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민영 서
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1 동의생리병리학회지제 22 권 6 호 Korean J. Oriental Physiology & Pathology 22(6): , 2008 금속단백분해효소의활성저해를통한삼귀고의탕의전이억제효과 김성무 이연희 이주호 1 김성훈 * 이은옥 * 경희대학교한의과대학암예방소재개발연구센터, 1 : 경희대학교동서의학대학원 Anti-metastatic Effect of Samguikoeui-Tang Via Inhibition of Matrix Metalloproteinases Activities Sung Moo Kim, Yun Hee Rhee, Joo Ho Lee 1, Sung Hoon Kim*, Eun Ok Lee* Cancer Preventive Material Development Research Center, Kyunghee University, 1:Graduate School of East-West Medical Science, Kyunghee University This study was performed to examine the anti-metastatic effect of ethanol extract of Samguikoeui-Tang (SGKE), a formula consisting of four oriental herbs, in highly-metastatic HT1080 human fibrosarcoma cells. SGKE significantly inhibited the adhesion of HT1080 cells to matrigel at nontoxic concentrations in a dose-dependent manner, while it did not exert cytotoxicity against HT1080 cells up to the concentration of 100 μg/ml. Also, SGKE depressed the activity of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) by gelatin zymography. However, SGKE did not affect the mrna expression of MMP-2 and TIMP-2, an inhibitor of MMP-2, by RT-PCR analysis. In addition, the effect of SGKE on HT1080 cell invasion was determined using Boyden chamber assay. SGKE suppressed the invasion of HT1080 cells in a dose-dependent manner. Taken together, these results suggest that SGKE has an anti-metastatic effect via inhibition of MMP-2 and -9 activities. Key words : Samguikoeui-Tang(SGKE), metastasis, matrix metalloproteinases, HT1080 서론 종양의전이 (metastasis) 는암세포의성장과증식에관련하여, 초기종양이혈관이나림프관을타고다른장기로이동하는것을말한다 1). 이모든과정은세포외기질 (extracelluar matrix, ECM) 이분해가되면서시작되는데 ECM을분해하는효소로는 matrix metalloproteinases (MMPs), serine protease (plasmin), urokinase plasminogen activator (upa), cysteine proteases가있다 2). 이들중가장중요한역할을하는단백질분해효소가금속단백분해효소라불리는 MMPs이다. MMPs는 Zn 2+ 의존성의 endopeptidase로써정상적인 ECM을분해하는가장중요한역 * 교신저자 : 이은옥, 서울시동대문구경희대학교암예방소재개발연구센터김성훈, 서울시동대문구경희대학교암예방소재개발연구센터 leook@khu.ac.kr, Tel : sungkim7@khu.ac.kr, Tel : 접수 : 2008/10/28 수정 : 2008/11/21 채택 : 2008/12/03 할을하고있어서염증이나종양의침투 (invasion), 전이에가장중요한역할을하고있으며, 현재 24 종류의 MMPs가알려져있다 3). 이중에서 MMP-2 (Gelatinase A, 72 kda) MMP-9 (Gelatinase B, 92 kda) 의발현정도가종양의전이와침투능력에가장밀접한관계가있다고알려져있는데 4-7), 이미여러연구에서 MMP-2와 MMP-9를억제하면종양의전이를효과적으로조절할수있다고밝히고있다. 삼귀고의탕은본실험실에서신약개발을목표로항암스크리닝을통해유효한효과를보인인삼, 고삼, 당귀, 의이인으로조합한처방으로각각의구성한약도이미대표적인항암제로잘알려져있다. 인삼은오갈피나무과 (Araliaceace) 에속하는다년생식물로써 ginsenoside, 다당류, 펩타이드, 지질등이추출되는것으로알려져있고, 이중 ginsenoside가유효항암작용을하는것으로밝혀져있다. Ginsenoside는약 20여종이알려져있고, 이중 ginsenoside Rg3, Rh2가암세포의전이및자멸사 (apoptosis) 에효과가있는것으로보고되어있다 8-10). 고삼은콩

2 금속단백분해효소의활성저해를통한삼귀고의탕의전이억제효과 과 (Leguminoase) 에속하는다년생초본인도둑놈의지팡이 (Sophora flavescens Alton) 의주피를거의벗긴뿌리로부터분리한 flavonoid 계열의성분으로 Sarcoma 180, lymphoid leukemic 1210, melanotic melanoma의암세포주에서항암활성을보인다고보고되어있다 11-13). 당귀는미나리과다년생초목의뿌리를꽃이피기전에채취하여건조한것으로당귀의약리학적활성을나타내는주성분은 coumarin 유도체인 decursin이라는물질이며, 이외에도 decursinol, umbelliferon, ß-sitosterol 등이함유되어있다. 이중주성분인 decursin은대표적인 in vitro 항암물질로알려져있다 14,15). 의이인은율무의열매로식용및약용으로쓰이고대표적인구성성분인 coixenolide가생쥐의 Ehrlich ascites sarcoma에대한증식억제효과가있고, dicholromethane 분획물은 HT-29, AGS, MG-63등의인체암세포주에서항암효과가뛰어난것으로알려져있다 16,17). 따라서본연구는항암효과가알려진이들약재를배합하여보다증강된항암활성을보일수있다고생각되는삼귀고의탕을개발하여, 전이능력이뛰어난 HT1080 cell line을대상으로종양전이억제실험을진행하여유효한결과를얻었기에보고하는바이다. 재료및방법 1. 재료 1) 삼귀고의탕의구성성분은 Table 1과같이 4종으로구성하였다. Table 1. Prescription of Samguikoeui-Tang Crude drug Botanical origin Place Weight (g) Ginseng Radix Panax ginseng C. A. Meyer Korea 4 Sophora flavescens Sophora flavescens Alton Korea 4 Angelicae Giantis Radix Angelica Gigas Nakai Korea 4 Coicis Semen Coiz lacryma-jobi Linne var. ma-yuen stapf Korea 4 2) 삼귀고의탕에탄올추출물제조 삼귀고의탕은총 4종의한약재로구성되었다. 이구성분 3첩분량 72 g을에탄올 3 L에 3일간여과및추출하여감압농축후동결건조를하여 4.3 g의분말을얻어수율 5.97% 를나타냈다. 이분말은 -20 에보관하였으며 DMSO에녹여사용하였다. 2. 세포배양 In vitro 실험에사용된세포주는전이능력이좋은 cell line으로알려진 HT1080 (human fibrosarcoma cancer cell line) 을사용하였다. HT1080 cell은 RPMI 1640 (Wellgene, Korea) 배지에 10% FBS, 1% antibiotic solution (100, penicillin 10,000 units/ml, streptomycin 10 mg/ml, amphotericin B in 0.85% NaCl, Wellgene, Korea) 을첨가하여 T75 plate에서 37, 5% CO 2 상태에서배양하였으며, 70~80% confluence 상태가되었을때실험에사용하였다. 3. 세포독성검사 (MTT assay) HT1080 세포를 96well에 well 당 cells 되도록 10% FBS가첨가된 RPMI 1640 배지에현탁하여 well에분주한후 24 시간배양한다음, SGKE를각각의농도로 (0, 25, 50, 100, 200 μ g/ml) 24시간처리하였다. 24시간후에배양액을제거한후 5 mg/ml의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 용액을 50 μl씩각 well에넣고잘섞어준후최대 4시간동안 37 에서배양시킨후 MTT용액을제거하고 DMSO를 100 μl씩분주하여 well에생성된 formazan을충분히녹인후 ELISA를이용해 570 nm에서흡광도를측정하였다. 4. Cell adhesion assay Matrigel (stock concentration: 11 mg/ml, Becton Dickinson science, USA) 을 10배희석하여 96well plate에 well당 100 μl 씩분주한후 37 에서 2시간코팅하였다. 이후, PBS로 2회세척한다음, 코팅된 well의 non-specific binding을막기위하여 0.1% bovine serum albumin (BSA) 을넣고 37 에서 1시간반응시켰다. 그사이에 cells/ml의농도로준비한 HT1080 cell과 SGKE를농도별로 1:1로혼합한후 20분간 37, 5% CO 2 상태에서 pre-incubation 하였다. Well에서 0.1% bovine serum albumin 을제거하고 PBS로 2회세척후, pre-incubation한세포와약재를 well당 100 μl씩분주하고 10분간반응시킨후에부착된 cell 은 XTT assay를이용해 ELISA 분석 (450 nm) 을시행하였다. 5. Gelatin zymography Gelatin zymography는 conditioned culture medium안의 MMP-2 (gelatinase A) 와 MMP-9 (gelatinase B) 의 gelatin 분해활성을알아보기위한실험으로, HT1080 cell을 6well plate ( cells/well) 에준비하고, SGKE를농도별로 (0, 10, 25, 50, 100 μg/ml) 24시간처리한시료의 supernatant를취해 microcon 으로농축하여정량하였다. 1% 의 gelatin을첨가한 10% polyacrylamide gel에정량한시료를전개하여 120V로전기영동을실시한후에 2.5% Triton X-100 으로 30분씩 3번세척하고 Reaction buffer (50 mm Tris-HCl, ph 7.5, 150 mm NaCl, 10 mm CaCl 2 2H 2O, 1 μm ZnCl 2, 0.02% NaN 3) 로 1시간동안실온에서 shaking incubation하고, 다시 reaction buffer로 37 에서 overnight incubation을하였다. Coomassie Brilliant Blue(10% glacial acetic acid, 30% MeOH, 1.5% comassie blue) 로 1시간염색한후, 탈색용액 (30% MeOH, 10% glacial acetic acid) 으로 white band가보일때까지탈색하여 gel을관찰하였다. 6. HT1080에 SGKE 처리후 mrna 발현측정 1) mrna의추출 Trizol reagent (Invitrogen, USA) 를사용한 extraction 방법으로 mrna를추출하였다. HT1080에 SGKE를각각의농도로 (0, 10, 25, 50, 100 μg/ml) 24시간처리하여 cell을수거하였다. 수거한 cell에 Trizol reagent 1 ml에넣고 5분간반응시킨후, 여기에 0.3 ml의 Choloform을넣고잘섞은다음, 상온에 2~3분간둔후 4, 15,000 rpm에서 15분간원심분리하고상층액을취하였

김성무 이연희 이주호 김성훈 이은옥 다. Isopropanol (Junsei chemical, Japan) 을 500 μl 넣어잘섞고상온에서 10분간반응시킨후 12000 rpm에서 20분간원심분리를하고상층액을제거한것을 80% ethanol로세척한후상온에서말렸다.

3 김성무 이연희 이주호 김성훈 이은옥 다. Isopropanol (Junsei chemical, Japan) 을 500 μl 넣어잘섞고상온에서 10분간반응시킨후 rpm에서 20분간원심분리를하고상층액을제거한것을 80% ethanol로세척한후상온에서말렸다. 건조된 RNA에 DEPC water(wellgene, Korea) 30~50 μl을첨가해녹이고실험전까지 -20 에보관하였다. 추출한 RNA 양과순도는 UV spectrophotometer DU730 (Beckman coulter, Switzerland) 를사용하여 260 nm와 280 nm에서흡광도를측정하였다. 2) RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction) 추출한 RNA에서 cdna의합성은아래와같이하였다. 5X MMLV RT buffer (Promega, USA) 4 μl, MMLV Reverse transcriptase (Promega, USA) 1 μl, Oligo dt (Roche, USA) 1 μl, dntp mix (Takara, Japan) 2 μl를넣고각각의농도로처리된 sample (RNA 2 μg) 과 DEPC water를혼합한 20 μl를 PCR (Bio-rad, USA) 을이용하여 25 10분, 42 60분, 99 5분반응시킨후에 -20 에보관하였다. 합성된 cdna는 Table 2에기술한각각의 sense 및 anti-sense primer(20 pmol, Bioneer, Korea) 각각 1 μl 첨가하고 10X Taq buffer 2.5 ul, dntp 2 μl, Ex Taq polymerase (Takara, Japan) 0.8 ul을첨가한다음 distilled H 2O 로 total volume 25 μl가되도록혼합한후각각의 PCR 조건으로반응시켰다. 나온 product를 2% agarose gel 전기영동을실시하여 photodoc system (Bio-rad, USA) 에서분석하였다. 에 microscope (100 ) (Carl Zeiss, Germany) 로관찰하여침윤된세포의개수를측정하였다. 결과및고찰 1. SGKE가 HT1080 cell의세포생존에미치는영향 SGKE가 HT1080 cell의세포생존에미치는영향을알아보기위하여 96well에 well당 의농도로분주하여 24시간배양한후 MTT assay를하여관찰한결과 Fig. 1과같은결과를얻었다. SGKE는 μg/ml 사이의농도에서 IC 50 을나타냈으며, 100 μg/ml까지는거의독성을나타내지않았다. 이와같은결과를가지고본실험시 HT1080 cell에독성을유발하지않는최대농도 100 μg/ml을기준으로사용하였다. Table 2. The primer sequences which were used in PCR reaction Gene primer product size sense TCA CCA TCT TCC AGG AGC GA hgapdh 700bp antisense CAC AAT GCC GAA GTG GTC GT sense TAT GGC TTC TGC CCT GAG AC hmmp2 970bp antisense TCC AAA CTT CAC GCT CTT CA sense TGC AGC TGC TCC CCG GTG CAC htimp2 581bp antisense TTA TGG GTC CTC GAT GTC GAG 7. Invasion assay (Boyden chamber assay) 48well의 Boyden chamber (Neuro Probe Inc., Gaithersburg, USA) 를이용하여, cancer cell이 ECM을뚫고다른장기로이동하기위한침투능력을 in vitro에서관찰하기위해서 invasion assay를실시하였다. 먼저 conditioned media (CM) 를만들기위해 HT1080 cell이 70-80% confluence 상태일때배지를제거하고 RPMI 1640 free 배지를넣어 24시간 37, 5% CO 2 배양기에서배양하고여기서나온상층액을취해 BSA를 0.1% 되게첨가한후 -80 에실험전까지보관하였다. Boyden chamber의 lower chamber에 CM을각각 30 μl/well씩분주하였다. ECM의구성분인 matrigel (11 mg/ml) 을 20배희석하여 polycarbonate membrane (8 μm pore size) 을코팅한다음, 공기중에서완전히말렸다. SGKE와 HT1080 cell ( cells/ml) 를 1:1로혼합하여 pre-incubation시킨후에 upper chamber에 well당 50 μl ( cells/well) 씩분주하였다. Chamber를조립하여물기가있는 tank에넣고 37, 5% CO 2 배양기에서 4시간반응시킨후에 Diff-Quick (Merck, USA) 으로 cell을고정하고염색한다음, membrane위에있는 invasion이안된 cell을완전히제거한후 Fig. 1. Effect of SGKE on cell viability of HT1080 cells. The cells were treated with SGKE for 24h and tested for viability by MTT assay. The absorbance was measured at 570 nm using microplate reader. Values were represented as means ±S.D., each in triplicate. ***: P< SGKE 가 HT1080 cell 의암세포부착능력에미치는영향 암세포가전이를하기위해서는 extracellular matrix (ECM) 에암세포가부착되면서전이의과정이시작된다. SGKE를암세포주에처리하였을때 ECM에부착되는능력을억제하는지알아보기위해재료및방법의 4번방법으로실험을해보았다. SGKE 를농도별로 (0, 25, 50, 100 μg/ml) 20분간 pre-incubation한 HT1080 cell을 matrigel이코팅된 96well plate에분주하여암세포주가부착된것을 XTT assay를이용해확인한결과 SGKE가농도의존적으로 HT1080 cell의 ECM부착을억제하는것을관찰할수있었다 (Fig. 2). 3. SGKE가 HT1080 cell의 matrix metalloproteinase-2, 9의활성에미치는영향 SGKE가 HT1080의 matrix metalloprotainase-2, 9 (MMP-2, MMP-9 또는 Gelatinase A, B) 의단백질수준에서의활성을저해함을알아보기위하여 6well plate ( cells/well) 에 SGKE를농도별로 24시간처리한 HT1080 cell의 supernatant를취하여 microcon으로농축하고정량한후 10% gelatin zymography를시행하였다. 결과대조군에비하여 SGKE를처리했을때 MMP-2 와 -9이농도의존적으로 gelatin의분해를억제하는것을관찰할수있었다 (Fig. 3)

금속단백분해효소의활성저해를통한삼귀고의탕의전이억제효과 팅한후실험에이용하였다. Lower chamber에는 cell의이동과침윤을유도하는 HT1080 conditioned media (CM) 를분주하였고, upper chamber에는 SGKE를농도별로처리한 HT1080을분주하여반응시켰다.

HT1080 cells pre-incubated with SGEK were added to coated well with matrigel.

, each in triplicate. *: P<0.05, **: P<0.01. Fig. 5. Effect of SGKE on invasion of HT1080 cells.

CM : HT1080 conditioned media. Fig. 3. Effect of SGKE on activities of MMP-2 and MMP-9 in HT1080 cells.

4 금속단백분해효소의활성저해를통한삼귀고의탕의전이억제효과 팅한후실험에이용하였다. Lower chamber에는 cell의이동과침윤을유도하는 HT1080 conditioned media (CM) 를분주하였고, upper chamber에는 SGKE를농도별로처리한 HT1080을분주하여반응시켰다. 결과 CM을처리한대조군은처리하지않은군보다침투를많이하였고, 이는 SGKE를처리한후농도에의존적으로억제되는것을관찰할수있었다 (Fig. 5). Fig. 2. Effect of SGKE on the adhesion of HT1080 cells to the ECM molecules. HT1080 cells pre-incubated with SGEK were added to coated well with matrigel. After 20 min of incubation, non-adherent cells were removed, and adherent cells were analyzed using XTT assay and the absorbance was mesured at 450 nm. Values were represented as means ±S.D., each in triplicate. *: P<0.05, **: P<0.01. Fig. 5. Effect of SGKE on invasion of HT1080 cells. HT1080 cells were preincubated with SGKE and then performed invasion assay as described in Materials and methods. Values were represented as means ±S.D., each in four times. *: P<0.05, ***: P< CM : HT1080 conditioned media. Fig. 3. Effect of SGKE on activities of MMP-2 and MMP-9 in HT1080 cells. HT1080 cells were treated with SGEK for 24h and then the supernatant soup were used for the measurement of MMP-2 (72 kda) and MMP-9 (92 kda) activities by gelatin zymography as described in Materials and methods. 4. SGKE가 HT1080 cell의 MMP-2와 TIMP-2의 mrna 발현에미치는영향 SGKE를처리한 cell을모아재료및방법 6번의방법대로 mrna를추출하였다. 이후에 table 2에나와있는 primer를이용하여 PCR을하였고, 이렇게나온산물을 2% agarose gel에전개하고 EtBr (1 mg/ml) 염색을하여 photodoc system을이용해 band를관찰하였다. MMP-2는 SGKE를농도별로처리하였을때그에따른억제효과가없는것으로나타났고, MMP-2의저해인자인 TIMP-2 역시 SGKE의농도에따른발현량의증가는나타나지않았다 (Fig. 4). 결론 삼귀고의탕에탄올추출물 (SGKE) 의암세포주전이저해작용을 in vitro 실험을통해입증하기위해비교적전이능력이좋다고알려져있는 cell line인 HT1080 (Human fibrosarcoma cells) 을이용한실험에서다음과같은결과를얻을수있었다. HT1080 세포주에독성이없는 100 μg/ml이하의농도로 SGKE 를처리하였을때 cell의 ECM에대한부착능력을농도의존적으로저해시켜주는것을관찰할수있었고, 전이가이루어지기위해 ECM을분해시키는 MMPs의활성을알아보기위해 gelatin zymography를수행한결과 SGKE는 MMP-2, MMP-9의 gelatin 분해능력을농도의존적으로저해하는활성을나타내었다. 한편 RT-PCR법을이용한실험에서 SGKE는 MMP-2와이의저해인자인 TIMP-2의 mrna수준에는아무런영향을미치지않았음을확인하였다. 마지막으로, SGKE는농도의존적으로 HT1080의침투능력을저해하였다. 이와같은결과로볼때, SGKE는 MMPs의활성을저해시킴으로써전이과정을억제하는것으로사료된다. 감사의 글 Fig. 4. Effect of SGKE on mrna levels of MMP-2 and TIMP-2 in HT1080 cells. HT1080 cells were treated with SGEK for 24h. The mrna expression levels of MMP-2 (970 bp) and TIMP-2 (581 bp), were determined by RT-PCR analysis. The housekeeping glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene serves as a loading control. 5. SGKE가 HT1080 cell의 ECM 침투능력에미치는영향 48well의 boyden chamber를이용하여 HT1080 cell이 ECM 을뚫고지나가는침투능력을알아보기위해 ECM의구성분인 matrigel을 20배희석하여 polycarbonate filter membrane을코 이연구는 2007년도경희대학교연구비지원에의한결과임 (KHU ) 참고문헌 1. Cavallaro, U., Christofori, G. Cell adhesion in tumor invasion and metastasis: loss of the glue is not enough. Biochim Biophys Acta. 1552: 39-45,

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,