, UK) 을구입하여사용하였다. In vitro MMP-1 활성저해효과측정을위해사용된형광물질이표지된 DQ collagen, collagenase, 1,10-phenanthroline (1,10-PT) 는 Life Technologies 사 (CA, USA) 로부터구입하여사용하였다. 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT), DMSO, 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH), bovine serum albumin (BSA) 및 nitroblue tetrazolium (NBT) 는 Sigma- Aldrich사 (MO, USA) 에서각각구입하여사용하였다. 그외실험에사용된모든시약들은일급및특급시약을구입하여사용하였다 지실추출물제조본실험에사용한지실은서울경동시장내한약건재상에서구입하여사용하였다. 세절하여음건한지실 100 g 을증류수 1L 로 3 시간씩 3 회환류추출후냉침하여와트만 (Whatman) #5 여과지로여과하였다. 여과된추출물을 50 o C 이하에서감압농축및동결건조한후, 18.1 g ( 수율 18.1%) 의추출물을얻었다. 동결건조물 10 g 을증류수 1L 에용해하여지실추출물 (Ponciri fructus extract, PFE) 을제조하였다 생물전환지실추출물제조영지버섯균사체를 potato dextrose agar (PDA) 가든시험관에사면배양하여 4 o C 에보관하여 1 개월마다계대배양하여사용하였다. 상기사면배지에서계대배양된균사체를무균적으로균질화하여탄소원으로지실추출물과질소원으로효모 - 맥아즙 (0.3~1.0% (w/v)) 이혼합된배지에영지버섯균사체가 5% (v/v) 되도록접종한후발효조내에서온도 28 o C, 회전수 150 rpm 의조건으로 6 일간배양하였다. 배양후배양액으로부터영지버섯균사체를제거한다음생물전환지실추출물 (Ponciri fructus extract fermented with G. lucidum, G- PFE) 을제조하였다 β-glucosidase 활성측정배양된영지버섯균사체의 β-glucosidase 의활성을 24 시간간격으로배양액을회수하여측정하였다. 시험관에배양상등액 0.5 ml, 100 mm acetae buffer (ph 5.0) 1 ml 및 5mM p-nitrophenyl-β-d-glucopyranoside 0.5 ml 를각각넣고혼합한다음, 37 o C 에서 30 분간반응하였다. 0.2 M Na 2 CO 3 용액 2mL 를넣어반응을종결한후 400 nm 에서흡광도를측정하였다. β-glucosidase 의활성 1 unit 는분당 1 µmol 의 p-nitrophenol 을분해하는효소량으로정의하였다 생물전환지실추출물의유효성분확인 총폴리페놀함량측정총폴리페놀화합물의함량은 Folin-Denis 방법 [20] 을변형하여측정하였다. 즉, 적당하게희석된시료 1mL 에 95% ethanol 1 ml 와증류수 5mL 를첨가하고 1 N Folin-Ciocalteu's reagent 0.5 ml 를넣어잘섞어주었다. 5 분간방치한후, 10% Na 2 CO 3 1mL 를가한후, 725 nm 에서 1 시간이내에흡

3 108 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 28(2): (2013) 광도를측정하였다. 이때총폴리페놀함량은 tannic acid 을이용하여미리작성한표준검량곡선으로부터환산하여정량하였다 총플라보노이드함량측정총플라보노이드함량은 Moreno 등 [21] 의방법에의해측정하였다. 각시료 0.5 ml 에 10% aluminum nitrate 0.1 ml, 1 M potassium acetate 0.1 ml 및에탄올 4.3 ml 를가하여혼합하고실온에서 40 분동안정치한뒤 415 nm 에서흡광도를측정하였다. 이때총플라보노이드함량은 quercetin 을이용하여작성한표준검량곡선으로부터환산하여정량하였다 HPLC 를이용한 flavanone aglycone 함량변화분석 PFE 에존재하는 flavanone glycoside 인 poncirin 과 G-PFE 에존재하는 flavanone aglycone 인 isosakuranetin 의변화를확인하기위하여 HPLC (Shimadzu, Kyoto, Japan) 를실시하였다. HPLC 분석조건은다음과같다. 검출기 PDA detector, 검출파장 289 nm, 분석칼럼 Atlantis dc 18 ( mm, 5 µm, Waters, USA), 시료주입량 20 µl, 유속 1.0 ml/min, 이동상용매로는 poncirin 의경우메탄올 :0.3% 인산용액 : 아세트니트릴 (20:60:20, v/v%), isosakuranetin 의경우메탄올 :0.3% 인산용액 : 아세트니트릴 (25:45:30, v/v%) 로분석하였다 항산화활성 DPPH 라디칼소거활성 DPPH 라디칼에대한소거활성은 Blois [22] 의방법을변형하여측정하였다. 각시료 20 µl 에 0.1 mm DPPH 180 µl 를넣고혼합한후, 30 분동안방치한다음 560 nm 에서흡광도를측정하였다. DPPH 라다칼소거능은 [( 시료를첨가하지않은대조군의흡광도 시료를첨가한반응군의흡광도 )/ 시료를첨가하지않은대조군의흡광도 100] 식으로부터구하였다 Superoxide 음이온라디칼소거활성 Superoxide 음이온라디칼소거활성은 Okamura 등 [23] 의방법을변형하여측정하였다. 즉, 시료 20 µl, 2 mm xanthine 과 0.1 mm NBT 혼합액 160 µl 를넣고, 0.05 mm EDTA 가포함된 50 mm potassium phosphate buffer (ph 7.4) 에녹인 xanthine oxidase (0.5 unit/ml) 20 µl 를가하여 37 o C 에서 30 분동안반응시켰다. 여기에 2.5 N HCl 80 µl 를첨가하여반응을중지시키고 560 nm 에서흡광도를측정하였다. Superoxide 음이온라디칼소거능은 [( 시료를첨가하지않은대조군의흡광도 시료를첨가한반응군의흡광도 )/ 시료를첨가하지않은대조군의흡광도 100] 식으로부터구하였다 세포독성측정세포독성은 MTT 시약을이용하여세포생존율을측정하는 Mosmann [24] 의방법을변형하여실시하였다. HDF 를 cells/well 농도로 96-well plate 에접종한후, 각 well 에시료를 투여하여 CO 2 배양기에서 24 시간배양하였다. MTT 용액 (5 µg/ml) 을첨가하고 4 시간후원심분리하여상등액을제거하고, 100 µl acid-isopropanol (0.04 N HCl in isopropanol) 을첨가한후, 푸른색의 formazan 이용출되도록하여 microplate reader (BioTek Instruments, VT, USA) 로 565 nm 에서흡광도를측정하였다 콜라겐생합성촉진효과측정 HDF 배양액내에서생성되는콜라겐생합성정도는 Procollagen Type I C-Peptide EIA kit (Japan) 를사용하여측정하였다. 즉, 세포를 cells/well 농도로 6-well plate 에접종하여 CO 2 배양기에서 24 시간배양하였다. 시료를혈청무첨가배지로적정농도로희석하여첨가한후, 24 시간추가배양하였다. 양성대조군으로사용한비타민 C 는 µg/ml 의농도로첨가하였다. 단클론항체 (mouse monoclonal anti- PIP) 가 coating 된 microplate 의각 well 에 antibody-peroxidase (POD) 용액 100 µl 와배양상등액또는표준액 20 µl 씩넣고잘혼합한다음 37 o C 에서 3 시간반응하였다. 세척용완충제 (wash buffer) 로 4 회세척한다음, 기질용액 (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)/H 2 O 2 ) 을각 well 에 100 µl 씩넣고실온 (20~25 o C) 에서 15 분간반응하였다. 1 M H 2 SO 4 로반응을완전히중지시킨후, 450 nm 에서흡광도를측정하였다. 측정된표준액에대한표준곡선으로부터시료의농도를산출하였다 MMP-1 활성저해효과측정시료의 MMP- 1 활성저해효과측정은 Wang 등 [5] 이사용한방법을약간변형하여실시하였다. 즉, 반응완충액 100 µl 에 DQ collagen (0.25 mg/ml) 20 µl, 시료 40 µl 와 0.5 unit collagenase 40 µl 를첨가하였다. 암소, 실온에서 20 분경과후, 형광분광광도계 (PerkinElmer, MA, USA) 를이용하여흡수파장 495 nm, 방출파장 515 nm 로형광값을측정하였고, 대조군으로효소액대신반응완충액을효소와동량첨가하여형광값을측정하였다. 양성대조군으로는 1,10-PT 를사용하였다 MMP-1 발현저해효과측정 UVA 조사에의해유도되는 MMP-1 발현저해효과측정은 MMP-1 Biotrak TM ELISA system (UK) 를이용한 enzyme linked immunosorbent assay 방법으로실시하였다. 먼저 HDF 에 UVA 를조사한후, 시료를처리하여 24 시간배양한배양상등액또는표준액을 MMP-1 에대한단클론항체 (mouse monoclonal anti-mmp-1) 로 coating 된 microplate 의각 well 에 100 µl 씩분주한후, 실온에서 2 시간동안배양하였다. 세척용완충제로 4 회세척한다음, 각 well 에 MMP-1 에대한다클론항체 (rabbit anti-mmp-1) 를 100 µl 씩분주한후, 실온에서 2 시간동안배양하였다. 세척용완충제로 4 회세척한다음각 well 에 peroxidase conjugate (donkey anti-rabbit Horseradish Peroxidase) 를 100 µl 씩분주한후, 실온에서 1 시간동안배양하였다. 반응이끝난후, 세척과정을 4 회반복하였으

4 콜라겐합성과 MMP-1 발현에대한생물전환지실추출물의효과 109 며, 희석된기질용액을각 well 에 100 µl 씩분주한후, 실온에서 30 분간반응하였다. 반응정지용액 (1 M H 2 SO 4 ) 을각 well 에 100 µl 씩넣고 30 분내에 450 nm 에서흡광도를측정하였다. 측정된표준액에대한표준곡선으로부터시료의농도를산출하였다 자료분석및통계처리모든실험결과는평균 ± 표준편차로표기하였으며, 각군간의통계적유의성검증은 SPSS 18.0 (SPSS Inc., IL, USA) 을이용한 one-way ANOVA 로하였으며, p 값이 0.05 미만일때통계적으로유의하다고판단하였다. 3. 결과및고찰 3.1. 총폴리페놀함량및플라보노이드함량측정결과폴리페놀이란녹색식물이광합성작용을할때생성된탄수화물의일부가변화한 2 차대사산물로식물계에 8,000 여개의구조를가진성분으로존재하며페놀성화합물이라고도한다. 분자내페놀성수산기가효소단백질과같은거대분자들과결합하는성질이있기때문에항산화작용, 항암및콜레스테롤저하작용등의다양한생리활성을가진다 [25]. 또한, 플라보이드는항균, 항암, 항바이러스, 항알러지및항염증활성등이보고되어있다 [26]. G-PFE 와 PFE 내총폴리페놀과플라보노이드의함량변화를측정하기위해표준물질로각각 tannic acid 와 quercetin 을사용하였다. 그결과 Table 1 에서와같이 G-PFE 는 1,021.00± 0.50 µg/ml 의폴리페놀화합물과 ±0.21 µg/ml 의플라보노이드를함유하는것으로나타난반면에 PFE 는각각 ±0.31 µg/ml 과 ±0.41 µg/ml 를함유하는것으로나타났다. 생물전환을통해폴리페놀함량은생물전환전 Fig. 1. Changes in β-glucosidase activity and ph in the culture of Ganoderma lucidum mycelia. G. lucidum mycelia were cultured at 28 o C on a shaking incubator at 150 rpm for 7 days and the β-glucosidase activity and ph of the media were measured spectrophotometrically. Table 1. Changes of the content of total polyphenol and flavonoid in Ponciri fructus extract fermented with G. lucidum (G-PFE) and Ponciri fructus extract (PFE) (µg/ml) Sample Total polyphenol 1) Total flavonoid 2) PFE ± ±0.41 G-PFE 1,021.00± ±0.21 Each value represents of three determinations±the standard deviations. 1) A standard compound was tannic acid for total polyphenol assay. 2) A standard compound was quercetin for total flavonoid assay. 에비해약 1.75 배, 플라보노이드함량은약 5.5 배정도증가하는것으로나타났다. 이러한결과는 Jeong 등 [27] 이보고한원료인삼보다균사체로배양된인삼의폴리페놀함량이높다는결과와일치하며, 이는발효균주로사용된영지버섯균사체가배양되는과정에서결합된고분자페놀화합물이저분자로분해또는파괴되거나새로운페놀화합물들이생성되었기때문이라사료된다 HPLC 를이용한 flavanone aglycone 함량변화분석결과영지버섯균사체배양액의 β-glucosidase 활성을측정한결과배양 6 일째에 75.2 mu/ml 로가장높게나타났다 (Fig. 1). G-PFE 내의 flavanone aglycone 인 isosakuranetin 의변화를확인하기위하여 HPLC 로분석하였다. Poncirin 과 isosakuranetin 을메탄올과디메칠설폭사이드에용해후, 표준원액으로하여이를메탄올로적당히희석하여표준액으로하였다. 검체는 0.45 µm membrane filter 로여과하여물로 50 배희석하여검액으로하였다. 표준액및검액을 HPLC 로분석한후, 각각의피크면적을미리작성한검량선식에대입하여검액중 poncirin 과 isosakuranetin 의양을구하였다. Poncirin 과 isosakuranetin 의검량선은모두 3.125~200 µg/ml 의범위에서상관계수 (R 2 ) 가 이상으로양호한직선성을보였다 (data not shown). 또한 poncirin 과 isosakuranetin 은각각의이동상조건에서 16.8 분과 17.0 분에각각검출되었다 (Fig. 2). 영지버섯균사체로 PFE 를생물전환시킨결과, 생물전환전에비해배당체인 poncirin 의함량은 1,937.91±24.35 µg/ ml 에서 96.07±11.20 µg/ml 감소하였고 (Fig. 2A, B), 반면에 favanone aglycone 인 isosakuranetin 의함량은 0.17±0.01 µg/ ml 에서 ±25.12 µg/ml 로증가하는것으로나타났다 (Fig. 2C, D). 대두추출물을영지버섯균사체로생물전환한이전의연구결과에따르면, 대두추출물을영지버섯균사체로배양할경우배당체인 isoflavone glycoside 가배양 9 일후에는 isoflavone aglycone 으로전환되는것으로보고되었다 [28]. 따라서본연구에서나타난 G-PFE 내 flavanone aglycone 이생성되는것은생물전환공정중 flavanone glycoside 가분해되어영지버섯균사체의탄소원으로이용되고남은대사산물로사료된다 DPPH 라디칼소거효과 DPPH 는자유라디칼의안정된모델로서반응중 DPPH 라디칼의감소는자유라디칼의소거반응이진행됨을알수있

5 110 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 28(2): (2013) Fig. 2. HPLC profile of poncirin and isosakuranetin in Ponciri fructus extract fermented with G. lucidum (G-PFE) and Ponciri fructus extract (PFE). The chromatogram of (A) and (B) showed change of poncirin in PFE and G-PFE, respectively. The chromatogram of (C) and (D) showed change of isosakuranetin in PFE and G-PFE, respectively. 고, 지질과산화의초기반응의억제정도를예측할수있기때문에시료의항산화작용을측정할때 DPPH 라디칼소거능측정법이많이이용된다 [29]. G-PFE 의항산화효과를측정한결과, G-PFE 와 PFE 는투여농도의존적으로 DPPH 라디칼소거작용을나타내었다 (Fig. 3). 즉, G-PFE 를 50, 100, 200, 400 µg/ml 의농도로처리한경우각각의 DPPH 라디칼소거능은 30.5±1.5%, 50.0±3.3%, 80.5±2.5%, 95.5±5.1% 로나타난반면에, PFE 의경우 20.3±2.3%, 40.5±5.0%, 60.4±3.7%, 80.5±6.5% 로나타나 PFE 를생물전환할경우상대적으로소 Fig. 3. Scavenging activity of Ponciri fructus extract fermented with G. lucidum (G-PFE) and Ponciri fructus extract (PFE) on DPPH radicals. All values were expressed as the average of triplicate samples with SD. The SC 50 of vitamin C (positive control) showed 11 µg/ml. *p<0.05 compared with control (negative control). 거능이증가한것으로나타났다 (p<0.05). 양성대조군인비타민 C 는 11 µg/ml 에서, G-PFE 는 100 µg/ml 에서각각 DPPH 라디칼을 50% 소거하는것으로나타났다. 따라서 G-PFE 는 DPPH 라디칼소거능이단일성분인비타민 C 에뒤지지않은매우우수한효과를가지는것으로밝혀졌다 Superoxide 음이온라디칼소거효과 Superoxide 음이온라디칼의저해작용은 xanthine oxidase 에의해발생한 superoxide 음이온라디칼이사용된시료에의해제거된비율을측정하여항산화효능을평가하는방법으로알려져있다 [30]. 양성대조군으로 3-t-butyl-4-hydroxyanisole (BHA) 를이용하여 G-PFE 의 superoxide 음이온라디칼소거효과를비교한결과를 Fig. 4 에나타내었다. 그결과 G-PFE 는투여농도의존적으로 superoxide 음이온라디칼소거작용을나타내 50, 100, 200, 400 µg/ml 의농도에서각각 50.0±5.0%, 70.5±3.2%, 85.7±4.7%, 95.5±5.5% 의소거능을나타내었고, PFE 의경우 40.7±3.5%, 60.7±5.1%, 70.3±5.4%, 80.5±4.5% 의소거능을나타내 PFE 를영지버섯균사체로생물전환한경우상대적으로항산화활성이증가하는것으로나타났다 (p<0.05). 양성대조군인 BHA 는 32 µg/ml 에서, G- PFE 는 50 µg/ml 에서각각 superoxide 음이온라디칼을 50% 소거하였다. Kim 등 [31] 은버섯균사체로발효하는과정에서항산화활성이낮은화합물이항산화활성이높은물질로생물전환되거나항산화활성과관련된화합물이버섯균사체배양시배지속으로유출되어항산화활성이높아진다고보고하였는데, 본연구에서도영지버섯균사체가 PFE 를탄소원으로하여배양되는과정에서페놀성화합물과같은항산화물질들이증가되어항산화활성이높아진것으로사료

6 콜라겐합성과 MMP-1 발현에대한생물전환지실추출물의효과 111 Fig. 4. Scavenging activity of Ponciri fructus extract fermented with G. lucidum (G-PFE) and Ponciri fructus extract (PFE) on superoxide anion radicals. All values were expressed as the average of triplicate samples with SD. The SC 50 of BHA (positive control) showed 32 µg/ml. *p<0.05 compared with control (negative control). 된다 세포독성 G-PFE 와 PFE 의사람피부섬유아세포에대한독성여부를알아보기위하여다양한농도로처리하고세포의생존율을관찰하였으며, 그결과는 Fig. 5 와같다. G-PFE 와 PFE 는최고 1,000 µg/ml 농도에서도 90% 이상의세포생존율을나타내어세포독성이없는것으로나타났다. 따라서 1,000 µg/ ml 농도이하범위를기준으로세포실험을실시하였다 콜라겐생합성촉진효과콜라겐은진피결합조직을구성하는세포외기질의주성분 으로프로콜라겐이라는전구물질형태로합성된다. 프로콜라겐은아미노말단과카르복실말단에프로펩티드라는펩티드염기서열을포함하는데, 이들은콜라겐중합반응이일어날때콜라겐분자로부터분리된다고알려져있다 [4]. 따라서프로펩티드의양을측정함으로써세포내콜라겐생합성정도를예측할수있다. G-PFE 의콜라겐생합성정도를 Procollagen Type I C-Peptide EIA kit (Japan) 를이용하여측정한결과를 Fig. 6 에나타내었다. 양성대조군으로콜라겐생합성촉진효과가있다고알려진비타민 C 를이용하여 G- PFE 와비교하였다. 그결과 G-PFE 를 100, 200, 400 µg/ml 농도로처리한경우음성대조군대비콜라겐생합성을각각 125.0±7.8%, 135.3±11.5%, 178.3±20.8% 증가시키는것으로나타났다 (p<0.05). 양성대조군인비타민 C 는 µg/ml 농도에서 152.0±26.6% 의콜라겐생합성을촉진하였고, PFE 의경우콜라겐생성에별다른영향을미치지못하는것으로나타났다. 이러한결과는 Kim 등 [32] 이보고한일반우방자추출물보다잎새버섯균사체로배양된우방자추출물의콜라겐생합성촉진효과가우수한결과와일치하며, 이는버섯균사체가배양되는과정에서생성되는 flavanone aglycone 과세포외다당체 (exo-polysaccharide) 에의한작용으로사료된다 MMP-1 활성저해효과피부건조중량의약 90% 에달하는콜라겐은진피결합조직의주요구성단백질로콜라겐의분해는곧결합조직의탄력저하와피부의주름및처짐에직접적인영향을미친다. 체내에서생성되는수십종의 MMPs 가운데 MMP-1 은콜라겐에특이적으로작용하는단백질분해효소 (proteinase) 로서 MMP-1 의활성을억제하여콜라겐을보호하면피부조직의탄력을유지하고주름의생성을예방할수있는것으로알려 Fig. 5. Effect of Ponciri fructus extract fermented with G. lucidum (G-PFE) and Ponciri fructus extract (PFE) on a cell viability in human dermal fibroblasts. All values were expressed as the average of triplicate samples with SD. Fig. 6. Effect of Ponciri fructus extract fermented with G. lucidum (G- PFE) and Ponciri fructus extract (PFE) on a procollagen biosynthesis in human dermal fibroblasts. All values were expressed as the average of triplicate samples with SD. Vitamin C (positive control) was showed 152.0±26.6% of collagen biosynthesis at µg/ml. *p<0.05 compared with control (negative control).

7 112 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 28(2): (2013) Fig. 7. Inhibitory effect of Ponciri fructus extract fermented with G. lucidum (G-PFE) and Ponciri fructus extract (PFE) on a MMP-1 activity. All values were expressed as the average of triplicate samples with SD. The IC 50 of 1,10-PT (positive control) showed 24 µg/ml. *p<0.05 compared with control (negative control). 져있다 [33]. 따라서형광물질이표지된 DQ collagen 을이용하여 G-PFE 의 MMP-1 활성저해작용을측정하였다. 양성대조군으로 MMP-1 활성저해작용이있는것으로알려진 1, 10-PT 를이용하여 G-PFE 와비교하였다. 그결과 Fig. 7 과같이 G-PFE 는투여농도의존적으로 MMP-1 의활성을저해하는것으로나타났다. 즉, G-PFE 와 PFE 를 100, 200, 400 µg/ ml 의농도로처리한경우, G-PFE 는 MMP-1 의활성을각각 56.7±10.4%, 82.7±6.5%, 97.3±5.5% 저해하였고, PFE 는각각 25.5±8.9%, 45.6±7.8%, 60.5±10.5% 저해하는것으로나타났다. 따라서 PFE 를영지버섯균사체로배양한경우일반 PFE 보다 MMP-1 저해활성이증가하는것으로나타났다. 또한, 양성대조군인 1,10-PT 는 24 µg/ml 에서 MMP-1 의활성을 50% 저해하는것으로나타났다. Kim 등 [34] 은인삼을증기로쪄서숙성시키는과정에서 2 차적인성분변화를초래하여인삼에존재하지않는특유의새로운약효성분들이생성되어 MMP-1 저해활성과같은새로운생리활성이증가된다고보고하였는데, 본연구에서 G-PFE 가일반 PFE 보다 MMP-1 저해활성이증가된것도버섯균사체배양시증가되는 β- glucosidase 의활성에의해 flavanone aglycone 을비롯한새로운유효성분들이증가되어생리활성이증가된것으로사료된다 MMP-1 발현저해효과자외선은피부에서활성산소종을생성시켜다수의신호전달경로를활성화시킴으로써전사인자인 activator protein-1 (AP-1) 과 nuclear factor-κb (NF-κB) 를활성화시켜염증반응과함께콜라겐분해를촉진하는 MMP-1 의발현을증가시키는것으로알려져있다 [35]. 따라서 UVA 조사에의해유도되는 MMP-1 발현에미치는 G-PFE 의영향을 MMP-1 Biotrak TM ELISA system (UK) 을이용하여측정하였다. 양성대 Fig. 8. Inhibitory effect of Ponciri fructus extract fermented with G. lucidum (G-PFE) and Ponciri fructus extract (PFE) on the expression of MMP-1 in UVA-irradiated human dermal fibroblasts. All values were expressed as the average of triplicate samples with SD. The IC 50 of RA (positive control) showed 1.1 µg/ml. *p<0.05 compared with control (negative control, UVA). 조군으로 MMP-1 의발현을저해하는것으로알려진 all-trans retinoic acid (RA) 를이용하여 G-PFE 와비교한결과 Fig. 8 에나타난바와같이 G-PFE 는농도의존적으로 MMP-1 의발현을저해하였다. 즉, G-PFE 를 100, 200, 400 µg/ml 의농도로처리한경우, MMP-1 의발현을각각 60.9±3.3%, 72.6±2.7%, 84.4±5.2% 저해하는것으로나타났으며, PFE 의경우 14.8± 3.5%, 24.5±4.5%, 35.5±5.3% 저해하는것으로나타났다 (p< 0.05). 양성대조군인 RA 는 1.1 µg/ml 의농도에서 52.0±2.4% 저해하는것으로나타났다. PFE 를영지버섯균사체로배양한경우일반 PFE 보다 UVA 에의한 MMP-1 의발현저해활성이증가하는것으로나타났다. Bae 등 [36] 은잎새버섯균사체가생성하는세포외다당체가 UVA 에의해증가되는 MMP-1 의발현을저해한다고보고하였다. 따라서 G-PFE 가일반 PFE 보다 MMP-1 발현저해효과가우수한것은영지버섯균사체의배양에의해 flavanone aglycone 과세포외다당체의생성이증가되었기때문인것으로사료된다. 향후 G- PFE 의 MMP-1 발현저해메커니즘과콜라겐생합성촉진메커니즘에관한연구는추가적으로진행되어야할것으로사료된다. 4. 결론 본연구에서는영지버섯균사체를발효균주로사용하여제조된 G-PFE 로부터유효성분의확인, 항산화활성, 콜라겐생합성촉진효과, MMP-1 의활성저해효과및 UVA 가조사된사람피부섬유아세포에서 MMP-1 발현저해효과를측정하여주름개선소재로서의가능성을검토하였다. 일반 PFE 를탄소원으로하여영지버섯균사체를배양한

8 콜라겐합성과 MMP-1 발현에대한생물전환지실추출물의효과 113 경우 flavanone glycoside (poncirin) 가 flavanone aglycone (isosakuranetin) 으로전환되어여러가지생물학적활성이증가됨을확인하였다. G-PFE 의항산화활성을측정한결과농도의존적으로 DPPH 라디칼과 superoxide 음이온라디칼을소거하였다. G-PFE 를 100, 200, 400 µg/ml 농도로처리한경우콜라겐생합성을음성대조군대비각각 125.0±7.8%, 135.3± 11.5%, 178.3±20.8% 증가시키는것으로나타났다. MMP-1 의활성은각각 56.7±10.4%, 82.7±6.5%, 97.3±5.5% 저해하는것으로나타났으며, MMP-1 의발현은각각 60.9±3.3%, 72.6 ±2.7%, 84.4±5.2% 저해하는것으로나타났다. 이상의실험결과를종합해볼때 G-PFE 는사람의섬유아세포에대하여콜라겐생합성을증가시키고 MMP-1 의활성과발현을억제하였으며항산화효과가우수한것으로보아주름개선소재로써이용될수있을것으로사료된다. 감사 본연구는중소기업청에서지원하는 2010 년도산학연공동기술개발사업 (No ) 의연구수행으로인한결과물임을밝힙니다. REFERENCES 1. Jenkins, G. (2002) Molecular mechanisms of skin ageing. Mech. Ageing Dev. 123: Fisher, G. J., S. Kang, J. Varani, Z. Bata-Csorgo, Y. Wan, S. Datta, J. J. Voorhees (2002) Mechanisms of photoaging and chronological skin aging. Arch. Dermatol. 138: Kim, E. J., M. K. Kim, X. J. Jin, J. H. Oh, J. E. Kim, and J. H. Chung (2010) Skin aging and photoaging alter fatty acids composition, including 11, 14, 17- eicosatrienoic acid, in the epidermis of human skin. J. Korean Med. Sci. 25: Kim, N. M., B. S. Koo, S. K. Lee, E. I. Hwang, S. H. So, and J. H. Do (2007) Effect of Korean red ginseng on collagen biosynthesis and MMP-1 activity in human dermal fibroblast. J. Ginseng Res. 31: Wang, Y., A. R. Johnson, Q. Z. Ye, and R. D. Dyer (1999) Catalytic activities and substrate specificity of the human membrane type 4 matrix metalloproteinase catalytic domain. J. Biol. Chem. 274: Brenneisen, P., H. Sies, and K. Scharffetter-Kochanek (2002) Ultraviolet-B irradiation and matrix metalloproteinases from induction via signaling to initial events. Ann. N.Y. Acad. Sci. 973: Park, J. H. and S. H. Sung (2007) The Key Medicinal Plants, pp Shinilbooks, Seoul, Korea. 8. KAPE (2008) Handbook of the Korea Pharmacopoeia. 9 th ed., pp Shinilbooks, Seoul, Korea. 9. Kim, H. M., H. J. Kim, and S. T. Park (1999) Inhibition of immunoglobulin E production by Poncirus trifoliata fruit extract. J. Ethnopharmacol. 66: Jeon, R. H., H. J. Choi, S. J. Moon, and M. S. Na (2010) The effects of antioxidant and antimicrobial activity with Poncirus trifoliata ethanol extracts during growth. J. Korean Soc. Cosmetol. 16: Cha, M. R., M. Y. Yoon, E. S. Son, and H. R. Park (2009) Selective cytotoxicity of Ponciri fructus against glucose-deprived PANC- 1 human pancreatic cancer cells via blocking activation of GRP78. Biosci. Biotechnol. Biochem. 73: Son, A. R., J. Y. Choi, J. A. Kim, S. H. Cho, X. G. Hua, S. H. Park, S. R. Chung, T. C. Chung, Y. D. Jahng, J. K. Son, and S. H. Lee (2005) Isolation of melanogenesis inhibitors from Ponciri fructus. Kor. J. Pharmacogn. 36: Shoji, N., A. Umeyama, T. Takemoto, and Y. Ohizhumi (1984) Isolation of a cardiotonic principle from Alpinia ocyphylla. Planta. Med. 50: Kiuchi, F. M. Shibuya, and U. Sankawa (1982) Inhibitors of prostaglandin biosynthesis from Aipinia officinarum. Chem. Pharm. Bull. 30: Shoji, N., A. Umeyama, Y. Asakawa, T. Takemoto, K. Nomoto, and Y. Ohizumi (1984) Structural determination of nootkatol, a new sesquiterpene isolated from Alpinia oxyphylla miquel possessing calcium-atagonistic activity. J. Pharm. Sci. 73: Marotti, I., A. Bonetti, B. Biavati, P. Catizone, and G. Dinelli (2007) Biotrnasformation of common bean (Phaseolus vulgaris L.) flavonoid glycosides by bifidobacterium species from human intestinal origin. J. Agric. Food Chem. 55: Nielsen, I. L., W. S. Chee, L. Poulsen, E. Offord-Cavin, S. E. Tasmussen, H Grederiksen, M. Enslen, D. Barron, M. N. Horcajada, and G. Williamson (2006) Bioavailability is improved by enzymatic modification of the citrus flavonoid hesperidin in humans: a randomized, double-blind, crossover trial. J. Nutr. 136: Otieno, D. O. and N. P. Shah (2007) A comparison of changes in the transformation of isoflavones in soymilk using varying concentrations of exogenous and probiotic derived endogenous β-glucosidases. J. Appl. Microbiol. 103: Joung, E. M., H. Y. Kim, I. G. Hwang, J. H. Jeong, K. W. Yu, J. S. Lee, and H. S. Jeong (2010) Changes of antioxidant activities on cultured ginseng with mushroom mycelia during cultivation. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 39: Follin, A. D. and W. Denis (1915) A colorimetric method for the determination of phenols and phenol derivatives in urine. J. Biol. Chem. 22: Moreno, M. I., M. I. Isla, A. R. Sampeiettro, and M. A. Vatuone (2000) Comparison of the free radical-scavenging activity of propolis from several regions of Argentina. J. Enthnopharmacol. 71: Blois, M. S. (1958) Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature 181: Okamura, H., A. Mimura, Y. Yakou, M. Niwano, and Y. Takahara (1993) Antioxidant activity of tannins and flavonoids in Eucalptus rostrata. Phytochemistry. 33: Mosmann, T. (1983) Rapid colorimetric assay for the cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxic assay. J. Immunol. Methods. 65: Jeong, H. J., S. B. Park, S. Kim, and H. K. Kim (2007) Total

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