<C0DABBFD20BDC4B9B0C0DABFF8C0C720444E41B9D9C4DAB5E520BDC3BDBAC5DB20B1B8C3E02032C2F7B3E2B5B5202DB3BBC1F62D2E687770>

Transcription

1 식물자원과 Plant Resources Division National Institute of Biological Resources 2016

2

3 참여 연구진 분야내용담당자소속 연구사업 총괄 관속식물 분석, 보고서 작성 총괄 임채은 (PI) 용담과, 조름나물과, 박주가리과시료확보, 분석, 보고서작성 관속식물속수준바코드시료확보, 분석, 보고서작성 김원희, 류세아, 최지은, 한수민, 송지희 식물자원과 용담과, 조름나물과, 박주가리과등 이진동, 김봉석, 관속식물 DNA 바코드분석시료확보및형태동정 속수준바코드분석시료확보 김태원, 남명자, 변경열, 양영태, 엄의호, 이성원, 한반도식물연구회 및 형태동정 이인배, 정귀동 관속 박종욱 식물 마디풀과시료확보, 분석, 보고서작성총괄 김경희, 김혜민, 박현욱, 정지선, 최태영, 가우리샹카 서울대학교 반다리, 송호준 오상훈 갈매나무과, 고추나무과, 단풍나무과, 지치과, 인동과, 산분꽃나무과시료확보, 분석, 보고서작성총괄 염정원, 최윤경, 한상욱, 황승현 대전대학교 꿀풀과, 현삼과시료확보, 분석, 보고서작성총괄 김상태 문현진, 박지은, 이윤경 성신여자대학교

4

5 요약문 1. 제목 자생식물자원의 DNA 바코드시스템구축 2 차년도 2. 연구목적 가. 나고야의정서대응관련국가생물자원의표준화된관리체계구축및국가생물다양성과학적근거마련나. 국가생물자원을이용한생물산업지원기반마련을위한객관화 표준화된생물소재종동정정보확보및제공 3. 연구내용및방법 가. 16 년도관속식물 DNA 바코드분석대상분류군우선순위결정 1) 속수준바코드구축의경우, 자생관속식물을대상으로기분석관속식물속목록작성을통해미분석관속식물속선정 2) 종수준바코드구축의경우, 기분석종을제외하고, 전통지식, 의약용소재등활용도가높은종및오 혼용가능성이높은근연종대상우선분석추진 국내생물산업계 ( 산학연협의체등 ) 및자원관생물자원활용부내수요조사결과및자생생물유용성등급화자료를반영하여선정나. 관속식물상위분류군 ( 속또는과 ) 수준의 DNA 바코드시스템구축 1) 기분석속을제외한총 214 속에대한 rbcl 구간분석 214속을제외한나머지속은자원관자체사업및 NCBI 등국제 DB상에기분석완료된속임다. 한반도자생식물자원 481 종의 DNA 바코드정보확보및분석 1) 분석대상종은직접채집, 관속식물수장고소장표본또는유전자원은행분양등을통한 1종당 3개체군이상시료확보및동정 2) DNA 추출및분류군별 DNA 바코드마커테스트 3) 분류군별 DNA 마커선정및 DNA 바코드 (matk, rbcl) 정보확보 4) 마커별또는확보된모든마커의유합자료분석, 근린결합계통수작성, 종간 / 종내변이율산출등분석구간유용성탐색

6 < 16 년도분석분류군 > 세부분류군 ( 속수준 DNA 바코드 ) 관속식물 222과 1,155속중 214속의대표종분석 생물산업소재로활용되는유용식물자원포함관속식물분류군 ( 용담과, 박주가리과, 조름나물과, 단풍나무과, 지치과, 인동과, 갈매나무과, 산분꽃나무, 고추나무과, 꿀풀과, 현삼과, 마디풀과 ) 및유용성분석대상종 rbcl 분석구간 3 개구간 (matk, rbcl, 및 ITS/trnH-psbA) 라. 생물산업계, 타부처의뢰생물소재종판별업무 1) 산학연협의체, 타부처업무협조등을통해종판별을의뢰받은생물자원의 DNA 바코드정보확보및 PCR 프라이머및실험정보제공 4. 연구결과 가. 514종 920개체군확증표본과시료확보, 513종 916개체군 DNA추출완료나. 자생식물자원 481종에대한 2, 116개 DNA바코드염기서열정보확보 바코드정보확보종수 : 16년도계획대비 120% 달성 ( 목표종수 : 400종 ) < 15 년도 DNA 바코드정보확보결과 > 구분세부분류군 ( 종수 ) 분석종수 관속식물 용담과, 조름나물과, 박주가리과, 단풍나무과, 지치과, 인동과, 갈매나무과, 산분꽃나무과, 고추나무과, 꿀풀과, 현삼과, 마디풀과및유용성분석대상종 267 관속식물속수준바코드 214 다. Neighbor-Joining 분석을통한분류군별분석구간의해상도분석 1) 조름나물과, 인동과, 산분꽃나무과, 고추나무과의경우, matk, rbcl, IT S 및이들의유합자료는모두 100% 해상도를나타내바코드구간으로써유용성이높은것으로확인됨 2) 현삼과, 마디풀과의경우, matk, rbcl, ccsa, rbcl-accd 유합자료등은 83~95% 의구간해상도가갖는것으로나타남 3) 박주가리과, 단풍나무과, 갈매나무과, 꿀풀과, 용담과는기존 DNA 바코드구간분석결과, 30~67% 정도의낮은해상도를나타냄

7 다. 관속식물속수준바코드시스템구축완료 구분자료출처분석속수 한반도관속식물 (1,155 속 ) 16 년 DNA바코드사업 ~15 DNA바코드및계통수사업 유전자로드맵사업 (NCBI, BOLD, etc) 469 KEI사업 ( 난과, 미나리과 ) 59 계 1,122 분석제외 (33속) 계 33 북한서식 16 실체모호 연구성과및활용계획 가. 한반도관속식물자원의 DNA 바코드정보확보율 48.4% 달성 - 16 년도관속식물바코드정보확보목표종수대비 120% 달성나. 한반도관속식물전체속의 DNA 바코드정보확보완료 - 분말등형태정보에의한종판별이불가능한시료의종판별에용이다. 논문게재 2편, 투고 1편및학술대회발표 8건라. 자생생물자원및생물다양성관리를위한과학적근거로써활용마. 생물산업소재판별을위한한반도자생생물자원의표준자료로써활용및생물산업계및타부처등에정보제공

8 목 차 요약문 ⅰ 목차 iv 표 목차 v 그림 목차 vii Ab stract viii I. 서론 1 II. 본문 3 1. 관속식물 속 (Genus) 수준 바코드 시스템 구축 3 가. 서론 3 나. 재료 및 방법 4 다. 연구결과 및 고찰 6 2. 관속식물 DNA 바코드 연구 8 가. 서론 8 나. 재료 및 방법 9 다. 연구결과 및 고찰 15 (1) 마디풀과 15 (2) 갈매나무과 21 (3) 고추나무과 24 (4) 단풍나무과 25 (5) 용담과 29 (6) 박주가리과 33 (7 ) 조름나물과 37 (8) 지치과 40 (9) 현삼과 및 꿀풀과 43 (10) 인동과 51 (11) 산분꽃나무과 54 III. 종합고찰 57 IV. 참고문헌 59 V. 붙임 62

9 표목차 표 1. 관속식물속수준 DNA 바코드분석현황 4 표 2. 관속식물속수준 DNA 바코드증폭을위하여사용된프라이머 5 표 3. 관속식물속수준 DNA 바코드분석을위한 PC R 조건 5 표 4. 관속식물속수준 DNA 바코드산출성공률및염기서열특징 6 표 5. DNA 바코드구간별프라이머정보 11 표 6. 분류군및마커별 PC R 조건 14 표 7. 마디풀과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률 16 표 8. 마디풀과및근연분류군의 DNA 바코드분석구간염기서열특징 16 표 9. 분석구간별마디풀과분류군의유전적거리 16 표 10. 마디풀과식물 DNA 바코드분석구간조합의종판별해상도 17 표 11. 갈매나무과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률 21 표 12. 갈매나무과식물의 DNA 바코드분석구간염기서열특징 21 표 13. 분석구간별갈매나무과분류군의유전적거리 22 표 14. 고추나무과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률 24 표 15. 고추나무과식물의 DNA 바코드분석구간염기서열특징 24 표 16. 분석구간별고추나무과분류군의유전적거리 24 표 17. 단풍나무과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률 26 표 18. 단풍나무과식물의 DNA 바코드분석구간염기서열특징 26 표 19. 분석구간별단풍나무과분류군의유전적거리 27 표 20. 용담과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률및염기서열특징 29 표 21. 분석구간별용담과분류군의유전적거리 30 표 22. 박주가리과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률및염기서열특징 33 표 23. 조름나물과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률및염기서열특징 37 표 24. 분석구간별조름나무과분류군의유전적거리 38 표 25. 지치과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률 40 표 26. 지치과식물의 DNA 바코드분석구간염기서열특징 40 표 27. 분석구간별지치과분류군의유전적거리 41 표 28. 현삼과식물의구간별 DNA바코드산출성공률및염기서열특징 43 표 29. 분석구간별현삼과분류군의유전적거리 44 표 30. 꿀풀과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률및염기서열특징 46 표 31. 분석구간별꿀풀과분류군의유전적거리 47 표 32. 현삼과및꿀풀과의구간별 DNA 바코드산출성공률및염기서열특징 48

10 표 33. 분석구간별현삼과및꿀풀과분류군의유전적거리 48 표 34. 현삼과및꿀풀과분류군의구간별해상도분석결과 50 표 35. 인동과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률 51 표 36. 인동과식물의 DNA 바코드분석구간염기서열특징 51 표 37. 분석구간별인동과분류군의유전적거리 52 표 38. 산분꽃나무과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률 54 표 3 9. 산분꽃나무과식물의 DNA 바코드분석구간염기서열특징 54 표 40. 분석구간별산분꽃나무과분류군의유전적거리 55

11 그림목차 그림 1. 자생식물속수준식물의엽록체 DNA rbcl 바코드구간염기서열의근린결합계통수 7 그림 2. 마디풀과 cpdna 3 구간유합자료근린결합계통수 17 그림 3. 마디풀과 cpdna 3구간 (rbcl+matk+rbcl-accd) 유합자료근린결합계통수일부 1 9 그림 4. 마디풀과 cpdna 3구간 (rbcl+matk+rbcl-accd) 유합자료근린결합계통수일부 20 그림 5. 갈매나무과 rbcl+matk+ IT S 유합자료의종간및종내변이율 22 그림 6. 갈매나무과 rbcl+matk+ IT S 유합자료의근린결합계통수 23 그림 7. 고추나무과 rbcl+matk 유합자료의근린결합계통수 25 그림 8. 단풍나무과 rbcl+matk 유합자료및 ITS 의종간, 종내변이율분포도 27 그림 9. 단풍나무과 rbcl+matk 유합자료및 ITS 구간의근린결합계통수 28 그림 10. 용담과분류군의종간, 종내변이율분포도 30 그림 11. 용담과식물의 DNA 바코드구간염기서열의근린결합계통수 31 그림 12. 박주가리과분류군의종간, 종내변이율분포도 34 그림 13. 박주가리과식물의엽록체 DNA 바코드구간의근린결합계통수 35 그림 14. 조름나물과분류군의종간, 종내변이율분포도 38 그림 15. 조름나물과식물의 DNA 바코드구간염기서열의근린결합계통수 39 그림 16. 지치과 rbcl+matk+ IT S 유합자료의종간, 종내변이율분포도 41 그림 17. 지치과rbcL+matK+ IT S 유합자료의근린결합계통수 42 그림 18. 현삼과분류군의종간, 종내변이율분포도 44 그림 19. 한국산현삼과및꿀풀과식물들의유연관계 45 그림 20. 꿀풀과분류군의종간, 종내변이율분포도 47 그림 21. 현삼과및꿀풀과분류군의종간, 종내변이율분포도 49 그림 22. 인동과 rbcl+matk 유합자료의종간, 종내변이율분포도 52 그림 23. 인동과 rbcl+matk 유합자료의근린결합계통수 53 그림 24. 산분꽃나무과 rbcl+matk+its 유합자료의종간, 종내변이율분포도 55 그림 25. 산분꽃나무과 rbcl+matk+ IT S 유합자료의근린결합계통수 56

12 Ab stract DNA barcoding employs sequence variation in short, standardized gene regions as a tool to discriminate species. The ideal DNA barcode region is reliably amplified and sequenced across large assemblages of taxa and provides a high level of species discrimination. Based on assessments of recoverability, sequence quality, and levels of species discrimination, two plastid gene regions, the large subunit of RuBisCo (rbcl) and/or an intron maturase (matk), were considered as DNA barcodes for vascular plants and their combinations were adopted as standards. In this study, we tested and evaluated the effectiveness of rbcl and matk for identifying a wide range of species within Polygonaceae, Genus Physocarpus (Rosaceae), Staphyleaceae, Aceraceae, Gentianaceae, Asclepiadaceae, Menyanthaceae, Boraginaceae, Laminaceae, Scropulariaceae, Caprifoliaceae, Viburnaceae in Korea. Of the 916 plant samples collected from 481 species in diverse families, rbcl, matk, and a subsequent DNA barcode regions ITS, successfully amplified and other candidate plastid DNA barcode regions (rbcl-accd, trnh-psba, ccsa) were sequenced for identification of Polygonaceae, Asclepiadaceae, Laminaceae, and Scropulariaceae, respectively. In Staphyleaceae, Menyanthaceae, Caprifoliaceae, Viburnaceae, rbcl, matk, ITS, and the combined data have a good resolution for species discrimination(~100%). In Polygonaceae and Scropulariaceae, it revealed that the combined sequence data have a good resolutions for species discrimination(83~95%). However, the resolution is much lower in Asclepiadaceae, Aceraceae, Stapyleaceae, Laminaceae, Genianaceae(30~67%). To deliver a genus-level identification for Korean vascular plants using a standard barcode library, we involved a large-scale comparative analysis of rbcl region from 1,122 genus in Korean vascular plants. Based on the results, it revealed that rbcl region has a high discrimination power(>95%) at the genus-level of Korean vascular plants.

13 I. 서론 DNA 바코드기법은생물체의유전체중특정위치에있는표준화된짧은 DNA 염기서열을정렬하여비교분석하는과정을통해종을동정하는기술이다 ( 이기법은최초로동물을동정하기위해널리이용되었으나, 현재는전세계분류학자들에게동물을포함한모든생물체를동정하는데있어매우유용한기법으로인식되고있다. 또한, DNA 바코드기법은생물종을대상으로한분류학적목적이외에도 (1) 생물과관련된지적재산권또는소유권주장을위한근거로써활용하기위해, (2) 신종또는미기록종을판단하는근거확보의목적으로, (3) 범죄현장에서발견되는생물샘플분석에이용하여법의학적인목적으로, (4) 식품안전성과재료의품질및순도인증의진위를밝히기위하여, (5) 생태계및환경진단및평가를위한객관적, 과학적근거자료로써도활용성이높다 (Stewart, 2005; H ebert et al., 2004; Yoon, 1993; Coyle et al., 2005; M ildenh all, 2006; G alimb erti et al, 2012; Huxley-Jones et al., 2012; Valentini et al., 2009). 이와같이다양한목적에대한활용도가높은이유로인해최근에는생물다양성협약 (CBD, Convention on Biological Diversity) GT I(Glob al T axonomy Initiative) 에서각국내의생물다양성을관리하는데있어 DNA 바코드기법이유용하게활용될수있음에동의하고, 생물다양성협약 GTI 결정문 9조및 13 조상에 DNA 바코드를이용한생물종동정기술개발및활용에대한촉구를명시하고있다 ( 한편, 생물자원에대한 DNA 바코드를통한생물동정체계구축은단순히특정국가나특정연구자만의노력으로완성될수없는방대한연구분야로, 2004 년부터전세계약 50여개국 150여기관이국제생물바코드컨소시엄 (C onsortium for the Barcode of Life, CBOL) 을통해협력네트워크를구성하고, 격년주기로 International Barcode of Life Conference 를개최하고있으며, 국내에서는해양연구원, 생명공학연구원, 고려대학교등이가입되어있다. 또한, 캐나다연구자들을중심으로국제생물바코드협력체 (International Barcode of Life, ibol) 가구성이되어, 전지구 5백만점의생물바코드서열생산과정보화를목적으로바코드연구가진행되고있다. 본협력체에서생산된정보는 BOLDSYSTEM ( 에실시간업로드하여바코드정보를공유하고있다. 국내에서는 DNA 바코드관련연구가과학기술부, 농림부 ( 농촌진흥청 ), 산림청, 환경부등에서다양한규모로일부추진중이나, 관련연구는부처별로독립적으로진행되어통합검색은여전히불가능한실정이다. 환경부에서는환경기술진흥

14 원의차세대사업으로 한반도주요생물종의보전과관리를위한 DNA 바코드시스템구축 사업이수행된바있으며, 본사업결과 2,429종의 DNA바코드가분석된바있다 (Kim et al., 2011). 국가생물자원관리의총괄기관으로서국립생물자원관은표본및유전자원의확보와관리, 확증표본구축및종목록구축사업등과연계하여한반도생물주권주장및생물자원관리를위한국가적기반을마련하여야할필요성이있다. 이에, 생물자원관리를위한 DNA 바코드데이터베이스구축은국가생물종동정표준화를위해필수적으로수행되어야한다. 따라서, 국립생물자원관에서는 2011년도에는자생생물 302종의 DNA바코드정보를분석하였고, 2012년도에는사초과, 박쥐류, 벌목등 362종이분석되었으며, 2013년도에는관속식물, 어류및곤충등 447 분류군, 2014년도에는관속식물 216종, 어류 30종, 곤충 96종및태형동물 45종등총 387 분류군을분석하였다. 2015년도에는식물분야에서는관속식물 152분류군, 선태류 10분류군, 조류 18분류군등총 180분류군을, 동물분야에서는홍합과, 가시군부과, 연두군부과, 산호강, 대벌레목, 연어과등 115분류군을대상으로분석을수행하였다. 2016년에는관속식물중마디풀과, 갈매나무과, 고추나무과, 단풍나무과, 용담과, 박주가리과, 조름나물과, 지치과, 꿀풀과, 현삼과, 인동과, 산분꽃나무과에속하는 267 분류군을대상으로 DNA 바코드구간염기서열을분석하여유전정보에근거한객관적이고과학적인종동정체계를구축하고자하였다. 또한, 한반도에분포하는것으로보고되어있는관속식물 1,155속을대상으로관속식물의표준 DNA바코드구간으로보고되어있는 rbcl 구간의염기서열을분석하여관속식물속수준동정시스템을마련하고자하였다.

15 II. 본문 1. 관속식물속 (G enus) 수준바코드시스템구축 가. 서론 나고야의정서발효에따라생물주권주장및생물산업소재의정확한이용을위해과학적이고객관적이며표준화된종동정기법에대한요구가높아지고있다. 특히, 생물산업계의경우생물산업소재오 혼용및위변조방지, 생물소재품질관리및각단계별모니터링을위한생물종동정수요가급격히증가하고있는추세이다. 그러나, 생물산업소재의경우, 뿌리, 줄기, 수피등식물체의일부분이거나분말또는절편의형태로사용되는경우가많아외부형태에의한동정이거의불가능하다. 따라서, 관속식물을대상으로한체계적이고지속적인 DNA 바코드정보구축은다양한형태로존재하는식물소재를판별하는데있어효용성이매우높을것으로기대되고있다. 한편, 한반도에분포하는관속식물은총 222과 1,155속 4,388분류군인것으로보고되어있으며 ( 국립생물자원관, 2011), 국립생물자원관에서는 2008년부터지속적으로한반도자생생물자원을대상으로 DNA 바코드연구및계통수작성사업을통해 DNA 염기서열정보를확보하는중장기적연구를수행중에있다. 특히, 관속식물의경우, 2016년까지기록종의약 48% 에해당하는 2,142분류군을대상으로 matk, rbcl, ITS 구간등의염기서열을확보하였으나, 여전히기록종의 50% 이상은미분석된상태이다. 따라서, 본연구에서는관속식물전종을대상으로한 DNA 바코드연구를수행함과동시에한반도관속식물의속동정용 DNA 바코드참조라이브러리를구축하여, 우선적으로관속식물속 (Genus) 수준에서의동정을가능케하고자하였다. 관속식물속수준의 DNA 바코드참조라이브러리는한반도에분포하는관속식물총 222과 1, 155속 ( 국립생물자원관, 2011) 을대상으로하였으며, 이중실체가불분명하거나북한에만분포하는 33 속은분석에서제외하였다. 본연구에서사용한 rbcl구간의염기서열은 (1) 주요생물자원의 DNA 바코드및계통수작성사업 ( 08~ 16) 을통해직접분석한정보와 (2) NCBI 및 BOLD 등국내외 DB에수록되어있는정보를활용하였다 ( 국립생물자원관, 2015). 한편, DNA 바코드구간중핵심바코드구간에해당되는 rbcl구간은프라이머안정성이높아대부분의분류군에서단일프라이머를

16 사용한 PCR 증폭및확보된구간의염기서열정렬이비교적쉬우며, 염기의치환속도가빠르지않아특히속또는과수준을구분하는데있어매우유용한구간으로알려져있다 (C BOL Plant Working Group, 2009; Li et al., 2015). 나. 재료 및 방법 (1) 재료 본 연구에서 사용된 재료는 당해연도에 신규로 채집하거나, 국립생물자원 관 야생생물유전자원은행에 수장되어 있는 시료를 사용하여 실험을 수행하였 다 ( 붙임 1). DNA 추출을 위해서 야외에서 채집한 잎을 Silica-gel 을 이용하 여 즉시 건조시키거나 혹은 실험실로 운반하여 -70 에서 필요시까지 냉동 보 관 후 DNA 추출을 위해 Freeze Dryer(EYELA, Japan) 을 이용하여 동결 건조 하였다. 확증표본은 국립생물자원관 식물표본관 (KB) 에 수장하였다. 한편, 우리나라에 분포하는 것으로 알려진 1,155속 중 2008년도부터 2015 년도의 자체연구과제 및 용역연구과제, 유전자로드맵사업, KEI사업을 통해 908속에 대한 데이터를 확보하였다. 2008년도부터 2015년도의 기확보된 데이 터는 NCBI(National Center for Biotechnology Information), BO LD(Barcode of Life Data Systems) 등 전 세계의 염기서열의 데이터베이스 유전자은행을 통한 데이터로 검증이 확인된 데이터를 이용하였다. 나머지 247 분류군에 대하 여 북한지역에만 분포하거나 분포의 실체를 확인 할 수 없는 33 속을 제외한 후, 최종적인 214속을 대상으로 연구를 수행하였다 ( 표 1). 표 1. 관속식물속수준 DNA 바코드분석현황 관속식물속수준바코드분석 (1,155속) 분석 (1, 122 속 ) 분석제외 (33 속 ) 내용 속수 16년 속 수준 DNA바코드 분석 대상 속 214속 08~ 15 년 DNA 바코드 및 계통수 작성 사업 380속 자생생물이용기술사업단 (EI사업, 환경부 ) 59 속 NC BI, BOLD 수록 바코드 정보 469속 북한분포 분류군 16 속 실체모호 분류군 17 속

17 (2) DNA 추출 Genomic DNA 추출은건조또는냉동된식물조직을막자사발에넣고액체질소와함께파쇄하거나, 1.5ml 튜브에완전히건조된조직을 stainless steel bead(qiagen, Germany) 를사용하여 Tissuelyser(Qiagen, Germany) 으로파쇄하여분말로만들었다. DNA 추출은 DNeasy plant mini kit(qiagen, Germany) 을사용하여수행하였으며, 모든처리과정은공급자의매뉴얼에따라수행하였다. 추출한 DNA 는일부를 1.0% agarose gel 에전기영동한뒤 Loading Star (DYNEBIO, Korea) 으로염색한후, UV 조명하에서 marker 와형광의밝기를비교하고 Nano drop (Power Lab, USA) 을이용해농도를측정하였다. (3) PC R (Polymerase C h ain Reaction) 본연구에서사용된프라이머는표 2와같다. AccuPower PCR Premix (Bioneer, USA) 를이용하여, 1~10ng/ μl의 genomic DNA 를주형으로사용하여표 2의프라이머와함께, 표 3의 PCR 조건으로바코드영역증폭을수행하였다. 증폭된절편의유무는 agarose gel 1 % 에서확인하였다. 표 2. 관속식물속수준 DNA 바코드증폭을위하여사용된프라이머 Region rbcl siz e range 7 20bp Primer 5' -seq uence-3' reference name rbcl1f ATGTCACCACAAACAGAAAC Fay et rbcl724r TCGCATGTACCTGCAGTAGC al.,1997 표 3. 관속식물속수준 DNA 바코드분석을위한 PCR 조건 Region Pre-dena -turation rbcl 95, 3min Dena -turation 95, 30sec Replication Cycle Annea Exten -ling -sion 54, 30sec 72, 30sec N cycles F inal Extention 30 72, 7min (4) 염기서열분석 (Seq uencing) 증폭된 PCR 산물은 PCR quick-spin PC R Product Purification Kit (Intron, Korea) 를사용하여정제하였으며, PCR반응에서사용된프라이머를

18 이용하여 Applied Biosystem 사의 ABI prism 37 30XL analyzer 로염기서열을결정하였다 (M acrogen, Seoul). 얻어진염기서열은 Sequencher 5.0(Gene C odes C orporation, U SA) 을이용하여 editing 및증폭에사용된프라이머서열을제거하고, NCBI 와 BOLD systems 에서 BLAST 검색을사용하여, 기존에공개된염기서열과비교하였다. (5) Data 분석종간 / 종내변이률은 PAUP program(ver. 4.0b4a; Swofford, 2002) 을이용하여산출하였으며, 염기변이 (nucleotide divergence) 는 Kimura-2-parameter method (Kimura, 1980) 로계산하였다. Neighbor-joining tree(saitou & Nei, 1987) 는 2, 000 회의 re-sampling 을통해 PAUP(ver. 4.0b4a; Swofford, 2002) 에서수행하였다. 다. 연구결과및고찰한반도관속식물 1, 122 속에대한엽록체 DNA rbcl 구간의염기서열분석결과, 표준바코드로사용되는 rbcl 구간인 720bp 에비해비교적짧은총 441bp 로정렬되었다. 이는본분석에사용한기분석분류군및 NCBI 또는 BOLD 수록 DNA 바코드정보중, 기분석시사용된프라이머가상이하여비교적짧은구간이분석된경우가존재하였기때문이다. 따라서, 본연구에서는기분석및 16 년도분석자료를종합한한반도관속식물 1, 122 속에대한 rbcl 구간의염기서열정렬시모든속이분석된구간인 441bp 길이의구간을선택하여분석하였다. 표 4. 관속식물 속 수준의 DNA 바코드 산출 성공률 및 염기서열 특징 rbcl No. of species (accessions) 214 No. of species (accessions) successfully amplified and seq uenced 214 Aligned length (b p) 441 No. of variable sites (% variable sites) 283 (64.2% ) No. of informative sites (% informative sites) 224 (51% ) G+ C ratio (% ) 45.5 한편, 당해연도에분석을수행한 214 분류군의경우, 표준바코드프라이머를이용한엽록체 rbcl 구간의증폭율은 100% 인것으로확인되었다. 한반도관속식물

19 1, 122 속에대한 rbcl 구간의확보된염기서열의수, 길이, 분석된염기서열의길이, informative site, G+C 함량등은표 4 에작성하였으며, 정렬된 441bp 의염기서열중 Informative site 와 variable site 의비율은각각 64.2% 와 51% 인것으로확인되었다. 한편, 정렬된 rbcl 구간의염기서열에의해양치식물, 나자식물, 피자식물 3 개의그룹이뚜렷이구분되었으며, Neigh b or-j oining 분석결과 (Saitou & Nei, 1987), 분석된 1,122 분류군은속수준에서 95% 이상의높은해상도를갖는것으로나타났다 ( 그림 1). 한반도산양치식물의경우, 고비목, 고사리목, 처녀이끼목, 발풀고사리목, 실고사리목, 생이가래목, 고사리목등 7 개목으로구분되었으며, 나자식물의경우에는은행나무목, 소철목, 소나무목등 3 개의목으로구분되었다. 피자식물의경우에는곡정초과, 벼과, 사초과, 골풀과, 부들과를포함하는벼목이가장뚜렷한하나의 clade 를생성하는것으로확인되었으며, 국화목, 산토끼목, 미나리목, 용담목, 가지목, 꿀풀목, 말피기아목, 노박덩굴목, 콩목, 박목, 장미목도각각의 clade 로유집되면서구분되었다. 또한, 꿀풀목, 가지목, 용담목은꿀풀군으로, 국화목, 산토끼목, 미나리목은초롱꽃군으로각각유집되었으며, 말피기아목, 노박덩굴목, 콩목, 박목, 장미목이콩군으로구분되면서 APG Ⅳ 의분류체계를대부분지지하는것으로나타났다. 한편, rbcl 구간에의해구분이되지않거나, APG 분류체계와상이한유집결과를나타내는일부분류군의경우에는분류군추가및 matk 등또다른표준 DNA 바코드구간의분석이필요할것으로판단된다. 그림 1. 분석된자생식물속수준식물의엽록체 DNA rbcl 바코드구간염기서열의근린결합계통수

20 2. 관속식물 DNA 바코드연구 가. 서론 현재까지한반도에분포하는문헌상기록된관속식물은총 4,425 종으로한반도기록종의 9.7% 를차지하는것으로보고되어있다 ( 국가생물종목록구축, 2015). 관속식물의경우예로부터식용, 의약용등그쓰임새가인간생활과밀접한관계에있어왔으며, 이로인해관속식물분야의종동정표준화는다른분류군에비해기존연구가많이진행되어있음에도불구하고, 여전히연구수요가다른분류군에비해많은편이다. 관속식물의 DNA 바코드구간은동물의 COI과같이하나의표준화된바코드구간이존재하지않고, 다수의구간을이용하여야한다는견해가지지되고있다. 동물의바코드구간으로이용되고있는미토콘드리아 COI 유전자에비하여관속식물의미토콘드리아 DNA 의돌연변이율이낮아엽록체 DNA 에서바코드구간을찾고자하는노력이있어왔다. 엽록체 genome 에서유전자부위 (coding 유전자 ) 인 matk, rbcl, rpob, rpoc1 구간과비유전자부위 (noncoding spacers) 인 atpf-atph, trnh-psba, psbk-psbi 구간이관속식물의 DNA바코드구간으로제시된바있다 (Pennisi, 2007 ; Ledford, 2008). 이러한관속식물의 DNA 바코드구간중어떠한구간을표준 DNA 바코드로결정할것인가에대한기준이 C BOL Plant Working Group(2009) 에의해제시되었다. 처음으로제시된기준은표준화된 primer pair 에의한식물의 DNA 바코드구간의 PCR 증폭이성공적으로이루어져한다는것이다. 두번째로제시된기준은분석된염기서열의정확성을기하기위해양방향 (5-3, 3-5 ) 으로염기서열을성공적으로확보해야한다는것이다. 세번째로제시된기준은종식별이가능할정도로염기서열간의차이점이발견되어야 DNA 바코드구간으로서의기능을수행할수있을것으로추론하고있다. 상기와같은기준에가장적합한구간을 CBOL Plant Working Group(2009) 은 rbcl 구간과 matk 구간을제시하고있다. rbcl 구간은비록진화속도가느려종식별능력이뛰어나지는않지만 DNA 바코드후보구간과의 DNA 염기서열 combination 을통해가장훌륭한종식별능력을보여주고있으며, 양방향염기서열정보의확보가가장뛰어난것으로평가되었다. 엽록체유전체의 matk의경우가장빠르게진화하고있는염기서열구간으로관속식물의종식별능력이가장뛰어나며, 표준 primer 의적용이우수한것으로밝혀지고있다. 그러나, 양치류에서표준

21 primer 에의한 DNA 증폭이나타나지않으며, 나자식물에서의증폭율이피자식물에비해상대적으로낮게나타나는경향이있으며, 일부피자식물의경우에도양방향염기서열정보의확보가어렵다는단점이존재한다. DNA 바코드는종간 DNA 의변이를발견하여정확하게종을동정하고분류하는것을목적으로한다. 관속식물을대상으로한 DNA 바코드연구동향은기존의 CBOL Plant Working Group(2009) 에서제시한 rbcl, matk구간및핵 ITS 구간과함께엽록체 DNA 상에존재하는 trnh-psba구간등엽록체 DNA 상의 IGS 구간과의유합분석을지향하고있다 (5th International Barcode of Life Conference, 2013). 최근에는, 식물 DNA 바코드연구자들에의해식물종동정정보확보를위해엽록체전체유전정보를활용하는 super-barcode 개념이제시되고있다 (Erickson et al., 2008; Such er and C arles, 2008; Parks, C ronn and Lison, 2009; Nock et al., 2011; Yang et al., 2013). 본연구에서는관속식물 DNA 바코드로널리인식되고있는엽록체 DNA 의 rbcl 및 matk 구간과그간널리활용되어온핵DNA 의 ITS 구간의염기서열및각분류군별로바코드구간으로써의유용성을갖는엽록체 DNA 상의 IGS구간들을추가분석하고, 이를통해각구간의 DNA 바코드적용가능성확인및자생관속식물의 DNA 바코드염기서열에대한표준데이터베이스를구축하고자하였다. 한편, 본연구대상분류군은 (1) DNA 바코드정보가미확보된분류군, (2) 고유종, 멸종위기종, 국외반출승인대상종등환경부가지정한법적보호종이포함된분류군및 (3) 전통지식, 의약용소재등활용도가높은유용식물이포함된분류군등을기준으로선정하였다. 나. 재료 및 방법 (1) 재료 본 연구에서 사용된 재료는 당해연도에 신규로 채집하거나, 국립생물자원 관 야생생물유전자원은행에 수장되어 있는 시료를 사용하여 실험을 수행하였 다 ( 붙임 2). DNA 추출을 위해서 야외에서 채집한 잎을 Silica-gel 을 이용하 여 즉시 건조시키거나 혹은 실험실로 운반하여 -70 에서 필요시까지 냉동 보 관 후 DNA 추출을 위해 Freeze Dryer(EYELA, Japan) 을 이용하여 동결 건조 하였다. 확증표본은 국립생물자원관 식물표본관 (KB) 에 수장하였다.

22 (2) DNA 추출 Genomic DNA 추출은건조또는냉동된식물조직을막자사발에넣고액체질소와함께파쇄하거나, 1.5ml 튜브에완전히건조된조직을 stainless steel b ead(q iagen, Germany) 를사용하여 T issuelyser(q iagen, Germany) 으로파쇄하여분말로만들었다. DNA 추출은 DNeasy plant mini kit(qiagen, Germany) 을사용하여수행하였으며, 모든처리과정은공급자의매뉴얼에따라수행하였다. 추출한 DNA 는일부를 1.0% agarose gel 에전기영동한뒤 Loading Star(DYNEBIO, Korea) 으로염색한후, U V 조명하에서 mark er 와형광의밝기를비교하고 Nano drop(power Lab, USA) 을이용해농도를측정하였다. (3) PC R (Polymerase C h ain Reaction) 본연구에서사용된프라이머는표 5와같다. AccuPower PCR Premix (Bioneer, USA) 를이용하여, 1~10ng/ μl의 genomic DNA 를주형으로사용하여표 5의프라이머와함께, 표 6의 PCR 조건으로바코드영역증폭을수행하였다. 증폭된절편의유무는 agarose gel 1 % 에서확인하였다. (4) 염기서열분석 (Seq uencing and Alignment) 증폭된 PC R 산물은 PC Rquick -spin PC R Product Purification Kit (Intron, Korea) 를사용하여정제하였으며, PCR반응에서사용된프라이머를이용하여 Applied Biosystem 사의 ABI prism 37 30XL analyzer 로염기서열을결정하였다 (M acrogen, Seoul). 얻어진염기서열은 Sequencher 5.0(Gene C odes C orporation, U SA) 을이용하여 editing 및증폭에사용된프라이머서열을제거하고, NCBI 와 BOLD systems 에서 BLAST 검색을사용하여, 기존에공개된염기서열과비교였으며, 각각의유전자구간에대하여 MEGA(ver. 7; Kumar et al., 2016) 에탑재되어있는 C LU ST ALX module을이용하여염기서열정렬하였다. (5) Data 분석종간 / 종내변이율은 PAU P program(ver. 4.0b 4a; Sw offord, 2002) 을이용하여산출하였으며, 염기변이 (nucleotide divergence) 는 Kimura-2-parameter meth od(kimura, 1980) 로계산하였다. Neigh b or-j oining tree(saitou and Nei, 1987 ) 는 2,000회의 re-sampling을통해 PAU P(ver. 4.0b 4a; Sw offord, 2002) 에서수행하였다.

23 표 5. DNA 바코드구간별프라이머정보 Taxa Region Size Primer name Primer seq uence (5' -3') Reference rb cl _ 1F AT G T CAC CAC AAACAG AAACT AAAGC AAG T rbcl 1194 bp Soltis et al., 1992 rb cl _ 137 6R GT AAAAT CAAGT CC ACC RCG trnk_670f CTGTATCGCACTATGTATC 마디풀과 matk 1181 bp Kim, 2007 matk_1326r TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT rbclaccd accd_ 79R AC AAC ATCG AATTAAAC CAC rb cl _ 50F GAAGT AT GGAAGG AAAT CA 893 b p Yasui & Oh nish, 1998 rbcl 1F ATG TCAC CAC AAACAG AAAC rbcl 724 bp Fay et al., 1997 rbcl724r TCGCATGTACCTGCAGTAGC 고추나무과, 인 3F_Kim_F CGTACAGTACTTTTGTGTTTA K. J. Kim, per. comm. 동과 1R_Kim_R ACCCAGTCCATCTGGAAATCT matk 850 b p matk390f CGATCTATTCATTCAATATTTC Samuel R. et al., 2005 matk1300r CGAAGTATATAYATTCGATAA rbcl 1F ATG TCAC CAC AAACAG AAAC rbcl 724 bp Fay et al., 1997 rbcl724r TCGCATGTACCTGCAGTAGC 갈매나무과, 단 3F_Kim_F CGTACAGTACTTTTGTGTTTA 풍나무과, 지치 K. J. Kim, per. comm. 1R_Kim_R ACCCAGTCCATCTGGAAATCT matk 850 b p 과, 산분꽃나무 matk390f CGATCTATTCATTCAATATTTC Samuel R. et al., 2005 과 matk1300r CGAAGTATATAYATTCGATAA ITS9 TCGTAACAAGGTTTCCGTAGGG ITS 700 b p Youm et al., 2016 ITS6 CCGCTTATTGATATGCTTAAAT rbcl 1F ATG TCAC CAC AAACAG AAAC rbcl 724 bp Fay et al., 1997 rbcl724r TCGCATGTACCTGCAGTAGC matk47 2F CC CRTY CATC TGGAAATC TTGGTTC 용담과 matk 850 b p Yu et al., 2011 matk1248r GCTRTRATAATGAGAAAGATTTCTGC ITS b p ITS5 GG AAG TAAAAGTC GTAACAAGG White et al., 1990 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC

24 Taxa Region Size Primer name Primer seq uence (5' -3') Reference rbcl 1F ATG TCAC CAC AAACAG AAAC rbcl 724 bp Fay et al., 1997 rbcl724r TCGCATGTACCTGCAGTAGC 3F_Kim_F CGTACAGTACTTTTGTGTTTA K. J. Kim, per. comm. 1R_Kim_R ACCCAGTCCATCTGGAAATCT 박주가리과 matk b p matk390f CGATCTATTCATTCAATATTTC Dunning L.T. et al., 2010 matk1326r TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT psba GTTATGCATGAACGTAATGCTC trnh-psba 500 b p Tate & Simpon, 2003 trnh2 CGCGCATGGTGGATTCACAATCc rbcl 1F ATG TCAC CAC AAACAG AAAC rbcl 720bp Fay et al., 1997 rbcl724r TCGCATGTACCTGCAGTAGC 3F_Kim_F CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG 조름나물과 matk 850bp K. J. Kim, per. comm. 1R_ Kim_ R AC CCAGTCC ATCTG GAAATCTTG GTTC 꿀풀과, 현삼과 ITS b p ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG White et al., 1990 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC rbcl26f CACCACAAACAGAGACTAAAGCA rbcl 1,377 bp matk 1,856 bp rbcl902r GCTTACTTCTTCACATTCACCG rbcl647f CCAGGGAATTGGGAGTTC rbcl3 CTCGGCCCAATCTTTTACTAAAAGGATTGAGCCG rbcl_736f TTACTTGAATGCTACTGCRGGT rbcl _ 1391R GC HGC TTGYG ARRTATGG AAA matk_145f GCACACRGCTTTCCCTA matk_ 1013R TGC CAAAARGTSAYAAGGT matk_909f GAAYAATWGGAACAARRGTMTC matk_ 1998R AG TGCG ATAC AGTM AAAACAA matk_973f TTCTADAMTTTGACTMCGTACY matk_ 986R GG AT RAAAC CAY ST YG AAAART matk_ 197 9R GG TYATC AAATGM TAC ATAG TRC matk_2ff CTADAATTTGACTCCGTACYAC matk_2rr ATAGRAARTCGTGTTGGTWAGATC new ly designed new ly designed

25 Taxa Region Size Primer name Primer seq uence (5' -3') Reference matk_sc_200f TGAATACTCAGTCGATTTAACCCTTA matk_ sc_ 986R ATG AAACCAGAG CGC AAAAT matk_3ff ATGCCGCAATCAGAGGAATA matk_3rr TTCGAGTAATTAACCGTTTCACAA ccsa 787 bp ccsa-3f ATTTTCAACYTTAGARCAYAT ccsa-4r CATAGTTATGGTTCATTTACATTAA ccsa_9f ACTCATATTTCTTTTTCGATCGTTT ccsa_10r TTCAGCAATTGTGGCGTCTA ccsa_11f CCTTTTTAGTCGATGAAATCGT new ly designed

26 표 6. 분류군및마커별 PCR 조건 마디풀과 Taxa Region 고추나무과, 인동과 갈매나무과, 단풍나무과, 지치과, 산분꽃나무과 용담과 박주가리과 조름나물과 꿀풀과, 현삼과 Predenaturation Replication C ycle Final Denaturation Annealing Extension N cycles Extention rbcl 95, 3min 95, 1min 50, 30s 72, 80s 35 72, 7min matk 95, 3min 95, 1min 52.5, 30s 72, 80s 35 72, 7min rbcl-accd 95, 3min 95, 1min 54, 40s 72, 45s 35 72, 7min rbcl 94, 5min 94, 20s 55, 40s 72, 1min 35 72, 7min matk 94, 5min 94, 20s 55, 40s 72, 1min 35 72, 7min rbcl 94, 5min 94, 20s 55, 40s 72, 1min 35 72, 7min matk 94, 5min 94, 20s 55, 40s 72, 1min 35 72, 7min IT S 94, 5min 94, 20s 57, 40s 72, 1min 35 72, 7min rbcl 94, 1min 94, 30s 55, 40s 72, 1min 35 72, 7min matk 94, 1min 94, 40s 54, 40s 72, 30s 35 72, 7min IT S 94, 1min 94, 30s 56, 40s 72, 30s 35 72, 7min rbcl 94, 3min 94, 30s 56, 30s 72, 30s 35 72, 7min matk 94, 3min 94, 40s 54, 30s 72, 30s 35 72, 7min trnh-psba 94, 3min 94, 30s 56, 30s 72, 30s 35 72, 7min rbcl 94, 1min 94, 40s 55, 30s 72, 30s 35 72, 5min matk 94, 1min 94, 30s 55, 40s 72, 30s 35 72, 5min IT S 94, 1min 94, 30s 54, 40s 72, 30s 35 72, 5min rbcl 94, 3min 95, 30s 55, 30s 72, 45s 35 72, 7min matk 94, 3min 95, 30s 55, 30s 72, 45s 35 72, 7min ccsa 94, 3min 95, 30s 55, 30s 72, 45s 35 72, 7min

27 다. 연구결과및고찰 (1) 마디풀과 마디풀과 11 속 82 종 255 개체를대상으로, 엽록체 DNA matk, rbcl 및 rbcl-accd IGS 구간에대한 DNA 바코드분석을수행하였다. 그결과, 이들개체로부터총 1530 개의 DNA 바코드염기서열이생산되었으며, 구간별 DNA 바코드성공률은 % 로매우높게나타났다 ( 표 7). 바코드분석결과얻어진마디풀과분류군의구간별염기서열특징은표 8 에제시하였다. DNA 바코드구간의염기서열길이는 rbcl의경우모든분류군에서 1194 b p로동일하였으나, 나머지두구간은비교적적은폭의종간변이를나타내었고, 총 3268 bp 로정렬되었다 ( 표 8). 가변영역비율은 rbcl이 16.3% 으로가장낮았으며, matk가 50.3% 로가장높은것으로밝혀졌다. 또한 informative site의비율도 rbcl이 14.3% 로가장낮았으며, matk가 44.2% 로가장높은것으로나타났다 ( 표 8). 종간 K2P distance 의평균값은 matk(0.0912) 가가장높았으며, 그다음으로는 rbcl-accd (0.0895), rbcl ( ) 순이었다 ( 표 9). 한편, 종내 K2P distance 의평균값은 coding 구간인 rbcl(0.0008) 과 matk(0.0008) 가 rbcl-accd IGS 구간 (0.0014) 에비해상대적으로낮은것으로나타났다. 한편, 종간 K2P distance 의평균값은종내 K2P distance 의평균값에비해최소 38 배 (rbcl) 에서최대 114배 (matk) 의값을갖는것으로밝혀졌다 ( 표 9). 상기 3 구간염기서열유합자료에대한동일속내종간및종내개체간염기서열변이율빈도분포를분석한결과, 이들사이에뚜렷한바코드갭 (barcode gap) 은존재하지않았으나속내종간변이가종내개체간변이보다현저히큰것으로밝혀져 ( 그림 2), 이들 3구간염기서열유합자료는마디풀과한반도자생종의식별을위한 DNA 바코드로서효용성이큰것으로판단되었다. DNA 바코드종판별해상능은분석한바코드구간들의가능한모든조합에대해 NJ 계통수 ( 근린결합계통수 ) 를산출하여분석하였으며, 그결과단일구간의종판별해상능은 rbcl이 57.3% 로가장낮았고, matk가 73.7% 로가장높게나타나단일구간을이용하여마디풀과식물의종판별을시도할경우 matk가가장유용한것으로확인되었다 ( 표 10). 또한, 2개이상의바코드구간을조합할경우종판별해상능은증가하였으며, 3개구간을모두조합하

28 였을경우종판별해상능이 83.7% 로대부분의한반도자생마디풀과종의식별이가능한것으로나타났다 ( 표 10). 표 7. 마디풀과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률 rbcl matk rbcl-accd No. of species (accessions) 82 (258) 82 (258) 82 (258) No. of species (accessions) successfully amplified and 82 (256) 82 (255) 82 (255) seq uenced % seq uencing success 표 8. 마디풀과 및 근연 분류군의 DNA 바코드 분석 구간 염기서열 특징 rbcl matk rbcl-accd total Seq uence length (b p) Aligned length (b p) G +C ratio (%) No. of variab le sites (% variable sites) No. of informative sites (% informative sites) 195 (16.3) 594 (50.3) 306 (34.3) 1084 (33.2) 171 (14.3) 522 (44.2) 254 (28.4) 939 (28.7) 표 9. 분석구간별마디풀과분류군의유전적거리 Region Intraspecific K2P distance Interspecific K2P distance Min. Mean Max. Min. Mean Max. rbcl matk rbcl-accd Combined

29 DNA 바코드종판별해상능은분석한바코드구간들의가능한모든조합에대해 NJ 계통수를산출하여분석하였으며, 그결과단일구간의종판별해상능은 rbcl이 57.3% 로가장낮았고, matk가 73.7% 로가장높게나타나단일구간을이용하여마디풀과식물의종판별을시도할경우 matk가가장유용한것으로확인되었다 ( 표 10). 또한, 2개이상의바코드구간을조합할경우종판별해상능은증가하였으며, 3개구간을모두조합하였을경우종판별해상능이 83.7% 로대부분의한반도자생마디풀과종의식별이가능한것으로나타났다 ( 표 10). 그림 2. 마디풀과의 rbcl +matk +rbcl-accd 유합자료의종간 (Black) 및종내개체간 (White) 염기서열변이율분포도 표 10. 마디풀과 식물 DNA 바코드 분석 구간 조합의 종 판별 해상도 Regions Species resolution (% ) rbcl 57.3 matk rbcl-accd 61.8 rbcl + matk 79.7 rbcl + rbcl-accd 70.3 matk + rbcl-accd 77 matk + rbcl+ rbcl-accd 83.7

30 본분석에서 2개체이상분석된종은총 65 종이며, 이중 55 종은 DNA 바코드 3개구간유합자료 NJ 계통수에서각각하나의집단으로유집되었다 ( 그림 3, 4). 그러나, 여뀌속의 2종 [ 장대여뀌 (Persicaria posumbu), 겨이삭여뀌 (P. taquetii)], 범꼬리속의 3종 [ 범꼬리 (Bistorta manshuriensis), 참범꼬리 (B. pacifica), 가는범꼬리 (B. alopecuroides)] 그리고수영속의 5종 [ 소리쟁이 (Rumex crispus), 참소리쟁이 (R. japonicus), 개대황 (R. longifolius), 금소리쟁이 (R. maritimus), 부령소리쟁이 (R. patientia)] 의개체들은종수준에서하나의집단으로유집되지않고, 일부개체들이분리되어위치하였다 ( 그림 3, 4). 상기종들은형태적으로변이가심하고, 종간교잡이흔히발생하여그분류학적한계가불분명한분류군들로, 이들에대한상세한계통분류학적연구가필요한것으로사료된다. DNA 바코드 3개구간유합자료 NJ 계통수상에서한반도자생마디풀과종들은크게 4 개의족 [ tribe Persicarieae (clade 1), tribe Polygoneae (clade 2; subclade 3), tribe Rumiceae (clade 2; subclade 4), tribe Fagopyreae (clade 3)] 으로명확히구분되었으며 ( 그림 3, 4), 이는최근의분류학적연구결과 (Sanch ez et. al, 2011) 와근본적으로일치하는것으로밝혀졌다. 따라서분석된 DNA 바코드 3 구간 (rbcl, matk, rbcl-accd IG S) 은마디풀과의계통적유연관계에관한정보를포함하고있는유용한구간으로판단된다. 한편, 2 개이상의종이분석된대부분의속들은 NJ 계통수상에서단일계통군으로유집되었으나, 싱아속 (Aconogonon) 과마디풀속 (Polygonum) 의종들은속수준에서단일계통군을형성하지못하였다 ( 그림 3, 4). 싱아속의경우, 대부분의종들은하나의집단으로유집되었으나, A. molle 는 Koenigia forrestii 과자매군을형성하였으며, 마디풀속의경우집단내에 Polygonella 속이포함되는것으로나타났다. 그러나이들속의종들은계통수상에서모두뚜렷이구분되어 DNA 바코드를이용한종판별에는문제가없는것으로확인되었다 ( 그림 3, 4).

31 그림 3. 마디풀과 cpdna 3구간 (rbcl+matk+rbcl-accd) 유합자료근린결합계통수일부 (Clade 1)

32 그림 4. 마디풀과 cpdna 3구간 (rbcl+matk+rbcl-accd) 유합자료근린결합계통수일부 (Clade 2, 3)

33 (2) 갈매나무과 갈매나무과 7속 15 분류군 43 개체의엽록체 DNA 염기서열분석을수행한결과 rbcl와 matk 구간에서 PC R 의성공률은 100% 로나타났으며, 정확한분석을위해 ITS 구간을추가로분석하였다 ( 표 11). 핵 ITS 구간은 15 종 42 개체에서성공적으로반응의결과를얻었으며, 깨끗한염기서열을결정하였다 ( 표 11). 표 11. 갈매나무과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률 rbcl matk ITS No. of species (accessions) 15(43) 15(43) 15(43) No. of species (accessions) successfully amplified and sequenced 15(43) 15(42) 15(42) % sequencing success 100% 97.7% 97.7% 표 12. 갈매나무과식물의 DNA 바코드분석구간염기서열특징 rbcl matk ITS rbcl+matk +ITS total Seq uence length (b p) ,850-1,897 1, 850-1,897 Aligned length (b p) ,939 1,939 G + C ratio (% ) No. of variab le sites (% variable sites) No. of informative sites (% informative sites) 총 43개개체들을정렬한후최종자료행렬 (data matrix) 은 565b p (rbcl) 및 67 5bp(matK) 로확정하였다. 이중, variable site 는 rbcl의경우 44bp, matk 의경우 109bp인것으로나타났으며 informative site수는각각 43bp 및 105bp 것으로나타났다 ( 표 12). ITS 구간의 42개체에대한염기서열은최종정렬한결과 699b p였으며, 이중 237 b p의 variab le site와 217 b p의 informative site가나타나핵 ITS 구간이엽록체구간보다더변이가크고정보가많은것으로나타났다 ( 표 12). 갈매나무과의 15종을대상으로 rbcl, matk 및 ITS 구간의유합자료에대한종내변이와종간변이를계산한결과는표 13에제시하였다.

34 표 13. 분석구간별갈매나무과분류군의유전적거리 Region rbcl+matk+its combined Intraspecific K2P distance Interspecific K2P distance Min. Mean Max. Min. Mean Max 각각의 DNA 바코드자료에대한일차분석결과갈매나무과 7속 15 분류군중중 7개속각각은어떤 DNA 바코드구간을분석하더라도명확히구분되었으나가장많은종 (7 종 ) 이지닌갈매나무속 (Rhamnus) 은종간의변이폭이작아구분되지않았다. 따라서갈매나무과에대한평가는 rbcl, matk 및 ITS 구간의 3 개구간을유합하여분석하였다. 유합자료의종내변이는 ( 평균 ) 로서종간변이의 ( 평균 ) 에비해평균을기준으로 60 배이상차이가나는것으로나타났다. 그러나이변이의차이는우리나라에분포하는갈매나무과의분류군들이 7개속에나누어져있고, 이들 7개속간의차이가큰것이기인한다. 이것은본연구에사용된 rbcl, matk, ITS 의세 DNA 바코드가 7개속을구분하는데매우유용하다는것을의미한다. 그림 5. 갈매나무과 rbcl+matk+its 유합자료의종간및종내변이율 분석한 DNA 바코드의자료로부터얻은유전적거리의분포를그래프로표시하면본연구에사용된 rbcl, matk+its 자료의종간변이가종내변이보다훨씬크다는것이확연히드러난다 ( 그림 5). 따라서, 이두구간의 DNA 바코드는한국산갈매나무과의종을구분할수있는유용성이있다고볼수있으나, 갈매나무속의종간변이는산황나무 (R. crenata) 를제외하면속내의종간에서거의구분되지않아서그유용성이제한적이다. 한편, 갈매나무과식물의식별및유연관계분석을위해 rbcl, matk, ITS 유합자료로분석한근린

35 결합계통수에서갈매나무과 15 분류군중갈매나무속을제외한나머지 6개속 [ 대추나무속 (Ziziphus), 갯대추속 (Paliurus) 헛개나무속 (Hovenia), 상동나무속 (Sageretia), 까마귀베개속 (Rhamnella), 망개나무속 (Berchemia)] 은각각독립된그룹으로유집되는것으로나타났다 ( 그림 6). 그림 6. 갈매나무과의 rbcl+matk+its 유합자료의근린결합계통수 또한망개나무속의망개나무 (B. berchemiifolia) 와먹넌출 (B. floribunda) 는각각서로다른그룹을형성하여독립된계통을이루는것으로확인되었으며, 이들종에대한 DNA바코드를이용한종판별율은 100% 이다 ( 그림 6). 그러나갈매나무속의 7종에서는산황나무 (R. crenata), 참갈매나무 (R. ussuriensis) 의 2종만독립된분계를이루었고, 나머지 5종에대해서는 DNA 바코드를이용한명확한종판별이불가능함을보여주고있다. 갈매나무과전체의근린결합계통

36 수에서가지길이 (branch length) 를보면, 갈매나무속안의종간길이가매우짧다. 이러한결과는한반도산갈매나무속종들이최근에분화되었거나분자진화속도가느려서종간에뚜렷한분자형질이축적되지못한것으로추정되며, 이들종에대한분자형질적종판별은 rbcl, matk, ITS 보다더빠른속도로진화하는분자마커를이용해야할것으로판단된다. (3) 고추나무과 고추나무과 2속 2분류군 7개체대해 DNA 바코드분석을하였다. 분석결과 rbcl구간과 matk구간에서 PCR 의성공률은 100% 로나타났다 ( 표 14). 표 14. 고추나무과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률 rbcl matk No. of species (accessions) 2(7 ) 2(7) No. of species (accessions) 2(7 ) 2(7) successfully amplified and sequenced % seq uencing success 100% 100% 표 15. 고추나무과 식물의 DNA 바코드 분석 구간 염기서열 특징 rbcl matk rbcl+matk total Seq uence length (b p) ,381 1,381 Aligned length (b p) ,381 1,381 G + C ratio (% ) No. of variab le sites (% variab le sites) No. of informative sites (% informative sites) 표 16. 분석구간별고추나무과분류군의유전적거리 Intraspecific K2P distance Interspecific K2P distance Regions Min. Mean Max. Min. Mean Max. rbcl+matk

37 총 7개개체들의염기서열을정렬한후최종자료행렬 (data matrix) 은 565bp (rbcl) 및 816bp (matk) 로확정하였다. 이중, variable site 는 rbcl의경우 1bp, matk의경우 7bp개인것으로나타났으며 informative site 수는각각 1bp, 6bp인것으로나타났다 ( 표 15). 고추나무과의 2종을대상으로 rbcl, matk구간의종내변이와종간변이를계산한결과는표 16 에제시하였다. 종내변이의폭은 rbcl+matk의경우 ( 평균 ) 이며, 종간변이의폭은 ( 평균 ) 인것으로나타나종간변이의값은종내변이값의약 25 배정도인것으로나타났다 ( 표 16). 이것은본연구에사용된 rbcl, matk 두구간이종판별 DNA 바코드로서유용성이있다는것을의미한다. 그림 7. 고추나무과의 rbcl+matk 유합자료의근린결합계통수 (4) 단풍나무과 단풍나무과단풍나무속 12 개분류군 43 개체로부터얻어진염기서열을바탕으로 DNA 바코드분석을수행하였다. 분석결과 rbcl와 matk 구간에서 PCR 의성공률은 100% 로나타났으나, matk구간은단풍나무와복장나무등일부

38 샘플에서시퀀싱분석이제대로이루어지지않아정확한분석을위해 ITS 구간을추가로분석하였다 ( 표 17). 핵 ITS 구간은 12 종 27 개체에서성공적으로반응의결과를얻었으며, 깨끗한염기서열을결정하였다 ( 표 17). 표 17. 단풍나무과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률 rbcl matk ITS No. of species (accessions) 12(43) 12(43) 12(43) No. of species (accessions) successfully amplified and sequenced 12(43) 12(33) 12(43) % seq uencing success 100% 76.7 % 100% 표 18. 단풍나무과 식물의 DNA 바코드 분석 구간 염기서열 특징 rbcl matk ITS rbcl+matk total Seq uence length (b p) ,289 1,289 Aligned length (b p) ,293 1,293 G + C ratio (% ) No. of variab le sites (% variable sites) No. of informative sites (% informative sites) 총 43개개체들을정렬한후최종자료행렬 (data matrix) 은 565b p(rbcl) 및 7 28bp(matK) 로확정하였다. 이중, variable site 는 rbcl의경우 7bp, matk의경우 26bp 인것으로나타났으며 informative site 수는각각 7bp, 23bp 인것으로나타났다 ( 표 18). ITS 구간의 27 개체에대한염기서열은최종정렬한결과 7 31b p였으며, 이중 125b p의 variab le site와 117 b p의 informative site가나타나핵 ITS 구간이엽록체구간보다더변이가크고정보가많은것으로나타났다 ( 표 18). 단풍나무과의 12 종을대상으로 rbcl+matk 및 ITS 구간의종내변이와종간변이를계산한결과는표 19 에제시하였다. 종내변이는평균값을기준으로 rbcl+matk의경우 이었으며 ITS 구간은 으로나타났다. 한편, 종간변이는평균값을기준으로 rbcl+matk는 , ITS 는 으로서본

39 연구에사용된 rbcl, matk, ITS의세 DNA 바코드의종간변이가종내변이보다훨씬크다는것을의미하며종판별 DNA 바코드로서유용성이있다는것을의미한다. 또한, ITS 구간의종간변이의평균은엽록체 DNA 바코드두구간의평균값에비해약 10 배이상의큰것으로나타나핵구간의변이가큼을보여주고있다. 표 19. 분석구간별 단풍나무과 분류군의 유전적 거리 Regions Intraspecific K2P distance Interspecific K2P distance Min. Mean Max. Min. Mean Max. rbcl+matk ITS 분석한 DNA 바코드의자료로부터얻은유전적거리의분포를그래프로표시하면본연구에사용된 rbcl, matk의유합자료와 ITS 자료의종간변이가종내변이보다훨씬크다는것이확연히드러난다 ( 그림 8). 따라서, 이두구간의 DNA 바코드는한국산단풍나무과의종을구분할수있는유용성이있다고판단된다. A B 그림 8. 단풍나무과 rbcl+matk 유합자료및 ITS 의종간, 종내변이율분포도 한편, 단풍나무과식물의식별및유연관계분석을위해 rbcl과 matk 유합자료로분석한근린결합계통수에서단풍나무과 12 종중시닥나무 (Acer komarovii) 은하나의무리로유집되지않고산겨릅나무 (A. tegmentosum) 의 sucessive sister 로위치하거나산겨릅나무와구분되지않았고 (Acer kom

40 ), 단풍나무 (A. palmatum) 과단당풍 (A. pseudosieboldianum) 의개체들은서로혼합되어하나의집단을유집되는것으로나타났다. 복장나무 (A. mandshuricum) 의경우분석에포함된 4개체가하나의무리로유집되지는않았으나다른종과구분되는것으로나타났다. 이러한위의 4종을제외한나머지종들은모두독립된무리로뚜렷하게유집되었다 ( 그림 9). A B 그림 9. 단풍나무과의 rbcl+matk 유합자료 (A) 및 ITS 구간 (B) 의근린결합계통수 한편, 추가로분석한 ITS 구간의 NJ 계통수 ( 근린결합계통수 ) 에서는분석한모든종이모두독립된무리로유집되는것으로밝혀졌다 ( 그림 9). 특히시닥나무는엽록체 rbcl + matk의자료와달리독립된무리를이루는것으로나타나 ITS 구간이종의유집을보여주는데있어서더유의한것으로판단된다. Acer pictum의변종으로인식되고있는털고로쇠 (A. pictum var. pictum), 고로쇠 (A. pictum var. mono), 만주고로쇠 (A. pictum var. truncatum) 은각각독립된무리로유집되지않고하나의무리로유집되었으며 ( 그림 9), 이러한

41 결과는상기한 3분류군이독립된종이아닌변종으로인식되는분류학적처리를지지한다 (Ch ang, 2007 ). 상기한결과를종합해볼때, 분석에사용된 3개바코드구간중및엽록체 matk와 rbcl 유합염기서열및핵 ITS 구간으로우리나라단풍나무과의식물을종수준에서판별할수있는것으로밝혀졌다 ( 그림 9). (5) 용담과 본연구결과, 용담과 5 속 22 분류군 50 개체에대한핵 DNA 상의 ITS 및엽록체 DNA 상의 rbcl 유전자및 matk 유전자구간의염기서열 134 개를확보하였다 ( 붙임 2, 표 20). 확보된염기서열의수, 길이, 분석된염기서열의길이, informative site 의수, G+C 함량등은표 20 에표시하였다. 확보된모든용담과식물로부터엽록체 rbcl 과 matk 및핵 ITS 구간의증폭을성공하였으나, 엽록체 matk 구간및핵 ITS 구간의경우일부샘플로부터 sequencing 을성공하지못하였다. Informative site 의비율로볼때핵 ITS, matk, rbcl 구간의순서로염기서열길이대비효율성이감소하며 ( 표 20), 확보된염기서열중 informative site 가가장많은구간은핵 ITS 구간으로분석된 698bp 중 211bp (30.2%) 였으며, 엽록체 rbcl 구간은분석된 703bp 중 57bp (8.1%) 로가장낮은것으로나타났다 ( 표 20). 표 20. 용담과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률및염기서열특징 rbcl matk ITS Total No. of species (accessions) 22 (50) 22 (50) 22 (50) 22(50) No. of species (accessions) successfully amplified and seq uenced 22 (50) 22 (45) 22 (39) - % seq uencing success Seq uence length (b p) Aligned length (b p) G +C ratio (%) 43.37% 39.98% 58.28% - No. of variab le sites (% variable sites) No. of informative sites (% informative sites) 69 (9.8% ) 205 (27%) 239 (34.2% ) (8.1% ) 17 6 (23.2%) 211 (30.2% ) 444

42 본연구를통해확보된본과상기 22 분류군의 ITS, rbcl 및 matk 구간염기서열을 PAUP program 의 Kimura-2-parameter 값을사용하여종내개체간, 동일속내종간및속간염기서열변이율을산출한결과, 그림 10 과같은결과를확보하였다. 그림 10. 용담과분류군의종내개체간 (Blue), 동일속내종간 (Red) 염기서열변이율빈도분포도 (A. rbcl gene; B. matk gene; C. ITS) 종내개체간염기변이율, 속내종간염기변이율및속간염기변이율에있어핵 ITS 구간이가장변이율이높고, 엽록체 rbcl 구간의염기서열이가장변이율이낮은것으로확인되었으며, 핵 DNA IT S 구간의종내변이는 0.0% ~ %, 엽록체 DNA rbcl 및 matk구간의종내변이율은각각 0.0% ~ 0.006%, 0.0% ~ 0.008% 인것으로나타났다. 또한, 용담과에속하는종간염기서열변이율의경우, 핵 DNA IT S구간에서는 0.0%~ 0.188%, 엽록체 DNA rbcl구간에서는 0.0%~ 0.05%, matk구간에서는 0.0~ 0.156% 인것으로나타났다 ( 표 21). 표 21. 분석구간별 용담과 분류군의 유전적 거리 Region Intraspecific K2P distance Interspecific K2P distance Min. Mean Max. Min. Mean Max. rbcl matk ITS

43 A B C D 그림 11. 용담과식물의 DNA 바코드구간염기서열의근린결합계통수 (A. rbcl gene; B. matk gene; C. rbcl+matk+its 유합염기서열 ; D. ITS)

44 용담과 식물의 식별 및 유연관계 분석을 위해 Kimura-2-parameter model 에 의해 산출된 염기변이율을 이용한 neighbor-joining tree( 근린결합계통수 ) 분석 결과 (Saitou & Nei, 1987), 분석에 사용된 3개 바코드 구간 및 엽록체 matk, rbcl와 핵 ITS 유합 염기서열에서 속 수준에서 우리나라 용담과 식물 이 구분되는 경향이 있으나, 각 구간별 해상력이 낮았으며, 이는 본 연구에 사 용된 구간이 용담과 식물의 바코드 마커로서 유용하지 않다는 것을 나타낸다 ( 그림 11). 본 연구에서 확보된 엽록체 rbcl, matk 유전자와 핵 ITS 구간의 염기서열을 근거로 각각의 neigh b or-j oining tree 를 분석한 결과, 엽록체 rbcl 구간에서 용담 과 7 속 중 2 속 ( 용담속, 덩굴용담속 ) 은 구분이 되었으나, 나머지 4 속 ( 쓴풀속, 수염 용담속, 좁은잎덩굴용담속, 닻꽃속, 대성쓴풀속 ) 은 구분되지 않는 것을 확인 할 수 있었다. 엽록체 matk 구간에서 분석된 5 속 ( 쓴풀속, 닻꽃속, 대성쓴풀속, 덩굴용담 속, 용담속 ) 중 용담속, 덩굴용담속은 구분이 되었으나, 나머지 3 속은 구분되지 않 았다. 핵 ITS 구간에서 분석된 용담과 7 속 중, 4 속 ( 용담속, 덩굴용담속, 수염용담 속, 좁은잎 덩굴용담속 ) 은 구분이 되었으나, 나머지 3 속은 구분되지 않았다. 또한 본 연구에서 분석에 사용된 3 개 바코드 구간의 유합 염기서열에서도 용담과 5 속 ( 쓴풀속, 닻꽃속, 대성쓴풀속, 덩굴용담속, 용담속 ) 중 덩굴용담속과 용담속은 분류 가 되었으나, 나머지 3 속은 구분되지 않았다 ( 그림 11). 본 연구결과 DNA 바코드 구간 (rbcl, matk, ITS) 과 3구간을 유합 (rbcl+matk+its) 한 경우, 용담속 (Gentiana) 의 식물은 절 (Section) 수준까지 분 류가 되는 경향을 확인할 수 있었다. 또한 쓴풀속 (Swertia) 내에 닻꽃속 (Halenia) 과 대성쓴풀속 (Anagaliidium) 이 각각의 clade 를 형성하는 것으로 나 타났으며, 이러한 결과는 기존이 분자계통학적 연구에서도 보고된 바 있다 (Ch assot et al., 2001; Liu et al., 2001). 이와 같이 우리나라 용담과 식물이 DNA 바코드로 속 수준 구분이 되는 경향은 있으나 각 구간별 해상도가 14% 이하로 낮았으며, 이는 본 연구에 사용된 구간이 용담과 식물의 바코드 마커 로서 유용하지 않다는 것을 나타낸다. 추후 한국산 용담과에 유용한 바코드 마커의 개발을 위해서 각 분류군의 개체를 늘리고, 다양한 유전지역을 바탕으 로 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.

45 (6) 박주가리과 박주가리과 3 속 15 분류군 45 개체에대한엽록체 DNA 상의 rbcl 유전자와 matk 유전자구간및 trnh-psba IGS 의염기서열 218 개를확보하였다 ( 표 22). 확보된염기서열의수, 길이, 분석된염기서열의길이. informative site 의수, G+C 함량등은표 22 에표시하였다. 표 22. 박주가리과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률및염기서열특징 rbcl matk trnh-psba Total No. of species (accessions) 15(45) 15(45) 15(45) 15(45) No. of species (accessions) successfully amplified and sequenced 15(45) 15(43) 15(44) - % seq uencing success Aligned length (b p) G +C ratio (%) No. of variab le sites (% variable sites) 33 (4.7% ) 109 (13% ) 248 (47.3%) 390 No. of informative sites (% informative sites) 24 (3.4% ) 77 (9.2%) 218 (41.6%) 319 확보된모든박주가리과식물로부터엽록체 rbcl 과 matk 및 trnh-psba IGS 의증폭을성공하였으나, 엽록체 matk 구간및 trnh-psba IGS 의경우일부샘플로부터 sequencing 을성공하지못하였다. Informative site 의비율로볼때 trnh-psba, matk, rbcl 구간의순서로염기서열길이대비효율성이감소하며 ( 표 21), 확보된염기서열중 informative site 가가장많은구간은 trnh-psba IGS 로분석된 524bp 중 248bp(42.7%) 였으며, 엽록체 rbcl 구간은분석된 702bp 중 24bp(3.4%) 로가장낮은것으로나타났다 ( 표 22). 본연구를통해확보된본과상기 15 분류군의 rbcl 와 matk 및 trnh-psba 구간염기서열을 PAUP program 의 Kimura-2-parameter 값을사용하여종내개체간, 동일속내종간및속간염기서열변이율을산출한결과, 그림 10 과같은결과를확보하였다. 종내개체간염기변이율, 속내종간염기변이율및속간염기변이율에있어 trnh-psba IGS 구간이가장변이율이높고, 엽록체 rbcl 구간의염기서열이가장변이율이낮은것으로확인되었으며, trnh-psba IGS 구간의종내변이는

46 0.0%~ 0.7%, matk 및 rbcl구간의종내변이율은각각 0.0%~0.3%, 0으로나타났다. 또한, 박주가리과에속하는종간염기서열변이율의경우, trnh-psba IGS구간에서는 0.0% ~ 29.5%, matk구간에서는 0.0%~7.6%, rbcl구간에서는 0.0~2.8% 인것으로나타났다. 박주가리과식물의식별및유연관계분석을위해 Kimura-2-parameter model 에의해산출된염기변이율을이용한 Neighbor-joining 분석결과 (Saitou & Nei, 1987), 분석에사용된 3개바코드구간및엽록체 matk와 rbcl 유합염기서열및 matk, rbcl, trnh-psba 유합염기서열에서속 / 종수준의우리나라박주가리과식물중백미꽃속식물의구분이비교적어려운것을확인할수있었다 ( 그림 12). 그림 12. 박주가리과분류군의종내개체간 (Red), 동일속내종간 (Blue) 염기서열변이율빈도분포도 [ A. rbcl g ene; B. mat K gene; C. trnh-psba; D. com b ined seq uence(mat K+rbcL +trnh-psba)] 분석된엽록체 matk, rbcl 및 trnh-psba 바코드구간모두에서 Tylophora( 왜박주가리속 ), Marsdenia( 나도은조롱속 ), Metaplexis( 박주가리속 ) 만이뚜렷이구분되었다 ( 그림 13). 속내의종수준에있어서한반도에분포하는박주가리과식물중 Tylophora( 왜박주가리속 ), Metaplexis( 박주가리속 ), Marsdenia( 나도은조롱속 ) 은각각의속내에 1 종만분포하는분류군으로분석된 3 개구간에있어서종수준에서도뚜렷이구분되었다. 본연구에포함된한반도에분포하는 Cynanchum( 백미꽃속 ) 11 개분류군의경우, 상기 3 개구간에있어서 Cynanchum wilfordii (Maxim.) Hemsl.( 큰조롱 ) 를제외하고솜아마존, 민백미꽃, 백미꽃, 덩굴민백미꽃등의종구분이어려운것으로나타났다 ( 그림 13).

47 A B C D 그림 13. 분석된박주가리과식물의엽록체 DNA 바코드구간염기서열의근린결합계통수 (A. matk gene; B. rbcl gene; C. trnh-psba; D. matk+rbcl+trnh-psba 유합염기서열 )

48 Cynanchum paniculatum (Bunge) Kitag.( 산해박 ) 의 경우, trnh-psba IGS 구간 에서 구분되는 반면, 엽록체 matk 와 rbcl 구간에서는 솜아마존, 민백미꽃 등 백미 꽃속 식물과 하나의 그룹을 이루며 종 수준에서 구분되지 않는 것으로 확인되었 다. 한편, 본 연구에서 분석된 각 구간별 종 구분율은 trnh-psba IGS 구간이 54.5% 로 분석된 구간 중 가장 높은 것으로 나타났으며, 엽록체 rbcl 구간은 28.9%, 엽록체 matk 구간은 37.2%, 엽록체 matk 구간과 rbcl 구간의 유합자료는 37.2%, matk, rbcl 및 trnh-psba IGS 구간의 유합자료는 65.1% 인 것으로 확인 되었다. 한편, matk, rbcl 및 trnh-psba 유합염기서열에서 Tylophorinae 의 Tylophora floribunda Miq.( 왜박주가리 ) 는 Cynanchum atratum Bunge( 백미꽃 ), Cynanchum inamoenum (Maxim.) Loes.( 선백미꽃 ), Cynanchum ascyrifolium (Franch. & Sav.) Matsum.( 민백미꽃 ) 등 Cynanchinae clade 와함께유집되었으며, Marsdenia tomentosa C. Morren & Decne.( 나도은조롱 ) 은 Marsdenieae clade 로 따로 유집되 었다. 특히 Cynanchum atratum Bunge( 백미꽃 ), Cynanchum inamoenum (Maxim.) Loes.( 선백미꽃 ), Tylophora floribunda Miq.( 왜박주가리 ), Cynanchum wilfordii (Maxim.) Maxim. ex Hook. F.( 큰조롱 ) 의 식물들은 종 구분이 가능한 것 으로 나타났다 ( 그림 13). 또한, Cynanchum nipponicum Matsum. var. nipponicum( 덩굴박주가리 ), Cynanchum volubile (Maxim.) Hemsl.( 세포큰조롱 ), Cynanchum ascyrifolium (Franch. & Sav.) Matsum.( 민백미꽃 ) 은 바코드를 이용한 종 구분을 위해서는 핵 DNA 구간 염기서열 등 다른 바코드 구간의 분석이 더 필요한 것으로 사료된다.

49 (7 ) 조름나물과조름나물과 2속 4분류군 14 개체에대한핵 DNA 상의 ITS 및엽록체 DNA 상의 rbcl유전자및 matk유전자구간, 총 3개구간의염기서열이결정되었다 ( 붙임 2, 표 23). 확보된모든조름나물과식물로부터엽록체 rbcl과 matk 및핵 ITS 구간의증폭을 100% 성공하였으나, 핵 ITS 구간의경우일부샘플로부터 sequencing 을성공하지못하였다. 이를제외한나머지 12 개체의경우핵 ITS 구간에대한 PCR 증폭및염기서열결정이모두용이하였다. 확보된염기서열의수, 길이, 분석된염기서열의길이. informative site 의수, G+C 함량등은표 23에표시하였다. Informative site 의비율로볼때핵 IT S, matk, rbcl 구간의순서로염기서열길이대비효율성이감소하며 ( 표 23), 확보된염기서열중 informative site 가가장많은구간은핵 ITS 구간으로분석된 777bp 중 90bp (11.6%) 였으며, 엽록체 rbcl구간은분석된 7 03b p 중 26b p (3.7%) 로가장낮은것으로나타났다 ( 표 23). 표 23. 조름나물과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률및염기서열특징 rbcl matk ITS Total No. of species (accessions) 4 (14) 4 (14) 4 (14) - No. of species (accessions) successfully amplified and sequenced 4 (14) 4 (14) 4 (12) - % seq uencing success Seq uence length (b p) Aligned length (b p) ,317 G +C ratio (%) No. of variab le sites (% variable sites) 26 (3.7% ) 65 (7.7%) 90 (11.6%) 181 No. of informative sites (% informative sites) 26 (3.7% ) 65 (7.7%) 90 (11.6%) 181 본연구를통해확보된본과상기 14 분류군의 ITS, rbcl 및 matk 구간염기서열을 PAUP program 의 Kimura-2-parameter 값을사용하여종내개체간, 동일속내종간및속간염기서열변이율을산출한결과, 그림 14 와같은결과를확보하였다. 종내개체간염기변이율, 속내종간염기변이율및속간염기변이율에있어핵 ITS 구간이가장변이율이높고, 엽록체 rbcl구간의염기서

50 열이가장변이율이낮은것으로확인되었으며, 핵 DNA ITS구간의종내변이는 0.0% ~ 0.104%, 엽록체 DNA matk 및 rbcl구간의종내변이율은각각 0.0%~ 0.004%, 0.0% ~ % 인것으로나타났다. 또한, 조름나물과에속하는종간염기서열변이율의경우, 핵 DNA IT S 구간에서는 0.0% ~ 0.104%, 엽록체 DNA matk구간에서는 0.0% ~ 0.084%, rbcl구간에서는 0.0~ 0.036% 인것으로나타났다 ( 표 24). 표 24. 분석구간별 조름나무과 분류군의 유전적 거리 Region Intraspecific K2P distance Interspecific K2P distance Min. Mean Max. Min. Mean Max. rbcl matk ITS 조름나물과식물의식별및유연관계분석을위해 Kimura-2-parameter model 에의해산출된염기변이율을이용한 neighbor-joining tree( 근린결합계통수 ) 분석결과 (Saitou & Nei, 1987 ), 분석에사용된 3개바코드중, 엽록체 matk와 rbcl구간에서는속수준에서조름나물과식물이구분되었고, 핵 ITS 및엽록체 matk와 rbcl, 핵 ITS 유합염기서열에서속 / 종수준에서우리나라조름나물과식물이잘구분되는것으로확인할수있었다 ( 그림 14). 그림 14. 조름나물과분류군의종내개체간 (Blue), 동일속내종간 (Red), 염기서열변이율빈도분포도 (A. rbcl gene; B. matk gene; C. IT S)

51 본연구에서확보된엽록체 rbcl, matk 유전자와핵 ITS 구간의염기서열을근거로각각의 neighbor-joining tree 를분석한결과, 조름나물과의 2속 ( 조름나물속, 어리연속 ) 이뚜렷이구분되었으며, ITS 구간과 3구간을유합 (rbcl+matk+its) 한경우어리연속내에서각각 3개의 Cluster 가뚜렷이구분되었다. 이를통해이들엽록체 2개구간이조름나물과식물을속수준에서식별하는데유용하며, 핵구간과 3구간의유합 (rbcl+matk+its) 은조름나물과식물을종수준에서식별하는데유용한것으로판단되었다 ( 그림 15). A B C D 그림 15. 조름나물과식물의 DNA 바코드구간염기서열의근린결합계통수 (A. rbcl gene; B. matk; C. rbcl+matk+its; D. ITS) 한편, 종동정률에있어엽록체 rbcl, matk 유전자와핵 ITS 구간이각각 50%, 50%, 100% 를보였으며, 이들 3개구간을모두합칠경우 100% 의종식별율을보인다. 이러한결과는기존에 Ch oi (2007 ) 등이제시한바와같이한반도에분포하는조름나물과식물이 4개의종으로잘구분되는것과일치하며, DNA 바코드 (rbcl, matk, ITS) 는조름나물과의식물을속또는종을판별하는데유용한것으로확인되었다.

52 (8) 지치과 지치과 8속 13 분류군 46 개체로부터 DNA 바코드분석을수행하였다. 분석결과 rbcl구간에서 PCR 의성공률은 100% 로나타났으나, 뚝지치, 반디지치, 왜지치종의 matk구간분석이되지않았다 ( 표 25). 표 25. 지치과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률 rbcl matk ITS No. of species (accessions) 13(46) 13(46) 13(46) No. of species (accessions) successfully amplified and sequenced 13(46) 13(34) 13(35) % seq uencing success 총 46 개개체들을정렬한후최종자료행렬 (data matrix) 는 571bp(rbcL) 및 7 84bp(matK) 로확정하였다. 분석한샘플들은지치 (Lithospermum erythrorhizon) 의한개체는 517bp이었으며, 이를제외한나머지모든개체에서 565bp이었다. 정렬된 57 1bp 중, variable site는 rbcl의경우 38bp, matk의경우 106bp인것으로나타났으며 informative site수는각각 32bp, 102bp인것으로나타났다 ( 표 26). ITS 구간의 35개체에대한염기서열은최종정렬한결과 7 06b p였으며, 이중 254b p의 variab le site와 247 b p의 informative site가나타나핵 ITS 구간이엽록체구간보다더변이가크고정보가많은것으로나타났다 ( 표 26). 표 26. 지치과식물의 DNA 바코드 분석 구간염기서열 특징 rbcl matk ITS total Seq uence length (b p) ,975-2,028 Aligned length (b p) G + C ratio (% ) No. of variab le sites (% variable sites) No. of informative sites (% informative sites)

53 지치과의 13 종을대상으로 rbcl, matk ITS 구간의종내변이와종간변이를계산한결과는표 27 에제시하였다. 종내변이의폭은 rbcl+matk+its 의경우 ( 평균 ) 이며, 종간변이의폭은 ( 평균 ) 인것으로나타나종간변이의값은종내변이값의평균값을기준으로약 40 배이상인것으로나타났다 ( 표 27). 이것은본연구에사용된 rbcl, matk, ITS 세구간이종판별 DNA 바코드로서바코드갭 (barcode gap) 이있다는것을의미한다. 표 27. 분석구간별지치과분류군의유전적거리 Intraspecific K2P distance Interspecific K2P distance Regions Min. Mean Max. Min. Mean Max. rbcl+matk+its 분석한 DNA 바코드의자료로부터얻은유전적거리의분포를그래프로표시하면본연구에사용된 rbcl, matk, ITS의두 DNA 바코드의종간변이가종내변이보다훨씬크다는것이확연히드러난다 ( 그림 16). 따라서, 이세구간의 DNA 바코드는한국산지치과의종을구분할수있는유용성이있다고판단된다. 그림 16. 지치과 rbcl+matk+its 유합자료의종간, 종내변이율분포도

54 한편, 지치과식물의식별및유연관계분석을위해 rbcl, matk, ITS 유합자료로분석한근린결합계통수에서대부분의속은뚜렷이독립된무리로유합되어각속을판별하는데유용한것으로나타났으나, 일부속에서는 DNA 바코드로종을판별하는데한계가있는것을나타났다. 특히, 꽃마리속 (Trigonotis) 는독립된무리를이루고있는집단외에뚝지치속 (Hackelia), 꽃받이속 (Bothriospermum) 의가깝게유집된개체들이있어, 상기한 DNA 바코드염기서열로종을판별하거나속을구분하는데한계가있는것으로사료된다. 또한, 모래지치속 (Argusia) 와갯지치속 (Mertensia) 도염기서열이매우유사하고근린결합계통수상에서서로혼합되어무리를이루고있는것으로나타나이들속의분류학적정체성및한계에대해서보다자세한연구가필요한것으로판단된다. 그림 17. 지치과 rbcl+matk+its 유합자료의근린결합계통수

55 한편, 꽃받이속 (Bothriospermum), 당개지치속 (Brachybotrys), 뚝지치속 (Hackelia), 지치속 (Lithospermum) 은각각독립된무리로유집되었으며, 상기한 DNA 바코드염기서열은이들분류군을판별할수있는것으로판명되었다 ( 그림 17). 지치속의개치지 (L. arvense) 는분석에포함된 4개체가독립된무리를형성하여종판별이가능한것으로나타났으나개기치및반디지치는각각이독립된무리를형성하지않았다. 따라서, 지치과에대한 DNA 바코드염기서열의 NJ 계통분석은분석에사용된 3개바코드구간이우리나라지치과의식물을판별하는데한계가있음을시사하고있고, 지치과의종판별에대해서는보다상세한수준의마커를개발할필요가있는것으로사료된다. (9) 현삼과및꿀풀과 현삼과 15 속 28 분류군 63 개체에대하여엽록체유전체의 rbcl, matk, ccsa 구간에대한염기서열을분석한결과, 정렬한 DNA 의세구간에대한전체길이는 4,020bp 였다 ( 표 28). 표 28. 현삼과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률및염기서열특징 rbcl matk ccsa combined No. of species (accessions) 28 (63) 28 (63) 28 (63) 28 (63) No. of species (accessions) 28 (63) 28 (63) 28 (63) 28 (63) successfully amplified and sequenced % seq uencing success Aligned length (b p) 1,37 7 1, ,020 G+C ratio (%) 42.9~ ~ ~ ~ 37.4 No. of variab le sites 27 0 (19.6) 892 (48.1) 327 (41.6) 1,489 (37.0) (% variable sites) No. of informative sites 239 (17.3) 7 92 (42.7 ) 281(35.7 ) 1,312 (32.6) (% informative sites) 이들중 variab le site는 1,489개이고, 계통학적으로유용한 informative site 는 3,655개였다. 각각의구간에대한효율성을알아볼수있는기준인 % of informative sites 는 rbcl이 17.3%, matk가 42.7 %, ccsa가 35.7 % 로서 matk 가가장효율성이높은구간이었다. 전체세구간을합친 % of informative sites 는 32.6% 였다. ccsa 구간을바코드구간으로정한것은꿀풀과의엽록체유전체가모두밝혀진세종의분석에의해결정한것이었고, 현삼과식

56 물과도거의비슷한양상을갖고있을것으로추정하고실시한것이다. 하지만, 현삼과식물에있어서 ccsa 구간은결과적으로 matk 구간보다 % of informative sites 가낮게나왔으며, 길이도 matk 구간보다길지못했다. 현삼과식물들의바코드연구에있어서는 ccsa 구간도 35.7% 의높은 % of informative sites 수치를보이기는했지만기존의 universal marker 구간으로제시되고있는 matk 구간이더욱효율적인구간으로파악되었다. 현삼과 DNA 바코드마커들의종내, 종간, 속간의염기변이율은세구간을모두합쳤을때종내변이는최대 10.6% 였고, 종간변이는 0.1~ 13.9% 로종내의개체간변이가종간의변이율을넘어서는경우도일부발견되었다 ( 표 29). 속간변이는 2.4~ 12.6% 였다 ( 표 29). 표 29. 분석구간별 현삼과 분류군의 유전적 거리 Intraspecific K2P Interspecific K2P Intergenic K2P Region distance(%) distance(%) distance(%) Min. Max. Min. Max. Min. Max. rbcl matk ccsa Combined 현삼과분류군들의각구간별및유합자료에의한염기서열의변이율분포도를작성하였다 ( 그림 18). 세유전자구간을합친유합자료의경우 ( 그림 18 D) 종간변이의분포역곡선과종내변이의분포역곡선이일부겹쳐짐을알수있는데, 이는이들세구간으로전체분류군들에대한완벽한바코드갭 (barcode gap) 이존재하지않고, 더좋은분해능을갖는바코드시스템개발을위해서는더많은구간을포함시켜야함을보여주고있다. A B C D 그림 18. 현삼과분류군의종내개체간 (Blue), 동일속내종간 (Red), 속간 (Green) 염기서열변이율분포도

57 A B C D 그림 19. 한국산 현삼과 및 꿀풀과 식물들의 근린결합계통수 [A. rbcl gene; B. matk gene; C. ccsa gene; D. rbcl+matk+ccsa 유합염기서열 자료. 각 절 위의 숫자는 bootstrap 값들 (1000 replications)] TG[\GT

58 각각의구간별분석된 neighbor-joining tree( 근린결합계통수 ) 들과세구간의통합분석에의한 neighbor-joining tree 에의해이들구간이갖는바코드분해능을도출하였다 ( 그림 19). rbcl에의한현삼과식물들의바코드분해능은 81.0%, matk는 90.5%, ccsa는 85.7% 로, 세구간을모두합친 neighbor-joining tree에있어서 95.2% 의분류군분해능을보였다. 쌀파도풀, 큰송이풀, 대송이풀, 논뚝외풀, 민구와말, 구와말, 소엽풀, 두메투구풀의 8종은한개의시료만을포함하였기때문에바코드분해능계산에서는제외시켰다. 향후이들종들에대한더많은시료들의추가와함께아직포함시키지못한종들전체에대한분석으로한국산현삼과식물들에대한바코드시스템을완비할수있을것이다. 꿀풀과 16 속 30 분류군 62 개체에대하여엽록체유전체의 rbcl, matk, ccsa 구간에대한염기서열을분석한결과, 정렬한 DNA 의세구간에대한전체길이는 4,020bp 였다 ( 표 30). 이들중 variable site는 1,138 개이고, 계통학적으로유용한 informative site는 900개였다. 각각의구간에대한효율성을알아볼수있는기준인 % of informative sites 는 rbcl이 13.6%, matk가 26.8%, ccsa가 27.2% 로서 ccsa가가장효율성이높은구간이었다. 전체세구간을합친 % of informative sites 는 22.4% 였다. GenBank 에등록되어있는꿀풀과세종의엽록체전체유전체의분석을통해 ccsa 구간이꿀풀과바코드연구에있어서가장효율적인구간이될수있을것이라고예상하였는데, 본연구의염기서열분석결과도예상과동일하였다. 그러나 matk는상대적으로 ccsa구간보다길이가두배이상길어, 제공하는 informative site의수또한배이상많았다 ( 표 30). 표 30. 꿀풀과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률및염기서열특징 rbcl matk ccsa C omb ined No. of species (accessions) 30 (62) 30 (62) 30 (62) 30 (62) No. of species (accessions) successfully 30 (62) 30 (62) 30 (62) 30 (62) amplified and sequenced % seq uencing success Aligned length (b p) 1,377 1, ,020 G +C ratio (%) 44.1~ ~ ~ ~37.5 No. of variab le sites (% variab le sites) 234 (17.0) 649 (35.0) 255 (32.4) 1, 138 (28.3) No. of informative sites (% informative sites) 188 (13.6) 498 (26.8) 214 (27.2) 900 (22.4)

59 한편, 엽록체유전체의 matk 구간은현재의 Sanger 방법에의한염기서열결정방법으로 2~3 개의 PCR product 를만들어야하는긴구간으로비효율적이다. 그러나 ccsa 구간은한번의 PCR 및 sequencing으로얻을수있는최대치 ( 약 900bp) 에근접하는길이를갖고, 또한높은 % of informative sites (%) 수치를보여꿀풀과의효율적인바코드개발을위해좋은마커임이밝혀졌다. 꿀풀과 DNA 바코드마커들에대한염기서열구간의변이율은 rbcl에서종내변이 0-1.1%, 종간변이 0-5.5%, 속간변이 %, matk의종내변이는 0-0.3%, 종간변이 %, 속간변이 % 의값을가지며, ccsa는종내변이 0-0.4%, 종간변이 %, 속간변이 % 였다 ( 표 31). 표 31. 분석구간별 꿀풀과 분류군의 유전적 거리 Intraspecific K2P Interspecific K2P Intergenic K2P Region distance(%) distance(%) distance(%) Min. Max. Min. Max. Min. Max. rbcl matk ccsa Comb ined A B C D 그림 20. 꿀풀과분류군의종내개체간 (Blue), 동일속내종간 (Red), 속간 (Green) 염기서열변이율분포도

60 현삼과및꿀출과 58분류군 125개체에대한 DNA바코드염기서열정보를종합하여분석한결과, 확보된염기서열의수, 길이, 분석된염기서열의길이. informative site의수, G+C 함량등은표 32에표시하였다. 표 32. 현삼과및꿀풀과식물의구간별 DNA 바코드산출성공률및염기서열특징 rbcl matk ccsa C omb ined No. of species (accessions) 58 (125) 58 (125) 58 (125) 58 (125) No. of species (accessions) successfully 58 (125) 58 (125) 58 (125) 58 (125) amplified and sequenced % seq uencing success Aligned length (b p) 1, 377 1, ,020 G +C ratio (%) 42.9~ ~ ~ ~37.5 No. of variab le sites (% variab le sites) 348 (25.3) (0.1) 386(49.0) 1,805 (44.9) No. of informative sites (% informative sites) 318 (23.1) 969 (52.2) 350 (44.5) 1,637 (40.7 ) 현삼과및꿀풀과 125 개체에대한염기서열구간의변이율을통합분석하면 rbcl에서종내변이 0-2.2%, 종간변이 0-7.5%, 속간변이 %, 과간변이는 4.9% 였으며, matk에서는각각 0-1.3%, %, %, 과간변이는 12.3% 였다. 그리고 ccsa구간에서는각각 0-1.5%, %, %, 과간변이 11.4% 로전체적으로 rbcl은 matk와 ccsa에비하여매우낮은변이율을보이고있었다 ( 표 33). 표 33. 분석구간별 현삼과 및 꿀풀과 분류군의 유전적 거리 Intraspecific K2P Interspecific K2P Intergenic K2P Interfamilial K2P Region distance(%) distance(%) distance(%) distance(%) Min. Max. Min. Max. Min. Max. rbcl % matk ccsa Comb ined 꿀풀과와현삼과의통합자료에있어서세 DNA 구간의 % of informative sites 는 40.7% 였다. 꿀풀과분류군들에대하여세분석구간을종합한데이터의종내개체간, 속내종간, 그리고속간염기서열변이율의분포도를보면