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1 구리를이용한비브리오속균사멸효과 The Effect of Cupric Ion Diffused from Brass Plate on the Growth of Vibrio spp. in Sea Water - 연구요약 - 3면이바다로둘러싸인우리나라는수산물을섭취하는비중이높으며식습관상생식하는경우가많고, 일부패류는 ready-to-eat로다루어져수산물이가지고있는위해요소에노출될가능성이높다. 실제적으로해수에존재하는병원성비브리오속균의오염에의해장염비브리오에의한식중독사고가 3대주요식중독균에속하고, 최근지구온난화로인하여비브리오발생양상도 10년간세계적으로급증하고있다. 또한법정전염병으로분리 관리되고있는비브리오패혈증과콜레라발생으로인하여심각한보건, 경제및사회적문제가지속되고있다따라서본연구는천년의지혜와조상의얼이담긴방자 ( 구리 78%, 주석 22% 합금 ) 를활어횟집의수족관에적용하여병원성세균인비브리오균등의살균 저해효과와활어의구리이온축적에대하여분석하였다. 연구결과방자판 (30 30cm) 을 24시간적용한경우 V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. cholerae의병원성균이 99.9% 억제되었으며, 해수중구리이온은 0.05 ppm에서 0.58 ppm으로증가하였다. 활어횟집과동일한조건하에서광어, 우럭을입식하였을때해수및각부위별즉, 아가미, 내장및피부에감염된 V. parahaemolyticus는 24시간경과시 99.9%, 48시간경과후는 2 cfu/ml 이하로억제되었으며, 해수중구리는 0.01~0.11 ppm검출되었으나여과제인 polyester에 97.8~ ppm으로대부분의구리이온이흡착되는것을알수있었다. 또한우럭의각부위별구리농도는 48시간째에아가미의경우 22 ppm으로급격히증가하였고, 내장 7.1~17.9 ppm, 횟감용살은 0.7~1.3 ppm으로자연함유량수준을나타냈다. 패류의경우칼조개, 가리비는 48시간후에약 102 cfu/g으로 99%, 백합의경우 101 cfu/g 수준으로 99.9% 억제시키는효과가있었으나활어에비해저해효과는낮았다. 구리함량은칼조개, 가리비, 백합의경우평균 18.7, 26.4, 15.7 ppm에서각각 55.4, 41.3, 33.4 ppm으로증가하였다. 또한동일실험수족관에 V. parahaemolyticus 의재감염후일정시간방자판으로부터구리이온을용출시킨후살균효과는 1차감염시 48시간후에 99.9%, 재차감염시 36시간후에 99.9% 억제되어억제속도가빨라졌으며, 방자판을 40시간적용후제거한경우도그효과는비슷하였지만저해속도는약간감소하였다. 이상의결과로구리이온의어패류에의축적에대한우려는미비하였으나비브리오균억제효과는뛰어나수족관에의적용을통하여장염비브리오균식중독저감과퇴치및도민의수산물이용에대한안전성확보로국민건강보호및보건위생에기여할수있을것으로사료된다.

2 구리를이용한비브리오속균사멸효과 The Effect of Cupric Ion Diffused from Brass Plate on the Growth of Vibrio spp. in Sea Water 연구총괄 : 이정복보건연구부장연구주관 : 박용배보건기획연구팀장연구책임 : 허정원보건연구사 경기도보건환경연구원

3 발간사 세계보건기구 (WHO) 는식품위생에대하여 식품의재배생산, 제조로부터최종적으로사람에게섭취되기까지의모든단계에걸친식품의안전성, 건전성및완전무결성을확보하기위한모든수단이다. 라고정의하고있습니다. 특히식품의안전성을위협하는요소로는미생물학적, 화학적, 물리학적요인등이있으며, 가장중요한위해성의주요원인은미생물학적요인입니다. 산업화와환경개선에따른위생관리의향상으로식품의제조, 가공, 생산, 유통시스템이개선되어왔으나, 세계화에따른 WTO, FTA협정등국가간무역의확대및자유화로지구촌모든나라들로부터수입되는식품의안전성은지속적으로위협받고있습니다. 최근 wellbeing( 참살이 ) 식품의확대로우리나라의수산물소비량은날로증가하고있으며, 동물성단백질공급원으로어패류가차지하는비율이 40% 이상으로수산물소비량이가장많은국가가되었습니다. 그러나이들수산물은우리의식습관상생식을하는경우가많아장염비브리오식중독, 비브리오패혈증등국민의건강과보건에심각한위협을가하고있습니다. 본연구를통하여수족관의효율적인관리를통한수산물의안전성확보에기여하여국민보건증진에널리활용되기를기대합니다. 아울러본연구를위해열과성의를다하여주신보건연구기획팀직원들의노고에진심어린격려를드립니다 년 3 월 경기도보건환경연구원장김종찬

4 ⅰ 목 차 1. 서론 재료및방법 실험재료 사용균주및배지 총균수및총비브리오균측정 중금속분석 결과및고찰 방자판에의한비브리오균억제 방자판과구리판에의한구리의용출 해수온도에따른비브리오속균의저해 구리의이온량에따른비브리오균의저해 구리이온에의한활어생육중비브리오균저해와구리의 축적 우럭의생육중 V. parahaemolyticus 의저해 광어의생육중 V. parahaemolyticus 의저해 53

5 ⅱ 3.6 우럭의부위별구리농도 광어생육시방자판의구리이온에의한총세균과 V. parahaemolyticus 의저해 구리이온에의한패류중비브리오균의저해 패류중구리의축적 결론 참고문헌 71

6 ⅲ 표차례 Table 1. Distribution of food-borne pathogens in Korea from 2003 to Table 2. Comparison of microbiological safety standards in each nations on marine food 24 Table 3. The Standard of natural environment on Cu in sea water 27 Table 4. The Standard of Cu concentration on fishes and shellfish 28 Table 5. Concentration of cupric ion at shellfish and sea water, and on brass plate in a model aquarium with sea water 64

7 ⅳ 그림차례 Fig. 1. SEM image of V. parahaemolyticus 15 Fig. 2. SEM image of Vibrio vulnificus 18 Fig. 3. Electron micrograph of Vibrio vulnificus 19 Fig. 4. Microscope image of V. cholerae 20 Fig. 5. Effect of cupric ion diffused from brass plate on the viability of Vibrio spp. in sea water at room temperature 42 Fig. 6. Concentration of cupric ion diffused from brass plate and Copper plate in a model aquarium with sea water 43 Fig. 7. Effect of temperature on the viability of Vibrio spp. in a model aquarium with sea water. 45 Fig. 8. Effects of brass plates on the viability of V. parahaemolyticus and concentration of cupric ion in a model aquarium with sea water 48

8 ⅴ Fig. 9. Survival time of V. parahaemolyticus at guts, gill and skin region of rockfish and concentration of cupric ion on brass plate in a model aquarium with sea water 50 Fig. 10. The filter system of a model aquarium with sea water 51 Fig. 11. The filters a model aquarium with sea water 51 Fig. 12. Survival time of V. parahaemolyticus at guts, gill and skin region of platefish and concentration of cupric ion on brass plate in a model aquarium with sea water 55 Fig. 13. Concentration of cupric ion at guts, gill and skin region of rockfish and viable count of V. parahaemolyticus on brass plate in a model aquarium with sea water 56 Fig. 14. Viable count of V. parahaemolyticus, total bacteria and concentration of cupric ion on brass plate in a model aquarium with sea water 58 Fig. 15. Viable count of V. parahaemolyticus at Shellfish and sea water, and concentration of cupric ion on brass plate in a model aquarium with sea water 61

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10 연구결과요약

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12 연구결과요약 3 1. 연구배경 우리나라국민들은수산물을섭취하는비중이가장높은국가중의하나로식생활습관으로해산물을날것으로많이먹고있으며이때발생할수있는질병은대부분수산물이주요원인식품인비브리오균감염증이다. 최근 웰빙식품 으로수산물에대한관심이고조되면서소비량이더욱증가하고있으며, 외국으로부터의수입량증가, 도시화산업화에따른환경오염즉지구의온난화, 하천오염및잦은태풍으로바다를오염시키고있어국제적으로도수산물의안정성이부각되고있는실정이다. 특히장염비브리오균식중독은대다수의경우휴유증없이쉽게치유되지만집단급식소의증가등으로이또한간과할수없는막대한물적인적피해를주고있으며, 국민보건에큰위해가될수있는이러한 Vibrio 균은제 1군법정전염병인콜레라의원인균 (V. cholerae) 이외에 V. parahaemolyticus 와 V. vulnificus 2종의비브리오균은보건학적측면에서매우중요하다. 조상의천년얼이담긴방자유기는구리 78% 와주석 22% 로이루어진합금으로이미그안정성과우수한기술이검증된우리고유의식기다. 최근식중독등각종유해세균을사멸시키고, 각종영양소를유지시켜주는등뛰어난효능이현대에들어밝혀짐으로써차츰차츰우리의곁으로다시닦아오고있으며재조명되고있다.

13 4 구리를이용한비브리오속균사멸효과 본연구에서는우리고유의식생활습관인생식어패류에대하여위생학적으로가장중요한병원성비브리오균의주요 3대종인 V. parahaemolyticus, V. vulnificus, 그리고 V. cholerae 뿐만아니라다른유해미생물을저감또는살균할목적으로우리선조들의천년지혜인방자의병원성균에대한억제및살균력을이용하여수족관에서비브리오균사멸효과를측정함으로서이들의실용화가능성을조사하였다.

14 연구결과요약 5 2. 연구방법 본연구에사용된균주는 Vibrio parahaemolyticus ATCC11143, V. vulnificus ATCC11177, V. cholera NAG ATCC11120을표준균주로사용하였으며, 구리이온의용출을위해구리판 ( mm, Cu, 100%) 과방자판 ( mm, Cu 78% : Sn 22%) 을제작하여사용하였다. 활어용횟집수족관 (78 W 73 L 47 H cm) 은여과통 (78 W 28 L 26 H cm) 에모래및 polyester를여과제로사용하였으며, 순환여과식으로냉각기를부착하여활어용수족관과동일하게제작하여사용하였다. 총세균및비브리오균배양은 1% NaCl 이첨가된 Tryptic soy agar(tsa) 및 TCBS Agar 를사용하였으며, 중온성세균배양법으로계 측하였고동정은생화학적검사와 Api20E Kit 를병용하였다. 구리및중금속의분석은 Microwave digester 를이용하여분해 여과 하여유도결합플라즈마발광광도계 (ICP-OES) 로분석하였다.

15 6 구리를이용한비브리오속균사멸효과 3. 결과및고찰 해수중방자판에의해용출된구리이온에대한비브리오균증식억제효과는장염비브리오균인 V. parahaemolyticus를 cfu/ml로접종하여 9시간후에는 2 cfu/ml이하로, 비브리오패혈증균인 V. vulnificus는 cfu/ml를접종하여 9시간이후검출되지않았다. 구리이온의용출은 24시간에 0.7 ppm까지증가하였으나, 구리를제외한 Sn, Pb, As, Cd 등은검출되지않았다. 수온조절에의한생육과저해는 14, 15 에서 V. cholerae NAG가 10 2 cfu/ml 수준을, V. parahaemolyticus 가 10 3 cfu/ml수준을유지하였으나 13 로수온을조절하였을때는 V. vulnificus 제외하고두균주에서보다더민감한저해를보였다 방자판으로부터용출되는구리이온의양에따른비브리오균저해효과는방자판 1매를적용하였을때 V. parahaemolyticus를초기농도 cfu/ml 가되도록접종한후 48시간경과시 10 cfu/ml이하로 99.9% 이상저해되었으며방자판 2매를적용한경우에는검출되지않았다. 이상의결과로부터 1매에비해 2매를적용할때 12시간이상저해속도가빨라져저해효과가상승하였으며구리의농도는증가하였다. 그러나 48시간이후 V. parahaemolyticus 가방자판 1, 2매적용시모두 10 cfu/ml 이하로검출되어구리이온에대한독성을고려할때본수족관 (200L) 에서는방자판 1매로도충분히비브리오균을저해할수있었다.

16 연구결과요약 7 수족관해수에장염비브리오균을 cfu/ml, 우럭의아가미에는 cfu/g, 내장에는 cfu/g, 피부에는 cfu/10cm 2 로감염시킨후방자판을적용한결과 6시간경과후해수에서는 cfu/ml, 아가미는 cfu/g, 내장은 cfu/g, 피부는 2 cfu/10cm 2 이하로각각 98%, 91%, 70%, 70% 가저해되었다. 해수와아가미에서는 48시간째에 cfu/ml, cfu/g 으로 99.9% 까지저해되었으며내장에도 cfu/g으로비브리오균이저해되었다. 그러나피부에서는 12시간이후비브리오균이검출되지않았으며 96시간후에는모든부분에서검출되지않았거나 2cfu/g이하의검출빈도를보였다. 해수중용출된구리의량을분석한결과시간에따른증가를보여주지않았고수족관여과제로사용된모래와 polyester filter에서각각 0.5 ppm, 97.8 ppm의높은농도로축적되었다. 수족관에비브리오균을감염시켜 cfu/ml 에서 cfu/ml 로 3 시간동안해수온도에의한저해가약 70% 나타났으며, 이 때광어의비브리오균감염상황은아가미에 cfu/g 내장에 cfu/g 피부에 cfu/10cm 2 였다. 또한해수중구리 의농도는 0.1 ppm 으로우럭의경우와동일하였다. 24 시간후에는해 수중에 cfu/ml 가검출되어 99.9%, 아가미와내장에서는 , cfu/g 이검출되어각각약 97%, 99.8% 가저해되 었다. 48 시간후에는 해수, 아가미내장모든부분에서 2 cfu/g (cfu/ml) 로 99.99% 저해되었거나검출되지않았다. 아가미의경우가 가장저해속도가느렸으며, 표면은 12 시간이후 2 cfu/10cm 2 이하로 나타났다. 이는광어의표면에서분비되는점액성의물질에의한균의

17 8 구리를이용한비브리오속균사멸효과 정착을방해하는것으로판단되었다. 방자판을적용한수족관에서우럭의각부위별아가미, 내장, 살 ( 횟감 ) 의구리농도를측정한결과내장과아가미에많이축적되었으며이중가장많이축적된부위인아가미는 12시간까지 1.5~1.8 ppm 수준을유지하다가 12시간이후 24시간까지 22 ppm으로급격히증가하였다. 내장의경우는 48시간동안커다란변동을보이지않고 7~17 ppm의농도로 6시간후에 17 ppm으로가장높았다가점차로감소하는경향을보였다. 이는활어에원래존재하는구리의농도와큰차이가없었던것으로단시간에는내장에축적되지않았다. 또한횟감인살에서의구리농도는 48시간동안에 0.7~1.3 ppm으로자연함유량에존재하는양의범위내에있어방자판에의해용출되는구리이온의축적은짧은시간에는이루어지지않았음을알수있었다. 광어생육시방자판의구리이온에의한총세균과장염비브리오균인 V. parahaemolyticus 의저해효과에있어서방자판을적용하여구리이온을용출시켜 96시간동안관찰한결과 V. parahaemolyticus 와호염성세균이 48시간후에각각 cfu/ml로, cfu/ml로 99.9% 이상저해되었다. V. parahaemolyticus 재접종을통해지속적인비브리오균의저해효과와동일한조건의다른수족관에서는 40시간동 안만방자판 1 매를투입 제거하여 V. parahaemolyticus 의저해에미 치는영향을조사한결과재접종한경우 12 시간후에는 cfu/ml 로 99.4% 가저해되었고, 40 시간을적용한경우는 cfu/ml 로 95% 가저해되었다. 24 시간후에는 cfu/ml, cfu/ml 로각각 99.99%, 99.9% 로거의대부분을저해하는

18 연구결과요약 9 효과를나타냈다. 이러한결과에서 40시간만적용한수조의경우용출된구리에의한효과는동일하나저해되는저감속도는약 6시간정도늦어지는결과를얻을수있었다. 따라서구리의농도에대한축적을고려하여방자판적용을조절함으로서보다효율적관리를할수있을것으로기대된다. 필터에흡착된구리의농도는 ppm으로과량의구리가검출되었다. 이는 2배이상장시간방자판을적용한결과로검출된구리의양도 2배로증가되었다. 패류에있어비브리오균저해효과는장염비브리오균인 V. parahaemolyticus를칼조개에 cfu/g, 가리비는 cfu/g, 백합 ( 대 ) 은 cfu/g 그리고백합 ( 소 ) 는 cfu/g으로감염시켜방자판을적용한결과 48시간후, 해수중에 cfu/ml 이검출되어 99.99% 가저해되었다. 반면칼조개가리비, 백합 ( 대 ), 백합 ( 소 ) 에서는해수보다는저해속도가느렸으나각각 cfu/g, cfu/g, cfu/g, cfu/g으로모두 99% 이상저해되었다. 72시간이후해수에서는불검출혹은 2 cfu/ml 이하로, 패류는 96시간이후의검사에서불검출혹은 2 cfu/g 이하로완전한저해를나타내었다. 이러한결과는패류가활어보다는저해효과가떨어지는것으로수족관에서의생존및활력이활어에비해떨어짐으로서내장에서의정착이더원활하고, 유기물의생산등세균생육에좋은환경을제공하여줌으로서구리이온에의한효과가떨어지는것으로생각된다. 패류중구리의축적량은칼조개, 가리비, 백합 ( 대 ), 백합 ( 소 ) 의구리 평균함유량은각각 18.7, 26.4, 15.7, 14.6 ppm 이었으며개체간의

19 10 구리를이용한비브리오속균사멸효과 범위는넓은편이였다. 48시간까지는자연함유량과의차이때문으로불규칙적으로나타났다. 그러나 72, 96시간후에는시간이경과함에따라백합 ( 소 ) 를제외하고는구리의축적량이증가하였다. 이상의결과로부터구리이온에의한비브리오균사멸효과는조상의천년지혜인방자가전통식기로사용되고그안전성이검증되어있으며, 용출된구리이온의어패류에의축적량에서도자연함유량을고려한다면매우미미한수준이며, 구리이온에의한비브리오속균에대해서완전한저해효과와수족관수의총균수도최대로억제함으로서수족관해수의규격기준을충분히충족할수있어일반횟집수족관에방자판을설치적용함으로서수온에의한저감과구리이온에의한저감이상호보완되어비브리오균의저감과저해효과와아울러경제적손실의극복을극대화할수있을것이다.

20 서 론

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22 서론 13 구리를이용한비브리오속균사멸효과 1. 서론 구리 (Cu) 를이용한 유기 제작은멀리청동기시대부터시작되었고고려시대에들어각종유기를만들기시작했으며, 궁중과귀족들이놋그릇을쓰기시작하게되면서 방자유기 로불리워졌으며일반인들에게도널리사용되었던우리의식기재료가되었다. 그뒤일제와현대산업사회를거치면서양은, 스테인레스에밀려차츰사라지게되었다. 그러나조상의천년얼이담긴방자유기는구리 78% 와주석 22% 로이루어진합금으로이미그안정성과우수한기술이검증된우리고유의식기였다. 최근식중독등각종유해세균을사멸시키고, 인체에유익한미네날성분을생성해주며, 각종영양소를유지시켜주는등뛰어난효능이현대에들어밝혀짐으로써차츰차츰우리의곁으로다시다가오고있으며재조명되고있다. 구리 (Cu) 는인간을포함한포유동물의필수영양소로서대부분음식물로부터섭취되고있다. 그러나미생물등다른생물체에서는그요구량이 1~10μ M수준으로매우낮으며과도한경우에는독성으로작용한다. 우리나라는 3면이바다로둘러싸여어업활동에알맞은천연조건을갖추고있으며국민들이수산물을섭취하는비중이가장높은국가중의하나이다. 2006년우리나라의총어업생산량은 303만 metric ton, 5조 2천억원을넘어섰으며, 양식어업총생산량도 126만 metric ton, 1조4천억원을상회하고있고, 매년꾸준한증가세를유지하고있다.( 통계청자료, 2007년 ) 최근 웰빙식품 으로수산물에대한관심이고조되면서소비량이더욱증가하고있으며, 외국으로부터의수입량증가, 도시화산업화에따른각종환경오염으로인하여바다가오염되고있다. 따라서국제적으로도수산물의안전성이부각되고있는실정이다. 특히어패류는익히지않고섭취하는수산

23 14 구리를이용한비브리오속균사멸효과 물의섭취량이높아지고있어식품위생및안전이더욱더요구된다. 이러한수산물수요를충족시키기위한횟집의수조는횟감으로사용될다양한생선및패류들이짧게는 1~2일길게는 1주일정도머무르는인위적인생활공간으로수족관수와어패류는이들에게질병의원인균을전파시키거나최소한균의생존을연장시켜줄수있는공간즉보존소의역할을할수있을가능성을가지고있다. 현재우리나라의식생활습관으로해산물을날것으로많이먹고있으며이때발생할수있는질병은대부분이수산물이주요원인식품인비브리오균감염증이다. 이중장염비브리오균식중독은대다수의경우휴유증없이쉽게치유되지만집단급식소의증가등으로이또한간과할수없는막대한물적인적피해를주고있고, 비브리오패혈증균은중증의질병으로진행되어사망하는경우도있다. 국민보건에큰문제가될수있는이러한 Vibrio 균은우리나라에서발생빈도가낮은 V. cholera를제외한다면 V. parahaemolyticus 와 V. vulnificus 2종의비브리오균이보건학적측면에서매우중요하다. V. parahaemolyticus 장염비브리오균은그람음성의운동성이있는다형성단간균이며, 1950년, 일본오오사카에서일어난식중독원인균으로서 Fujino에의해분리되었고후에여러가지성상이비브리오균과일치하여 V. parahaemolyticus 라고부르게되었다. 호염균으로바닷물에서유래되는인체감염증의원인균으로식염 3~4% 가함유된배지에서잘자라며, 위장관염이나설사증을일으킨다. 우리나라, 동남아시아각지역, 인도, 아메리카, 유럽에서도분포하며, 여행자설사의원인균으로도중요하다. 이균은살모넬라, 포도상구균과함께우리나라의 3대주요식중독균중의하나이다.

24 서론 15 Fig. 1. SEM image of V. parahaemolyticus * Left ; Agar medium. Right ; liquid medium 이균은바다의해안환경의침전물속에서서식하며, 따뜻해지면해수중에서자유생활을하거나해안과어패물에서서식하는것으로잘알려져있다. 충분히요리되지않거나날해산물, 해산물을다루는사람의손이나용기에의해오염된음식물또는오염된해수로씻은날음식등을먹을때전파된다. 실온에서오염된음식물을상당기간보존하면감염량수준 (10 6 /g 이상 ) 으로증식한다. 잠복기는 12~24시간이며자연스럽게회복한환자의 30% 는 1주일이상대변으로균을배출하며, 건강보균자는배균기간이짧고, 1주일이내에멈춘다고생각된다. 산발적으로혹은집단적으로발병하

25 16 구리를이용한비브리오속균사멸효과 며사람에서사람으로의전염은없다. 증상은산통성복통과물과같은설사 ( 수양성설사 ) 를하며가끔은구역, 구토, 두통및발열을동반한다. 대장염 ( 조직이침범되는경우 ) 이생기면이질과비슷하게변에혈액과점액이나오며, 고열과백혈구상승을초래하는환자도있다. 이런증세는 2~10시간계속되지만일반적으로 1~7일정도경과후회복된다. 전신감염증이나사망은드물다. 그러나지구온난화로인한기온의상승, 외식증가및집단급식의확대등으로식중독사고는 Table 1에서보는것처럼계속적인증가를보이다가 2005년에큰폭으로감소하였다가 2006년다시증가하는추세를보이고있으며특히장염비브리오에의한식중독사고는 4년간전체환자의 6.4%, 발생건수는 11.8% 를나타내고있으며계절적으로는 6월부터 10월까지집중적으로발생하고있어 ( 식의약청, 통계자료 ) 국민보건위생과경제에막대한손실을주는식중독균이다.

26 서론 17 Table 1. Distribution of food-borne pathogens in Korea from 2003 to 2006 No. of outbreaks and cases (outbreaks / cases) Total 135/7, /10, /5, /10,833 Subtotal 70/4,112 92/6,040 73/4, /6,156 Salmonella spp. 17/416 23/839 22/753 22/576 S. aureus 13/808 11/763 16/863 32/1,924 V. parahaemolyticus 22/732 15/300 17/663 25/547 B. cereus 3/198 2/84 1/24 5/59 Bacteria Clostridium perfringens 1/12 4/680-2/160 Botulium 1/ Campylobacter jejuni 1/215 3/175 1/175 1/53 Pathogenic E. coli 6/1,502 21/2,043 15/1,883 38/2,832 other 6/226 13/1156 1/45 1/5 Subtotal 16/1,606 18/1,407 8/744 54/3,371 Virus Norovirus 14/1,442 13/922 6/719 51/3,338 Other 2/164 5/485 2/25 3/33 Chemical - 1/1 8/1 1/4 Toxin 2/11 3/15 1/3 1/4 Unknown 47/2,180 52/2,926 26/550 77/1,288 ( 식품의약품안전청통계자료, 2007)

27 18 구리를이용한비브리오속균사멸효과 V. vulnificus 비브리오패혈증균은기수및연안에분포하는그람음성세균으로, NaCl의농도가 1~3% 인배지에서잘번식하는호염성이다. 오랫동안다른세균으로오인되었다가 V. parahemolyticus와달리락토스 (lactose) 를분해한다는사실이밝혀져 1979년에 V. vulnificus로명명되었다 (Farmer, 1979). 이균은 colistin 내성이지만, ampicillin이나 carbenicillin에는감수성이있어다른유사한세균과구별할수있다. 여름철해안지역을중심으로발생하며, 만성간질환등저항력이약한허약자들이어패류를생식하거나해안지역에서낚시또는어패류손질시균에오염된해수및갯벌등에서피부상처를통해서도감염된다. 잠복기는 1~2 일이며, 피부감염의경우는약 12시간이다. 40세이상의남자에서흔하며 ( 남 : 여 = 9:1) 주로해수온도가 18~20 로상승되는여름철에해안지역에서발생한다. Fig. 2. SEM image of Vibrio vulnificus. * A slightly curved bacterium, motile by means of a single polar flagellum.

28 서론 19 Fig. 3. Electron micrograph of Vibrio vulnificus. * The arrows mark fimbriae (pili) of the bacterium. V. vulnificus는구강으로섭취되어위장관에서직접혈류로들어가패혈증을일으키며, 혈중에일정농도이상으로증식하였을경우다시조직에침착되어괴저를일으키는병의경과를보인다. 이는피부감염만을주로일으키는항색포도상구균이나, 장관에서국소감염만을일으키는콜레라균, 또는구강으로섭취되어균혈증이나만성패혈증을일으키는장티프스균등과비교하여더광범위한병리스펙트럼 (wider pathologic spectrum) 을보여주며, 상대적으로단시간내에예후가결정되는특징을가지고있다. 따라서비브리오패혈증은뉴밀레니엄에인류의건강을위협하는가장위험한질환으로재등장한세균감염질환이다. 비브리오패혈증은초기에는경미한피부병변을나타내다가진행하여수포성피부및연조직괴저 (necrosis) 를일으키는데, 이때문에우리나라에최초로보고되었던 1980년대초기에는비브리오괴저병또는괴질이라고보고된이래호남지방을중심으로전국에걸쳐발생하고있으며, 매

29 20 구리를이용한비브리오속균사멸효과 년 20`~30 여명의사망자가보고되고있다. 이러한이유로법정전염병제 3 군으로지정되어관리되고있으며매년 4 월부터전국적으로해수, 갯벌, 수 족관수등을모니터링하여검출되거나환자가발생하였을경우경보 주의 보를발령하여비브리오패혈증에대한경각심과예방에만전을기하고있으 나그역기능으로심각한보건경제및사회적문제로자리잡고있다. V. cholerae V. cholerae 균은그람음성간균으로한개의편모가있어서운동성이활발하며아포나협막이없다. 현재분리된콜레라균의생물학적형 (biotype) 에는인도지방등에서유래한진성콜레라균 (Classical) 과이의생물학적변이형인엘트로 (El Tor) 형이있으며, ph 6.0이하나 56 에서 15분간가열하면균이죽는다. 끊는물에서는순간적으로죽으며, 실온에서는약 2주, 물에서는수일간, 그리고하천과해수에서는더오래생존한다. 냉장이나냉동상태에서는증식되지않으나균이죽지않는다. 콜레라균은주로오염된식수나음식물, 과일, 채소특히연안에서잡히는어패류를먹어감염되며감염에는 1억 ~100억개에이르는많은수의균이필요하므로직접접촉전파는유행에큰구실을하지못한다. Fig. 4. Microscope image of V. cholerae. * Left : Flagellar stain of V. cholerae Right : SEM image of V. cholerae

30 서론 21 우리나라에서는콜레라를제1군전염병으로분류하고있으며 ( 전염병예방법령, 2000) 또한세계보건기구는국제검역전염병으로분류하여콜레라발생이있는나라는공식적으로보고하도록하고그정보를매년발표하고있다 (WHO 2006). 1961년에시작한 V. cholerae O1의제7차대유행은전세계적으로여러나라에유행되었으며우리나라도그영향으로 10여차례의크고작은콜레라유행이있었다. 2001년 162명으로크게유행한후 2002년부터 5년간 36명으로매년 10명내외의환자가발생하고있다 (Wachsmuth, 1994). 이러한콜레라는병원성비브리오균중가장위험한균으로전세계에서소금끼있는물이나담수에서많은수가확인되고있다. 이들환경에서분리되는균은대부분콜레라독소를분비하지않으며설사를일으키지않거나심하지않다 ((Miller 등 1985). 그러나 V. cholerae 의혈청형에는전형적인설사증유행을일으키는균에서부터환경에서나타나는비병원성균까지넓은스펙트럼을가진다.(Miller 등 1985, Bourkc 등 1986). 우리나라의해역으로부터분리되는대부분의콜레라균도비병원성균으로위협적이진않으나해외여행의급증, 동남아국가로부터의수산물수입에의한해외유입전염병으로 2차적오염에의한감염등국가가관리하는 1군법정전염병을일으키는비브리오균이다. 비브리오균의현황과피해실태비브리오속균은 30여개의종으로기술되고있지만계속해서새로운종이추가되고있으며이종들대부분은임상환자에게서분리되고있지는않지만모두증식하는데소금을필요로하며농도는종에따라다양하다 (Balows 등 1992). 비브리오균에의한인체감염은일반적으로해양환경및해산물의섭취와밀접한관련이있는것으로알려져있다. 국내에서는비브리오속균가운데서도콜레라균 (V. cholerae), 장염비브리오균 (V. parahaemolyticus), 비브리오패혈증균 (V. vulnificus) 에의한감염이주를이루고있는데수산

31 22 구리를이용한비브리오속균사멸효과 물의식중독사고로 1950년, 일본오오사카에서일어난식중독의원인균이 V. parahaemolyticus 로보고된이래수산물섭취가많은아시아국가들에있어문제가되는병원성균으로회, 초밥, 생굴, 숙회, 조개류, 새우등어패류에서발생하고있다. Table 1에서보는바와같이식중독원인균중 2~3 번째로규모는적으나그빈도가많다. 특히여름철에집중적으로발생하고있으며비브리오균중질병을일으키는가장빈번한균이다. 또한여름철에비브리오패혈증파동이전국을휩쓸면심대한국가경제적손실이야기되는질병으로일단병원도착시에피부병변을나타낸환자들은바로패혈성쇼크증상을나타내고집중적인치료에도불구하고 50~80% 가사망한다. 이질환은미국, 일본, 덴마크, 스페인, 태국, 홍콩, 대만등전세계에걸쳐보고되고있으며, 특히우리나라에서가장높은발생률을나타내고있다. 따라서매년여름철비브리오패혈증주의보를발령하여국민들의경각심을높히고있으나그에대한부작용으로수산물섭취의기피현상으로시장의경제적타격이매우크다. 2001년콜레라감염환자는총 162명 ( 질병관리본부통계자료 ) 으로전국적으로대규모유행을일으킨영천시의경우관계기관의역학조사결과해산물생식과관련이있고해산물중일부가콜레라에오염되어발생한것으로밝혀지기도하였다 ( 감염병발생정보 ). 2005년 5월부터 2006년까지질병관리본부의국내해양환경내인체병원성비브리오균의분포조사실태조사사업 에서비응집성콜레라균 302 건, 패혈증균 244건, 장염비브리오균 3,017건을분리하였다고보고하고있는것처럼우리의해양환경도안전할수만은없는곳이다. 우리나라는 2003년부터 2006년까지총668건중장염비브리오균에의한것이 79건으로 11.8% 이였으며중국은 1991~2001년까지 5,770건의 outbreak 로 31.1%, 대만은 1981~2003까지전체식중독사고의 69%, 일본은장염비브리오식중독사고의빈도는 9~16% 를차지하고있으며원인식

32 서론 23 품별로보면회 26%, 초밥 23%, 조리된해산물 12% 로이루어져있다. 이렇듯수산물로기인되는위해성미생물을관리하기위해수산물에대한기준을설정하고있다. 각국의수산물유해미생물에대한기준은발생빈도가높은특성으로 12개항목즉, 세균수, 대장균군, 장관독소원성대장균, 살모넬라, 리스테리아, 황색포도상구균, Clostridium, Botulum, 비브리오패혈증, 장염비브리오, 콜레라가포함되어있었다. 우리나라의경우 Table 2에서와같이세균수와대장균을대상으로관리되고있으며, 특히다른나라와달리횟감이생식되고있기때문에생식및횟감용수산물은세균수 10 5 cfu/g 로, 살모넬라, 리스테리아, 황색포도상구균, 장염비브리오, 콜레라는검출되어서는안된다고규정하고있다. 또한수족관의해수는세균수 (10 5 cfu/ml) 와대장균군 (10 3 cfu/100ml) 을관리하고있다. 일본도우리와비슷하지만생식용굴 (10 4 cfu/g), 횟감용굴 (230 MPN/100g), 횟감용어패류 (100 MPN/g) 로나누어관리기준을정하고있다. 미국, 캐나다, 유럽, 호주등선진국에서도이들유해미생물에대한규제와기준정하고있으나나라의식문화습관의차이에따라굴을제외한생식을거의하지않기때문에횟감용에대한특별한규정은정하고있지않고있다.

33 Table 2. Comparison of microbiological safty standards in each nations on marine food 세균수 Korea Japan U.S.A EU Canada Australia 생식용냉동어, 패류및냉동대구머리가공품 : 10 5 /g 냉동창란 : /g 대장균군 생식용냉동어 패류 : 10/g 문어 ( 자숙, 냉동 ), 게 ( 자숙 ) : 10 5 /g 생식용굴 : /g 냉동식품 : 10 5 /g 어묵제품, 게 ( 자숙 ), 문어 ( 자숙, 냉동 ), 냉동식품 : 음성 E. coli - 횟감용굴 : 230MPN/100g 장관독소원성대장균 살모넬라 리스테리아 S. aureus Clostridium botulinum V. vulnificus 냉장 냉동수산물 ( 횟감용 ) : 음성 냉장 냉동수산물 ( 횟감용 ) : 음성 냉장 냉동수산물 ( 횟감용 ) : 음성 굴, 홍합, 조개류 ( 신선, 냉동 ) : /g 굴, 홍합, 조개류 ( 신선, 냉동 ) : 230MPN/100g - - 갑각류 ( 냉장전가열 ) :10 6 /g 갑각류 ( 냉동전가열 ) :10 5 /g 연체류, 패류 ( 비가열열섭취 ) : 5 개시료중중 1 개이하 ( 단 /g 이하 비가열섭취식품 : 1,000/g 음성 10,000/g 미만 장독성의경우 : 음성 포자생성없고독소가없어야함 비가열섭취식품 : 음성 활어및패류 : 230MPN/100g 또는분변계대장균군 300MPN/100g 가열조리된갑각류패류 ( 탈각 ):10-100/g 가열조리된갑각류패류 : 불검출 가열조리된갑각류패류 ( 탈각 ): /g 비가열섭취식품 : 5 개시료중 1 개이하 ( 단 40/g 이하 ) 생식용패류 : 5 개시료중 1 개이하 ( 단 330/100g 이하 ) 기타식품 : 5 개시료중 2 개이하 (40/g 이하 ) 음성 냉동식품 ( 저장기간 10 일이상 ): 음성 냉동식품 ( 저장기간 10 일미만 ) : 100/g 미만 갑각류 ( 냉장전가열 ) : 10/g 갑각류 ( 냉동전가열 ) : 9/g 연체류, 패류 ( 비가열섭취 ): 5 개시료중 1 개이하 (7/g 이하 ) 갑각류 ( 냉장 냉동동전가열 ) : 음성 상어류,gemfish, 다랑어류 ( 훈제진공포장 ) : 음성 홍합류 ( 비가열섭취 ): 음성 갑각류 ( 냉장 냉동동전가열 ): 음성 비가열섭취식품 : 음성 V. parahaemolyticus 냉장 냉동수산물 ( 횟감용 ) : 음성 횟감용어패류 : 100 MPN/g 문어 ( 자숙, 비가열섭취 ): 음성 게 ( 자숙 ) : 음성 비가열섭취식품 : 10,000/g V. cholerae 활, 신선 냉장품, 냉동품 : 음성 비가열섭취식품 : 음성 가열조리또는비가열섭취식품 : 음성 갑각류 ( 냉장 냉동동전가열 ): 음성 패류 ( 비가열섭취 ): 음성

34 서론 25 구리의현황과규제구리는붉은색의전이금속으로원자번호는 29이며, 암석, 토양, 물, 침전물, 대기등여러환경매체에자연적으로존재하는물질이기도하다. 구리는지각의구성물질로평균적으로약 50 ppm 정도의농도를갖고있으며, 모든동식물에자연적으로존재한다. 구리는저농도에서는인간을포함한모든살아있는동물에필요한필수원소이지만, 고농도에서는독성을나타낸다 (ATSDR, 2004). 구리는해수에서 CuCO의형태로용존되어있거나염분이낮은하구역및연안역에서는 CuOH + 의형태로혹은유기분자와결합한상태로존재하기도한다. 그러나구리는타중금속류에비하여해수에서여러가지유기물질에비교적잘흡착되며해수중의구리농도는약 83% 가입자들에흡착되어해수로부터쉽게제거되는것으로추정된다. 구리및그화합물은주로음식이나물의섭취를통한경구적으로섭취되며, 유입된구리는위와소장에서쉽게흡수되며, 아미노산, 지방산, 비타민등과함께정상적인대사과정에서필요하다. 그러나인체는구리를합성하지못하므로섭취를통하여일정량을공급받아야한다. 인체에필요한양이상은체외로배출된다. 과량의구리는위점막세포에흡착되어금속결합단백질인 metallothionein에결합한다. 이와같이결합된구리는세포의탈리를통해배출된다. 장에 metallothionein으로결합되어있던구리가분리되면, 간으로이동하고간에서간 metallothionein으로저장된다. 이후최종적으로는담즙을통해배설물로배출된다. 이처럼간은체내의구리의항상성 (homeostasis) 에중추적인역할을수행한다. 구리는인체에있어서결핍과과잉모두에서독성을나타낸다. 그러므로인체에서구리의독성은항상성 (homeostasis) 의파괴에서기인한다고할수있다. 구리는수많은금속효소 (metalloenzyme) 와구리의존성효소 (copper-dependent enzyme) 에필수적인원소이다. 그러므로구리결핍은빈혈, 백혈구감소증 (leukopenia),

35 26 구리를이용한비브리오속균사멸효과 골다공증 (osteoporosis) 등의증상을일으킨다. 고농도의구리에노출시, 인체에부정적인영향을나타내는데, 간및신장손상, 빈혈, 면역독성, 발생독성 (developmental toxicity) 등이이에해당한다. 또한구리는심혈관계독성, 혈액독성, 생식독성등을나타내는것으로의심받고있다 (ATSDR, 2004; HSDB, 2005). 포유동물에대한구리의독성은비교적낮은것으로보고되고있다. 이는포유동물은간과신장에서구리를무해화 (detoxification) 할수있는생화학적체계를보유하고있으며, 구리가유기물과결합하여생체이용도가낮기때문인것으로보고되고있다. 그러나구리는수계에서는환경에독성을나타내며, 어류와갑각류는포유동물보다구리에약 10~100배더민감하여, 특히조류는포유동물보다구리에약 1,000배정도더민감하다. 실험실에서의실험결과를통해서, 물벼룩과같은플랑크톤은어류에비해구리에더민감하다는것이밝혀졌지만, 독성치는매우광범위한것으로보고되고있다. 그러나실제의수질환경에서구리는금속형태의구리로존재하는 경우가드물다. 결과적으로구리는수생생물에독성을나타내며, 구리의 독성과생체이용도 (bioavailability) 는수체의 DOC(Dissolved Organic Carbon) 농도에의해조절된다. 즉구리는용존휴믹산 (humic acid) 과다른유기화합물과착화합물을형성하는경향이있다 (Wright and Welbourn, 2002). 수생생물에대한구리의생태독성자료로서녹조류인 Selenastrum capricornatum에대한 EC 50 (14days) 은 mg/l, 해수에서조류인 Thalassiosira pseudonana에대한 EC 50 (72hr) 은 mg/l, Nitschia closterium에대한 EC 50 (96hr) 은 mg/l, Chlorella stigmatophora 에대한 EC 50 (21days) 은 0.07 mg/l로보고되고있다. 조개류인 Corbicula manilensis에대한 LC 50 (96hr) 은 2.6 mg/l, 은연어 (coho salmon) 인 Oncorhynchus kisutch에대한 LC 50 (96hr) 은 mg/l,

36 서론 27 무지개송어 (rainbow trout) 인 Salmo gairdneri의치어에대한 EC 10 (28days) 은 mg/l로보고되고있다 (HSDB, 2005). 중금속의생물에대한영향에대한연구는 Tattersfield와 Morris(1924) 에의해실시된이래중금속의실험기술및방법등이여러학자들에의해서발전되어왔다. 해양생물에미치는오염원의영향에관한연구로는갑각류 (knickmeyer와 Steinhart 1988, Dillon 등 1990, Dillon과 Burton 1991), 어류 (Staveland 와 Marthinsen 1989, Ruiz와 Liorente 1991, Borgamann 과 Whittle 1992), 플랑크톤 (Richer과 Peters 1993) 및패류 (Hummel 등 1989, 1990, Ferreria 등 1990) 등의다수가보고되고있다. 해양생물의중금속축적에대한국내의연구는조와김 (1971) 이녹색굴 Crassostrea gigas, Crassostrea rivularis에서구리의함량을, Won(1973) 이어패류에서수은, 카드뮴, 납의함량을조사하였다. 그리고 Moore와 Rainbow(1987), Rainbow와 White(1989,1990) 에의한중금속의체내축적에대한보고가있다. Table 3. The Standard of natural environment on Cu in sea water Nation Standard of natural environment(mg/l) Korea 0.02 Japan - Australia Wasington State of U.S.A

37 28 구리를이용한비브리오속균사멸효과 Table 4. The Standard of Cu concentration on fishes and shellfish Nation Standard of allowance(mg/l) Fishes Shellfish Mollusk Australia Newzealand 30 - U.K 20 - U.S.A 구리의국내수질기준은먹는물수질기준, 수질환경기준, 배출허용기준이설정되어있고, 특정수질유해물질중하나로지정되어있다. 국내의구리에대한먹는물수질기준은심미적영향물질에관한기준으로 1 mg/l 이하로설정되어있다. 수질환경기준으로는하천, 호소, 지하수에관한수질환경기준을설정되어있지않지만해역의경우사람의건강보호를목적으로전수역에대하여 0.02 mg/l 이하로설정되어있다 (Table 3). 미국의경우, 구리에대한수질기준은먹는물수질기준, 수질환경기준, 배출허용기준이설정되어있다. 구리에대한먹는물수질기준은목표치인 MCLG(Maximum Contaminant Level Goal) 는 1.3 mg/l로설정되어있고, 규제치인 Action level은 1.3 mg/l로설정되어있다. 또한구리에대한심미적기준 (secondary drinking water regulations) 으로 1.0 mg/l이설정되어있다 (USEPA, 2004). 미국에서구리에대한인체건강기준은 1.3 mg/l로설정되어있으며, 수생생물의보전을위한기준으로담수에대하여급성독성기준인 CMC(Criterion Maximum Concentration) 는 mg/l, 만성독성기준인 CCC(Criterion Continuous Concentration) 는 mg/l로설정되어있다. 또한해수의경우, 수생생물의보전을위한 CMC는 mg/l, CCC는 mg/l로설정되어있다 (USEPA, 2002a). 이러한기준치는물의경도 (hardness) 를고려하여농도가결정된다.

38 서론 29 특히구리의경우 DOC(Dissolved Organic Carbon) 의농도가높을경우, 독성이감소하기때문에구리의생체이용도 (bioavailability) 와수생생물에대한독성을고려한 WER(Water-Effect Ratio) 을이용한다 (USEPA, 2001). 또한구리의수질환경에서의심미적기준 (Organoleptic effects criteria) 은 1 mg/l로인체건강에대한기준보다강화되어있다. 일본의경우, 구리에대한먹는물수질기준은먹는물성상관련항목으로 1.0 mg/l 이하로설정하고있으며, 수질환경기준에서는 copper-8- hydroxyquinoline(oxine copper) 을주요감시항목으로설정하고있으며, 지침으로 0.04 mg/l를제시하고있으나해수에서는정해져있지않다 (Table 3). WHO에서는구리에대한 PMTDI(Provisional Maximum Tolerable Daily Intake) 를 0.5 mg/kg으로하여인체건강에대한음용수수질권고치로서 2 mg/l를제시하였다 (WHO, 1993). 또한심미적기준으로이보다낮은 1 mg/l를제시하였다. 어패류에대한구리의기준은호주, 뉴질랜드는 30 mg/l, 영국은 20 mg/l, 미국은패류의경우 100 mg/l를허용기준치로제시하고있다. 그외각국가별어패류수산물의중금속기준설정은 6항목으로수은, 납, 카드뮴, 니켈, 비소, 크롬으로나라의사정에따라그규격을달리하고있고이는국가마다섭취하는수산물의종류와환경에따라달리하고있으며, 우리나라도수은, 납, 카드뮴을관리하고있으나구리에대한규격은설정되어있지않다. 구리의섭취량에대하여는우리나라는미국의 NRC(National Research Council) 에서설정한기준을참조로성인이 1.5~3.0 mg/day을책정하고있다. 그러나식품의약품안전청의중금속에대한모니터링조사결과구리의섭취량은성인 ( 체중 60kg) 의경우약 1 mg정도이며이는구리의잠정일일섭취허용량 30 mg의약 3% 에불과하여우리나라의경우여러식품을

39 30 구리를이용한비브리오속균사멸효과 통해더많이공급되는것이바람직하다는결론으로미루어구리의섭취에 보다많은관심을기울려야할것으로생각된다. 비브리오균의저감을위한방안들비브리오균에의한감염성질병예방에는가열처리후섭취가가장완벽한방법이되지만미각을중시하는전통적인식문화에있어단백질변성이수반되는가열처리가이상적이라할수없다. 서구지역에서는굴이외에는생식을거의하지않지만우리나라와동남아지역에서는많은생선들이생식을위한횟감으로이용되고있으며위생적으로취약한여름철에는우럭, 광어, 돔등다양한어패류들이생식에이용되고있는실정이다. 이러한생식이발병으로까지진전되는데는개별적인차이가크겠지만섭취되어지는균의양도크게영향을미칠수있다. 이러한차원에서비브리오균을저감시키기위한많은연구가이루어져왔으며주로냉장, 냉동, 열처리, 및급속한삼투압쇽크, 초고압처리, 방사선조사와관련된연구보고가있으나이러한처리를해산물에적용하기에는품질변화와소비자의인식등문제점을안고있다. 수산제품에서의비브리오균의저감및제거방안들로는생물학적정화법으로패류의채취전오염된지역으로부터청정지역으로옮겨자연적인생물학적정화를시키는지극히기본적인방법이있으나연안지역의오염이증가하고, 비브리오균이패류의내장에정착되어있어그효과는미비하였다. Depuration 과정에서염소, 요오드의효과를살펴본연구에서어떠한방법도 V. parahaemolyticus를제거하는데는쉽지않다고보고하고있다. 또비가열공법중의하나로방사선조사방법이있다. 3 kgy이하의낮은조사로굴은죽이지않고굴의관능적특성을변화시키지않는것으로보고되었다그러나이는소비자의방사선이조사된식품에대한거부감이단점이라할수있다.

40 서론 31 자외선소독 (Tamplin and Casper 1992) 오존처리 (Schneider 등 1991), Generally Recognizied as Safe(GRAS) 화합물 (Sun and Oliver, 1994), Chelating agent( 정등 1989) 등을처리하는방법및천연식품재료와식품첨가물을이용한증식억제효과에대한보고도있다. 이외에도수온을 15 로낮추어균증식을억제하는수온조절방법 (Tamplin and Casper 1992) 이보고되어있으나이역시수온을인위적으로조절할시에어패류가받는 Stress와저수온으로인한성장제해등의문제로사용하기어려운방법이다. 최근에다당질-단백질배합체 (polysaccharide-protein conjugate) 를이용한백신을합성 (Devi 등 1995) 하였으나비브리오패혈증의인지부족으로백신을접종받는사람이드믄실정이다. 최근하절기수산물에의한식중독예방을위하여활어패류취급장이나횟집에서유용하게활용할수있는전기분해해수를이용한활어조위생처리기술을개발하여활용하고있다. 따라서본연구에서는우리고유의식생활습관인생식어패류에대한 ready to eat로식품안전과위생요구, FTA 등국제사회에대한수산물의안전성부각, 지구온난화, 산업화에의한환경적오염으로가장문제시되고있는병원성비브리오균의주요 3대 species 인 V. parahaemolyticus, V. vulnificus 그리고 V. cholerae 균을사용하여이들비브리오균 (Vibrio spp.) 뿐만아니라다른유해미생물을저감또는살균할목적으로우리선조들의천년지혜인방자의병원성균에대한억제및살균력을활용하여수족관에서비브리오균증식억제효과를측정하여이들의실용화가능성을검토하였다.

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44 재료및방법 재료및방법 2.1 실험재료 본실험에사용된해수는일반활어및패류판매점에공급되는해수전문판매점 ( 시흥월곶 ) 으로부터구입하여사용하였다. 활어는일반인이가장많이횟감으로선호하는광어, 우럭을대상으로수산물도매시장 ( 노량진수산시장 ) 으로부터활력이좋은건강한개체를구입하였으며, 실험실로이송된어체중 (body weight) 은우럭은 400~500g 광어는 600~700g으로실험실의 250L( 78W 73L 47H cm) 순환여과식수조에서수온 14±0.5 로유지하여 12시간순치시킨후실험에사용하였다. 패류는가리비, 백합, 키조개등건강한개체를수산물도매시장으로부터구입하여 150L 순환여과식수조에서수온 14±0.5 로유지하여 12시간순치시킨후실험에사용하였다. 방자판은중요무형문화재로지정된안성맞춤유기공방으로부터주문제작하였다.( mm, Ansung Yugi, Ansung, Korea) 또한구리판은 100% 구리 ( mm) 를구입사용하였다. 2.2 사용균주및배지증식억제효과측정에사용한균주는 V. parahaemolyticus ATCC11143, V. vulnificus ATCC11177, V. cholera NAG ATCC11120 를사용하였다. 즉 1% NaCl-TSA에배양한각균주를멸균생리식염수 (saline, 0.85% NaCl) 에현탁하여본실험의접종액으로하였다. 각시료로부터비브리오속균측정은 TCBS Agar 배지를사용하여십진단계희석법을이용하여측정하였다. 호염성총균수의측정은 1% NaCl-TSA를십진단계희석법을이용하여측정하였다

45 36 구리를이용한비브리오속균사멸효과 2.3 총균수및총비브리오균측정해수중의총균수및총비브리오균은중온성세균배양법으로시행하였다. 즉, 희석액을사용하여십진단계희석법으로적당한농도 (1mL당세균수가 30~300개로추정될수있는농도 ) 로희석하고, 각단계희석액을총균수는 1% NaCl-TSA, 비브리오균은 TCBS Agar 배지에각페트리접시 2매이상에무균적으로접종하여 35±0.5 에서 24±2 시간배양하여형성된집락을계산하였다. 집락수는평판당 30~300개의집락을형성한평판을택하여그평균값으로하였다. 활어는무균적으로아가미와내장을적출하여약 5~10g을정확히평량하여잘게자른후멸균생리식염수 (0.85%, NaCl) 와함께멸균필터백 (Nasco Whirl-Pak, U.S.A.) 을이용하여스토마커를사용균질화한것을시험용액으로하였다. 활어의표면시료는멸균면봉을이용하여일정면적 (10 10 cm) 을닦아내어 5 ml의멸균생리식염수를넣어세게진탕하여부착균의현탁액을조제하여시험용액으로하였다. 패류는무균적으로전체혹은 1/2로나누어약 5~10g을정확히평량하여잘게자른후멸균생리식염수 (0.85%, NaCl) 와함께멸균필터백 (Nasco Whirl-Pak, U.S.A.) 을이용하여스토마커를사용균질화한것을시험용액으로하였다. 모든시험용액은십진단계희석하여위의방법과동일하게총균수및총비브리오균수를측정하였다 2.4 중금속분석해수는시간별로 50mL을채취하여그중 10mL에질산 1mL를넣어 Hot plate에서유기물질을산분해한후 0.5N HNO 3 용액으로 50mL가되게희석하여염농도를낮추어 0.2μm필터 (syring filter, Whatman, U.S.A.) 로여과한후그여액을유도결합플라즈마발광광도계 (ICP-OES, Perkin

46 재료및방법 37 Elmer, Optima 5300DV, U.S.A.) 로분석하였다. 채취한활어의아가미, 내장을적출하고살은껍질을분리하고, 패류는컵질을제외한모든부분을건조기를이용하여건조시킨후분쇄하여중금속분석시료로사용하였다. 조제시료는약 0.5~1.0g을정확히평량하여 HNO 3, 9mL와 H 2 O 2 1mL를넣어 Microwave digester(ethos Plus, Microwave laboratory System, Italy) 를이용하여실온에서 200 까지분당 5 씩상승시켜 15분간분해하였다. 분해후 Hot plate에서서서히 HNO 3 를제거하고 0.5N HNO 3 10 ml로희석하여 0.2μm필터 (syring filter, Whatman, U.S.A.) 로여과한후그여액을 ICP-OES(Perkin Elmer, Optima 5300DV, U.S.A.) 로분석하였다.

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48 결과및고찰

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50 결과및고찰 결과및고찰 3.1 방자판 (Brass plate) 에의한비브리오균억제효과 해수중방자판에의해용출된구리이온에대한비브리오균증식억제효과는 Table 5에나타내었다. 본실험은실온에서약 20L의수조를이용한것으로비브리오균중보건위생에가장많은피해를주고있는장염비브리오균, 비브리오패혈증균을대상으로실시하였다. 그결과장염비브리오균인 V. parahaemolyticus는 cfu/ml로초기접종한후 6시간경과시 cfu/ml 로 99% 이상, 9시간경과시에는 2 cfu/ml이하로대부분저해되었다. 비브리오패혈증균인 V. vulnificus는 cfu/ml로초기접종후 6시간경과후에 10 cfu/ml 이하, 9시간이후는검출되지않았다. 반면방자판을넣지않은대조구는 V. parahaemolyticus를 cfu/ml 접종하여 24시간동일조건하에두었을때 cfu/ml까지증식하였다. 방자판은구리와주석의비가 78 : 22로이루어진합금으로구리이온의용출은 6시간에 0.23 ppm, 9시간에 0.43 ppm, 24시간 0.7 ppm으로증가하였으나, 구리를제외한 Sn, Pb, As, Cd 등은검출되지않았다. 이상의결과로부터해수에방자판을적용하였을때구리이온의용출이이들균의생육을저해하거나살균효과가있는것을알수있었다. 이는정등 (2004) 이방자유기에대한살균력실험에서그람음성세균인 E. coli, S. typhimurium의경우 16시간후 10 7 ~10 8 cfu/ml 에서 10 cfu/ml이하로저해되었다는보고와유사한것으로이는그람음성세균인비브리오속균의저해에유효함을알수있었다.

51 42 구리를이용한비브리오속균사멸효과 6 1 Viable count (log cfu/ml) V. vulnificus Control Cu V. parahaemolyticus Cu(ppm) Time (hr) 0 Fig. 5. Effect of cupric ion diffused from brass plate on the viability of Vibrio spp. in sea water at room temperature. * Control : None of applied brass plate and infected V. parahaemolyticus in a model aquarium(20l) with sea water : Time of infection : Time of brass plate application

52 결과및고찰 방자판과구리판에의한구리의용출방자판과 100% 구리판에의한구리이온의용출량을비교하기위하여동일수족관 ( 해수량약 200L) 에서용출되는구리양을측정한결과 Fig. 6과같다. Cu(mg/L) Copper plate Brass plate Time(hr) Fig. 6. The concentration of cupric ion diffused from brass plate and copper plate in a model aquarium with sea water. * The size of brass plate and copper plate is mm : Time of brass plate and copper plate application

53 44 구리를이용한비브리오속균사멸효과 구리판 ( mm) 의경우 12시간까지 0.09 ppm까지, 24시간에 0.11 ppm, 48시간 0.23 ppm, 120시간째는 0.72 ppm으로용출된구리의양이증가하였다방자판 ( mm) 은구리판보다는약간낮은농도로동일한양상을보였다즉, 12시간째 0.05 ppm, 24시간은 0.07 ppm, 48시간째는 0.19 ppm 그리고 120시간째는 0.68 ppm이용출되었다. 그러나구리를제외한 Sn, Pb, Cd 등유해중금속은검출되지않았다. 이는정등 (2004) 의보고에따르면실온에서방자유기와구리용기에서의구리의용출농도는 24시간째에각각 29ppm, 33ppm이었다는보고에서볼때용량의차이와실험온도의차이가있으나용출되는양상은비슷하였다. 따라서구리이온에의한비브리오균의저해는비슷한결과를보여주었으나어패류의섭취에대한일반인들의인식에있어서우리조상들이천여년동안사용해온방자는안전성과우수성이검증되어있어거부감이전혀없는반면구리판은금속에대한거부감과구리판과방자판에피복된유기물에의한색깔의변화등으로구리판보다는방자판이훨씬더친밀감을가지고있고실용화를위해보다효과적이라고사료된다. 따라서이후의실험에서는구리의용출에의한비브리오균저해효과와용출량이비슷한방자판을이용하여실험을실시하였다.

54 결과및고찰 45 Viable count(log cfu/ml) V. paraheamolyticus V. vulnificus V. cholera 0 In Fig. 7. Effect of temperature on the viability of Vibrio spp. in a model aquarium with sea water. * 3 kinds of Vibrio spp. were counted at intervals of 24hr for each temperature. In : Time of infection : Time of brass plate application

55 46 구리를이용한비브리오속균사멸효과 3.3 해수온도에따른비브리오속균의저해방자판을횟집수족관에적용하기위하여여름철횟집수족관의해수온도를보통 16 에서 13 까지해수온도를조절하여사용되고있어이와동일한조건을설정하기위하여온도에따른비브리오균의생존여부를살펴본결과는 Fig. 7과같다. 병원성을갖는 3종류의비브리오균즉, V. parahaemolyticus, V. vulnificus 및 V. cholerae NAG 를 13~15 (16 에서는균의생육상태가양호하여온도에의한저해효과를증대시키기위하여 15 부터실시함 ) 까지 1 간격으로 24시간생육시키면서점증적으로온도를낮추면서관찰한결과모든비브리오속균에서수온조절에의해저해됨을알수있었다. 장염비브리오균인 V. parahaemolyticus 는 15 에서 cfu/ml 로 감염시켜 24시간경과후 cfu/ml로 45%, 14 에서는 4, cfu/ml로 50%, 13 에서는 cfu/ml로 93% 가저해되었다. V. vulnificus 는 15 에서 cfu/ml 로감염시켜 24시간경과후 cfu/ml로 33%, 14 에서는 cfu/ml 61%, 13 에서는 cfu/ml 로거의변화가없었다. V. cholerae NAG는 15 에서 cfu/ml로접종하여 24시간경과후 cfu/ml으로 17%, 14 에서는 cfu/ml으로 40% 그리고 13 에서는 cfu/ml로 98% 로나타나해수중온도변화에따른저해효과가상대적으로컸다. 이상의결과에서 15, 14 에서는 V. cholerae NAG가 10 2 cfu/ml 수준을, V. parahaemolyticus 가 10 3 cfu/ml수준을유지하였으나 13 로수온을조절하였을때는 V. vulnificus 보다저해효과가높았다. 이러한결과는 Tamplin 과 Casper(1992) 가보고한수온조절에의한비브리오균저감방안을제시한저온효과와동일한결과를얻을수있었다. 그러나수온을낮게조절함으로서비브리오속균의저해는달성할수있지만너무낮은온

56 결과및고찰 47 도는활어와패류에스테레스를줌으로서활력과생존에위협이되고, 경제적관점에서비용이높아지는결과를초래하게된다. 반면온도를높이면완전한저해혹은안전한수준의저해효과를기대할수없는단점을가지고있으며어패류의생육시내장등에감염되어비브리오균이생존하고있기때문에방자판에의한구리이온의살균작용과수온조절을병용하면저해및저감을극대화할수있고경제적비용도절감할수있을것이다. 따라서일반횟집수족관의사용온도인 14~16 를고려하여 14~15 를사용하는것이비브리오균의저해에복합적상승작용을거둘수있을것이며, 구리이온에대한저해를극대화하기위해수족관의온도를 14 로하여실험을실시하였다.

57 48 구리를이용한비브리오속균사멸효과 Viable count (log cfu/ml) V. parahaemolyticus 2 sheets 1 sheet Sea water Cu Cu(ppm) Time (hr) 0 Fig. 8. Effects of brass plates on the viability of V. parahaemolyticus and concentration of cupric ion in a model aquarium with sea water. * 1 sheet : One brass plate was applied in an aquarium 2 sheets : Two brass plates were applied in an aquarium Aquarium Vol. : about 250L The size of brass plate is mm : Time of infection, : Time of brass plate application 3.4 구리이온량에따른비브리오균의저해 방자판으로부터용출되는구리이온의양에따른비브리오균의저해효과를 알아보기위하여방자판 ( mm) 을동일수족관에 1~2 매를적

58 결과및고찰 49 용하여장염비브리오균인 V. parahaemolyticus 에대한저해효과를 Fig. 8에나타내었다. 방자판 1매를적용하였을때 V. parahaemolyticus를 cfu/ml이되게접종하여 12시간경과후에 cfu/ml로약 90% 가저해되었으며 24시간경과후에는 cfu/ml로약 98%, 48시간경과후에는 10 cfu/ml이하로 99.9% 이상저해되었다. 반면에방자판 2매를적용하여해수에 V. parahaemolyticus를 cfu/ml 되게초기접종하였을때 12시간후에 cfu/ml로 99% 이상의저해를, 24시간이후에는 10 1 cfu/ml 이하로 99.9% 이상의저해효과를보였으며 48시간후에는검출되지않았다. 이상의결과로부터 1매에비해 2매를적용할때 12시간이상저해속도가빨라져저해효과가상승하였으며구리의농도는증가하였다. 정등 (2004) 은 CuSO 4 를농도별로첨가하였을때그람양성세균은 25 ppm, 그람음성은 15 ppm이상에서저해되었다고한보고와최와기나에 (1994) 의넙치, 숭어, 조피보락의치어에대한구리의독성연구에서도 48h LC50의구리농도차이, 박과김 (1979) 의빙어및돌돔에대한구리의영향등에서볼수있는것처럼방자판으로부터용출된구리이온에의한비브리오균에대한구리이온농도에따른독성때문이라할수있다. 그러나본실험의결과로부터 48시간이후 1, 2매모두 10 cfu/ml 이하로검출되어구리이온에대한독성을최소화한다면본수족관 (200L) 에서는방자판 1매로도충분히비브리오균을저해할수있을것으로판단되며실제수족관에적용시는수족관의크기및어패류의채류시간등을고려하여결정할수있다고판단된다.

59 50 구리를이용한비브리오속균사멸효과 Viable count (log cfu/ml, g wet.) Guts Gill Cu Skin Sea water V. parahaemolyticus C S F Time (hr) Cu (ppm) Cu (ppm) Fig. 9. Survival time of V. parahaemolyticus at guts, gill and skin region of rockfish and concentration of cupric ion on brass plate in a model aquarium with sea water. * C : Control(New polyester filter) S : Sand F : polyester filter : Time of infection : Time of brass plate application

60 결과 및 고찰 51 Sea water Sand Polyester filter Filter system Fig. 10. The filter system of a model aquarium with sea water. A Fig. 11. The B filters of a model aquarium water. * A : Polyester filter, B : Sand with sea

61 52 구리를이용한비브리오속균사멸효과 3.5 구리이온에의한활어생육중비브리오균저해와구리의축적 우럭의생육중 V. parahaemolyticus 의저해방자로부터기인된구리이온에의한비브리오균의저해효과, 수족관의온도, 수족관의용량에따른방자판수량을결정하고일반횟집수족관과동일하게적용시킨후우리나라사람이가장많이찾는횟감중의하나인우럭을수산물도매시장으로부터구매하여입식한후약 12시간순치시킨다음장염비브리오균인 V. parahaemolyticus 를해수에접종하여 3시간동안우럭에감염시켰다. 해수중의비브리오균저해효과와시간별로우럭을무균적으로아가미, 내장을적출하고, 표면은 100cm 2 (10 10 cm) 를면봉으로채취하여비브리오균을측정한결과는 Fig. 9에나타냈다. V. parahaemolyticus를해수에 cfu/ml 되게접종하여우럭에감염시켰다. 이때수족관의장염비브리오균감염농도는해수에 cfu/ml이었으며, 아가미는 cfu/g, 내장은 cfu/g, 피부 는 cfu/10cm 2 로검출되어내장이가장많이감염되었으며상대 적으로피부감염이덜하였다. 또한해수중구리의농도는 0.1 ppm 이었 다. 방자판을적용한 6 시간경과후해수는 cfu/ml, 아가미는 cfu/g, 내장은 cfu/g, 피부는 2 cfu/10cm 2 으로각각 98%, 91%, 70%, 70% 가저해되었다. 해수와아가미는 48시간째에 cfu/ml, cfu/g로 99.9% 까지저해되었으나 V. parahaemolyticus 는완전히살균되지는않았다. 내장도 cfu/g의비브리오균이남아있었다. 그러나피부에서는 12시간이후비브리오균이검출되지않았으며 96시간후에는모든부분에서검출되지않았거나 2 cfu/10cm 2 이하의검출빈도를보였다. 이러한결과는양 (1999) 이보고한천연재료와첨가물을이용한 V. vulnificus에대한억제효과에서 TBHQ가해수에서 10 ug/ml농도에서 24시간후에균이검출되않았다고하는보고와전기분해수에의한비브리오균의 24시간후사멸등의보고와비교할

62 결과및고찰 53 때저해되는시간이길지만활어를이용한실험결과는피부의경우 12시간이후아가미와내장은 40시간이후위생적으로안전한먹거리를제공할수있을것으로기대되었다. 해수중용출된구리의량을분석한결과시간경과에따라지속적인상승결과를보여주지않았고, Fig. 9에서나타낸바와같이 0.13 ppm 이하의수준을유지하고있었다. 그러나 Fig. 10, 11에서나타낸바와같이수족관의여과시스템에서여과제로사용되는모래와 polyester filter를실험종료후구리량을분석한결과에서모래로부터 0.5 ppm, polyester filter 필터는 97.8 ppm(control, 0.61 ppm) 의높은농도를나타내었다. 이는활어를생육시키지않고여과제를사용하지않은동일조건의수족관에서의구리분석결과와해수중구리이온이시간에따라증가하지만필터시스템이가동되었을때해수중의구리농도가증가하지않는이유는활어의생육에의해생기게되는유기물질과흡착되고그것들이여과제에흡착되는것으로추정되었다 광어의생육중 V. parahaemolyticus 의저해우리나라사람이가장많이즐겨먹는횟감중의다른하나는광어라할수있다. 광어는우럭과달리유영을잘하지않고바닥에붙어있는특성을가지고있다. 광어의경우도우럭과동일하게일반횟집수족관의모델을동일하게적용하여수산물도매시장으로부터구입한건강한광어를입식한후 Fig. 11에서와같이약 12시간순치시켜장염비브리오균인 V. parahaemolyticus 을 cfu/ml이되게해수에접종하여 3시간동안감염시킨후해수중의비브리오균저해효과와무균적으로광어의아가미, 내장을적출하고, 표면은 cm(100cm 2 ) 를면봉으로채취하여비브리오균수를측정한결과는 Fig. 12에나타내었다. 수족관에해수와광어에비브리오균을감염시킨후최초접종시

63 54 구리를이용한비브리오속균사멸효과 cfu/ml에서 cfu/ml로 3시간동안해수온도에의해약 70% 가저해되었으며, 이때광어의비브리오균감염상황은아가미 cfu/g, 내장 cfu/g, 피부 cfu/10cm 2 이였다. 또한해수중구리의농도는 0.1ppm으로우럭의경우와동일하였다. 12 시간경과후해수에서는 cfu/ml, 99%, 아가미는 cfu/g로 88%, 내장은 cfu/g, 99% 로저해되었으며아가미의경우가가장저해속도가느렸다. 표면은 12시간경과이후 2 cfu/10cm 2 로검출되지않았다. 이는광어의표면에서분비되는점액성의물질때문에균의정착을방해하는것으로판단된다. 24시간후에는해수에서 cfu/ml가검출되어 99.9% 가저해되었고, 아가미와내장에서는 , cfu/g 가검출되어각각약 97%, 99.8% 가저해되었다. 48시간후에는해수, 아가미내장모든부위에서 2cfu/g (cfu/ml) 로 99.99% 가저해되었거나검출되지않았다. 이상의결과로광어, 우럭모두피부의경우 12시간이후아가미와내장은 40시간에서 48시간후에는위생적으로안전한활어을제공할수있을것으로기대되었다. 해수중용출된구리의량을분석한결과에서도시간에따른지속적상승결과를보여주지않았고 Fig. 12에서나타낸바와같이 0.13 ppm 이하의수준을유지하고있었다. 그러나여과제로사용되는모래와 polyester filter를실험종료후분석한결과에서모래로부터 0.5ppm, polyester filter 필터는 ppm(control, 0.61 ppm) 의높은농도를나타내어우럭에서와동일한결과를나타내었다. 흡착량의차이는활어의종류에따라분비되는유기물이들유기물과구리이온의흡착, 구리이온이흡착된유기물질의여과제흡착등으로인한차이로추정된다.

64 결과및고찰 55 Viable count (log cfu/ml, g) Sea water Guts Skin Gill Cu V. parahaemolyticus C S F Cu (ppm) Time(hr) Fig. 12. Survival time of V. parahaemolyticus at guts, gill and skin region of platefish and concentration of cupric ion on brass plate in a model aquarium with sea water. * C : Control( New polyester filter) S : Sand F : Polyester filter : Time of infection : Time of brass plate application

65 56 구리를이용한비브리오속균사멸효과 Viable count (log cfu/ml) Guts V. parahaemolyticus Fish Gill Cu Cu (ppm) Time (hr) 0 0 Fig. 13. Concentration of cupric ion at guts, gill and skin region of rockfish and viable count of V. parahaemolyticus on brass plate in a model aquarium with sea water. 3.6 우럭의부위별구리농도우럭의각부위별구리축적량을측정하기위하여그림 9에서와동일한조건하에서우럭을내장, 아가미, 살 ( 횟감 ) 을분리하였으며내장과아가미는물을이용하여해수를제거한다음건조시켜 ICP를이용하여구리를분석한결과 Fig. 13에나타내었다. 방자판을적용하여우럭의각부위별아가미, 내장, 살 ( 횟감 ) 의구리축적농도를측정한것으로내장과아가미에많이축적되었으며이중가장많이

66 결과및고찰 57 축적된부위는아가미로 12시간경과시 1.5~1.8 ppm 수준을유지하다가 12시간이후 24시간경과시 22 ppm으로급격히증가하였다. 그러나 48시간후에는 24 ppm으로약간증가하는데그쳤다. 내장의경우는 48시간동안커다란변동을보이지않고 7~17 ppm의농도를나타내었고, 6시간경과후에 17 ppm으로구리축적량이가장높았다가점차로감소하는경향을보였다. 이는우럭에원래존재하는구리의농도와큰차이가없었던것으로단시간에내장에축적되지않는것을나타내고있다고할수있다. 또한횟감인살에서의구리농도는 48시간동안에 0.7~1.3 ppm으로자연함유량에존재하는양의범위내에있어방자판에의해용출되는구리이온의축적은짧은시간에는이루어지지않았으며, 수족관에방자판투입에의한구리농도에따른영향은없을것으로생각된다. 해수중의구리의농도는 48시간째에 0.23ppm이었고, 접종된비브리오균 은접종시에 cfu/ml 에서 12 시간경과후에 cfu/ml 로 99.9% 이상저해되었으며, 24시간경과후에는 cfu/ml로, 48 시간후에는 cfu/ml 로대부분이저해되었다. 이상과같이우럭의부위별구리의농도를측정한결과각개체간의자연함유량에의한차이가있으나 12시간후부터구리의농도가증가하고있으며, 아가미의경우가장많은축적량을나타내었다. 이는아가미의특성인필터역할로부터축적농도가다른부위에비해높아지는것을알수있었다.

67 58 구리를이용한비브리오속균사멸효과 Viable count(log cfu/ml) Total Bacteria 1 V. parahaemolyticus V. parahaemolyticus CS F Time(hr) Cu (ppm) Fig. 14. Viable count of V. parahaemolyticus, total bacteria and concentration of cupric ion on brass plate in a model aquarium with sea water. * C : Control( New polyester filter) S : Sand F : Polyester filter : Time of infection, : Time of brass plate application 3.7 광어생육시방자판의구리이온에의한총세균과 V. parahaemolyticus의저해일반횟집의수족관들은자주해수를교체하지못하는경우, 동일해수에어패류만을넣는경우가빈번히발생할수있어약 1주일간동일해수를사용하면서 V. parahaemolyticus 균의저해효과를관찰하기위하여동일한방법으로광어를입식한다음장염비브리오균인 V. parahaemolyticus 를해수에접종하고, 방자판을투입하여구리이온을용출시켜미생물저해

68 결과및고찰 59 실험결과는 Fig. 14와같다. V. parahaemolyticus 와호염성총균수를 96시간동안관찰한후 V. parahaemolyticus 재접종을통해지속적인비브리오균의저해효과를관찰하였다. 또한동일한조건의다른수족관에서는 40시간동안방자판 1매를투입하여구리이온을용출시킨다음방자판을제거하고용출된구리이온만으로 V. parahaemolyticus 의저해에미치는영향을조사하였다. Fig. 14 에서나타낸바와같이비브리오균을 cfu/ml 이되도록 접종한후총균수를측정한결과 cfu/ml 로나타나수족관수기 준인 10 5 cfu/ml 이하를초과하는적합하지않는조건을설정하였다. 그결 과 V. parahaemolyticus는 12시간경과시 cfu/ml로 99.9%, 총균수는 cfu/ml로약 93% 가저해되었다. 24시간경과시에는 cfu/ml 99.99%, cfu/ml 99% 가, 48시간후에는 cfu/ml, cfu/ml로나타나일반세균및비브리오균모두 99.9% 이상저해되어앞서실험하였던결과와동일하였다. 총균수의경우는정 (2004) 등이보고한그람음성과그람양성간의세포벽구조에의해저해에차이가있으며그람양성의경우에보다높은농도가필요하다고한보고에비추어볼때총균수중그람양성균에대한저해효과가떨어짐으로서완전한저해가이루어지지않았음을알수있다. 그러나수족관수의기준규격을충족할수있는바람직한수준으로저해되었다. V. parahaemolyticus 재접종을위해 96시간까지충분히반응을한후 V. parahaemolyticus 을 cfu/ml 이되게재차접종하였다. 또한동일한조건하에있는다른수족관에는 40시간동안방자판을적용한즉, 용출된구리이온만있도록한후모든배양조건이동일한 V. parahaemolyticus 균을 cfu/ml 되도록접종하였다. 그결과재접종한경우 12시간후에는 cfu/ml로 99.4% 가저해되었고, 40시간동안방자판을적용한경우 12시간후에는

69 60 구리를이용한비브리오속균사멸효과 cfu/ml로 95% 가저해되었다. 24시간후에는 cfu/ml, cfu/ml로각각 99.99%, 99.9% 로거의대부분을저해하는효과를나타냈다. 이상의결과로볼때방자판이계속적으로적용된수조에재접종한경우에용출된구리의양이상대적으로많아지게되므로재접종시저해속도가빨라지며, 40시간만적용한수조의경우용출된구리에의한구리의효과는동일하나저해되는저감속도는약 6시간정도늦어지는결과를얻을수있 었다. 따라서구리의농도에대한축적을고려하여방자판적용을조절함 으로서보다효율적인관리를할수있을것으로기대된다. 측정종료후여과제에대한구리의흡착정도를조사한결과 Fig. 12에나타낸것과같이 150시간이상순환여과된수조의폴리에스테르필터에서는 ppm의과량의구리가검출되었다. 이는 2배이상장시간방자판을적용한결과로검출된구리의양도 2배로증가된결과였다.

70 결과및고찰 61 6 Viable count (log cfu/ml, g) 백합 ( 대 ) 칼조개가리비백합 ( 소 ) Sea water Time (hr) C S F Cu (ppm) Fig. 15. Viable count of V. parahaemolyticus at shellfish and sea water, and concentration of cupric ion on brass plate in a model aquarium with sea water. * C : Control( New polyester filter) S : Sand F : Polyester filter : Time of infection, : Time of brass plate application 3.8 구리이온에의한패류중비브리오균의저해패류의경우생식및구이에의한섭취가늘어나고있으며전문판매점도증가되고있다. 따라서주로섭취되고있는칼조개, 가리비, 백합을대상으로각품종별로 50~60개정도를동일수족관에넣어비브리오균을감염시켜저해정도를관찰한결과는 Fig. 15와같다. 접종전비브리오균의감염농도는칼조개 cfu/g, 가리비

71 62 구리를이용한비브리오속균사멸효과 cfu/g, 백합 ( 대 ) cfu/g, 백합 ( 소 ) cfu/g으로 TCBS Agar 배지상에녹색집락을비브리오균으로하였으며동정결과대부분이 V. parahaemolyticus, V. mimicus, V. fluvialis 등이였으며노란색집락은 V. alginolyticus로동정되었다. 장염비브리오균인 V. parahaemolyticus를 cfu/ml가되게해수에접종하여각패류에 3시간동안감염시켰다. 3시간후의비브리오균의감염상태는해수중에 cfu/ml로약 20% 정도수온에의해저해되었으나패류인칼조개는 cfu/g, 가리비는 cfu/g, 백합 ( 대 ) 은 cfu/g 로그리고백합 ( 소 ) 는 cfu/g로비브리오균이감염되었다. 백합 ( 대 ) 의경우만접종후 6시간까지 cfu/g 으로감염량이증가하였다가저해를받기시작하였다. 24시간후에는해수중에 cfu/ml가검출되어약 97% 가감소하였으나 12시간째에비해서는약 73% 가저해되었다. 칼조개, 가리비, 백합 ( 대 ), 백합 ( 소 ) 는 cfu/g, cfu/g, cfu/g, cfu/g으로각각 96, 96, 78, 98% 의비브리오균이저해되었다. 48시간후에는해수중에 cfu/g가검출되어 99.99% 가저해되었다. 반면칼조개가리비, 백합 ( 대 ), 백합 ( 소 ) 에서는해수보다는저해속도가느렸으나 cfu/g, cfu/g, cfu/g, cfu/g으로모두 99% 이상저해되었으며이는최초구입상태에오염되어있는수준이하로저해되었다. 72시간이후해수에서는불검출혹은 2 cfu/ml 이하로완전하게저해되었으나패류는 96시간이후에불검출혹은 2 cfu/g 이하로완전한저해를나타내었다. 이상의결과로부터칼조개와가리비는 24시간이후 36시간까지는 V. parahaemolyticus 의비브리오균이약간증가하는경향을보였고백합 ( 대 ) 은약 80%, 백합 ( 소 ) 는 66% 로저해되는정도가완만하였다. 이는 Cho와 Kim(1971) 의보고에서와같이패류에감염된비브리오균이내장에정착되

72 결과및고찰 63 어생존되기때문에구리이온에대한직접적인영향이저감되어비브리오균의저해효과도떨어지는것으로판단된다. 또한패류의경우수족관에서의생존이활어에비해떨어져개체당활력이떨어짐으로서유기물의배출등세균생육에좋은환경을제공하여줌으로서구리이온에의한효과가떨어지는것으로생각된다. 3.9 패류중구리의축적 비브리오균저해를위해투입된방자판에의한 패류중구리의축적량을 조사한결과 Table 5와같다. 해수에서의경우활어에서와같이구리의량은 96시간동안 0.14 ppm으로비슷하였으며여과재로사용된모래와 polyester로된필터에각각 0.7 ppm, ppm이축적되었으며, 패류의경우칼조개, 가리비, 백합 ( 대 ), 백합 ( 소 ) 의구리의평균함유량은각각 18.7, 26.4, 15.7, 14.6 ppm 이였으며개체간의범위는넓은편이였다. 방자판으로부터의구리이온축적은 Table 5에나타낸바와같이 48시간까지는자연함유량과의차이때문으로불규칙적으로나타났다. 그러나 72, 96 시간후의분석에있어서는시간이경과함에따라백합 ( 소 ) 를제외하고는구리의축적량이증가함을알수있었다. 패류의중금속축적량에대해서는우리나라의경우 Pb, Cd, Hg의유해중금속에대한기준이설정되어관리하고있으나구리에대한기준은현재까지설정되어있지않는실정이다. 그러나각국가별로보면수은, 납, 카드뮴, 니켈, 비소, 크롬의 6개항목중나라의사정에따라그규격을달리하고있다. 미국의경우는패류에대한구리에대한허용량기준을 100 ppm 으로설정하고있고, 호주의경우 30 ppm으로더욱엄격한기준으로관리되고있는실정이다.( 수산물및수산제품유해요소관리지침, FDA, 호주뉴질랜드식품기준, 호주뉴질랜드식품규제위원회 )

73 64 구리를이용한비브리오속균사멸효과 Table 5. Concentration of cupric ion at shellfish and sea water, and on brass plate in a model aquarium with sea water Time(hr) Cu 축적량 (ppm: dry weight) 해수 1) 칼조개가리비백합 ( 대 ) 백합 ( 소 ) 여과재 ( 모래 ) 0.71 여과재 ( 솜 ) range 2) 15.3~ ~ ~ ~22.1 average 3) ) Unit : mg/l 2) Range of analyzed date on ten shellfishes 3) Average of ten shellfishes 이상의결과로부터구리이온에의한비브리오균사멸효과에대하여종합하면방자판이구리판보다는구리의용출량이적고사멸효과는차이가없었으며, 전통적으로식기로사용되고있어그안전성이검증되어있고, 용출된구리이온의어패류에의축적량에서도자연함유량을고려한다면매우미비한수준이었다. 구리섭취의유용성등을본다면우려할수준은아니었다. 반면에이구리이온에의한비브리오속균에대한완전한제어를확인하였다.

74 결과및고찰 65 일반횟집수족관에방자판을설치적용함으로서총균수규격기준에적합한일반세균을최대로억제하고, 수온에의한저해과구리이온에의한살균이상호보완되어비브리오균의저감과사멸을극대화할수있을것이다. 따라서보다더안전하고위생적인활어와패류를제공할수있을것이며, 여름철비브리오균에대한공포로부터벗어나소비위축에대한심각한경제적손실과낮은온도로의수온조절에대한경제적손실에대한어패류의제공원가를낮출수있어일거양득의효과를거둘수있을것으로사료된다.

75

76 결 론

77

78 결론 결론 본연구는구리와주석의합금으로이루어진방자유기의살균력을이용방자판을제작하여여름철수산물로부터유래되는비브리오패혈증, 장염비브리오식중독으로부터안전성을확보하여국민보건위생에기여하고자구리이온에의한비브리오균의저감과살균효과를알아보았다. 1. 실온에서방자판에의한살균효과는 V. parahaemolyticus를 cfu/ml로접종한후 9시간경과후에는 2 cfu/ml이하로, V. vulnificus는 cfu/ml 접종한후 9시간이후에는검출되지않았다. 구리이온의용출은 24시간경과시 0.7ppm으로증가하였으나, Sn, Pb, As, Cd등은검출되지않았다. 2. 일반횟집수족관 (200L) 에방자판 ( mm) 두개를적용한경우하나를적용하였을때보다비브리오균억제속도가빨랐으며해수중구리이온은 0.05 ppm에서 0.58 ppm으로증가하였다. 3. 수온조절에의한생육과저해는 15, 14 에서는 V. cholerae NAG가 10 2 cfu/ml 수준을, V. parahaemolyticus 가 10 3 cfu/ml수준을유지하였으나 13 로수온을조절하였을때는 V. vulnificus 에대비두균주에서더욱민감한저해를보였다. 4. 광어, 우럭의생육시해수, 아가미, 내장및피부중의 V. parahaemolyticus는 24시간째에 99.9%, 48시간후에 2 cfu/ml이하로억제되었으며, 해수중구리농도는 0.01~0.11 ppm, 여과제는 97.8~163.7 ppm으로대부분의구리이온이여과제에흡착되었다. 5. 광어생육시방자판의구리이온에의한총세균과 V. parahaemolyticus의저해효과연구결과방자판을적용하여구리이온을용출시켜 96시간동안관찰한결과 V. parahaemolyticus와호염성세균은 48시간후에각각 cfu/ml로, cfu/ml로검출되어 99.9% 이상저해되었다.

79 70 구리를이용한비브리오속균사멸효과 6. V. parahaemolyticus 재접종및수족관에 40 시간동안방자판 1 매를 투입 제거하여 V. parahaemolyticus 의저해에미치는영향을조사한 결과 24시간후에재접종한경우와 40시간방자판을적용한경우에있어서 cfu/ml, cfu/ml로나타나각각 99.99%, 99.9% 가저해되어거의대부분의비브리오속균을저해하는효과를나타냈다. 7. 우럭의구리농도는, 48시간째에아가미의경우 22 ppm으로급격히증가하였고, 내장은 7.1~17.9 ppm, 횟감용살은 0.7~1.3 ppm을나타냈다. 8. 패류의경우칼조개, 가리비는 48시간후에 10 2 cfu/g 수준으로 99%, 백합의경우 10 1 cfu/g 수준으로 99.9% 저해시키는효과가있었다. 9. 패류의구리함량은칼조개, 가리비, 백합 ( 대 ), 백합 ( 소 ) 의구리의평균함유량은각각 18.7, 26.4, 15.7, 14.6 ppm 이었으며개체간의범위는다양하였다. 방자판으로부터의구리이온축적은 72시간이후부터시간이경과함에따라백합 ( 소 ) 을제외하고는구리의축적량이증가하였다.

80 참고문헌

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90 구리를이용한비브리오속균사멸효과 발간등록번호 인쇄 2008 년 3 월 발행 2008 년 3 월 발행처경기도보건환경연구원 경기도수원시장안구파장동 TEL : (031) FAX : (031)